專利名稱：T細(xì)胞活化抑制劑、含有其的藥物組合物以及抑制t細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及T細(xì)胞活化抑制劑、含有其的藥物組合物以及抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法，具體而言，本發(fā)明涉及以RGM抑制物質(zhì)作為有效成分的T細(xì)胞活化抑制劑、含有該T細(xì)胞活化抑制劑的用于預(yù)防或治療T細(xì)胞活化所引起的疾病的藥物組合物、以及抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法，所述篩選方法包括使受試物質(zhì)與RGM接觸的步驟。
背景技術(shù)：
RGM(排斥性導(dǎo)向分子(repulsive guidance molecule))最初是被鑒定為視覺系統(tǒng)的軸突導(dǎo)向分子的膜蛋白質(zhì)(參照非專利文獻(xiàn)I)。已知RGM家族包含稱為RGMa、RGMb以及RGMc的3類成員，至少RGMa和RGMb通過相同的信號傳導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮作用(參照非專利文獻(xiàn)2)。后續(xù)的研究明確了 RGM在非洲爪蟾和雞胚中具有軸突導(dǎo)向和層形成(laminaformation)的功能、以及在小鼠胚中具有調(diào)節(jié)頭部神經(jīng)管的閉鎖等功能(參照非專利文獻(xiàn)3)。除了在發(fā)育階段的功能外，RGM還在成年人和大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再表達(dá)，在大鼠中抑制RGM提高了脊髓損傷后的軸突生長、促進(jìn)了功能恢復(fù)(參照非專利文獻(xiàn)4)，因此認(rèn)為RGM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后抑制軸突再生的物質(zhì)。另外，專利文獻(xiàn)I公開了含有以抗RGM中和抗體為有效成分的軸突再生促進(jìn)劑。多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis)是由于覆蓋腦和脊髓的神經(jīng)纖維的髓鞘質(zhì)(髓鞘)發(fā)炎引起脫髓，神經(jīng)的信息不能很好地傳導(dǎo)導(dǎo)致出現(xiàn)視覺障害、運(yùn)動障害、感覺低下、平衡障害等多種癥狀的疾病，其原因尚未清楚地闡明，且在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中是不能完全治愈的慢性病。雖然多發(fā)性硬化癥作為一種自身免疫病而認(rèn)識，但是尚未詳細(xì)闡明其發(fā)病機(jī)理。例如，非專利文獻(xiàn)5報導(dǎo)了 CD4+T細(xì)胞免疫地攻擊腦以及脊髓的白質(zhì)中的髓鞘質(zhì)以及少突膠質(zhì)細(xì)胞。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :專利第3981148號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Stahl, B.，Muller, B.，von Boxberg, Y.，Cox, E. C. &Bonhoeffer,F. Biochemical characterization of a putative axonal guidance molecule of thechick visual system. Neuron 5，735-743(1990)非專利文獻(xiàn)2 :Liu，X.，Hashimoto，M.，Horii, H.，Yamaguchi, A.，Naito，K.和 Yamashita， T. ， Repulsive guidance molecule b inhibits neurite growthand is increased after spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382，795-800(2009)非專利文獻(xiàn)3 :Yamashita，T.，Mueller, B. K. &Hata，K.，Neogenin and repulsiveguidance molecule signaling in the central nervous system.Curr.Opin.Neurobiol. 17，29-34 (2007)非專利文獻(xiàn)4 :Hata, K.等人，RGMa inhibition promotes axonal growth andrecovery after spinal cord injury. J. Cell Biol. 173,47-58 (2006)非專利文獻(xiàn)5 Trapp, B. D. , Ransohoff, R. M. , Fisher, E. &Rudick,R. Neurodegeneration in multiple sclerosis !relationship to neurologicaldisability. Neuroscientist 5,48-57 (1999)發(fā)明概述發(fā)明欲解決的課題本發(fā)明的目的是，發(fā)現(xiàn)RGM的新功能，提供新的T細(xì)胞活化抑制劑、提供用于預(yù)防或治療T細(xì)胞活化所引起的疾病的藥物組合物、抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法。
用于解決課題的手段本發(fā)明為了解決上述課題，包含以下各發(fā)明。[1]T細(xì)胞活化抑制劑，其以RGM抑制物質(zhì)作為有效成分。[2]上述[I]所述的T細(xì)胞活化抑制劑，其中RGM抑制物質(zhì)是抗RGM中和抗體。[3]上述[I]所述的T細(xì)胞活化抑制劑，其中RGM抑制物質(zhì)是RGMsiRNA。[4]T細(xì)胞活化所引起的疾病的預(yù)防或治療用藥物組合物，其特征在于，含有上述[I] [3]中任一項所述的T細(xì)胞活化抑制劑。[5]上述[4]所述的藥物組合物，其中T細(xì)胞活化所引起的疾病是自身免疫病。[6]上述[5]所述的藥物組合物，其中自身免疫病是多發(fā)性硬化癥。[7]抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法，其特征在于包括使受試物質(zhì)與RGM接觸的步驟、測定所述RGM的活性水平的步驟、將所述活性水平與沒有接觸受試物質(zhì)的RGM的活性水平進(jìn)行比較的步驟、和選擇使RGM的活性水平降低的受試物質(zhì)的步驟。[8]抑制T細(xì)胞活化的方法，其特征在于，包括使RGM抑制物質(zhì)與RGM表達(dá)細(xì)胞接觸的步驟。[9]上述[8]所述的抑制T細(xì)胞活化的方法，其中RGM抑制物質(zhì)是抗RGM中和抗體。[10]上述[8]所述的抑制T細(xì)胞活化的方法，其中RGM抑制物質(zhì)是RGM siRNA。[11]預(yù)防或治療自身免疫病的方法，其特征在于包括將有效量的上述[I] [3]中任一項所述的T細(xì)胞活化抑制劑施與哺乳動物。[12]上述[I] [3]中任一項所述的T細(xì)胞活化抑制劑的用途，用于制備自身免疫病的預(yù)防或治療用藥物組合物。[13]上述[I] [3]中任一項所述的T細(xì)胞活化抑制劑，用于預(yù)防或治療自身免疫病。發(fā)明的效果通過本發(fā)明，能夠提供新的T細(xì)胞活化抑制劑。所述T細(xì)胞活化抑制劑用于預(yù)防或治療T細(xì)胞活化所引起的疾病，例如自身免疫病。