專利名稱：熱休克蛋白結(jié)合化合物、組合物以及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由本文揭示的通式表示的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽；含有所述化合物的醫(yī)藥組合物；制備所述化合物的方法；使用所述化合物治療和/或預(yù)防各種惡性腫瘤或增生性病癥的方法；使用所述化合物鑒別治療和/或預(yù)防各種惡性腫瘤或增生性病癥的物質(zhì)的方法；使用所述化合物鑒別用于臨床研發(fā)治療和/或預(yù)防各種惡性腫瘤或增生性病癥的物質(zhì)的生物標(biāo)記物的方法；和使用所述化合物鑒別其在組合療法中的合理使用的方法。具體地說，本發(fā)明涉及作為熱休克蛋白70(Hsp70)的小分子調(diào)節(jié)劑的化合物。在另一實施例中，本發(fā)明涉及占據(jù)位于Hsp70核苷酸結(jié)合部位外部的Hsp70變構(gòu)袋的小分子以及鑒別、表征和使用所述小分子的方法。
背景技術(shù)：
癌細(xì)胞常常高水平表達(dá)若干熱休克蛋白(HSP)，這些熱休克蛋白加強(qiáng)這些腫瘤的攻擊性，并且也允許所述細(xì)胞在致命條件(包括被療法殺死)中存活下來。除了賦予治療抗性以外，升高的HSP表達(dá)也通過抑制程序性細(xì)胞死亡以及促進(jìn)自主性生長促進(jìn)癌癥。主要的HSP為Hsp90和Hsp70，它們是以相互關(guān)聯(lián)但又不同的方式起作用以調(diào)控惡性表型的蛋白質(zhì)。Hsp90維持若干致癌蛋白的轉(zhuǎn)化能力，其中HER2、AKT、RAFU IGF-IR和HIF-I的功能由Hsc70、組成性Hsp70、誘導(dǎo)性Hsp70同功異型物促進(jìn)。在抑制Hsp90時，Hsp90客戶(client)致癌蛋白變得不穩(wěn)定并通過蛋白酶體通路降解(圖Ia)。轉(zhuǎn)錄因子HSF-I (熱休克反應(yīng)的主調(diào)控子)是另一個Hsp90客戶，并且不像致癌蛋白，其在Hsp90受到抑制時變得活化。HSF-I活化引起Hsp70含量升高，此為某些腫瘤中限制Hsp90抑制劑效力的反饋反應(yīng)。Hsp70本身是一種強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡分子，表明通過增加Hsp70含量抑制內(nèi)在與外在細(xì)胞凋亡通路可減弱Hsp90抑制的作用。除了抑制細(xì)胞凋亡以及幫助Hsp90以外，Hsp70和其高度同源的胞質(zhì)同功異型物提供許多其它重疊的伴侶蛋白功能并在一些情況下可相互替代。Hsp90多伴侶蛋白復(fù)合物(又稱Hsp90超級伴侶蛋白(super-chaperone)機(jī)構(gòu))通過調(diào)控驅(qū)動和支持若干惡性腫瘤的客戶蛋白而在致病性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Hsp90多伴侶蛋白系統(tǒng)的活性通過伴侶蛋白的復(fù)雜系統(tǒng)維持和實現(xiàn)。Hsp70(組成性表達(dá)的Hsc70和熱誘導(dǎo)性Hsp70-1和Hsp70-6)參與初始步驟，而Hsp90參與后期階段(圖Ia)。它們的功能需要大量的輔助伴侶蛋白，例如Hsp70-調(diào)控子、Hsp40、Hspll0、BAG和HIP ；HSP組織蛋白(HOP)(參與使客戶從Hsp70傳到Hsp90的中間分子伴侶蛋白復(fù)合物的形成)，以及其它，例如P23、cdc37和免疫親和素(在最終或成熟Hsp90復(fù)合物上起作用)(圖Ia)。用通過直接結(jié)合于Hsp90的調(diào)控腺苷三磷酸酶袋起作用的藥劑(例如格爾德霉素(geldanamycin，GM)以及PU衍生物PU24FC1和PU-H71 (圖Ib))抑制Hsp90機(jī)構(gòu)干擾成熟復(fù)合物的形成，將客戶蛋白引向蛋白酶體降解(圖la)。有趣的是，據(jù)報導(dǎo)Hsp90的活性降低而非Hsp70或輔助伴侶蛋白H0P、HIP、p23和Hsp40表達(dá)的降低顯著活化HSF-I。此觀測結(jié)果的一個值得關(guān)注的結(jié)果是不像Hsp90機(jī)構(gòu)的致癌蛋白客戶，HSF-I活化無需Hsp70。雖然直接Hsp90抑制的重要性現(xiàn)已充分了解，并且目前已在多種癌癥的臨床評估中用于研發(fā)小分子抑制劑，但是關(guān)于干預(yù)Hsp90機(jī)構(gòu)活性的替代方式所知甚少。以除直接Hsp90抑制以外的方式干擾伴侶蛋白機(jī)構(gòu)可區(qū)分其若干功能，并賦予特定的生物活性
發(fā)明內(nèi)容

總之，考慮到癌癥中HSP之間的復(fù)雜相互影響以及腫瘤細(xì)胞對這些蛋白質(zhì)的內(nèi)在依賴性，并不意外在抑制一種HSP時，細(xì)胞發(fā)展通過另一種HSP的作用來平衡此功能喪失的機(jī)制。因此，例如本文的本發(fā)明中所描述的同時靶向一種以上HSP的方法較可能進(jìn)行成功治療。因此，本發(fā)明提供通過特異性調(diào)節(jié)Hsp70伴侶蛋白來區(qū)分Hsp90分子機(jī)構(gòu)的兩種功能(即調(diào)控致癌蛋白和抑制HSF-1)的化合物和方法。本文描述新穎化合物以及其制備和使用方法。在本發(fā)明的一個實施例中，本文描述的化合物可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，例如抑制惡性細(xì)胞和/或增加針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在另一實施例中，本文描述的化合物可充當(dāng)熱休克蛋白70(Hsp70)調(diào)節(jié)劑。因而，發(fā)現(xiàn)使用這些或其它化合物在藥理學(xué)上調(diào)節(jié)Hsp70在癌細(xì)胞中具有重要且廣泛有益的影響。在其它實施例中，本文描述的化合物可在不破壞或降解非致癌激酶的情況下破壞Hsp90機(jī)構(gòu)/致癌蛋白復(fù)合物的形成，引起若干致癌蛋白的蛋白酶體降解。在其它實施例中，本文所述化合物的抗癌作用可包含例如抑制增殖、轉(zhuǎn)化特異性阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或降低侵襲性。在本發(fā)明的另一實施例中，描述如本文所述的重要活性可通過以不可逆或可逆結(jié)合模式相互作用的物質(zhì)組合物實現(xiàn)。在一個具體實施例中，這些化合物與Hsp70相互作用。在另一實施例中，其與本文描述的在Hsp70上的變構(gòu)部位相互作用。在一個實施例中，提供人類Hsp70的同源模型。在本發(fā)明的另一實施例中，使用所述同源模型合理設(shè)計調(diào)節(jié)哺乳動物Hsp70活性的化合物。此同源模型將適用于通過包括(但不限于)合理藥物設(shè)計和虛擬篩選在內(nèi)的方法發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物。在其它實施例中，提供位于Hsp70和Hsc70核苷酸結(jié)合部位外部的變構(gòu)袋(allosteric pocket)。此袋的天然或合成小分子配體未知。在其它實施例中，提供用小分子配體占據(jù)此袋將會例如抑制增殖、轉(zhuǎn)化特異性阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或降低侵襲性。此袋將適用于發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物。候選化合物可通過若干方法用計算機(jī)提供。所述方法的實例包括將分子片段組裝成候選化合物；重新設(shè)計候選化合物；修飾已知結(jié)合于此部位的化合物，包括本文描述的組合物，以形成候選化合物；以及(并非最后地)篩選候選化合物的數(shù)據(jù)庫。根據(jù)另一實施例，尚無已知天然存在或合成產(chǎn)生的配體的Hsp70蛋白中的空腔在被如本文所述的本發(fā)明化合物以對正常細(xì)胞無毒的劑量占據(jù)時抑制惡性細(xì)胞生長、抑制異常細(xì)胞周期進(jìn)程、降解和抑制若干致癌蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及降低癌細(xì)胞的侵襲潛能。根據(jù)另一實施例，其它小分子配體以對正常細(xì)胞無毒的劑量占據(jù)此尚未探測到的袋將引起所有以下作用或其子集(但不限于)抑制惡性細(xì)胞生長、抑制異常細(xì)胞周期進(jìn)程、降解和抑制若干致癌蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低癌細(xì)胞的侵襲潛能。