專利名稱：生物活性劑的囊封方法
生物活性劑的囊封方法
背景技術(shù)：
很多藥物在大腦或眼中的靶標(biāo)處具有活性，為了使這些藥物到達(dá)它們的靶標(biāo)，它們必須穿過生物屏障，如血腦屏障。雖然一些分子能夠通過生物屏障，但是還有一些不能有效或事實上根本不能穿過這些屏障的其它分子。許多藥物也僅僅當(dāng)直接進入靶標(biāo)組織時才有效，且如果不能到達(dá)這個靶標(biāo)組織，藥物實際上也不能起作用。因此，由于不能穿過這樣的生物屏障，很多可能有效的藥物不能在臨床上使用。

現(xiàn)有技術(shù)中已記述了很多方法以增強藥物穿透這些生物屏障的能力。一種方法是改變屏障本身的功能。例如，滲透劑或擬膽堿藥物檳榔堿類 (cholinomimetic arecolines)，其能打開血腦屏障或者改變血腦屏障的穿透性(Saija A 等人，J Pharm. Pha. 42 135-138 (1990))。其它的方法是修飾藥物分子本身。例如，修飾蛋白以試圖穿過血腦屏障，包括使這些蛋白糖基化或者形成前藥(W0/2006/029845)。還有另一方法是植入可控制釋放的聚合物，其從基質(zhì)系統(tǒng)直接將活性成分釋放進入神經(jīng)組織。然而，如果直接植入大腦或骨髓，這種方法是浸入性的且需要外科手術(shù)介入 (sable等人，美國專利4，833，666)，這存在的問題是需要病人的同意，且通常僅僅是在大腦內(nèi)隨給予的藥物一起進行定位輸送，通常很快被排出(W0/2006/029845)。為了克服這些局限，人們使用了藥物載體系統(tǒng)，然而，靶標(biāo)的藥物傳輸?shù)闹饕獑栴}是通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)尤其是通過肝和脾的巨噬細(xì)胞的注射的載體的快速調(diào)理 (opsonisation)禾口攝取。因此，仍然需要一種有效的方法，以將大分子(如蛋白質(zhì))輸送到大腦和眼中。具體而言，需要找到一種將大分子穿過血腦屏障的方法，所述大分子在進入大腦時仍能保留活性，以及還能提供所需要的釋放動力學(xué)，保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和活性，且能夠回避清除機制。


圖1所示為通過動態(tài)光散射(DLS)獲得的粒度數(shù)據(jù)，表明懸液中納米粒子的存在。圖1 (a)所示為通過動態(tài)光散射對納米粒子懸液分析之后獲得的相關(guān)圖。圖1(b)所示為納米粒子的多模態(tài)粒度分布(導(dǎo)出數(shù)據(jù))，繪圖以說明相對于粒度范圍的粒子群(數(shù)量)的分布。圖1(c)所示為所示為納米粒子的多模態(tài)粒度分布(導(dǎo)出數(shù)據(jù))，繪圖以說明相對于粒度范圍的粒子群(數(shù)量)的分布。圖1(d)所示為所示為納米粒子的多模態(tài)粒度分布(導(dǎo)出數(shù)據(jù))，繪圖以說明相對于粒度范圍的粒子群(數(shù)量)的分布。圖2所示為用HIP方法獲得的囊封的亮啡肽類似物(Dalargin)的量與通過普通方法在粒子表面吸收得到的量的對比。圖3所示為在輸送HIP-PBCA納米粒子之后腦中的亮啡肽類似物水平。僅當(dāng)使用HIP方法在微粒中囊封時所述肽是可測量的。圖4所示為使用HIP方法在PBCA納米粒子中對亮啡肽類似物的囊封。測定水相的PH對囊封效率的影響。圖5所示為使用HIP方法在PBCA納米粒子中對抗雞蛋溶菌酶結(jié)構(gòu)域抗體的囊封。 通過Edman測序分析納米粒子。圖6所示通過SDS-PAGE分析以確認(rèn)在HIP-PBCA納米粒子中的dAb殼體化。將納米粒子離心分離以除去任何游離的dAb并用SDS-PAGE分析顆粒以觀察殼體化的dAb。圖 7 所示為通過 SDS-PAGE 分析以確認(rèn) VEGA dAb (D0M15-26-593)載入 HIP-PBCA 納米粒子。將納米粒子制劑與dAb標(biāo)準(zhǔn)進行比較，以便確定在納米粒子中存在的dAb的量。 起始輸入的12mg中總計3. 31mg dAb已經(jīng)在納米粒子中殼體化。因此，載入效率為27. 6%。 dAb載入率為3. 31% w/w。圖8所示為小鼠中含有域抗體的HIP PBCA納米粒子通過靜脈途徑將它們載入的蛋白輸送到腦中的能力的體內(nèi)評估結(jié)果。在給藥后10分鐘，納米粒子中的dAb形成可檢測的腦吸收物，其量為8. Ong/mL·游離的dAb在腦中也可以檢測到，其濃度較低，為3. 3ng/ ml (初始數(shù)據(jù))。因此，納米粒子似乎少量增加蛋白的腦吸收(初始數(shù)據(jù))。在60分鐘時， 觀察到相反的現(xiàn)象，因為游離的dAb似乎聚集在腦中，導(dǎo)致其腦水平進一步增加到13 . 5ng/ ml。校正了腦水平。圖9所示為通過靜脈途徑從含有域抗體的HIP PBCA納米粒子的體內(nèi)評估中得到的dAb在腦和血液中的比例。結(jié)果顯示，當(dāng)和納米粒子一起給予與給予在溶液中的游離dAb 相比時，腦中存在的dAb比血液中存在的dAb的比例高。圖10所示為小鼠中含有域抗體的HIP PBCA納米粒子通過靜脈途徑將它們載入的蛋白輸送到大腦中的能力的體內(nèi)評估結(jié)果。給藥后10分鐘，納米粒子組中的dAb在腦中顯示出高水平的dAb，平均值為627. 60ng/ml。圖11所示為通過頸動脈途徑從含有域抗體的HIP PBCA納米粒子的體內(nèi)評估中得到的dAb在腦和血液中的比例。納米粒子組中的dAb顯示了在兩個時間點(在10和60分鐘分別為1. 569和1. 845)處，腦與血液的比例大于1，表明大多數(shù)制備的dAb已成功地到達(dá)腦。圖12所示為通過光學(xué)顯微鏡對產(chǎn)生的微球體的確認(rèn)。所有的微球體制劑都使用聚己酸內(nèi)酯通過HIP方法生成。(a)維生素E TPGS 2%表面活性劑4000rpm 2分鐘20x mag(b)維生素E TPGS 2%表面活性劑7500rpm 2分鐘20x mag(c)維生素 E TPGS 2%表面活性劑 7500rpm 2 分鐘+dAb 1 20x mag(d)維生素 E TPGS 2%表面活性劑 7500rpm 2 分鐘+dAb2 20x mag圖13所示為所示為通過激光衍射對產(chǎn)生的微球體的確認(rèn)。所有的微球體制劑都使用聚己酸內(nèi)酯通過HIP方法形成。(a)維生素E TPGS 2%表面活性劑4000rpm 2分鐘20x mag(b)維生素E TPGS 2%表面活性劑7500rpm 2分鐘20x mag(c)維生素 E TPGS 2%表面活性劑 7500rpm 2 分鐘+dAb 1 20x mag(d)維生素 E TPGS 2%表面活性劑 7500rpm 2 分鐘+dAb2 20x mag