另外，通過本發(fā)明的篩選方法得到的抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)成為T細(xì)胞活化所引起的疾病的預(yù)防藥或治療藥的有效成分的候選。附圖簡述圖I是顯示通過實時定量PCR測定用LPS刺激的骨髓來源的樹狀細(xì)胞(BMDCs)中RGMa mRNA表達(dá)的結(jié)果的圖。圖2是顯示通過蛋白質(zhì)印跡檢測用LPS刺激的BMDCs中RGMa的表達(dá)結(jié)果的圖。圖3是顯示通過流式細(xì)胞術(shù)分析⑶4+T細(xì)胞以及⑶Ilb+巨噬細(xì)胞與各種濃度的人RGMa-Fc的結(jié)合的結(jié)果圖。圖4(A)是顯示通過蛋白質(zhì)印跡檢測⑶4+T細(xì)胞以及⑶Ilb+巨噬細(xì)胞中總Rapl以及活性型Rapl的結(jié)果圖。圖4(B)是顯示將圖4(A)的蛋白質(zhì)印跡條帶用Scion image定量,算出相對Rapl活化水平的結(jié)果圖。圖5(A)是顯示在有或沒有RGMa刺激下，測定脾細(xì)胞向纖連蛋白的粘附率的結(jié)果 圖。
圖5⑶是顯示在有或沒有RGMa刺激下，測定⑶4+T細(xì)胞向ICAMl的粘附率的結(jié)果圖。圖6是顯示在施與抗RGMa中和抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠和施與對照抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠中，通過評分實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的臨床癥狀而數(shù)值化、觀察隨時間變化的結(jié)果圖。圖7 (A)是顯示在每組中EAE的臨床癥狀發(fā)生率的圖；(B)是顯示在每組中EAE發(fā)病日的平均值的圖；(C)是顯示每組中各小鼠的EAE評分最大值的平均值的圖；(D)是顯示每組中各小鼠的EAE評分累積值的平均值的圖。圖8(a)以及(b)是施與對照抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠的頸髓的HE染色組織圖像；(c)以及(d)是施與抗RGMa中和抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠的頸髓的HE染色組織圖像。圖9是顯示在施與對照抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠的骨髓組織標(biāo)本以及施與抗RGMa中和抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠的骨髓組織標(biāo)本中，基于炎癥指數(shù)而將炎癥程度數(shù)值化的結(jié)果的圖。

圖10是顯示自施與對照抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠以及施與抗RGMa中和抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠制備的脾細(xì)胞，研究其抗原特異的T細(xì)胞活化以及非特異的T細(xì)胞活化的結(jié)果的圖，(a)是顯示細(xì)胞增殖的結(jié)果的圖，(b)是顯示IL-2的分泌量的結(jié)果的圖，(c)是顯示IFN-Y的分泌量的結(jié)果的圖，⑷是顯示IL-17的分泌量的結(jié)果的圖。圖11是顯示在施與抗RGMa中和抗體的再發(fā)性多發(fā)性硬化癥模型小鼠和施與對照抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠中，通過評分EAE的臨床癥狀而數(shù)值化、觀察隨時間變化的結(jié)果圖。圖12是顯示對敲低了 RGMa基因的BMDCs或沒有敲低RGMa基因的BMDCs進(jìn)行MOG刺激后，將這些BMDCs移植至接受體小鼠，在接受體小鼠中通過評分EAE的臨床癥狀而數(shù)值化、觀察隨時間變化的結(jié)果圖。圖13是顯示對自施與了抗RGMa中和抗體或?qū)φ湛贵w、以及MOG的供體小鼠制備的⑶4+T細(xì)胞，進(jìn)行MOG刺激后，將這些⑶4+T細(xì)胞移植至接受體小鼠，在接受體小鼠中通過評分EAE的臨床癥狀而數(shù)值化、觀察隨時間變化的結(jié)果圖。用于實施發(fā)明的實施方案本發(fā)明者們首次發(fā)現(xiàn)骨髓來源的樹狀細(xì)胞(BMDCs)表達(dá)RGM;⑶4+T細(xì)胞以及CDllb+巨噬細(xì)胞表達(dá)RGM受體；RGM通過與CD4+T細(xì)胞或CDllb+巨噬細(xì)胞的RGMa受體結(jié)合而活化Rapl，其結(jié)果是發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞或CDllb+巨噬細(xì)胞的細(xì)胞粘附活性增強(qiáng)。另外，本發(fā)明者們明確了，在使用多發(fā)性硬化癥模型小鼠的實驗中，施與抗RGM中和抗體減輕了髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)誘導(dǎo)的多發(fā)性硬化癥模型小鼠(實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠)的臨床癥狀以及組織病變這兩者、自施與抗RGM中和抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠采取的脾細(xì)胞顯著減輕了抗原特異的以及非特異的T細(xì)胞活化。進(jìn)一步地，發(fā)現(xiàn)了抗RGM中和抗體的施與在髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)誘導(dǎo)的再發(fā)性多發(fā)性硬化癥模型小鼠中抑制EAE臨床癥狀的出現(xiàn)；對敲低了 RGMa的BMDCs進(jìn)行MOG刺激并移植至小鼠的情形，在接受移植的小鼠中抑制EAE臨床癥狀的出現(xiàn)；在自施與了抗RGM中和抗體以及MOG的小鼠制備的CD4+T細(xì)胞給予MOG刺激并移植至小鼠的情形，在接受移植的小鼠中抑制EAE臨床癥狀的出現(xiàn)(參照實施例)?！?T細(xì)胞活化抑制劑〕
本發(fā)明提供了以RGM抑制物質(zhì)作為有效成分的T細(xì)胞活化抑制劑。作為本發(fā)明的T細(xì)胞活化抑制劑的有效成分的RGM抑制物質(zhì)可以是任一抑制RGM的活性(RGM活性)的物質(zhì)和抑制RGM表達(dá)的物質(zhì)。作為抑制RGM活性的物質(zhì)，可以列舉例如抑制RGM活性的低分子化合物、抗RGM中和抗體等。作為RGM活性的指標(biāo)，可以列舉例如RGM向RGM受體的結(jié)合活性(參照實施例I的(1-2))、Rapl活化的誘導(dǎo)活性(參照實施例I的(1_3))、T細(xì)胞對ICAM的粘附增強(qiáng)活性(參照實施例I的(1-4))等，使用這些指標(biāo)評價時抑制(減弱)RGM活性的物質(zhì)稱為RGM抑制物質(zhì)。作為抑制RGM活性的低分子化合物，可以列舉例如作為Rho激酶抑制劑而已知的 Y27632 (M. Uehata 等人，Calcium sensitization of smooth muscle mediated by aRho-associated protein kinase in hypertension. Nature 389,990(1997))?？筊GM中和抗體可以是結(jié)合RGM并抑制其活性的抗體，例如,可以列舉結(jié)合RGM，使RGM不能結(jié)合RGM受體的抗RGM抗體等。