在其它實施例中，提供發(fā)現(xiàn)占據(jù)此袋的配體的方法。在其它實施例中，提供用小分子配體占據(jù)此袋將會導(dǎo)致Hsp90與Hsp70致癌通路的雙重抑制。此處描述的Hsp70中的新穎結(jié)合空腔和相互作用模式也代表設(shè)計具有類似作用機(jī)制和治療用途的抑制劑的一個有價值的出發(fā)點。雖然每次靶向一種HSP具有其明顯的治療意義，但是本文提供的實施例顯示，通過同時抑制Hsp70與Hsc70，可獲得抑制Hsp90的有益作用，即耗盡腫瘤中驅(qū)動例如增殖、存活和轉(zhuǎn)移等惡性過程的致癌蛋白，并獲得抑制Hsp70的細(xì)胞凋亡作用。最后，一個實施例描述一種抑制位于Hsp70和Hsc70核苷酸結(jié)合部位外部的變構(gòu)袋的新穎癌癥靶向策略。在本發(fā)明的其它實施例中，提供包含以本文描述的本發(fā)明化合物在癌細(xì)胞中的重要且廣泛有益的影響來評估候選化合物起作用能力的若干方法中的一者或一者以上的策 略。所述策略包括在所選癌細(xì)胞中測試本文描述的表型結(jié)果，執(zhí)行競爭性熒光偏振檢驗以測試如本文所述的Hsp90和Hsp70結(jié)合，以及用計算機(jī)評估候選化合物在本文提及的袋中的結(jié)構(gòu)匹配。所述表型測試包括(但不限于)測試一大組癌細(xì)胞中的生長抑制、HER2+SKBr3乳癌細(xì)胞中的HER2和Raf-I降解、M0LM-13AML細(xì)胞中的FLT3和p_STAT5失活、MDA-MB-468三重陰性乳癌細(xì)胞中的P-STAT3和p-PDKl失活、LNCaP前列腺癌細(xì)胞中突變的AR降解、一大組癌細(xì)胞中的PARP裂解、M0LM-13細(xì)胞中的卡斯蛋白酶(caspase)3，7活化、乳癌細(xì)胞中干擾素和TNF細(xì)胞凋亡作用的加強(qiáng)和一大組癌細(xì)胞中Hsp70誘導(dǎo)的缺乏。Hsp70和Hsp90競爭性檢驗測試候選化合物與癌細(xì)胞中表達(dá)的HSP的競爭性結(jié)合。在其它實施例中，顯示本文描述的化合物使與致癌客戶蛋白貨物(cargo)形成復(fù)合物的Hsp70分離。因此本文所述化合物的固體支撐物固定型式賦予研究內(nèi)源細(xì)胞環(huán)境中癌癥的Hsp70相互作用組的新穎可能性。在其它實施例中，本文描述的本發(fā)明化合物也可衍生化以形成含有生物素的化合物，其可附接到抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白珠粒，或可直接連接到相應(yīng)官能化的樹脂，例如(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和基質(zhì)膠樹脂。在另一實施例中，本文描述的化合物可用例如(但不限于)Cy3B、FITC和BODiPY等熒光染料衍生化。當(dāng)在本文描述的熒光偏振檢驗的背景下使用時，此化合物可用于篩選以類似于本文描述的本發(fā)明化合物的方式與Hsp70相互作用的候選化合物。在其它實施例中，使用本文描述的固體支撐物固定的化合物來鑒別致癌活化的通路的不同腫瘤的組分與Hsp70形成復(fù)合物。將本文描述的組合物加入特定癌細(xì)胞中使這些復(fù)合物不穩(wěn)定、致癌蛋白降解或抑制以及癌細(xì)胞生長抑制和死亡。腫瘤Hsp70抑制的這些下游事件可用于在功能上監(jiān)測本文描述的本發(fā)明化合物的作用。因此本文描述的方法有效地分析與對所述本發(fā)明的化合物和通過占據(jù)本文描述的變構(gòu)袋起作用或通過本文描述的檢驗鑒別的其它療法的反應(yīng)相關(guān)的功能分子生物標(biāo)記物。提出這些生物標(biāo)記物適用于臨床研發(fā)本文描述的物質(zhì)組合物、占據(jù)本文描述的袋的物質(zhì)組合物或通過本文描述的檢驗鑒別的物質(zhì)組合物。有趣的是，只有Hsp90的活性降低，而非其Hsp90機(jī)構(gòu)輔助伴侶蛋白(例如Hsp70或HOP、HIP、p23或Hsp40)的活性降低可顯著活化HSF-1，并且使用本發(fā)明的化合物，有可能通過特異性調(diào)控其輔助伴侶蛋白區(qū)分分子機(jī)構(gòu)的兩種功能。不像直接Hsp90抑制劑，本發(fā)明的化合物可能例如既不活化HSF-1，也不誘導(dǎo)保護(hù)性反饋熱休克反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施例中，化合物在不活化HSF-I和/或不誘導(dǎo)保護(hù)性反饋熱休克反應(yīng)的情況下破壞Hsp90機(jī)構(gòu)/致癌蛋白復(fù)合物的形成。當(dāng)與直接Hsp90抑制相比時，在一些實施例中藥理學(xué)投予所述化合物例如因細(xì)胞凋亡而增加針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但具有選擇性。藥理學(xué)抑制Hsp70的生物學(xué)影響已經(jīng)通過使用本發(fā)明的化合物在惡性細(xì)胞中得到表征。已發(fā)現(xiàn)Hsp70調(diào)節(jié)乳癌細(xì)胞中STATl腫瘤抑制子的脫磷酸化，此為使STATl腫瘤抑制子失活的新穎機(jī)制。在本發(fā)明的另一實施例中，本文描述的化合物抑制乳癌細(xì)胞中STATl脫磷酸化的Hsp70加速作用或使其失活，從而通過腫瘤抑制子STATl的持續(xù)活性促進(jìn)腫瘤抑制。
STATl是干擾素-(IFN) y信號傳導(dǎo)的主要效應(yīng)物。IFNy是T細(xì)胞和自然殺手細(xì)胞所產(chǎn)生的具有防御腫瘤發(fā)生的必要免疫刺激功能的細(xì)胞因子。在另一實施例中，發(fā)現(xiàn)本文提供的目標(biāo)組合物加強(qiáng)IFN y和另一個細(xì)胞因子TNF a的作用并允許免疫反應(yīng)更有效地除掉腫瘤。此對于疫苗療法試驗來說是令人興奮的發(fā)現(xiàn)，表明共投予生物活性干擾素與本文描述的本發(fā)明化合物(即占據(jù)所述袋的本發(fā)明化合物或通過本文描述的檢驗鑒別的本發(fā)明化合物)，可提高疫苗功效并允許使用更小的接種劑量。


圖I. Hsp90機(jī)構(gòu)伴侶循環(huán)(chaperoning cycle)的各個方面。a)Hsp90伴侶循環(huán)是一個動態(tài)過程，其中客戶蛋白呈遞到含有Hsp70、Hsp40、HIP和HOP的中間復(fù)合物中的Hsp90。在ATP結(jié)合和水解后，Hsp90形成含有p23、p50/cdc37和免疫親和素(IP)的成熟復(fù)合物，其催化Hsp90客戶蛋白的構(gòu)型成熟。例如格爾德霉素(GM)以及嘌呤骨架衍生物PU-H71和PU24FC1等Hsp90抑制劑藥物結(jié)合于Hsp90的N端ATP結(jié)合袋并抑制ATP結(jié)合和水解，從而鎖住中間復(fù)合物中的Hsp90?？蛻舻鞍纂S后泛素化(可能通過例如CHIP等E3泛素連接酶)并成為蛋白酶體的靶而降解。此為基于一種當(dāng)前對所述過程的了解的示意圖。b)代表性Hsp90抑制劑的結(jié)構(gòu)。圖2. YK類Hsp70相互作用子和YK5_Hsp70復(fù)合物的計算機(jī)模型的設(shè)計。a)Hsp70的假定結(jié)合部位是通過美濤(Maestro) 8. 5的部位地圖(SiteMap) 2. 2版程序(紐約薛定諤制藥軟件公司(SchTOdinger L. L. C.，NY))預(yù)測。部位地圖經(jīng)配置以達(dá)到根據(jù)部位評分(Site score)和成藥性評分(Druggability score)排列的5個可能部位。在此研究中，部位地圖的所有其它參數(shù)都設(shè)為缺省值。所呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)是使用人類Hsp70N端結(jié)構(gòu)域(PDB ID 1S3X)、大腸桿菌(E. Coli) DnaK (PDB ID 2kho)和人類Hsp70蛋白質(zhì)序列構(gòu)筑的同源模型。若干基于2，5'-硫代二嘧啶骨架的化合物(右)經(jīng)合理設(shè)計以與Hsp70相互作用。2，5'-硫代二嘧啶骨架用粗體鍵呈現(xiàn)以便識別。b)半胱氨酸修飾的小分子蛋白質(zhì)相互作用子的結(jié)構(gòu)。丙烯酰胺官能被團(tuán)圈出以便識別。c)如通過使用美濤8. 5和格萊德(Glide)4.0(薛定諤(SchfMinger))進(jìn)行分子建模所揭露的所提出的YK5與人類Hsp70同源模型的相互作用。圖3.發(fā)現(xiàn)YK5的測試策略。a、b) SKBr3細(xì)胞用所指示濃度的抑制劑處理24小時并溶解細(xì)胞以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(western blot,WB)分析。