圖14所示為通過SDS-PAGE分析對進入HIP-PC微球體的dAb殼體化的確認(rèn)。過濾微球體，(F)離心過濾(3k或13k rpm)以除去游離的dAb和上清液⑶，以及小球⑵， 并通過SDS-PAGE分析，以觀察殼體化的dAb。 圖15所示為通過SDS-PAGE分析對殼體化的dAb從HIP-PC微球體中的釋放的確認(rèn)。清洗微球體，接著在56°C下加熱處理0、20、40或60分鐘，以釋放dAb、碎片小球(5分鐘@5k)和上清液(S)，通過SDS-PAGE進行分析，以觀察殼體化的dAb。分子標(biāo)記-參見Blue Plus 2預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)(invitrogen)，分子量(kd)，凝膠確認(rèn)了已經(jīng)有dAb釋放出來。凝膠還確認(rèn)了 dAb是完整的，且由于釋放方法，它們沒有片段化。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個方面中，提供一種在微粒載體中囊封生物活性劑的方法，如在納米粒子中，或納米粒子中和上，或用納米粒子囊封蛋白和/或肽的方法，和通過在納米粒子中，或納米粒子中和上，或用納米粒子囊封以輸送蛋白和/或肽穿過血腦屏障的方法，以及通過在微粒載體中，或微粒載體中和上，或用微粒載體囊封以將蛋白和/或肽輸送到眼中的方法。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供一種微粒載體，其包括粒子形成物質(zhì)和生物活性劑如蛋白和/或肽，以將蛋白和/或肽從血液穿過血腦屏障輸送到腦或輸送到眼中。在本發(fā)明的再一實施方式中，提供納米粒子的組合物以及它們在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或眼的疾病或病癥中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明提供包括粒子形成物質(zhì)和生物活性劑的微粒載體，以及所述微粒載體的制備方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種在微粒載體中囊封生物活性劑的方法，包括以下步驟a)在疏水離子配對(HIP)試劑存在下使生物活性劑在有機溶劑中溶解；b)使聚合物形成物質(zhì)的單體和/或寡聚體溶解于(a)中的有機相中；c)在連續(xù)水相中形成在(b)中形成的有機相的乳液，以使單體聚合；以及d)得到從乳液中形成的微粒載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種在微粒載體中囊封生物活性劑的方法，包括以下步驟a)使在水相中的生物活性劑與在有機溶劑相中的疏水離子配對(HIP)試劑混合， 以形成生物活性劑-HIP復(fù)合物；b)從水相中分離復(fù)合物；c)除去水相，并使復(fù)合物與有機相均化；d) (i)使聚合物溶解于(C)中形成的有機相，然后在連續(xù)水相中形成有機相的乳液；或者(ii)使聚合物形成物質(zhì)的單體或寡聚物溶解于(C)中形成的有機相，然后在連續(xù)水相中形成有機相的乳液，以允許單體或寡聚體聚合形成聚合物；以及e)得到從步驟(d)中的乳液中形成的微粒載體。
使用疏水離子配對試劑的這種方法允許生物活性劑如蛋白(如親水蛋白)在疏水聚合物粒子的中心中囊封。疏水離子配對允許萃取出蛋白進入有機介質(zhì)，因此，這種方法能用單乳液制備微粒載體。在另一個實施方式中，本發(fā)明的微粒載體包含生物活性劑如蛋白或肽。所述蛋白可以是抗原結(jié)合分子，本文中使用的抗原結(jié)合分子是指抗體、抗體片段和能夠結(jié)合靶標(biāo)的其它蛋白結(jié)構(gòu)?？乖Y(jié)合分子可包括域(domain)?！坝颉笔钦郫B的蛋白結(jié)構(gòu)，具有獨立于余下的蛋白的三級結(jié)構(gòu)。一般地，域負(fù)責(zé)蛋白的離散的功能特性，在很多的情況下可加入、移除或轉(zhuǎn)移到其它的蛋白上，而不會損失該蛋白和/或域的余下部分的功能。“單抗體可變域”是折疊的多肽域，其包括抗體可變域的序列特征。因此，它包括完整的抗體可變域和修飾的可變域，例如， 其中的一個或多個環(huán)已經(jīng)被非特征性的抗體可變域的序列取代，或者被截短或包括N或C 末端延伸部分的抗體可變域取代，以及被可變域的折疊片段取代，所述折疊片段至少保留全長域的結(jié)合活性和特異性?？乖Y(jié)合分子可包括至少一個免疫球蛋白可變域，例如，這些分子可包括抗體、域抗體、 Fab、Fab'、F(ab' ) 2、Fv、ScFv、雙特異抗體、異源結(jié)合抗體。這些抗原結(jié)合分子能結(jié)合單個的靶標(biāo)，或可以是多特異性的，即結(jié)合多個靶標(biāo)，如它們可以是雙特異性的或三特異性的。在一個實施方式中，所述抗原結(jié)合分子是抗體。在另一實施方式中，所述抗原結(jié)合分子是域抗體(dAb)。在又一實施方式中，所述抗原結(jié)合分子可以是抗體和抗原結(jié)合片段的組合物，例如連接到單克隆抗體的一個或多個dAb和/或一個或多個ScFv。在又一實施方式中，所述抗原結(jié)合分子可以是抗體和肽的組合物。抗原結(jié)合分子可包括至少一個非Ig 結(jié)合域，例如特異性地結(jié)合獨立于不同V區(qū)或域的抗原或表位的域，這可以是dAb，例如人、 駱駝或鯊魚的免疫球蛋白單可變域，或者它可以是這樣的域，其選自以下的支架的衍生物 CTLA-4 (Evibody)、脂籠蛋白(Lipocalin)、蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-域(親和蛋白體，SpA)、A-域(Avimer/Maxibody)、熱休克蛋白如GeoEI和GroES、轉(zhuǎn)鐵蛋白(穿膜抗體)、 錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)、肽適體、C型凝集素域(四連接素)、人晶體蛋白和人泛素(親和物)、PDZ域、人蛋白酶抑制劑的的蝎毒kimitz型域、以及纖連蛋白(adnectin)；其已經(jīng)用于蛋白工程，以便使其與配體而非與天然的配體結(jié)合。CTLA_4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4)是主要在⑶4+T細(xì)胞上表達(dá)的⑶28家族受體。它的胞外域是可變域狀的Ig折疊。對應(yīng)于抗體的CDR的環(huán)可用異源序列取代，以賦予不同的結(jié)合特性。業(yè)已知道，經(jīng)工程改造成具有不同結(jié)合特性的CTLA-4分子是Evibody。 進一步詳細(xì)的內(nèi)容請參見免疫學(xué)方法雜志248 (1-2)，31-45 (2001)。脂籠蛋白是轉(zhuǎn)運小疏水分子如類固醇、后膽色素、類視黃醇和脂質(zhì)的胞外蛋白家族。它們具有剛性折疊的二極結(jié)構(gòu)，其在圓錐形結(jié)構(gòu)的開始端具有很多的環(huán)，可以經(jīng)工程改造以結(jié)合不同的靶標(biāo)抗原。Anticalin的大小在160-180個氨基酸之間，并源自脂籠蛋白。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見 Biochim Biophys Acta 1482 :337_350 (2000)，US7250297B1 和 US20070224633。親和體是源自能經(jīng)工程改造以結(jié)合抗原的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架。該域由三螺旋束的約58個氨基酸組成。通過表面殘基的隨機化產(chǎn)生庫。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見 Protein Eng. Des. Sel. 17，455-462 (2004)和 EP1641818A1。