能夠使用RGM或其片段作為免疫原，以公知的方法制備抗RGM中和抗體。能夠使用上述RGM活性的指標(biāo)確認(rèn)所獲得的抗體是中和抗體。作為RGM，可以列舉例如包含序列編號2所示的氨基酸序列的人RGMa、包含序列編號4所示的氨基酸序列的大鼠RGMa等，但不限于此。能夠合適地使用多種生物來源的RGM作為免疫原。這些氨基酸序列能夠容易地獲自公知的數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank等)?？筊GM中和抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。另外，其可以是完全的抗體分子，也可以是能夠與抗原特異性結(jié)合的抗體片段(例如,？813、？(313’)2、？313’、？￥、80 ￥等)。多克隆抗體例如能夠如下制備并獲得。即，將抗原(RGM或它們的片段)溶解在PBS中，根據(jù)需要將適量混合了常規(guī)佐劑(例如弗氏完全佐劑)的物質(zhì)作為免疫原免疫哺乳動物(小鼠、大鼠、兔、山羊、馬等)。對免疫方法沒有特別的限定，但是例如優(yōu)選皮下注射或腹腔內(nèi)注射I次或以適當(dāng)?shù)拈g隔注射多次的方法。接下來，根據(jù)常規(guī)方法，能夠通過從經(jīng)免疫的動物采集血液，分離血清，純化多克隆抗體級分而取得。單克隆抗體是將上述經(jīng)免疫的哺乳動物得到的免疫細(xì)胞(例如脾細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤，能夠通過自該雜交瘤的培養(yǎng)物采集抗體而獲得。另外，從雜交瘤中克隆抗體基因，整合入適當(dāng)?shù)妮d體，將所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使用基因重組技術(shù)能夠產(chǎn)生重組型的單克隆抗體。進(jìn)一步地，也能夠使用嗤囷體展不法來制備。
抗RGM中和抗體優(yōu)選是人型嵌合抗體或人源化抗體。人型嵌合抗體是由人以外的動物來源的抗體的重鏈可變區(qū)以及輕鏈可變區(qū)、和人抗體的重鏈恒定區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)組成的抗體。人源化抗體是指將人以外的動物來源的抗體的CDR(互補(bǔ)決定區(qū)complementarity determining region)移植至人抗體的⑶R的抗體，也稱為⑶R移植抗體、重構(gòu)抗體等。將人源化抗體的FR(構(gòu)架區(qū)framework region)選擇為使⑶R形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。為了使人源化抗體的CDR形成合適的抗原結(jié)合部位，根據(jù)需要也可以替換抗體可變區(qū)中FR的氨基酸序列。人抗體的恒定區(qū)的氨基酸序列能夠從公知的數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank 等)獲得。作為抑制RGM表達(dá)的物質(zhì)，可以列舉例如RGM基因的siRNA (短干擾RNA)、shRNA(短發(fā)夾RNA)、反義寡核苷酸等。作為RGM基因，可以列舉例如包含序列編號I所示喊基序列的人RGMa基因、包含序列編號3所不喊基序列的大鼠RGMa基因等，但不限于此。能夠容易地從公知數(shù)據(jù)庫(GenBank等)獲得多種生物來源的RGM基因的堿基序列。siRNA是能夠抑制目標(biāo)基因(本發(fā)明中是RGM基因)表達(dá)的短的雙鏈RNA。只要作為siRNA發(fā)揮功能，對其堿基序列和/或長度(堿基長)無特別限定，但優(yōu)選地是不到約30個堿基、更優(yōu)選地是約19 27個堿基、進(jìn)一步優(yōu)選地是約21 25個堿基。shRNA是指通過在單鏈RNA 中包含部分回文狀的堿基序列，形成分子內(nèi)的雙鏈結(jié)構(gòu)，在3'末端具有突出部的短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約20個堿基對以上的分子。這樣的shRNA在導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)后，在細(xì)胞內(nèi)分解成約20個堿基(代表性地為例如21個堿基、22個堿基、23個堿基)的長度、與siRNA同樣地能夠抑制目標(biāo)基因(本發(fā)明中是RGM基因)的表達(dá)。只要是能夠抑制RGM基因的表達(dá)，siRNA以及shRNA可以是任何形式。siRNA或shRNA能夠人工地化學(xué)合成。另外，例如使用T7RNA聚合酶以及T7啟動子，能夠自模板DNA體外合成反義以及有義的RNA。反義寡核苷酸可以是與RGM基因的DNA序列中連續(xù)5個至100個堿基序列互補(bǔ)的或雜交的核苷酸、是DNA或RNA均可。另外，只要不阻礙功能，也可以是經(jīng)修飾的。能夠通過常規(guī)方法合成反義寡核苷酸，例如，通過市售的DNA合成裝置能夠容易地合成。因此，RGM抑制物質(zhì)通過與RGM表達(dá)細(xì)胞(表達(dá)RGM的細(xì)胞或具有表達(dá)RGM能力的細(xì)胞)接觸，能夠抑制T細(xì)胞活化。因此，本發(fā)明也包含抑制T細(xì)胞活化的方法，其特征在于包括使RGM抑制物質(zhì)與RGM表達(dá)細(xì)胞接觸的步驟?！菜幬锝M合物〕本發(fā)明提供了對T細(xì)胞活化所引起的疾病的預(yù)防或治療用藥物組合物，其包含上述本發(fā)明的T細(xì)胞活化抑制劑。本發(fā)明的藥物組合物換言之是以RGM抑制物質(zhì)作為有效成分的、用于預(yù)防或治療T細(xì)胞活化所引起的疾病的藥物組合物。作為T細(xì)胞活化所引起的疾病，可以列舉自身免疫病、腦血管病等。作為自身免疫病，可以列舉例如細(xì)胞性自身免疫病、風(fēng)濕癥、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)自身免疫病(急性熱病性多神經(jīng)炎、神經(jīng)貝切特病等)、惡性貧血、I型(胰島素依賴型)糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、炎癥性腸疾病(IBD)、斯耶格倫綜合征、遺傳過敏性皮炎、古德帕斯徹綜合征、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜病、腎小球腎炎、重癥肌無力癥、橋本病等。作為腦血管病，有腦梗塞、腦出血、蛛網(wǎng)膜下出血等。其中，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地用于預(yù)防或治療自身免疫病，特別優(yōu)選地用于預(yù)防或治療多發(fā)性硬化癥。本發(fā)明的藥物組合物能夠?qū)⒆鳛橛行С煞值腞GM抑制物質(zhì)與藥學(xué)上容許的載體或添加劑適宜地混合而制劑化。具體而言，能夠制劑為錠劑、包衣錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液體劑、懸浮劑、乳劑等經(jīng)口劑；注射劑、輸液、栓劑、軟膏、貼劑等非經(jīng)口劑。關(guān)于載體或添加劑的混合比例，基于醫(yī)藥品領(lǐng)域通常采用的范圍合適地設(shè)定即可。對于能夠用來混合的載體或添加劑，沒有特別的限制，可以列舉例如水、生理鹽水、其它水性溶劑、水性或油性基劑等各種載體；賦形劑、結(jié)合劑、PH調(diào)節(jié)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑、香料等各種添加劑。