P _肌動蛋白用作內(nèi)部對照。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n ^ 3)獲得的數(shù)據(jù)一致。c)所指示抑制劑在SKBrf細(xì)胞提取物中與GM-Cy3B競爭結(jié)合Hsp90的能力是通過熒光偏振檢查。在加有抑制劑的孔中記錄的值相對于在對照孔中讀取的值標(biāo)準(zhǔn)化并相對于所測試抑制劑的濃度作圖。藥物一式三份進(jìn)行檢驗。所有化合物都以DMSO儲備液形式使用。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。d)生長抑制SKBr3細(xì)胞一式三份與遞增濃度的化合物一起培育，并評估經(jīng)72小時的生長情況。低于0%的Y軸值表示起始群體細(xì)胞死亡。HER2降解如圖a)中所分析，并通過光密度法定量凝膠。記錄的值相對于對照(僅經(jīng)媒劑處理的細(xì)胞)標(biāo)準(zhǔn)化并且數(shù)據(jù)相對于YK5濃度作圖。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)。圖4. YK5選擇性地與Hsp70和Hsc70相互作用。a)生物素標(biāo)記的YK5的結(jié)構(gòu)。b)K562細(xì)胞用所指示濃度的YK55處理6小時，接著溶解，并在4°C下使蛋白質(zhì)復(fù)合物在抗生蛋白鏈菌素珠粒(50iU)上沉淀，保持I小時。珠粒用高鹽(1M NaCl)緩沖液洗滌，蛋白質(zhì)通過在2% SDS中煮沸洗脫，在變性凝膠上分離并進(jìn)行銀染色。BB70Ab下拉(pull-down) 用以指示Hsp70的位置(BB70IP ;2 ill)。此抗體識別若干Hsp70同功異型物，例如Hsp70、Hsc70、Grp75和Grp78。HC =重鏈。c) SKBr3細(xì)胞用所指示濃度的YK5處理24小時并溶解細(xì)胞。利用化學(xué)沉淀，通過將細(xì)胞提取物(500 iig)與YK55-珠粒(50 ill) —起培育，分離出蛋白質(zhì)復(fù)合物，用2% SDS洗脫，在變性凝膠上分離并如所指示觀察。YK55珠粒通過將YK55(50iiM)與抗生蛋白鏈菌素珠粒(50 yl) —起培育來制備。d)來自SKBr 3細(xì)胞提取物(500 u g)的蛋白質(zhì)復(fù)合物通過用YK55-珠?；蚨栊苑肿覦-生物素化學(xué)沉淀來分離。珠粒是通過將所指示濃度的YK55或D-生物素與抗生蛋白鏈菌素珠粒(50iU) —起培育來制備。接著蛋白質(zhì)在變性凝膠上分離并通過蛋白質(zhì)印跡法分析。e)用YK55-珠粒(IOOiiMYK55加入50 u I抗生蛋白鏈菌素珠粒中)或Hsp70Ab (5 u I Ab加入30 蛋白G珠粒中)從SKBr3提取物(500 u g)沉淀的Hsp70復(fù)合物通過WB來分析。HC =重鏈(左)。探查Hsp/c70含量分別通過BB70Ab或IgG免疫沉淀降低的SKBr3細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)復(fù)合物與YK55珠粒的結(jié)合。蛋白質(zhì)通過WB分析(右)。f) SKBr3提取物與所指示濃度的YK5 —起在4°C下培育3小時，接著Hsp70復(fù)合物在YK55-珠粒(100 u M YK55加入50 U I抗生蛋白鏈菌素珠粒中)上沉淀。蛋白質(zhì)通過WB分析。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n ^ 3)獲得的數(shù)據(jù)一致。圖5. YK5在結(jié)合于Hsp70時與Cys267形成共價鍵。a) K562細(xì)胞用YK55 (25 y M)處理所指示的時間，接著溶解，并在4°C下使蛋白復(fù)合物在抗生蛋白鏈菌素珠粒(50 iU)上沉淀，保持I小時。珠粒用高鹽(1M NaCl)緩沖液洗滌，蛋白質(zhì)通過在2% SDS中煮沸洗脫，在變性凝膠上分離并進(jìn)行銀染色。BB70Ab下拉用以指示Hsp70的位置(BB70IP ;2iil)。此抗體識別Hsp70、Hsc70、Grp75和Grp78。HC =重鏈。b)實驗設(shè)置類似于圖a)，但蛋白質(zhì)通過WB分析。c)K562細(xì)胞用YK55或D-生物素(50 u M)處理6小時并溶解。提取物(500 u g)與抗生蛋白鏈菌素(ST)-珠粒一起在4°C下培育I小時并且下拉物用高鹽緩沖液(1M NaCl)洗滌。蛋白質(zhì)通過在如方法中所述的緩沖液A或B中煮沸來洗脫。在變性凝膠上分離后，蛋白質(zhì)通過WB進(jìn)行觀察。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n彡2)獲得的數(shù)據(jù)一致。d)YK55結(jié)合于癌細(xì)胞中的Hsp70的MALDI-reTOF-MS/MS分析。K562細(xì)胞用100 u M YK55處理4小時并溶解。經(jīng)YK55處理的細(xì)胞提取物(500 iig)與抗生蛋白鏈菌素瓊脂糖珠粒一起在4°C下培育I小時。珠粒用高鹽緩沖液(IMNaCl)洗滌，蛋白質(zhì)通過在2% SDS中煮沸洗脫，在變性凝膠上分離并進(jìn)行庫馬斯(Coomassie)染色。凝膠解析的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化并且肽如方法中所指示來鑒別。圖6. YK5抑制Hsp70的核心生物化學(xué)功能并破壞Hsp90/Hsp70相互作用。a)測量在YK5 (100 u M)或媒劑存在下所指示的時間內(nèi)(左)或在所指示濃度的YK5存在下60分鐘時(右)在30°C下Hsc70和DJA2引起的變性熒光素酶的再折疊。b)測量在30°C下在媒劑(DMSO)或YK5 (IOOiiM)存在下與所指示的Hsc70和輔助伴侶蛋白的組合反應(yīng)的Hsc70腺苷三磷酸酶速率。ADP的產(chǎn)生通過放射性標(biāo)記的ADP從ATP的薄層色譜分離和磷屏成像分析(下)監(jiān)測。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n ^ 2)獲得的數(shù)據(jù)一致。c、d) SKBrf細(xì)胞用媒劑或所指示濃度的YK5處理24小時(c)或用YK5 (IOiiM)處理所指示的時間(d)。用抗Hsp90和Hsp70抗體(IP Hsp90或Hsp70)分離或細(xì)胞提取物(溶解產(chǎn)物)中存在的蛋白質(zhì)通過WB分析。結(jié)合特異性用對照IgG測試。HC =重鏈；DJA1和Hdjl = Hsp40同功異型 物。e)不像Hsp90抑制劑，YK5無法活化HSF-1。SKBr3細(xì)胞在42°C下熱休克45分鐘或與媒劑、YK5或PU24FC1 (5 u M) 一起培育3小時。蛋白質(zhì)被施加于非變性凝膠并通過免疫印跡分析。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n>3)獲得的數(shù)據(jù)一致。f)YK5在針對359種激酶的斯坎麥斯(scanMAX)篩選(安比公司(Ambit))中測試。呈現(xiàn)YK5的TREEspot 相互作用地圖。僅僅c-Met (激酶樹上的紅點)看似YK5的潛在低親和力激酶碰撞(hit)。圖7. YK5破壞Hsp90/Hsp70/致癌客戶蛋白復(fù)合物，導(dǎo)致致癌蛋白不穩(wěn)定，隨后被蛋白酶體降解。a) SKBr3細(xì)胞用YK5 (IOiiM)處理所指示的時間。用抗Hsp90抗體(IP:Hsp90)分離或細(xì)胞提取物(溶解產(chǎn)物)中存在的蛋白質(zhì)通過WB分析。結(jié)合特異性用對照IgG測試。HC=重鏈。b)SKBr3細(xì)胞在媒劑(DMSO)或YK5(10iiM)存在下用蛋白質(zhì)生物合成抑制劑放線菌酮(cycloheximide) (100 U g/ml)處理所指示的時間。WB分析后，蛋白質(zhì)表達(dá)通過光密度法定量并相對于處理時間作圖。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。c)如方法中所述，在加入YK5 (IOiiM)前，SKBr3細(xì)胞用所指示的蛋白質(zhì)水解機(jī)構(gòu)抑制劑預(yù)處理。處理24小時后，清潔劑可溶性與不溶性部分中的蛋白質(zhì)表達(dá)通過蛋白質(zhì)印跡法測定。單獨抑制劑對蛋白質(zhì)加工的作用呈現(xiàn)于右側(cè)圖中。 圖8. YK系列中的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。