Avimer是源自A-域支架家族的多域蛋白。約35個氨基酸的天然域采用限定的二硫化物鍵合結(jié)構(gòu)。通過慢慢移動由A域家族展現(xiàn)的天然變異可產(chǎn)生多種變化。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見 Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909—917(2007 年 6 月)。 轉(zhuǎn)鐵蛋白是單體血清轉(zhuǎn)運糖蛋白。通過在允許的表面環(huán)中插入肽序列，轉(zhuǎn)鐵蛋白可以經(jīng)工程改造以結(jié)合不同的靶標(biāo)抗原。工程改造的轉(zhuǎn)鐵蛋白支架的例子包括穿膜抗體 (trans-body)。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見 J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)源自錨蛋白，其為一種蛋白家族，用于將整合膜蛋白的附屬部分介導(dǎo)至細(xì)胞骨架上。單個的錨蛋白重復(fù)是由雙螺旋和a轉(zhuǎn)角組成的33個殘基基序。通過隨機化每個重復(fù)的第一螺旋和轉(zhuǎn)角中的殘基，它們可經(jīng)改造以結(jié)合不同的靶標(biāo)蛋白。通過增加單元的數(shù)量(親和力成熟的方法)，可增加結(jié)合界面。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見 J. Mol. Biol. 332，489-503 (2003)，PNAS 100 (4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028(2007)以及 US20040132028A1。纖連蛋白是一種能改造以結(jié)合抗原的支架。Adnectin由 人的III型纖連蛋白 (FN3)的15個重復(fù)單元的第十域的天然氨基酸序列的主鏈組成。夾心結(jié)構(gòu)的一端的三個環(huán)可改造成使Adnectin特異性地識別感興趣的治療靶標(biāo)。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見Protein Eng. Des. Sel. 18，435-444 (2005)、US2008013979U W02005056764 和 US6818418B1。肽適體是由連續(xù)的支架蛋白組成的組合識別分子，一般是含有在活性位點插入的限制性的可變肽環(huán)的硫氧還蛋白(TrxA)。進一步詳細(xì)的內(nèi)容參見ExpertOpin. Biol. Ther. 5，783-797(2005)。微體源自天然生成的長度為25-50個氨基酸的微蛋白，包含3-4個半胱氨酸橋，微蛋白的例子包括KalataBl和芋螺毒素(conotoxin)和結(jié)蛋白(knottins)。微蛋白具有能夠改造成包括多達(dá)25個氨基酸的環(huán)，且不影響微蛋白的整體折疊。改造的結(jié)蛋白域的進一步詳細(xì)內(nèi)容，參見W02008098796。其它的非Ig結(jié)合域包括已用作支架以改造不同靶標(biāo)抗原結(jié)合特性的蛋白，包括人晶體蛋白和人泛素(親和結(jié)合體)，人蛋白酶抑制劑的kimitz型域、Ras-結(jié)合蛋白AF-6 的PDZ域、蝎毒素(北非蝎毒素)，C型凝集素域(四連蛋白)，其在Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007， Stefan Dubel 編輯)的第 7 章禾口 Protein Science 15:14-27(2006)中有綜述。本發(fā)明的非Ig結(jié)合域可源自任意的這些可替代的蛋白域。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述抗原結(jié)合分子結(jié)合到在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)中，例如腦或脊髓中或者例如神經(jīng)組織中。在本文描述的本發(fā)明的再一實施方式中，抗原結(jié)合分子特異性地結(jié)合到已知與神經(jīng)疾病或病癥相關(guān)的靶標(biāo)中，例如MAG (髓鞘相關(guān)糖蛋白)、N0G0 (神經(jīng)突起生長抑制蛋白) 或淀粉樣蛋白。這些抗原結(jié)合分子包括能夠結(jié)合N0G0 (如抗-N0G0抗體)的抗原結(jié)合分子。用于本發(fā)明的的抗-N0G0抗體的一個例子是由SEQ ID NO 1的重鏈和SEQ ID NO 2的輕鏈限定的抗體，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗體的⑶R的抗-N0G0抗體或其抗原結(jié)合片段。該抗體(H28L16)的進一步詳細(xì)的內(nèi)容可在PCT申請W02007068750中找到，其內(nèi)容納入本文
中作為參考。這種抗原結(jié)合分子包括能夠結(jié)合MAG (如抗-MAG抗體)的抗原結(jié)合分子。用于本發(fā)明的抗-MAG抗體的一個例子是由SEQ ID NO 11的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)限定的抗體，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗體的⑶R的抗-MAG抗體或其抗原結(jié)合片段。該抗體(BvHICvLl)的進一步詳細(xì)的內(nèi)容可在PCT申請W02004014953中找到，其內(nèi)容納入本文中作為參考。這種抗原結(jié)合分子包括能夠結(jié)合β -淀粉樣蛋白(如抗β _淀粉樣蛋白抗體)的抗原結(jié)合分子。用于本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白抗體的一個例子是由SEQ ID NO 5的重鏈和/或SEQ ID NO 6的輕鏈限定的抗體，或包含SEQ ID NO 5和6所示的抗體的⑶R的抗-β-淀粉樣蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段。該抗體(H2L1)的進一步詳細(xì)的內(nèi)容可在PCT 申請W02007113172中找到，其內(nèi)容納入本文中作為參考。用于本發(fā)明的可替代的抗β -淀粉樣蛋白抗體是由SEQ ID NO 7的重鏈和/或SEQ ID NO 8的輕鏈限定的抗體，或包含SEQ ID NO 7和8所示的抗體的⑶R的抗_淀粉樣蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段。這種抗體的CDR序列可由以下方法確定Kabat編號系統(tǒng)(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)、Chothia 編號系統(tǒng)(Al-Lazikani 等人，(1997) JMB 273,927-948)、接觸定義方法(MacCallum R. Μ.，和 Martin Α. C. R.和 Thornton J. Μ, (1996)，Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745)或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的對抗體的殘基編號并確定CDR的任何其它確定的方法。