當(dāng)RGM抑制物質(zhì)是抗RGM中和抗體的情形，優(yōu)選地將與藥學(xué)上容許的載體一同制劑的注射劑或輸液通過非經(jīng)口施與途徑施與，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下或局部施與。包含抗RGM中和抗體的注射劑或輸液能夠作為溶液、懸液或乳液使用。作為其溶劑，能夠使用例如注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖溶液以及等張液(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇等溶液)。進(jìn)一步地，該注射劑或輸液可以包含穩(wěn)定劑、助溶劑、懸浮化劑、乳化劑、無痛化劑、緩沖劑、保存劑、防腐劑、PH調(diào)節(jié)劑等。作為穩(wěn)定劑，可以使用例如白蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、EDTA鈉、檸檬酸鈉、二丁羥基甲苯等。作為助溶劑，可以使用例 如醇(例如，乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非離子型表面活性劑(例如，失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯(注冊商標(biāo))、HC0-50等)等。作為懸浮化劑，可以使用例如單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉等。作為乳化劑，可以使用例如阿拉伯膠、藻酸鈉、西黃蓍膠等。作為無痛化劑，可以使用例如苯甲醇、氯丁醇、山梨醇等。作為緩沖劑，可以使用例如磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液等。作為保存劑，可以使用例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、氯化苯甲烴銨、脫氫乙酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、硼酸、硼砂等。作為防腐劑，可以使用例如氯化苯甲烴銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。PH調(diào)節(jié)劑，可以使用例如鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等。當(dāng)RGM抑制物質(zhì)是核酸(siRNA、shRNA、反義寡核苷酸等)的情形，能夠以非病毒載體或病毒載體的形式施用。在非病毒載體形式的情形，能夠利用使用脂質(zhì)體導(dǎo)入核酸分子的方法(脂質(zhì)體法、HVJ-脂質(zhì)體法、陽離子脂質(zhì)體法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Iipofectamine)法等)、微注射法、用基因槍(Gene Gun)將運(yùn)載體(金屬粒子)與核酸分子一同轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的方法等。將siRNA或shRNA使用病毒載體施與生物的情形時，能夠利用重組腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體。通過使細(xì)胞或組織感染重組病毒，能夠?qū)⒒驅(qū)爰?xì)胞或組織內(nèi)，其中所述重組病毒是向已無毒化的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、辛德比斯病毒、仙臺病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒中導(dǎo)入表達(dá)siRNA或shRNA的DNA。通過將由此所獲得的制劑以有效量施與例如人或其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)能夠預(yù)防或治療T細(xì)胞活化所引起的疾病。對于施與量，通過考慮目的、疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡、體重、性別、過往病史、有效成分的種類等而合適地設(shè)定。例如，當(dāng)有效成分是抗RGM中和抗體的情形，在以具有約65 70kg體重的通常人為對象的情形時，優(yōu)選地每日施用O. 02mg 4000mg左右，更優(yōu)選地每日施用O. Img 200mg左右。每日的總施與量可以是單一施與量，也可以是分開的施與量。
〔篩選方法〕對于本發(fā)明的篩選方法，只要所述方法包括使受試物質(zhì)與RGM接觸的步驟、測定與受試物質(zhì)接觸過的RGM的活性水平的步驟、將該測定的活性水平與沒有接觸受試物質(zhì)的RGM的活性水平比較的步驟、選擇使RGM的活性水平降低的受試物質(zhì)的步驟即可。通過本發(fā)明的篩選方法，能夠簡便且有效地篩選到抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)。能夠通過例如向RGM溶液中添加受試物質(zhì)使其溶解或懸浮而實施受試物質(zhì)與RGM的接觸。對于RGM，能夠使用市售的重組RGM或根據(jù)常規(guī)方法自制的重組RGM。對于接觸時間、接觸溫度沒有特別的限定，進(jìn)行適宜選擇即可。另外，優(yōu)選地設(shè)定不與受試物質(zhì)接觸的對照組。RGM的活性水平能夠以RGM與RGM受體的結(jié)合活性(參照實施例I的(1_2))、誘導(dǎo)Rapl活化的活性(參照實施例I的(1-3))、T細(xì)胞向ICAM的粘附增強(qiáng)活性(參照實施例I的(1-4))等為指標(biāo)而測定。通過將所測定的活性水平與沒有接觸受試物質(zhì)的RGM的活性水平比較，能夠確定 受試物質(zhì)是否是抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)。與沒有接觸受試物質(zhì)的RGM的活性水平比較，如果接觸了受試物質(zhì)的RGM的活性水平降低，則確定受試物質(zhì)是抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)，可以選擇該物質(zhì)。優(yōu)選地，接觸了受試物質(zhì)的RGM的活性水平為50%以下，更優(yōu)選地，為25%以下時，則確定是抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)。通過本發(fā)明的篩選方法獲得的抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)作為自身免疫病等由T細(xì)胞活化所引起的疾病的預(yù)防藥或治療藥的有效成分候選物質(zhì)是有用的。特別地，作為多發(fā)性硬化癥的預(yù)防藥或治療藥的有效成分候選物質(zhì)是極有用的。