a) SKBr3乳癌細(xì)胞用所指示濃度的YK衍生物處理24小時并通過蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)。b)香澄-I (Kasumi-I)細(xì)胞與遞增濃度的YK衍生物一起培育并用如方法中所指示的阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)檢驗來分析細(xì)胞生長的抑制。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。低于0%的Y軸值表示起始群體細(xì)胞死亡。c)抗生蛋白鏈菌素珠粒(50 u I)與所指示濃度的YK55、YK56或D-生物素一起培育以將相應(yīng)化合物固定于珠粒上。珠粒(50 yl)用SKBr3細(xì)胞提取物(500 y g)探查，并且沉淀的Hsp70通過蛋白質(zhì)印跡法分析并通過劑量測定法定量。將來自三個獨立實驗的結(jié)果繪圖以確定YK的相對結(jié)合親和力。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。d)代表性YK的結(jié)構(gòu)。YK55和YK56分別是YK54和YK57的生物素標(biāo)記衍生物。圖9. (a)本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式降低過度表達(dá)SKBr3HER2的乳癌細(xì)胞中HER2和Raf-I致癌激酶的穩(wěn)態(tài)水平，并如PARP裂解所指示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞用所指示濃度的YK149和YK5處理24小時。溶解細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)。b)本發(fā)明化合物的實例抑制三重陰性乳癌細(xì)胞MDA-MB-468中致癌性STAT3的活性。細(xì)胞用化合物或媒劑處理所指示的時間且蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡法分析。(C)本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式誘導(dǎo)急性骨髓性白血病細(xì)胞M0LM13的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞用所指示濃度的化合物處理24小時，并測量卡斯蛋白酶3，7活性的增加并且與僅經(jīng)媒劑(DMSO)處理的細(xì)胞相比較。卡斯蛋白酶_3，7活性是化合物使卡斯蛋白酶底物Z-DEVD-Rl 10裂解和釋放若丹明(rhodamine)的效力的量度。通過比較從經(jīng)化合物處理的細(xì)胞獲得的熒光讀數(shù)與從經(jīng)媒劑(DMSO)處理的細(xì)胞獲得的熒光讀數(shù)，計算凋亡細(xì)胞的增加百分比。圖10. (a)本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式降低三重陰性乳癌細(xì)胞MDA-MB-468中Raf-I致癌激酶的穩(wěn)態(tài)水平，并如PARP裂解所指示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式降低過度表達(dá)SKBr3HER2的乳癌細(xì)胞中HER2和Raf-I致癌激酶的穩(wěn)態(tài)水平，并如PARP和卡斯蛋白酶-3裂解所指示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。未觀測到Hsp70的相關(guān)誘導(dǎo)。本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式降低表達(dá)M0LM-13突變體FLT3的急性骨髓性白血病細(xì)胞中FLT3和P-STAT5的穩(wěn)態(tài)水平。細(xì)胞用所指示濃度的化合物處理24小時或用所指示濃度的化合物處理所指示的時間。溶解細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)。(b)本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式誘導(dǎo)急性骨髓性白血病細(xì)胞M0LM13的細(xì) 胞凋亡。細(xì)胞用所指示濃度的化合物處理24小時，并測量卡斯蛋白酶3，7活性的增加并且與僅經(jīng)媒劑(DMSO)處理的細(xì)胞相比較?？ㄋ沟鞍酌竉3，7活性是化合物使卡斯蛋白酶底物Z-DEVD-Rl 10裂解和釋放若丹明的效力的量度。通過比較從經(jīng)化合物處理的細(xì)胞獲得的熒光讀數(shù)與從經(jīng)媒劑(DMSO)處理的細(xì)胞獲得的熒光讀數(shù)，計算凋亡細(xì)胞的增加百分比。圖11. (a)本發(fā)明化合物的實例以劑量依賴性方式降低過度表達(dá)SKBr3HER2的乳癌細(xì)胞中HER2和Raf-I致癌激酶的穩(wěn)態(tài)水平，并如PARP裂解所指示，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞用所指示濃度的藥劑處理24小時。溶解細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白質(zhì)。(b)在三重陰性乳癌細(xì)胞MDA-MB-468中，本發(fā)明化合物的實例抑制致癌性STAT3的活性，降低Raf-I的穩(wěn)態(tài)水平并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞用所指示化合物處理24小時或用所指示濃度的化合物處理所指示的時間，且蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡法分析。圖12. YK5影響癌癥的主要標(biāo)志抑制增殖和侵襲性以及使癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯。(a)所指示的癌細(xì)胞與遞增濃度的抑制劑一起培育并評估經(jīng)72小時的生長情況。低于0%的Y軸值表示起始群體細(xì)胞死亡。藥物一式三份進(jìn)行檢驗。(b)如方法中所述，向帶有體積達(dá)約100-200mm3的MDA-MB-468皮下(s. c.)異種移植腫瘤的小鼠(n = 5)的腫瘤內(nèi)(i.t)投予YK5或媒劑。腫瘤體積(mm3)由測徑規(guī)測量值估算。(c)細(xì)胞用所指示濃度的YK5處理24小時。DNA含量通過碘化丙啶染色和流式細(xì)胞術(shù)分析(左)，而蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡法分析(右)。(d)用YK55-珠粒從SKBr3和MDA-MB-468提取物(500 u g)分離的Hsp70客戶蛋白通過蛋白質(zhì)印跡法分析。對照珠粒含有附接的D-生物素(lOOiiM)。(e)MDA-MB-231乳癌細(xì)胞用YK5 (I y M)處理24小時并且蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行免疫印跡(上)或用媒劑或YK5預(yù)處理24小時，并定量能夠在20小時時間內(nèi)移動穿過基質(zhì)膠的活細(xì)胞并將數(shù)據(jù)繪圖(下)。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n ^ 3)獲得的數(shù)據(jù)一致。圖13.在所選腫瘤中YK5的細(xì)胞凋亡作用高于Hsp90抑制劑。(a_d)細(xì)胞用所指示濃度的抑制劑處理所提供的時間。(a、b)凋亡的細(xì)胞通過如方法中所述的吖啶橙/溴化乙啶雙重染色定量。(c、d)細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)記物(PARP裂解)是通過蛋白質(zhì)印跡法在用所指示濃度的抑制劑處理24小時的細(xì)胞中分析(c)或在用所指示濃度的抑制劑處理所指示的時間的細(xì)胞中分析⑷。(e)MDAMB-468細(xì)胞用媒劑、TNFa (20ng/ml), YK5 (I u M)處理，在TNF a前用YK5預(yù)處理2小時或共同處理，并溶解細(xì)胞以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(左)，或通過分析碘化丙啶染色后的亞二倍體群來定量細(xì)胞死亡(右)。數(shù)據(jù)與從多個重復(fù)實驗(n ^ 3)獲得的數(shù)據(jù)一致。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖14. YK5對腫瘤Hsp70具有較高親和力并選擇性地殺死癌細(xì)胞。