在本發(fā)明的一個實施方式中，該抗原結(jié)合蛋白結(jié)合到眼中的靶標(biāo)中，例如TNF、 TNFr-l、TNFr-2、TGF3 受體-2、VEGF、N0G0、MAG、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL_17、CD20、β -淀粉樣蛋白、FGF-2、IGF-U PEDF, PDGF 或補體因子，如 C3、C5、C5aR、CFD、CFH、CFB、CFI、sCRl 或C3。在本發(fā)明的另一實施方式中，該抗原結(jié)合蛋白結(jié)合VEGF。在本發(fā)明的另一個可替代的實施方式中，該抗原結(jié)合蛋白結(jié)合淀粉樣蛋白。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述微粒載體可以是微球體或納米粒子。在一個這樣的實施方式中，所述微粒載體是納米粒子，且生物活性劑是蛋白。在另一實施方式中，所述微粒載體是納米粒子，且生物活性劑是肽。在又一實施方式中，所述微粒載體是納米粒子，且生物活性劑包含抗原結(jié)合分子，如域抗體或抗體。在又一實施方式中，所述微粒載體是納米粒子，且生物活性劑包含域。在另一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑是蛋白。在又一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑是肽。在又一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑包含抗原結(jié)合分子，如域抗體或抗體。在再一實施方式中，所述微粒載體是微球體，且生物活性劑包含域。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供包括本發(fā)明所述的方法制備的納米粒子的組合物。在另一實施方式中，當(dāng)用動態(tài)光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的納米粒子在約 Inm-約IOOOnm之間的范圍內(nèi)。在又一實施方式中，當(dāng)用動態(tài)光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的納米粒子在約Inm-約400nm之間，或約Inm-約250nm之間，或約Inm-約150nm 之間，或約40nm-約250nm之間，或約40nm_約150nm之間，或約40nm_約IOOnm之間的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的又一實施方式中，當(dāng)用動態(tài)光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的納米粒子在約40nm-約250nm之間的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一實施方式中，當(dāng)用動態(tài)光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的納米粒子在約40nm-約150nm之間的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一實施方式中，其提供一種包括本發(fā)明的納米粒子的組合物，其中當(dāng)用動態(tài)光散射技術(shù)測量時，組合物中的納米粒子的粒徑中間值小于約lOOOnm，例如粒徑小于約400nm，例如粒徑小于約250nm，例如粒徑小于約150nm。在另一實施方式中，組合物中的納米粒子的粒度中間值為約40nm-約250nm。在另一實施方式中，組合物中的納米粒子的粒度中間值為約40nm-約150nm。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供包括本發(fā)明所述的任一種方法制備的微球體的組合物。在另一實施方式中，當(dāng)用小角激光光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的微球體的直徑在約1 μ m-約100 μ m之間的范圍內(nèi)。在又一實施方式中，當(dāng)用小角激光光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的粒子在約1 μ m-約80 μ m之間，或在約1 μ m-約60 μ m之間，或在約1 μ m-約40 μ m之間，或在約1 μ m_約30 μ m之間，或在約1 μ m_約10 μ m之間的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，當(dāng)用小角激光光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的微球體在約1 μ m-約60 μ m之間的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，當(dāng)用小角激光光散射技術(shù)測量時，數(shù)量上至少約90%的微球體在約1 μ m-約30 μ m之間的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的又一實施方式中，其提供一種包括本發(fā)明的微球體的組合物，其中當(dāng)用小角激光光散射技術(shù)測量時，組合物中的微球體的粒徑中間值小于約100 μ m,例如粒徑小于約80 μ m,例如粒徑小于約60 μ m,例如粒徑小于約40 μ m。在另一實施方式中，組合物中微球體的粒度中間值為約1 μ m-約6 μ m或1 μ m-約 30 μ m0在本發(fā)明的另一實施方式中，所述微粒載體在超過至少3個月或更長的時間內(nèi)， 或長達(dá)6個月或更長的時間或者長達(dá)12個月或更長的時間內(nèi)持續(xù)釋放治療量的活性生物分子。在一個實施方式中，在沒有疏水離子配對試劑存在時，所述生物活性劑不溶于有機相。在本文所述的本發(fā)明的一個實施方式中，當(dāng)?shù)鞍资顷庪x子時，疏水離子配對試劑是陽離子HIP試劑。在另一實施方式中，當(dāng)?shù)鞍资顷栯x子時，疏水離子配對試劑是陰離子 HIP試劑。在又一實施方式中，陰離子HIP試劑選自烷基季銨鹽陽離子，優(yōu)選烷基溴化銨，更優(yōu)選四丁基溴化銨、四己基溴化銨、四辛基溴化銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、油酸鈉或多庫脂鈉(aka Aerosol 0T )，且HIP試劑以化學(xué)計量等于或大于蛋白上的凈正電荷的數(shù)量的的量存在。在另一實施方式中，陽離子HIP試劑選自二甲基二(十八烷基)溴化銨 (DDAB18)、1，2-二油酰基氧基-3-三甲銨丙烷(DOTAP)、或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)， 且HIP試劑以化學(xué)計量的量等于或大于蛋白上的凈負(fù)電荷的量存在。在進一步的實施方式中，任何疏水陽離子或陰離子可潛在地用作HIP試劑以溶解蛋白。疏水離子配對(HIP)包含帶有類似電荷種類，但是不容易被溶劑化的極性平衡離子的化學(xué)計量取代。如本文所述，本發(fā)明提供一種使用HIP改變蛋白溶解性的方法，這允許萃取蛋白進入有機溶劑中，例如二氯甲烷中。多庫脂鈉(雙(2-乙己基)琥珀酸酯磺酸鈉) 是合適的離子配對試劑的一個例子。在一個實施方式中，使含有多庫脂鈉的二氯甲烷與水性蛋白溶液混合。這導(dǎo)致多庫酸酯離子與蛋白形成離子對，并隨后隔開蛋白進入油相。