實施例以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不受限于這些實施例?！矊嵤├齀:免疫細(xì)胞中RGMa以及RGMa受體的表達(dá)〕(1-1)骨髓來源的樹狀細(xì)胞(BMDCs)中RGMa的表達(dá)按照Lutz 等人的方法(Lutz, Μ. B.,等人，J. Immunol. Methods 223,77-92(1999))，自C57BL/6小鼠(8 10周齡)采取骨髓細(xì)胞，通過在含有GM-CSF(20ng/mL, Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得BMDCs。實驗中，使用培養(yǎng)開始后6天的BMDCs。通過實時定量PCR測定BMDCs中RGMa mRNA的表達(dá)。即，向培養(yǎng)開始后6天的BMDCs添加 0、0. 01、0. I 或 lyg/mL LPS (Sigma-Aldrich)，培養(yǎng) 24 小時，收集活化的 BMDCs。使用RNeasy Kit(QUIAGEN)自 BMDCs 提取總 RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(GE Healthcare)獲得 cDNA。以得到的cDNA為模板，按照制造商的方案進(jìn)行TaqMan實時PCR(ABI Prism7500 Seq uenceDetection System),定量分析 RGMa 的 mRNA 表達(dá)。自 Applied Biosystems 購買特異的引物和探針。此外，通過蛋白質(zhì)印跡檢測BMDCs中RGMa的表達(dá)。即，將添加了 LPS 24小時后的 BMDCs (2X IO6 個)裂解于 2X 樣本緩沖液(250mMTris-HCl,4% SDS、20%甘油、O. 02%溴酚蘭、以及10% β_巰基乙醇)，煮沸5分鐘后，將等量的各樣本在還原條件下進(jìn)行15%SDS-PAGE。泳動后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)。用包含5%脫脂乳以及O. 05%吐溫20的PBS封閉后，與抗RGMa抗體(本發(fā)明者們制備的抗體，參照非專利文獻(xiàn)3)反應(yīng),使用HRP標(biāo)記的二次抗體(Cell Signaling Technology)以及ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(GE Healthcare)檢測。使用Scion image進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶的定量。實時PCR的結(jié)果示于圖1，蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果示于圖2。由圖I可見，LPS的刺激增強(qiáng)了 BMDCs中RGMa mRNA的表達(dá)。另外，由圖2可見，存在抗RGMa抗體結(jié)合的35kDa以及50kDa的條帶，通過LPS的刺激，細(xì)胞內(nèi)的量增加。50kDa的條帶相當(dāng)于RGMa的全長，35kDa是 RGMa 的 C 末端片段，推定是 RGMa 的成熟體(Mueller, B. K. , Yamashita, T. , Schaffar,G.& Mueller, R. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361,1513-1529 (2006))。這些結(jié)果表明在活化的BMDCs中誘導(dǎo)了 RGMa的表達(dá)。(1-2)⑶4+T細(xì)胞以及⑶Ilb+巨噬細(xì)胞中RGMa受體的表達(dá)自C57BL/6小鼠(8 10周齡)摘出脾臟，快速置于RPMI1640培養(yǎng)基 (Invitrogen)中，輕輕擠壓，用ACK裂解緩沖液(Lonza Walkersville)進(jìn)行除去紅細(xì)胞的處理，獲得細(xì)胞懸液。用RPMI1640洗3次后，將細(xì)胞懸液通過70 μ m的細(xì)胞濾過器，制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。向該懸液添加各種濃度的人RGMa的C末端片段(下文中稱為“RGMa-Fc ”)，孵育30分鐘。洗凈后，組合使用PE標(biāo)記的抗⑶I Ib抗體或APC標(biāo)記的抗⑶4抗體、和FITC標(biāo)記的抗人RGMa-Fc抗體(BD Biosciences)進(jìn)行免疫染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析測定細(xì)胞與人RGMa-Fc的結(jié)合。在流式細(xì)胞術(shù)分析中使用了 FACSCalibuHBDBiosciences)以及 CellQuest 軟件(BD Biosciences)。結(jié)果示于圖3。由圖3可見，來自脾臟的⑶4+T細(xì)胞以及⑶Ilb+巨噬細(xì)胞均濃度依賴地與人RGMa-Fc結(jié)合。由該結(jié)果可見，這些細(xì)胞表達(dá)RGMa受體。(1-3)研究⑶4+T細(xì)胞以及CDllb+巨噬細(xì)胞中的Rapl活化接下來，研究了通過結(jié)合⑶4+T細(xì)胞以及⑶Ilb+巨噬細(xì)胞的RGMa而介導(dǎo)的可能的信號傳導(dǎo)。已知在T淋巴細(xì)胞中，TCR連接作用引起暫時活化Rapl以及在T細(xì)胞的與抗原呈遞細(xì)胞的接觸面蓄積Rapl-GTP，這調(diào)節(jié)由LFA-I (整聯(lián)蛋白)ICAM-I (整聯(lián)蛋白配體)介導(dǎo)的信號(Katagiri,K.等人，Mol. Cell Biol. 20，1956-1969 (2000) ；Katagiri,K. , Hattori,Μ. , Minato, N. & Kinashi, Τ. Mol. Cell Biol 22，1001-1015 (2002))。本文評價了 CD4+T 細(xì)胞以及CDllb+巨噬細(xì)胞的Rapl活化中RGMa的參與。自上述(1-2)制備的脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液分別使用抗⑶4磁珠以及抗⑶Ilb磁珠(Miltenyi Biotec)，通過陽性分選分離CD4+T細(xì)胞以及CDllb+巨噬細(xì)胞，測定活性型Rapl。在活性型Rapl的測定中，使用Rapl活化測定法試劑盒(Upstate Biotech);使用分離⑶4+T細(xì)胞以及CDllb+巨噬細(xì)胞之前的脾細(xì)胞作為對照。即，向各細(xì)胞懸液中添加2μ g/mL的重組小鼠RGMa (R&D Systems)，處理5分鐘后，用Mg2+裂解緩沖液(包含25mM HEPES (pH 7.5)，150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, IOmMMgCl2, ImM EDTA，2%甘油，2mM 原釩酸鈉，ImM 乙磺酰氯，以及蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics))裂解。將細(xì)胞裂解液用于總Rapl的測定。結(jié)合有RalGDS的瓊脂糖與細(xì)胞裂解液于4V反應(yīng)30分鐘，沉淀結(jié)合至Ral結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活性型Rapl。將珠用Mg2+裂解緩沖液洗凈，再懸浮于2X樣本緩沖液，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。在蛋白質(zhì)印跡中使用了試劑盒所附帶的抗Rapl抗體，以上述(1-1)同樣的步驟實施。使用Scion image進(jìn)行條帶的定量,算出相對的Rapl活化水平。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果示于圖4(A),顯示相對的Rapl活性的圖示于圖4(B)中。在圖4⑶中，相對活性值的圖以3 4次獨(dú)立實驗的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，“ * ”表示Studentt檢驗中P < O. 05。