(a_c)細(xì)胞用所指示濃度的抑制劑處理所提供的時間，且代謝的活細(xì)胞通過如方法中所述的阿爾瑪藍(lán)吸收來確定(a)。細(xì)胞凋亡的分子標(biāo)記物(PARP和卡斯蛋白酶-3裂解)是通過蛋白質(zhì)印跡法在用所指示濃度的抑制劑處理24小時的細(xì)胞中分析(b、C)。用媒劑或所指示抑制劑處理24小時的細(xì)胞的形態(tài)通過光學(xué)顯微術(shù)分析(c )。(d)提取物(500 u g)與含有D-生物素(75 u M)的珠粒或加入50 u I抗生蛋白鏈菌素珠粒中的所指示濃度的YK55 —起培育過夜。HS=熱休克。(e) SKBr3 (200 ii g)和MRC-5 (400 y g)提取物以及重組人類Hsp70 (2 y g)與所指示濃度的YK5 —起培育3小時，接著Hsp70復(fù)合物在YK55-珠粒(50 u M YK55加入50 U I抗生蛋白鏈菌素珠粒中)上沉淀。將從三個獨立實驗獲得的數(shù)據(jù)繪圖(右)。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖15.附接固體支撐物的YK5、YK55_珠粒以腫瘤特異性方式分離與致癌蛋白形成復(fù)合物的Hsp70。(a左和b)用YK55-珠?；駾-生物素-珠粒(100 u M YK55或D-生物素分別加入50iU抗生蛋白鏈菌素珠粒中)從所指示的細(xì)胞提取物(500 ii g)沉淀的Hsp70復(fù)合物通過WB分析。(a右)蛋白質(zhì)復(fù)合物與YK55珠粒的結(jié)合在Hsp/c70含量分別通過BB70Ab或IgG免疫沉淀降低的細(xì)胞提取物中探查。(c)細(xì)胞提取物與所指示濃度的YK5 —起在4°C下培育3小時，接著Hsp70復(fù)合物在YK55-珠粒(100 u M YK55加入50 U I抗生蛋白鏈菌素珠粒中)上沉淀。(d)YK5降低Hsp70調(diào)控的致癌蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。癌細(xì)胞用所指示濃度的YK5處理24小時并溶解細(xì)胞以進(jìn)行WB分析。P -肌動蛋白用作內(nèi)部對照。圖16. Hsp70競爭性熒光偏振檢驗。將遞增濃度的所指示抑制劑一式三份加入檢驗盤中，并如方法中所指示進(jìn)行熒光偏振(FP)檢驗。競爭作用表示為對照物的百分比并通過用各盤中來自抑制劑孔的毫偏振(mP ;減去游離cy3B-YK5)值除以來自對照物(cy3B_YK5和利用媒劑DMSO的細(xì)胞溶解產(chǎn)物)的平均mP (減去游離cy3B-YK5)計算。將配體結(jié)合相對于Iogltl抑制劑濃度作圖，并使用非線性最小二乘曲線擬合程序在普瑞姆(Prism)4.0中計算EC5tl值。點為平均值；棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖17. YK5鑒別STATl和STAT3為乳癌細(xì)胞中新穎Hsp70相互作用致癌產(chǎn)物。(a)YK55-珠粒而非生物素-珠粒識別MDA-MB-468提取物中與STATl和STAT3形成復(fù)合物的Hsp70 (左)。為研究YK5對STAT穩(wěn)態(tài)水平和活性的作用，細(xì)胞用媒劑(DMSO)或YK5 (10 u M)處理24小時(右)。(b)目標(biāo)實例組合物在三重陰性細(xì)胞MDA-MB-468中有效抑制STAT3。活化的STAT3是三重陰性乳癌中重要致癌通路的一部分。圖18. YK5揭露一種抑制STATl腫瘤抑制子促細(xì)胞凋亡作用的新穎機(jī)制。(a)YK55珠粒識別MDA-MB-468提取物(500 u g)中與p-STATl和STATl形成復(fù)合物的Hsp70。(b)蛋白質(zhì)復(fù)合物與YK55珠粒的結(jié)合在由BB70Ab或IgG免疫沉淀引起Hsp/c70水平降低的MDA-MB-468 細(xì)胞提取物中探查。(c)MDA-MB-468 細(xì)胞用媒劑、IFN y 100ng/ml)、YK5 (10 u M)處理7小時，在IFNy刺激前用YK5預(yù)處理2小時或共同處理，并溶解細(xì)胞以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。(d)細(xì)胞用IFN Y 100ng/ml)刺激，并且提取物(500 y g)中Hsp70/STAT1復(fù)合物通過分別使用D-生物素、YK55-珠粒和Hsp70Ab的化學(xué)和免疫沉淀分析。(e、f)細(xì)胞在YK5 (IOiiM)存在或缺乏下用IFNy刺激所示時間，并且其中加入或未加入如方法中所述的十字孢堿(staurosporine)或正I凡酸鹽。p-STATl的含量通過蛋白質(zhì)印跡法分析并通過劑量測定法定量。來自兩個重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)相對于治療時間作圖。圖19. YK5提高IFN y活化的STATl的核含量并增強(qiáng)其與DNA的結(jié)合。MDAMB-468細(xì)胞用IFNy (100ng/ml)處理或用IFNy (100ng/ml)和YK5 (IOyM)共同處理。(a)活化的STATl (pTyr701)通過免疫熒光顯微術(shù)，使用與FITC結(jié)合的二級抗體測定。核染色用DAPI進(jìn)行。(b)活化的STATl結(jié)合于STAT共同結(jié)合部位(5' -TTCCCGGAA-3')是通過基于ELISA的檢驗測定。含于未經(jīng)處理(白色棒)、經(jīng)YK5(淡灰色棒)、IFNy (深灰色棒)或IFN Y與YK5的組合(黑色棒)處理的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中且結(jié)合于寡核苷酸的活化的STATl是通過 使用抗STATl抗體檢測。檢驗是在缺乏或存在20pmol含有野生型或突變型STAT共同結(jié)合部位的競爭性寡核苷酸下使用經(jīng)IFN Y處理的細(xì)胞(深灰色棒)進(jìn)行。實驗是一式四份進(jìn)行。結(jié)果表示為平均吸光度值(0D450nm)加SEM。圖20.用YK5處理原代AML細(xì)胞。YK5殺死母細(xì)胞與癌干細(xì)胞，但未殺死正常細(xì)胞。細(xì)胞用遞增濃度的YK5處理24小時。(a-b)顯示相對于未經(jīng)處理的對照物的活力％?？招陌簟捌渌贝硗换颊咧械恼＜?xì)胞(非母細(xì)胞)，灰色棒母細(xì)胞(⑶45dim)，紅色棒白血病干細(xì)胞(LSC)(⑶34+⑶38-CD123+)。(c)用YK5處理原代AML細(xì)胞后CFU (集落形成單位)減少。、<0.001。圖21 :全長 hHsp70(SEQ ID NO: I)(寄存編號:P08107)、N 端 hHsp70 蛋白(SEQ IDNO 2) (PDB ID :1S3X)、大腸桿菌 Hsp70(DNAK)結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO 3) (PDB ID 2KH0)和秀麗隱桿線蟲(C. elegans) (PDB ID 2P32) (SEQ ID NO :4)的蛋白質(zhì)序列的比對。殘基批注加有下劃線并且保守殘基以類似顏色展現(xiàn)。界定變構(gòu)袋部位I的序列以盒顯示。這些序列中的重要氨基酸與本文設(shè)計的配體相互作用。
具體實施例方式定義本文中使用的術(shù)語“投予(administer、administering和 administration) ” 是指在合理醫(yī)學(xué)實踐中將組合物按一定方式遞送到個體以提供治療作用的任何方法。本文中使用的短語“衍生物”是指特定化合物或分子的任何水合物、溶劑化物、鹽、外消旋物、異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、前藥、代謝物、酯或其它類似物或衍生物。術(shù)語“衍生物”也可指對所揭示化合物的改性，包括(但不限于)所揭示化合物的水解、還原或氧化產(chǎn)物。水解、還原和氧化反應(yīng)是此項技術(shù)中已知的。術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指對生物體的生物活性、功能、健康或狀況產(chǎn)生影響的方法，其中以符合生物體的一般健康狀況和良好狀態(tài)的方式維持、增強(qiáng)、降低或治療所述生物活性、功能、健康或狀況。術(shù)語“增強(qiáng)”生物體的生物活性、功能、健康或狀況是指加強(qiáng)、強(qiáng)化、增強(qiáng)或改善的過程。本文中使用的短語活性劑或成分或者醫(yī)藥活性劑或成分的“有效量”或“治療有效量”在本文中同義，是指在投藥后足以具有治療作用的醫(yī)藥活性劑的量。