蛋白分散于二氯甲烷中使得蛋白被囊封在通過單水包油乳化法制備的納米粒子或微球體中。在本文所述的本發(fā)明的一個實施方式中，當(dāng)?shù)鞍资顷庪x子型，而HIP試劑是陽離子型時，連續(xù)水相的pH為約7. 0或更高，例如，pH可以是至少約8. 0或至少約10. 0或至少約 12. 0。在本文所述的本發(fā)明的另一個替代性的實施方式中，當(dāng)?shù)鞍资顷栯x子型，而HIP 試劑是陰離子型時，連續(xù)水相的PH為約7. 0或更低，例如，pH可以是小于約6. 0或小于約 4. 0或小于約2. 0。在這樣的一個實施方式中，蛋白與聚合物的重量/重量比(w/w)可以是 0. 5% -90%,例如是至少約0.5%，或至少約1 %，或至少約2%，或至少約2.5%，或至少約 5 %，或至少約9 %，或至少約10 %，或至少約15 %，或至少約20 %，或至少約40 %，或至少約 50%，或至少約60%，或至少約70 %，或至少約80 %或至少約90%。例如，當(dāng)?shù)鞍资请臅r， 該肽與聚合物的比率可以是至少約9%，當(dāng)?shù)鞍资强贵w時，該抗體與聚合物的比率可以至少是約2%，或當(dāng)?shù)鞍资怯蚩贵w時，該域抗體與聚合物的比率可以至少是約2. 5%。在本發(fā)明的一個實施方式中，蛋白與總制劑(聚合物+HIP和可選的表面活性劑) 的w/w比可以是0. 5% -50%，例如是至少約5%，或至少約9%，或至少約15%，或至少約 16%，或至少約20%或至少約25%。例如，當(dāng)?shù)鞍资请臅r，該肽與總制劑的重量比可以是至少約16%，或蛋白是抗體時，抗該體與聚合物的重量比可以是至少約1%，或當(dāng)?shù)鞍资怯蚩贵w時，該域抗體與總制劑的重量比可以是至少約9%。在本發(fā)明的一個實施方式中，粒子的囊封效率是至少約1 %，或至少約2 %，或至少約10%，或至少約20%，或至少約40%，或至少約50%，或至少約60%，或至少約70%， 或至少約80 %，或至少約90 %，或至少約95 %，或至少約97 %，或至少約99 %。例如，當(dāng)?shù)鞍资请臅r，囊封效率可以是至少約90%，當(dāng)?shù)鞍资强贵w時，囊封效率可以是至少約1%，或當(dāng)?shù)鞍资怯蚩贵w時，囊封效率可以是至少約70 %。在本發(fā)明的一個實施方式中，單體或寡聚體選自甲基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-二甲胺乙酯。在進一步的實施方式中，該單體是氰基丙烯酸烷基酯，如氰基丙烯酸丁酯(BCA)。在又一實施方式中，用于本文所述的任一方法中的聚合物選自但不限于以下物質(zhì)聚-L-交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚交酯、聚己酸內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯和/或其共聚物。合適的粒子形成物質(zhì)包括但不限于聚二烯烴如聚丁二烯等；聚烯烴類如聚乙烯、聚丙烯等；聚丙烯酸類如聚丙烯酸等；聚甲基丙烯酸類如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯等；聚乙烯醚類、聚乙烯醇類、聚乙烯酮類、聚乙烯基鹵化物如聚氯乙烯等；聚乙烯腈類；聚乙烯酯類如聚乙酸乙烯酯等、聚乙烯吡啶類如聚(2-乙烯基-吡啶)、聚(5-甲基-2-乙烯吡啶)等；聚苯乙烯類；聚碳酸酯類；聚酯類；聚原酸酯類；聚酯酰胺類(polyesterarnides)；聚酸酐類；聚氨酯類；聚酰胺類；纖維素醚類如甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等；纖維素酯類如醋酸纖維素、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、 醋酸丁酸纖維素等；多糖、蛋白質(zhì)、凝膠、淀粉、膠、樹脂等等。這些材料可單獨使用，作為物理混合物(共混物)或作為共聚物使用。還共混聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚芳基酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、N，N-L-賴氨酸二基對苯二甲酸酯、聚酸酐、去溶劑化的生物活性劑或碳水化合物、多糖、聚丙烯醛、聚戊二醛及其衍生物、共聚物和聚合物。適合用于本發(fā)明的方法的有機溶劑的例子包括但不限于不溶于水的酯如乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、異丁酸異丁酯、2-乙基乙酸己酯、乙二醇二乙酸酯；不溶于水的酮如甲基乙基酮、甲基異丁基酮、甲基異戊基酮、甲基正戊基酮、 二異丁基酮；不溶于水的醛如乙醛、正丁醛、巴豆醛、二乙基己醛、異丁醛和丙醛；不溶于水的醚酯如3-乙氧基丙酸乙酯；不溶于水的芳香烴如甲苯二甲苯和苯；不溶于水的鹵代烴如 1，1，1_三氯乙烷；不溶于水的乙醇醚酯如丙二醇單甲醚醋酸酯、乙二醇單乙醚醋酸酯、乙二醇單丁醚醋酸酯、二乙二醇單丁醚醋酸酯；不溶于水的鄰苯二甲酸增塑劑如鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二辛酯、對苯二甲酸二辛酯、辛基鄰苯二甲酸丁酯、鄰苯二甲酸丁基芐酯、鄰苯二甲酸烷基芐酯；不溶于水的增塑劑如己二酸二辛酯、乙二醇二-2-乙基己酸三乙烯酯、偏苯三酸三辛酯、三醋酸甘油酯、甘油基/三丙酸菌素(glyceryl/tripropionin)、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二異丁酸酯、二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、環(huán)己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、庚烷、己烷或其它的烴；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4_三甲基戊烷、1-辛醇及其異構(gòu)體或苯甲醇。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于本發(fā)明的方法的溶劑選自二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亞砜、四氯化碳、氯仿、環(huán)己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、 庚烷、己烷或其它的烴；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其異構(gòu)體或苯甲醇。本文所述的本發(fā)明的所有方面的微粒載體、包含它們的組合物或它們的制備方法可進一步包括加入表面活性劑，其例如但不限于膽酸鈉、泊洛沙姆188(p0l0Xamer) (pluronic F68 ，或F127)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80、葡聚糖、泊洛沙姆、 poloxamines、多功能醇的羧酸酯類、烷氧基化醚類、烷氧基酯類、烷氧基化甘油單、二、三酯類、烷氧基酚類以及聯(lián)苯酚類、乙氧基醚類、乙氧基酯類、乙氧基甘油三酸酯類、GenapolR 和BaukiR 系列的物質(zhì)、脂肪酸的金屬鹽、羧酸的金屬鹽、醇硫酸金屬鹽以及脂肪醇硫酸金屬鹽和磺基琥珀酸金屬鹽以及兩種或更多種上述物質(zhì)的混合物。