由圖4 (A)可見，小鼠RGMa處理使任一細(xì)胞均增加了活性型Rapl (圖中是下拉的(Pulldown)Rapl)。而且，如圖4(B)所示，通過RGMa刺激5分鐘，脾細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞以及CDllb+巨噬細(xì)胞的Rapl均顯著地被活化。該結(jié)果教導(dǎo)了，樹狀細(xì)胞表達(dá)的RGMa通過⑶4+T細(xì)胞以及⑶Ilb+巨噬細(xì)胞表面的RGMa受體而可以活化細(xì)胞內(nèi)的Rapl。(1-4)淋巴細(xì)胞結(jié)合測定法通過整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的粘附在T細(xì)胞運(yùn)輸以及活化中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。進(jìn)一步地，TCR誘導(dǎo)的粘附需要 Rapl 的活化(KatagiriX 等人，Mol. CellBiol. 20，1956-1969 (2000)；Reedquist, K. A.等人，J. Cell Biol. 148，1151-1158 (2000) ；Suga,K.等人，F(xiàn)EBS Lett. 489,249-253(2001))。因此，為了確認(rèn)通過RGMa誘導(dǎo)的活性型Rapl是否參與粘附活性，進(jìn)行了淋巴細(xì)胞結(jié)合測定法。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)(Sebzda,E.，Bracke, Μ.，Tugal, Τ.，Hogg, N.&Cantrell,D. A. , Nat. Immunol. 3,251-258(2002) ；Duchniewicz, M.等人，Mol. Cell Biol.26,643-653(2006))所述的方法進(jìn)行細(xì)胞粘附的評價。即，在96孔平底板(NUNC，MaxiSorp)中 添加 2 μ g/mL 重組小鼠 I CAM-1/Fe (R&D Systems)或 4 μ g/mL 纖連蛋白(Sigma-Aldrich)，4°C靜置一夜，進(jìn)行預(yù)包被。用PBS洗凈板，為了防止非特異的結(jié)合，使用包含2% BSA的RPMI1640 (Invitrogen)于37°C、1小時進(jìn)行封閉。將ICAM-1/Fc包被的板用于CD4+T細(xì)胞的評價；將纖連蛋白包被的板用于脾細(xì)胞評價。將新鮮制備的脾細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞用2. 5μΜ BCECF-AM(2’ 7’ - 二 -(2_羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素，乙酰氧基甲酯，Calbiochem)于37°C標(biāo)記30分鐘，隨后用包含O. 5% BSA的RPMI1640洗凈。將5X IO5個細(xì)胞加至預(yù)包被的板，在含或不含2 μ g/mL重組RGMa、含有O. 5% BSA的RPMI1640中于37°C孵育I小時。將沒有粘附的細(xì)胞用溫的含有
O.5% BSA 的 RPMI1640 洗凈 3 次而除去。使用 Spectra MAX (Molecular Devices)，在激發(fā)波長485nm和熒光波長538nm處定量粘附。用相對于I孔中播種的總細(xì)胞數(shù)的百分率表示粘附率。脾細(xì)胞的結(jié)果示于圖5(A)，CD4+T細(xì)胞的結(jié)果示于圖5(B)。粘附率的圖用3次獨(dú)立實驗的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以及“μ”表示在Student t檢驗中分別為P < O. 05以及P < 0.01。由圖5(A)可見，與沒有受RGMa刺激的脾細(xì)胞相比較，受RGMa刺激的脾細(xì)胞對纖連蛋白的粘附率顯著提高。同樣地，由圖5(B)可見，與沒有受RGMa刺激的⑶4+T細(xì)胞相比較，受RGMa刺激的CD4+T細(xì)胞對ICAM-I的粘附率顯著提高。由這些結(jié)果可見，RGMa通過活化Rapl，增強(qiáng)了脾細(xì)胞以及⑶4+T細(xì)胞的粘附活性?！矊嵤├?:在多發(fā)性硬化癥模型小鼠中研究抗RGMa中和抗體的效果〕(2-1)多發(fā)性硬化癥模型小鼠的制備作為多發(fā)性硬化癥的臨床以及病理學(xué)特征的研究模型而廣泛接受的模型動物，使用以髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,下文中稱為“M0G” )誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,下文中稱為“EAE”)小鼠。具體而言，使用包含100 μ g (MOG) 35_55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(序列編號5) ,Greiner Bio-one)的 100 μ L PBS 以及包含500 μ g結(jié)核死菌(H37Ra，Difco)的100 μ L弗氏完全佐劑的乳濁液200 μ L脅腹皮下施與C57BL/6小鼠(8 10周齡)而誘導(dǎo)ΕΑΕ。進(jìn)一步地，MOG施與后以及MOG施與48小時后，靜脈內(nèi)施與 200ng 百日咳毒素(List Biological Laboratories)。
(2-2)通過向多發(fā)性硬化癥模型小鼠施與抗RGMa中和抗體觀察臨床癥狀MOG施與后第7天以及第10天日腹腔內(nèi)施與本發(fā)明者們制備的抗RGMa中和抗體(參照非專利文獻(xiàn)3)或?qū)φ湛贵w(兔IgG, Sigma-Aldrich)各400 μ g?？筊GMa中和抗體施與組由9只、對照抗體施與組由11只EAE小鼠組成。自MOG施與日(O天)至21天進(jìn)行觀察，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評價EAE的臨床癥狀。O :無異常O. 5 :喪失尾的緊張I :喪失尾的反射性2 :喪失尾的反射性、正向反射低下、一肢的知覺異常3 :—肢的知覺異常以及麻痹 3. 5 :兩后肢的麻痹4:前肢以及后肢的麻痹5 :瀕死、死亡觀察結(jié)束后將小鼠安樂死，摘出脊髓，用低聚甲醛固定、制備石蠟包埋切片，供組織學(xué)評價。將切片用蘇木精-伊紅(HE)染色、評價炎癥。每只小鼠從頸髓至胸髓觀察20-30個切片，按照以下標(biāo)準(zhǔn)雙盲地進(jìn)行半定量的炎癥組織學(xué)評價(炎癥指數(shù))。對抗RGMa中和抗體施與組中的5只、對照抗體施與組中的6只進(jìn)行評價。O :沒有炎癥I :僅血管周圍以及髓膜的細(xì)胞浸潤2 :骨髓實質(zhì)的輕度的細(xì)胞浸潤3 :骨髓實質(zhì)的中等程度的細(xì)胞浸潤4 :骨髓實質(zhì)的重度的細(xì)胞浸潤圖6示出了觀察期間EAE評分的變化。用平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示EAE評分。由圖6可見，與對照抗體施與組相比較，第14天以后抗RGMa中和抗體施與組的EAE評分是顯著降低的值。雖然在圖中沒有顯示，但是Student t檢驗的結(jié)果顯示第14天P <0.05、第15天以后P < O. 01，兩組間有統(tǒng)計上的顯著性差異。圖7 (A)顯示了在每組中EAE的臨床癥狀發(fā)生率、圖7 (B)顯示了在每組中EAE發(fā)病日的平均值、圖7(C)顯示了各組的各小鼠的評分最大值的平均值、圖7(D)顯示了各組的各小鼠的評分累積值的平均值。