醫(yī)藥活性劑的治療有效量可以、將會或預(yù)期會引起癥狀的緩解。醫(yī)藥活性劑的有效量將隨所治療的一種或一種以上具體病況、病況的嚴(yán)重程度、治療持續(xù)時間、所用組合物的具體組分等因素而變化。本文在定義式⑴和(I')時使用的短語“任何取代基”意思指可替代氫的任何取代基。在一些實施例中，本文在定義式(I)和(r )時使用的術(shù)語“任何取代基”是任選取代的直鏈或分支烷基、烯基或炔基；任選取代的碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或雜芳基；齒基；任選取代的c2_22酸基；輕基；硝基；氰基；芳氧基；燒氧基；i^'代燒氧基；烯氧基；輕基燒基；氣基；烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；芳基氨基；二芳基氨基；酰基氨基；氨甲酰基；取代或未取代的酰胺基；烷基酰胺基；烷基磺酰胺基；磺酰胺基；-NHS02烯基；-NHC0烯基；-NHC0炔基；_C0烯基；_C0炔基；三齒代烴；硫烷基；S02-烷基；-coo-烷基；_C0烷基；和烷基-CN ；或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽或其水合物。在其它實施例中，短語“任何取代基”是指包含可用于鑒別、追蹤和或分離化合物的標(biāo)記或標(biāo)記物基團(tuán)的取代基?？捎糜诒疚闹械臉?biāo)記基團(tuán)和標(biāo)記物基團(tuán)的非限制性實例包括例如熒光基團(tuán)、生物素基團(tuán)、抗生物素蛋白基團(tuán)和酶連接基團(tuán)。
在命名取代基選擇時，例如對于下文的Z和W1-W4，名稱是指直接附接到中心結(jié)構(gòu)的基團(tuán)的類型，且不排除附接到基礎(chǔ)取代基的額外官能團(tuán)。因此，術(shù)語“烷基”是指任選取代的直鏈、環(huán)狀或分支狀飽和烴基，其中附接到結(jié)構(gòu)其余部分的原子是碳原子。烷基可具有I到24個碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、羊基、癸基、十四燒基、十TK燒基、_■十燒基、_■十四燒基等。優(yōu)選本文中的“烷基”含有I到12個碳原子?！暗图壨榛笔侵妇哂蠭到6個，更優(yōu)選具有I到4個碳原子的燒基。燒基可具有取代基，例如齒素、輕基、燒氧基、氣基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、磺酰氨基、磺酰胺基、硫氧基、芳基、氰基、羧基、羧酰胺、?；⑾趸?、硫基。術(shù)語“烯基”是指任選取代的在一個或一個以上位置處具有碳-碳雙鍵的直鏈、環(huán)狀或分支狀不飽和烴基，其中附接到結(jié)構(gòu)其余部分的原子是碳原子。烯基可具有2到20個碳，優(yōu)選具有2到8個碳。線性烯基包括例如1-烯基，例如乙烯基、I-丙烯基和I- 丁烯基；和2_稀基,例如2_ 丁稀基和2_戍稀基。稀基可具有與燒基相同的取代基。術(shù)語“炔基”是指任選取代的在一個或一個以上位置處具有碳-碳三鍵的分支或未分支不飽和烴基，其中附接到結(jié)構(gòu)其余部分的原子是碳原子。炔基可具有2到20個碳，優(yōu)選具有2到8個碳。實例包括1-炔基，例如乙炔基、I-丙炔基和3，3- 二甲基-I- 丁炔基；和2-炔基，例如2-丙炔基、2-丁炔基和3-苯基-2-丙炔基。炔基可具有與烷基相同的取代基。術(shù)語“鹵基”或“鹵素”是指氟、氯、溴或碘，通常認(rèn)為鹵基取代有機(jī)化合物中的氫原子。在這些鹵基中，一般優(yōu)選氯和氟，其中一般更優(yōu)選氯。術(shù)語“氨基”涵蓋胺N直接鍵接到中心結(jié)構(gòu)的分子，包括NH2、烷基氨基和烯基氨基。術(shù)語“?；笔侵笟?、烷基、部分飽和或完全飽和的環(huán)烷基、部分飽和或完全飽和的雜環(huán)和芳基取代的羰基。術(shù)語“芳基”是指具有5到約30個碳原子且優(yōu)選約6到約14個碳原子的取代或未取代的芳香族烴環(huán)基團(tuán)?！胺蓟笨删哂袉我画h(huán)或多個稠合環(huán)。當(dāng)取代基確定為芳基取代基時，芳基環(huán)的原子直接鍵接到結(jié)構(gòu)其余部分的原子。芳氧基取代基是芳基通過-0-橋連接到結(jié)構(gòu)的其余部分。芳基可具有與烷基相同的取代基以及烷基、烯基或炔基取代基。術(shù)語“芳基”包括(但不限于)苯基、a-萘基萘基、聯(lián)苯、蒽基、四氫萘基、芴基、茚滿基、亞聯(lián)苯基和苊基?！胺蓟钡亩x內(nèi)特別包括任選取代的芳香族基團(tuán)。舉例來說，在本發(fā)明的代表性實施例中，“芳基”任選經(jīng)I到5個選自由以下組成的群組的取代基取代酰氧基、羥基、酰基、具有I到6個碳原子的烷基、具有I到6個碳原子的烷氧基、具有2到6個碳原子的烯基、具有2到6個碳原子的炔基、氨基、經(jīng)I或2個具有I到6個碳原子的烷基取代的氣基、氣基酸基、酸基氣基、置氣基、氰1基、齒基、硝基、硫燒氧基、二齒代甲基和芳基。術(shù)語“芳烷基”包含芳基取代的烷基部分。優(yōu)選芳烷基為芳基附接到具有I到6個碳原子的烷基的“低級芳烷基”。所述基團(tuán)的實例包括苯甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、苯乙基和二苯基乙基。術(shù)語“碳環(huán)”是指含有一個或一個以上共價閉合環(huán)結(jié)構(gòu)并且形成環(huán)主鏈的原子都為碳原子的任選取代的基團(tuán)。因此，此術(shù)語使碳環(huán)與環(huán)主鏈含有至少一個非碳原子的雜環(huán)相區(qū)別。術(shù)語“環(huán)烷烴”或“環(huán)狀烷烴”或“環(huán)烷基”是指環(huán)是任選取代的環(huán)狀脂肪烴(例如，優(yōu)選具有3到12個環(huán)碳的環(huán)狀烷基)的碳環(huán)基團(tuán)?！碍h(huán)烷基”包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基等。 術(shù)語“雜環(huán)的或雜環(huán)”意思指具有4到約20個碳原子，優(yōu)選具有約5到約6個碳原子的任選取代的飽和或不飽和、芳香族或非芳香族環(huán)狀烴基，其中I到約4個碳原子經(jīng)氮、氧或硫替代。優(yōu)選的雜環(huán)選自由以下組成的群組苯并咪唑、二氫噻吩、二氧雜環(huán)己烯、二噁烷、二氧雜環(huán)戊烷、二噻烷、二噻嗪、二噻唑、二硫雜環(huán)戊烷、呋喃、咪唑、嗎啉、噁唑、噁二唑、氧雜噻唑、氧雜噻唑烷、噁嗪、噁二嗪、哌嗪、哌啶、吡喃、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯烷、四氫呋喃、四嗪、噻二嗪、噻二唑、噻三唑、噻嗪、噻唑、硫代嗎啉、噻吩、硫代吡喃、三嗪和三唑。一些雜環(huán)的結(jié)構(gòu)如下雜環(huán)
權(quán)利要求
1.一種式2a化合物
2.一種式2a'化合物
3.一種式2a"化合物
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中 R1各自獨立選自由以下組成的群組H;和任選取代的直鏈或分支烷基、烯基或炔基； 民、1 3、1 4和1 5各自獨立選自由以下組成的群組H ;任選取代的直鏈或分支C1-C6烷基；和-C(O)R6，其中R6是任選取代的直鏈或分支C1-C6烷基、烯基或炔基；且 X選自由以下組成的群組任選取代的直鏈或分支烷基、烯基或炔基；任選取代的碳環(huán)、雜環(huán)、芳基或雜芳基；和鹵基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，其中 R1各自獨立選自由以下組成的群組直鏈或分支C1-C6烷基和經(jīng)取代的直鏈或分支C1-C6烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，其中 R1各自獨立選自甲基和乙基；NR2R3 是 NH2 ；NR4R5 是 NHC (O) -C1-C6 烷基或 NHC (0) -C2-C6 烯基；且 X是連接在氮原子處的哌嗪環(huán)且所述哌嗪環(huán)任選經(jīng)鹵基、鹵烷基或直鏈或分支C1-C6燒基取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，其中 R1各自相同或不同且是甲基或乙基；且 R2、R3和R4各自是H ;R5是_C (0)-甲基、-C (0)-乙基或-C (0)-乙稀基； X是哌嗪、4-甲基哌嗪-I-基或4-(2-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-I-基。