在又一實施方式中，所述表面活性劑選自膽酸鈉、泊洛沙姆188(plUronic F68 )、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80和葡聚糖。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供包含生物活性劑的微粒載體，其可由本文所述的本發(fā)明的任意方法制備。囊封在本發(fā)明的微粒載體和/或組合物內(nèi)的生物活性劑在它從微粒載體釋放時保留至少一些生物活性，例如，當(dāng)藥劑是結(jié)合的藥劑并對生物活性劑從粒子中釋放產(chǎn)生生物應(yīng)答時，該組合物中的一定比例的分子可保留至少一些結(jié)合它們的靶標(biāo)的能力?？捎煤线m的生物結(jié)合測定測量這樣的結(jié)合，合適的測定的例子包括但不限于ELISA或Biacore 。在另一實施方式中，當(dāng)通過生物活性測定對粒子的釋放進行測量時，例如在一個實施方式中通過ELISA、Biacore測量時，組合物保留至少50 %它對靶標(biāo)的親和力，或?qū)Π袠?biāo)保留至少70%或至少90%的親和力(Kd)。在一個實施方式中，組合物能夠在給藥的對象中引出治療效果。本發(fā)明的組合物的生物活性可通過任意合適的測定進行測量，其測量的是囊封的生物活性分子的活性，例如當(dāng)生物活性分子是VEGF dAb時，可使用實施例18記載的測定。在另一個實施方式中，其提供一種包含囊封在本文所述的本發(fā)明的微粒載體中的生物活性劑的藥物組合物。在另一個實施方式中，其提供一種包含囊封在本文所述的本發(fā)明的納米粒子中的蛋白的藥物組合物。在另一個實施方式中，本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預(yù)防涉及微粒載體穿過血腦屏障的疾病或病癥。在另一個實施方式中，本文所述的本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥，例如可用來治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、牛海綿狀腦病、西尼羅河病毒性腦炎、神經(jīng)艾滋病、腦損傷、脊髓損傷、轉(zhuǎn)移性腦癌、多發(fā)性硬化、中風(fēng)。在另一個實施方式中，所述組合物可包含抗MAG-抗體，以治療和/或預(yù)防中風(fēng)或神經(jīng)損傷。在另一個實施方式中，所述組合物可包含抗-NOGO-抗體，以治療和/或預(yù)防中風(fēng)或神經(jīng)損傷，或者例如治療或預(yù)防神經(jīng)退化性疾病如阿爾茨海默病。在另一個實施方式中，所述組合物可包含抗-β -淀粉樣蛋白抗體，以治療和/或預(yù)防中風(fēng)或神經(jīng)損傷，或者例如治療或預(yù)防神經(jīng)退化性疾病如阿爾茨海默病。在本文所述的本發(fā)明的一個實施方式中，所述微粒載體可通過腸胃外注射或輸注、靜脈或動脈給藥的方式給予患者。在另一個實施方式中，本文所述的本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預(yù)防眼睛疾病或病癥。在另一個實施方式中，本文所述的本發(fā)明的組合物可用來治療和/或預(yù)防疾病， 其例如但不限于年齡相關(guān)的黃斑變性(新生血管/濕的)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞癥、葡萄膜炎、角膜新生血管形成或青光眼。在另一個實施方式中，所述組合物可用來治療和/或預(yù)防AMD (年齡相關(guān)的黃斑變性)，例如濕性AMD或干性AMD。在本發(fā)明的另一個實施方式中，其提供一種囊封在本文所述的納米粒子和/或微球體中的生物活性劑，用作藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，其提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療和/ 或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病的藥物中的用途。在又一個實施方式中，本發(fā)明提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療和/或預(yù)防中風(fēng)或神經(jīng)損傷的藥物中的用途。在本發(fā)明另一個實施方式中，提供本文所述的本發(fā)明的組合物在制備治療或預(yù)防眼病的藥物(如在制備治療和/或預(yù)防AMD的藥物)中的用途。本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療阿爾茨海默病的方法。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預(yù)防中風(fēng)或神經(jīng)損傷的方法。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預(yù)防眼病的方法。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的組合物治療和/或預(yù)防AMD的方法。定義本文使用的術(shù)語“粒子形成的物質(zhì)”用來描述任意的能夠聚合的單體和/或寡聚體，或能形成不溶于水性環(huán)境中的粒子的聚合物，如PBCA、PLGA。在未聚合時，該粒子形成物質(zhì)可溶于有機溶劑中。本說明書全文使用的術(shù)語“微粒載體”用于包含納米粒子和微球體。“微球體”是由直徑大于ι μ m的各種天然和合成的材料組成的粒子，而本文使用的“納米粒子”是亞微米級的粒子，如l-1000nm。在一個實施方式中，本文使用的術(shù)語微粒載體、納米粒子和微球體具有載體結(jié)構(gòu)， 其具有生物相容性且足以抵抗使用環(huán)境導(dǎo)致的化學(xué)和/或物理損壞，以至于在給藥進入人或動物體之后，足量的粒子基本上保持完整，并能保持足夠的時間，以便能夠到達(dá)所需要的靶器官或組織，如腦或眼睛。本文所使用的術(shù)語“生物活性劑”是用于表示當(dāng)?shù)竭_(dá)它們應(yīng)到的靶標(biāo)時，該分子必須能夠至少部分具有生物活性的術(shù)語。為避免術(shù)語“生物活性劑”和“生物活性分子”在本說明書全文中重復(fù)使用表示歧義，兩個術(shù)語表示相同的含義，且能夠互換。術(shù)語“溶解”定義為形成溶劑中的單獨分子形式的溶液，或形成液體懸液中的固體，其形式為分子微小固體聚集塊懸浮于液體中。溶解過程也可以得到完全溶解的分子和懸浮的固體聚集塊的混合物。整份說明書中所使用的用于在微粒載體中囊封的術(shù)語“蛋白”包括分子量至少為 llkDa、或至少12kDa、或至少50kDa、或至少lOOkDa、或至少150kDa或至少200kDa的蛋白。 囊封用的蛋白也可以有很長的長度，例如至少為70個氨基酸的長度或至少為100個氨基酸的長度或至少為150個氨基酸的長度或至少為200個氨基酸的長度。整份說明書中所使用的用于在微粒載體中囊封的術(shù)語“肽”包括較短序列的氨基酸，其分子量不大于約lOkDa、或不大于約8kDa、或不大于約5kDa、或不大于約2kDa或不大于約IkDa或小于lkDa。囊封用的肽的長度不超過70個氨基酸的長度或不超過50個氨基酸的長度或不超過40個氨基酸的長度、或不超過20個氨基酸的長度、或小于10個氨基酸的長度。