圖中“n. s. ”表示在Student t檢驗中沒有顯著性差異、“ ”以及表示在Student t檢驗中分別是P <0.05以及P <0.01。由圖7㈧可見，對照抗體施與組全部(100% )表現(xiàn)出EAE的臨床癥狀；但是在抗RGMa中和抗體施與組中有44%的小鼠沒有表現(xiàn)出EAE的臨床癥狀。另外，由圖7(B)可見，兩組間的發(fā)病日沒有差異，施與抗RGMa中和抗體不推遲EAE的發(fā)病。另一方面，由圖7(C)以及(D)可見，評分最大值的平均值以及評分累積值的平均值均是抗RGMa中和抗體施與組顯示顯著低于對照抗體施與組的值。這些結(jié)果表明，抗RGMa中和抗體的施與對抑制出現(xiàn)EAE的癥狀以及抑制其進(jìn)展是有效的。圖8示出了頸髓的HE染色組織圖像。(a)以及(b)是對照抗體施與組的HE染色組織圖像；(c)以及⑷是抗RGMa中和抗體施與組的HE染色組織圖像，比例尺表示250 μ m。由圖8(a)以及(b)可見，其顯示了對照抗體施與組的骨髓中廣泛存在炎癥性單核細(xì)胞、大范圍的炎癥性病變。另一方面，由(C)以及(d)可見，其顯示了抗RGMa中和抗體施與組的骨髓中炎癥性單核細(xì)胞顯著減少、炎癥病變減輕。圖9顯示了炎癥指數(shù)的評價結(jié)果。圖中表示在Student t檢驗中P <0.05。由圖9可見，與對照抗體施與組相比較，其顯示了抗RGMa中和抗體施與組的炎癥指數(shù)表現(xiàn)顯著的低數(shù)值。自以上的使用多發(fā)性硬化癥模型小鼠的實驗結(jié)果，明確了抗RGMa中和抗體的施與減輕了 EAE的臨床癥狀以及組織學(xué)的病變這兩者?！矊嵤├?:研究施與抗RGMa中和抗體的多發(fā)性硬化癥模型小鼠的脾細(xì)胞中的T細(xì)胞活化〕自結(jié)束了實施例2的臨床癥狀觀察的多發(fā)性硬化癥模型小鼠(EAE小鼠)在MOG施與后第21天摘出脾臟，分離脾細(xì)胞，以5 X IO5個/孔播種在96孔板中，培養(yǎng)3天，分析細(xì) 胞增殖。對于培養(yǎng)基，使用包含谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素、2-ME、以及10%熱滅活FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。為了再刺激⑶4+T細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)開始時添加20 μ g/mL的MOG肽或5 μ g/mL 的抗 CD3 單克隆抗體(2C11,BD Biosciences)。按照 Kubo 等人的方法(Kubo, T.，等人，J. Immunol. 173，7249-7258 (2004))，評價培養(yǎng)結(jié)束前18小時的[3H]胸苷攝入。為了測定IFNi、IL-2、IL-4以及IL-17的生成量，將上述脾細(xì)胞以2X106個/孔播種在24孔板，在20 μ g/mL的MOG肽或5 μ g/mL的抗CD3單克隆抗體存在下或不存在下進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)開始后24小時的培養(yǎng)上清用于IL-2的測定；將培養(yǎng)開始后72小時的培養(yǎng)上清用于其他細(xì)胞因子的測定。使用ELISA試劑盒(InvitiOgen)按照說明書所述進(jìn)行細(xì)胞因子的測定。圖10中顯示了結(jié)果。(a)是細(xì)胞增殖的測定結(jié)果、(b)是IL-2的測定結(jié)果、(C)是IFN-Y的測定結(jié)果、(d)是IL-17的測定結(jié)果。各圖用平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差(對照抗體施與組η = 6、抗RGMa中和抗體施與組η = 5)表示以及分別表示在Student t檢驗中P < O. 05以及P < O. 01。由圖10(a)可見，與自對照抗體施與組的小鼠獲得的脾細(xì)胞的細(xì)胞增殖相比較，在MOG肽進(jìn)行抗原特異的刺激以及抗CD3單克隆抗體進(jìn)行非特異的刺激的任一情形中均顯示出自抗RGMa中和抗體施與組的小鼠獲得的脾細(xì)胞的細(xì)胞增殖顯著地低。另外，由圖10(b)、(c)、(d)可見，與自對照抗體施與組的小鼠獲得的脾細(xì)胞的各細(xì)胞因子分泌量相比較，在MOG肽進(jìn)行抗原特異的刺激以及抗CD3單克隆抗體進(jìn)行非特異的刺激的任一情形中均顯示出自抗RGMa中和抗體施與組的小鼠獲得的脾細(xì)胞的IL-2、IFN-Y以及IL-17的分泌量顯著地低。另一方面，雖然沒有給出數(shù)據(jù)，但是抗RGMa中和抗體的施與不影響IL-4的分泌量。這些結(jié)果表明，向EAE小鼠施與抗RGMa中和抗體顯著減弱了 EAE小鼠中抗原特異的以及非特異的T細(xì)胞活化?！矊嵤├?:在再發(fā)性多發(fā)性硬化癥模型小鼠中研究抗RGMa中和抗體的效果〕(4-1)再發(fā)性多發(fā)性硬化癥模型小鼠的制備代替M0G,將髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(myelin proteolipid protein,以下稱為“PLP”)施與S幾/J小鼠，制備再發(fā)性EAE模型小鼠。具體而言，再發(fā)性EAE是通過將包含100μ g(PLP)139_151 肽(HSLGKWLGHPDKF (序列編號 6)，Greiner Bio-one)的 IOOyL PBS 和包含500 μ g結(jié)核死菌(H37Ra，Difco)的100 μ L弗氏完全佐劑的乳濁液200 μ L脅腹皮下施與SJL/J小鼠(8 10周齡)而誘導(dǎo)的。進(jìn)一步地，PLP施與后以及PLP施與48小時后，靜脈內(nèi)施與 200ng 百日咳毒素(List Biological Laboratories)。
(4-2)通過向再發(fā)性多發(fā)性硬化癥模型小鼠施與抗RGMa中和抗體觀察臨床癥狀PLP施與后第25天以及第28天，腹腔內(nèi)施與各400 μ g的本發(fā)明者們制備的抗RGMa中和抗體(參照非專利文獻(xiàn)3)或?qū)φ湛贵w(兔IgG, Sigma-Aldrich)。抗RGMa中和抗體施與組由9只、對照抗體施與組由11只的EAE小鼠組成。自PLP施與(第O天)至第45天進(jìn)行觀察，根據(jù)上述實施例2所述的標(biāo)準(zhǔn)評價EAE的臨床癥狀。圖11示出了觀察期間EAE評分的變化。用平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差表示EAE評分。圖中表示在Student t檢驗中P < O. 05。由圖11可見，與對照抗體施與組的EAE評分相比較，抗體施與后的抗RGMa中和抗體施與組的EAE評分是顯著的低值。該結(jié)果表明，通過在最初麻痹表現(xiàn)期的后期施與抗RGMa中和抗體，能夠預(yù)防EAE的再發(fā)?！矊嵤├?:在MOG刺激的BMDCs移植小鼠中研究RGMa基因敲低對EAE臨床癥狀的效果〕(5-1) RGMa基因敲低的BMDCs的制備 購頭和使用以下所不喊基序列的小鼠RGMa siRNA (Stealth RNAi (商品名)，Invitrogen)。另外，使用非祀向 dsRNA(Invitrogen)作為對照 siRNA。有義鏈5，-AAAGAGGCCGCAGUGAGUGUAGUUG-3，(序列編號7)反義鏈5’-CAACUACACUCACUGCGGCCUCUUU-3’ (序列編號 8)使用培養(yǎng)開始后7天的BMDCs (參照實施例I)。在包含500pmol小鼠RGMa siRNA或?qū)φ誷iRNA的100 μ L核酸導(dǎo)入用溶液中懸浮I X IO6個BMDCs。