8.一種式3a化合物
9.一種式4a化合物
10.一種式5a化合物
11.一種式6a化合物
12.—種式7a化合物
13.一種式2b化合物
14.一種式3b化合物
15.一種式4b化合物
16.一種式5b化合物
17.一種式6b化合物
18.一種式7b化合物
19.根據(jù)權(quán)利要求I到20中任一權(quán)利要求所述的化合物，其選自由本文揭示的表1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的化合物組成的群組， 或其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體或醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化合物，其選自由以下組成的群組 N-(6-氨基-2-(4，6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶_5_基硫基)嘧啶_4_基)丙烯酰胺， N-(6-氨基-2-(4，6-二乙氧基-2-(4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶_5_基硫基)嘧啶_4_基)丙烯酰胺， N- (2- (4，6- 二甲氧基-2- (4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)丙烯酰胺， N- (3- (4-(苯甲氧基)-2- (4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺， N- (3- (4-(苯甲氧基)-2- (4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)苯甲酰胺， 2-氨基-N- (3- (4-(苯甲氧基)-2- (4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N-(3-(2-(4-甲基哌嗪-I-基)-4-(吡啶-3-基甲氧基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N- (3- (2- (4-甲基哌嗪-I-基)-4-(吡啶-4-基甲氧基)嘧啶_3_基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N-(3-(4-(4-氯苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶_5_基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N-(3-(4-(3-氨基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪_1_基)嘧啶_5_基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N-(3-(4-(2-氨基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪_1_基)嘧啶_5_基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N-(3-(4-( 二氟(苯基)甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺， 2-氨基-N-(3-(4-(3，5-二氟苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪_1_基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺， N- (3- (4-(苯甲氧基)-2- (4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)丙烯酰胺， N- (2- (4-(苯甲氧基)-2- (4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)丙烯酰胺，和 N-(6-氨基-2-(4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-I-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶_4_基)丙烯酰胺。
21.根據(jù)權(quán)利要求I到20中任一權(quán)利要求所述的化合物，其中所述化合物進(jìn)一步衍生化以包含標(biāo)記。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物，其中所述標(biāo)記是熒光染料。
23.一種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I到20中任一權(quán)利要求所述的化合物和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
24.一種治療動物的癌癥或增生性病癥的方法，其包含 向有需要的動物投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I到20所述的化合物；條件是所述化合物在針對AML香澄-I (Kasumi-I)細(xì)胞中生長抑制的測試中或在針對乳癌SKBr3細(xì)胞中生長抑制的測試中或在兩者中的IC5tl值小于100 PM。
25.一種治療動物的腫瘤或增生性病癥的方法，其包含 向有需要的動物投予治療有效量的Hsp70抑制劑； 以致所述Hsp70抑制劑結(jié)合于位于Hsp70和Hsc70的核苷酸結(jié)合部位外部的變構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及 抑制Hsp70與Hsc70 ;并由此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或與增生性病癥有關(guān)的細(xì)胞凋亡；而不誘導(dǎo)正常細(xì)胞、基質(zhì)或血管的細(xì)胞凋亡。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述Hsp70抑制劑是選自權(quán)利要求I到20的化合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述變構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于SEQID NO 1上且所述結(jié)構(gòu)域由一個或一個以上選自由以下組成的群組的氨基酸殘基界定Thrl3、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、Pro91、Phe92 和其組合。
28.一種治療動物的腫瘤或增生性病癥的方法，其包含 向有需要的動物投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I到20所述的化合物，以致所述化合物結(jié)合于 位于SEQ ID NO :1上由一個或一個以上選自由以下組成的群組的氨基酸殘基界定的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域Thrl3、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、Pro91、Phe92 和其組合。
29.—種抑制Hsp70活性的方法，其中所述Hsp70含有在SEQ ID NO :1的蛋白質(zhì)或其變體上由一個或一個以上選自由以下組成的群組的氨基酸殘基界定的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域Thrl3、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、Pro91、Phe92 和其組合；所述方法包含 使所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與配體接觸以抑制Hsp70的活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述配體是根據(jù)權(quán)利要求I到20所述的化合物。