術(shù)語“眼周，，是指局部給藥至眼外周的位置，其包括但不限于“結(jié)膜下，，-結(jié)膜的下面-在鞏膜上覆蓋整個眼球的的清澈的黏液膜；“筋膜下”-包裹眼睛的筋膜的下面但在鞏膜外面；“眼球周圍”-眼球下的空間，其中眼球位于眼框中；“眼球后”-眼球正后方的空間，鄰近視神經(jīng)；“脈絡(luò)膜上層”-鞏膜的下面，但在脈絡(luò)膜進入脈絡(luò)膜上層空間的外部；“經(jīng)鞏膜”-該術(shù)語也用來指輸送通過，即從鞏膜的外部通過。短語“免疫球蛋白單可變域”是指特異性地結(jié)合到獨立于不同V區(qū)或域的抗原或表位的抗體可變域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白單可變域可以與其它不同的可變區(qū)或可變域的形式(例如同源或異源多聚體)存在，其中，通過單個免疫球蛋白可變域的抗原結(jié)合不需要所述的其它的區(qū)或域(即免疫球蛋白單可變域獨立于其它的可變域結(jié)合抗原)?！坝蚩贵w”或“dAb”與本文所使用的術(shù)語能夠結(jié)合抗原的“免疫球蛋白單可變域” 一致。免疫球蛋白單可變域可以是人抗體可變域，但是也包括其它物種的單抗體可變域，如嚙齒目動物(例如在WO 00/29004中揭示的鉸口鯊和駱駝Vhh dAbs)。駱駝Vra是源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和駱馬的物種的免疫球蛋白單可變域多肽，其產(chǎn)生天然地缺少輕鏈的重鏈抗體。這種Vhh域可根據(jù)本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行人源化處理，根據(jù)本發(fā)明，這種域仍然被認(rèn)為是“域抗體”。本文使用的“Vh包括駱駝Vhh域”。本文使用的術(shù)語“抗原結(jié)合分子”是指抗體、抗體片段和能夠結(jié)合到靶標(biāo)的其它蛋白結(jié)構(gòu)?！坝颉笔钦郫B蛋白結(jié)構(gòu)，具有獨立于余下的蛋白的三級結(jié)構(gòu)。一般地，域負(fù)責(zé)蛋白的離散的功能特性，在很多的情況下可加入、移除或轉(zhuǎn)移到其它的蛋白上，而不損失該蛋白和 /或域的余下部分的功能。“單抗體可變域”是折疊的多肽域，其包括抗體可變域的序列特征。因此，它包括完整的抗體可變域和修飾的可變域，例如，其中的一個或多個環(huán)已經(jīng)被非特征性的抗體可變域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗體可變域，以及可變域的折疊片段取代，所述折疊片段至少保留結(jié)合活性和全長域的特異性。本文使用的術(shù)語“光散射技術(shù)”是指用來確定溶液中的小粒子的粒度分布特征的方法-光散射技術(shù)的一個例子是可用來測量納米粒子的動態(tài)光散射，光散射的另一例子是可用于測量微球體的靜態(tài)光散射或小角度光散射。本位使用的術(shù)語“動態(tài)光散射”(DLQ是使用通過粒子分散利用散射光以得出粒度的信息的方法。動態(tài)光散射取決于這樣的事實，即當(dāng)在液體懸液中時，粒子的Browian運動依賴粒度，且粒子的Browian運動使來自粒子樣品的散射光的強度產(chǎn)生波動。通過相關(guān)的函數(shù)分析這些波動，以得出粒徑。接著利用斯托克斯-愛因斯坦方程算出粒子的平均流體力學(xué)直徑?！岸嘀笖?shù)分析”可得出粒度分布，可確定不同樣品內(nèi)部的不同物種的存在。DLS通?？捎糜诩{米粒子的分析。整份說明書中可換用的術(shù)語“靜態(tài)光散射”或“小角度激光光散射”有時是指激光衍射。激光衍射依賴的是衍射角與粒度成反比的事實。該方法使用全米氏理論，其完全解答了光與物質(zhì)的相互作用的方程。激光衍射可用來分析納米粒子和微粒子(直徑為 0. 02-2000 微米)。本文使用的術(shù)語“血腦屏障”(BBB)是指主要保護腦不受血液中的化學(xué)物質(zhì)影響， 但仍允許基礎(chǔ)代謝功能的膜結(jié)構(gòu)。它由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成，其在腦毛細(xì)血管中緊密聚集。與身體其它任何部位的毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞相比，這種較高的密度更能限制物質(zhì)從血流通過。在整篇說明書中，藥物載入的百分比定義為在粒子制劑中使用的每份物料的重量 (聚合物重量)中含有的藥劑的重量百分比w/V。藥物載入(藥物重量/粒子制劑中使用的物料重量)XlOO %。在整篇說明書中，參考多個實施方式以清楚簡潔的語言描述了本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，在不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)實施方式可有多種組合或者分開使用。
實施例
實施例1通過HIP方法制備PBCA納米粒子通過在含有溶解的HIP離子(在Iml 二氯甲烷中的多庫酯鈉，3. 058-6. 116% w/v) 的有機相中加入ΙΟΟμΙ BCA單體以制備納米粒子。將得到的溶液經(jīng)移液器移入水相(1% w/v 葡聚糖，0.2% pluronic F68, IOml, ρΗ7· 0)中，使用 Silveron L4RT 均化器以 7000 的速度進行均化處理。接觸中性PH的水相使BCA單體快速聚合形成PBCA聚合物。將形成的乳液均化處理45秒，接著在通風(fēng)櫥中孵育3小時，使有機相蒸發(fā)并形成納米粒子。將得到的納米粒子懸液在4°C下儲存。實施例2通過動杰光散射確認(rèn)納米粒子形成使用動態(tài)光散射(DLQ通過測量粒度來確認(rèn)經(jīng)HIP方法形成的PBCA納米粒子。使用Broolihaven儀器公司微粒粒度分析儀(BIC 90plus)來分析粒子。圖1所示為經(jīng)DLS得到的粒度數(shù)據(jù)，表明懸液中有納米粒子存在。通過DLS得到的粒度表明形成了平均流體力學(xué)直徑為的納米粒子(圖la)。也發(fā)現(xiàn)粒子群是相對單分散的，而測量樣品中的粒度范圍有多寬的多分散指數(shù)為O.M2(圖la)。這低于粒子制劑的最大的可接受值0.300。 一般而言，該相關(guān)圖確認(rèn)了粒子制備方法已經(jīng)成功地產(chǎn)生了高質(zhì)量的PBCA納米粒子懸液。得到的數(shù)據(jù)表明大多數(shù)的粒子是小的(圖lb-d)。結(jié)果表示，約96. 3%的粒子群的直徑為210. 37nm或更小(圖lb)。還發(fā)現(xiàn)懸液似乎也沒有大的聚集塊，且不含有直徑大于732. 05nm的任何粒子，大多數(shù)的粒子群顯然更小(圖Ic)。此外，該制劑看來還不含直徑小于143. 38nm的任何粒子(圖Id)。因此，大多數(shù)粒徑在143. 38nm_210. 37nm之間，一種靜脈給藥的安全粒度，但不是非常的小，以至于減小藥物加載的效率。圖1(a)-通過動態(tài)光散射對納米粒子懸液分析后獲得的相關(guān)圖。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，粒子的平均流體力學(xué)直徑為4nm，多分散指數(shù)為0. 2420圖1(b)-納米粒子的多模態(tài)粒度分布(得到的數(shù)據(jù))，繪圖以描述粒子群(數(shù)量) 相對于粒度范圍的分布。數(shù)據(jù)表明96. 3%的粒子群的直徑似乎為201. 37nm或更小。圖1(c)-納米粒子的多模態(tài)粒度分布(得到的數(shù)據(jù))，繪圖以描述粒子群(數(shù)量) 相對于粒度范圍的分布。數(shù)據(jù)表明96. 3%的直徑為201. 37nm或更小，100%的粒子樣品的直徑為732.05nm或更小。因此，懸液中沒有發(fā)現(xiàn)大的聚集塊，且因而認(rèn)為對靜脈給藥是安全的。圖1(d)-納米粒子的多模態(tài)粒度分布(得到的數(shù)據(jù))，繪圖以描述粒子群(數(shù)量) 相對于粒度范圍的分布。數(shù)據(jù)表明6. 2%的粒子樣品直徑為143. 38nm或更小。當(dāng)制備不同的納米粒子制劑時，還發(fā)現(xiàn)該方法得到了相似的納米粒子粒度。表1 總結(jié)了一系列的從6個不同的組合物制劑得到的粒度數(shù)據(jù)
1權(quán)利要求
1.一種在微粒載體中囊封生物活性劑的方法，包括以下步驟a)在疏水離子配對(HIP)試劑存在下使生物活性劑在有機溶劑中溶解以形成有機相；b)使聚合物形成物質(zhì)的單體或寡聚體溶解于(a)中形成的有機相中；c)在連續(xù)水相中形成在(b)中形成的有機相的乳液，以使單體聚合；以及d)得到從乳液中形成的微粒載體。
2.一種在微粒載體中囊封生物活性劑的方法，包括以下步驟a)使在水相中的生物活性劑與在有機溶劑相中的疏水離子配對(HIP)試劑混合，以形成生物活性劑-HIP復(fù)合物；b)從水相中分離復(fù)合物；c)除去水相，并使復(fù)合物與有機相均化；d)(i)使聚合物溶解于(c)中形成的有機相，然后在連續(xù)水相中形成有機相的乳液；或者( )使聚合物形成物質(zhì)的單體或寡聚體溶解于(c)中形成的有機相中，然后在連續(xù)水相中形成有機相的乳液，以允許單體或寡聚體聚合形成聚合物；以及e)得到從步驟(d)中的乳液中形成的微粒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的單體包含氰基丙烯酸烷基酯 (ACA)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的單體包含氰基丙烯酸丁酯(BCA)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚-L-交酯 (PLA)、聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)或聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)或聚己酸內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯和/或其共聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚己酸內(nèi)酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚(丙交酯-乙交酯) 共聚物(PLG)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚-L-交酯(PLA)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述連續(xù)水相的pH為約6或更高。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，所述的微粒載體是納米粒子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑是蛋白或肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑是抗原結(jié)合分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原結(jié)合分子包括域。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原結(jié)合分子是抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原結(jié)合分子是域抗體。
16.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述的生物活性劑在沒有疏水離子配對試劑存在的條件下不溶于有機相中。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，當(dāng)生物活性劑是陽離子時， 所述的HIP試劑是陰離子HIP試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的HIP試劑是多庫酯鈉。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，當(dāng)生物活性劑是陰離子時，所述的HIP試劑是陽離子HIP試劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述的HIP試劑是二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDAB18)、1，2-二油?；趸?3-三甲銨丙烷(DOTAP)、或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。
21.一種微粒載體，其特征在于，該微粒載體包括由前述任意一項權(quán)利要求所述的方法可得到的囊封的生物活性劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微粒載體，其特征在于，所述的蛋白與聚合物的比例至少是約1. 0% w/w，或至少約2. 5% w/w或者至少是約5% w/w。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微粒載體，其特征在于，所述的肽與聚合物的比例至少是約5% w/w,或至少約9% w/w。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微粒載體，其特征在于，所述的抗體與聚合物的比例至少是約w/w，或至少約2. 5% w/w。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微粒載體，其特征在于，納米粒子中所述的域抗體與聚合物的比例至少是約5% w/w。
26.—種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包括權(quán)利要求21-25中任一項所述的微粒載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物在治療或預(yù)防疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供使用Hip試劑將生物活性劑(如蛋白)囊封在微粒載體(如納米粒子)中的多種方法。本發(fā)明還提供包括利用這些方法可得到的微粒載體的組合物以及這些組合物在治療中的用途。
文檔編號A61K9/51GK102215830SQ200980126814
公開日2011年10月12日 申請日期2009年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日
發(fā)明者I·帕帕尼科勞烏 申請人:葛蘭素集團有限公司