31.一種調(diào)節(jié)Hsp70活性的方法，其中所述Hsp70包含具有位于在ATP/ADP結(jié)合結(jié)構(gòu)域外部的裂縫區(qū)中并側(cè)接亞區(qū)Ib和IIb的部位I的結(jié)合袋，且所述方法包含使所述結(jié)合袋的部位I與結(jié)合于所述結(jié)合袋的配體接觸以調(diào)節(jié)Hsp70的活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的調(diào)節(jié)H s p 7 0活性的方法，其中部位I具有包含T h r 13、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264 和 Thr265 極性氨基酸的第一大親水性子袋；嵌入此子袋中的半胱氨酸殘基(Cys267);且鄰近所述子袋的是Hsp70上包含例如 Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68和Tyr41的非極性與極性氨基酸殘基的第二較大子袋；且部位I也含有由例如Lys88、His89、Trp90、Pro91和Phe92的氨基酸組成的另一子袋。
33.一種鑒別腫瘤中或與增生性病癥有關(guān)的細(xì)胞中的Hsp70相關(guān)蛋白的方法，其包含將根據(jù)權(quán)利要求I到20中任一權(quán)利要求所述的化合物間接或直接連接到固體支撐物 使生物樣品與連接到所述固體支撐物的所述化合物接觸，以允許所述化合物結(jié)合于所述樣品中存在的任何Hsp70復(fù)合物； 和鑒別結(jié)合于所述化合物的所述Hsp相關(guān)蛋白； 以鑒別所述腫瘤或所述與增生性病癥有關(guān)的細(xì)胞中的所述Hsp相關(guān)蛋白。
34.一種用于監(jiān)測治療腫瘤或增生性病癥的患者的治療狀態(tài)的方法，其包含在治療期前或期間某一時間從所述患者獲得第一生物樣品并測量Hsp相關(guān)蛋白的含量和活性； 在治療期期間稍遲的某一時間從所述患者獲得第二生物樣品并測量相同Hsp相關(guān)蛋白的含量和活性； 將所述第一生物樣品中所述Hsp相關(guān)蛋白的含量和活性與所述第二生物樣品中所述Hsp相關(guān)蛋白的含量和活性相比較，其中所述Hsp相關(guān)蛋白的含量和/或活性降低指示所述療法已產(chǎn)生有益作用。
35.一種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求I所述的Hsp70或其變體的結(jié)合部位I的三維結(jié)構(gòu)的計算機(jī)輔助系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包含(a)計算機(jī)可讀數(shù)據(jù)存儲媒體，其包含用計算機(jī)可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料，其中所述數(shù)據(jù)包含肽序列SEQ ID NO :1和圖21中的盒中所示序列的至少一部分；(b)工作存儲器，其存儲有用于處理所述計算機(jī)可讀數(shù)據(jù)的指令；(C)用于將所述計算機(jī)可讀數(shù)據(jù)處理成所述三維結(jié)構(gòu)的中央處理單元，其耦接到所述計算機(jī)可讀數(shù)據(jù)存儲媒體和所述工作存儲器；和(d)用于顯示所述三維結(jié)構(gòu)的顯示器，其耦接到所述中央處理單元。
36.一種由根據(jù)權(quán)利要求35所述的計算機(jī)輔助系統(tǒng)產(chǎn)生的Hsp70或其變體的結(jié)合部位I的三維結(jié)構(gòu)，其用于篩選調(diào)節(jié)Hsp70或Hsc70活性的調(diào)節(jié)劑，其中所述結(jié)合部位包含由選自由以下組成的群組的氨基酸殘基界定的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域Thrl3、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63>Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41>Lys88> His89、Trp90、Pro91、Phe92和其組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的Hsp70或其變體的結(jié)合部位I的三維結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)合部位包含由選自由以下組成的群組的氨基酸殘基界定的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域Thrl3、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、Pro91、Phe92 和其組合。
38.一種篩選用于調(diào)節(jié)Hsp70或其變體的結(jié)合部位I活性的調(diào)節(jié)劑的方法，其中所述方法包含使用SEQ ID NO :I和圖21中的盒中所示序列的至少一部分來鑒別Hsp70或變體的調(diào)節(jié)劑；使所述調(diào)節(jié)劑與Hsp70或變體接觸，和測定所述調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)活性。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的篩選調(diào)節(jié)劑的方法，其中Hsp70的所述結(jié)合部位I包含由選自由以下組成的群組的氨基酸殘基界定的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域Thrl3、Thrl4、Tyrl5、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63> Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41> Lys88> His89、Trp90、Pro91、Phe92和其組合。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的篩選調(diào)節(jié)劑的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑與預(yù)防和/或治療選自由以下組成的群組的Hsp70相關(guān)性細(xì)胞生長疾病或增生性病癥相關(guān)乳癌、前列腺癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、淋巴瘤和白血病。
41.根據(jù)權(quán)利要求38到40中任一權(quán)利要求所述的方法，其中使用一種或一種以上測量選自由以下組成的群組的癌癥表型的生長抑制檢驗進(jìn)一步測試所述調(diào)節(jié)劑對癌細(xì)胞的生長抑制 HER2+SKBr3乳癌細(xì)胞中HER2或Raf-I降解； MOLM-13AML 細(xì)胞中 FLT3 或 p_STAT5 失活； MDA-MB-468三重陰性乳癌細(xì)胞中P-STAT3或p-PDKl失活； LNCaP前列腺癌細(xì)胞中突變的AR降解； 一組一種或一種以上癌細(xì)胞中PARP裂解； M0LM-13細(xì)胞中卡斯蛋白酶3，7(caspase 3,7)活化； 乳癌細(xì)胞中干擾素和TNF細(xì)胞凋亡作用的加強(qiáng)； 一組一種或一種以上癌細(xì)胞中Hsp70誘導(dǎo)的缺乏； 和其任何組合。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其進(jìn)一步包含進(jìn)行競爭性熒光偏振檢驗以測試Hsp90或Hsp70與所述調(diào)節(jié)劑的結(jié)合；和用計算機(jī)評估所述調(diào)節(jié)劑在結(jié)合部位I處的結(jié)構(gòu)匹配。全文摘要
本發(fā)明涉及由通式(I)或(I′)表示的化合物或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽；含有至少一種所述化合物的醫(yī)藥組合物；制備至少一種所述化合物的方法；使用至少一種所述化合物治療和/或預(yù)防各種癌癥和/或增生性病癥的方法；使用至少一種所述化合物監(jiān)測抗癌療法針對各種癌癥的有效性的方法。在一個實施例中，本發(fā)明涉及以一定特異性水平結(jié)合于熱休克蛋白70Hsp70的化合物。在另一實施例中，本發(fā)明涉及以一定特異性水平結(jié)合以抑制熱休克蛋白70Hsp70與熱休克同源蛋白70Hsc70的化合物。
文檔編號A61K31/54GK102753177SQ201080036818
公開日2012年10月24日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日
發(fā)明者加芙列拉·基奧西斯, 安娜·羅迪納, 帕拉維·帕特爾, 康彥龍, 托尼·塔爾多內(nèi) 申請人:紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心