將樣本移至小杯中，使用Nucleofector (注冊商標(biāo))裝置(Lonza社)，按照制造者所附的說明書，將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞。在siRNA導(dǎo)入后，使用添加了谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素、2-ME、10 %熱滅活FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。導(dǎo)入了小鼠RGMa siRNA的BMDCs中的RGMa的表達(dá)顯著降低。(5-2) MOG刺激以及向小鼠的移植向?qū)肓诵∈?RGMa siRNA 或?qū)φ?siRNA 的 BMDCs 添加 100 μ g/mL 的(MOG) 35_55肽，培養(yǎng)4 6小時，從而給予抗原刺激。將刺激后的6X IO5個活細(xì)胞靜脈內(nèi)施與接受體的小鼠(C57BL/6)。接下來，皮下施與包含500 μ g結(jié)核死菌(H37Ra，Difco)的弗氏完全佐劑200yL。進(jìn)一步地，在48小時后靜脈內(nèi)施與200ng百日咳毒素(List BiologicalLaboratories)。(5-3) EAE臨床癥狀的觀察對RGMa siRNA組(5只)以及對照siRNA組(5只)，自細(xì)胞移植(第O天)至第21天進(jìn)行觀察，按照上述實施例2所述的標(biāo)準(zhǔn)評價EAE的臨床癥狀。觀察期間的EAE評分的變化示于圖12。EAE評分用平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。圖中以及分別表示在Student t檢驗中P < 0.05以及P < 0.01。由圖12可見，與對照siRNA組的EAE評分相比較，RGMa siRNA組的EAE評分是顯著的低值。由該結(jié)果可見，RGMa siRNA有效地預(yù)防或治療多發(fā)性硬化癥。〔實施例6:在受MOG刺激的⑶4+T細(xì)胞移植小鼠中研究抗RGMa中和抗體對EAE臨床癥狀的效果〕(6-1)供體小鼠的⑶4+T細(xì)胞的制備向供體小鼠(C57BL/6)腹腔內(nèi)施與本發(fā)明者們制備的抗RGMa中和抗體(參照非專利文獻(xiàn)3)或?qū)φ湛贵w(兔IgG, Sigma-Aldrich)各400 μ g (第_2天)。2天后(第O天)，第二次施與抗RGMa中和抗體或?qū)φ湛贵w，同時皮下施與包含100 μ g (MOG) 35-55肽的100 μ LPBS和包含500 μ g結(jié)核死菌(H37Ra，Difco)的100 μ L弗氏完全佐劑的乳濁液200 μ L。進(jìn)一步地，在其5天后(第5天)，第三次施與抗RGMa中和抗體或?qū)φ湛贵w。自MOG施與的第10天，將小鼠安樂死，取出脾臟以及引流區(qū)淋巴結(jié)，分離細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。為了再刺激CD4+T細(xì)胞，用包含40 μ g/mL的(MOG) 35_55肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(I X IO6個/mL) 3天。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，使用⑶4+T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec)分離⑶4+T細(xì)胞。(6-2)向接受體小鼠的移植以及EAE臨床癥狀的觀察預(yù)先用亞致死量(500Gy)的放射線照射接受體小鼠(C57BL/6)。將6X IO5個CD4+T細(xì)胞(活細(xì)胞)靜脈內(nèi)施與接受體小鼠。對于移植來自施與了抗RGMa中和抗體的供體小鼠的CD4+T細(xì)胞的小鼠(抗RGMa中和抗體組，7只)以及移植來自施與了對照抗體的供體小鼠的CD4+T細(xì)胞的小鼠(對照抗體組，7只)，自細(xì)胞移植(第O天)至第21天進(jìn)行觀察，按照上述實施例2所述的標(biāo)準(zhǔn)評價EAE的臨床癥狀。 觀察期間的EAE評分的變化示于圖13。EAE評分用平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。圖中以及分別表示在Student t檢驗中P < 0.05以及P < 0.01。由圖13可見，與對照抗體組的EAE評分相比較，抗RGMa中和抗體組的EAE評分是顯著的低值。由該結(jié)果可見，由抗RGMa中和抗體所致的對多發(fā)性硬化癥的預(yù)防或治療效果是基于抗RGMa中和抗體抑制抗原特異的T細(xì)胞活化和/或自身反應(yīng)性T細(xì)胞的分化。以上結(jié)果解明了，RGMa參與了通過單核細(xì)胞對脊髓的浸潤以及T細(xì)胞活化等增大免疫應(yīng)答引起的EAE的發(fā)病，其中所述T細(xì)胞活化是T細(xì)胞的增殖和/或EAE相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-17以及IFN-Y的產(chǎn)生等。進(jìn)一步地，顯示了抗RGMa中和抗體和RGMa siRNA抑制T細(xì)胞的活化，對于預(yù)防或治療多發(fā)性硬化癥是有效的。另外，本發(fā)明不限于上述各實施方案以及實施例，而是能在權(quán)利要求所示的范圍進(jìn)行多種變更，將不同實施方案中分別公開的各技術(shù)的手段進(jìn)行適宜組合得到的實施方案也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍中。另外，本說明書中所述的全部學(xué)術(shù)文獻(xiàn)以及專利文獻(xiàn)均在本說明書中援引作為參考。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明在醫(yī)藥品產(chǎn)業(yè)具有極高的利用價值。
權(quán)利要求
1.T細(xì)胞活化抑制劑，其以RGM抑制物質(zhì)作為有效成分。
2.權(quán)利要求I所述的T細(xì)胞活化抑制劑，其中RGM抑制物質(zhì)是抗RGM中和抗體。
3.權(quán)利要求I所述的T細(xì)胞活化抑制劑，其中RGM抑制物質(zhì)是RGMsiRNA。
4.T細(xì)胞活化所引起的疾病的預(yù)防或治療用藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求I至3中任一項所述的T細(xì)胞活化抑制劑。
5.權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中T細(xì)胞活化所引起的疾病是自身免疫病。
6.權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中自身免疫病是多發(fā)性硬化癥。
7.抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法，其特征在于包括使受試物質(zhì)與RGM接觸的步驟、測定所述RGM的活性水平的步驟、將所述活性水平與沒有接觸受試物質(zhì)的RGM的活性水平進(jìn)行比較的步驟、和選擇使RGM的活性水平降低的受試物質(zhì)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了T細(xì)胞活化抑制劑，其以抗RGM中和抗體等的RGM抑制物質(zhì)作為有效成分。所述T細(xì)胞活化抑制劑作為多發(fā)性硬化癥等的自身免疫病和/或其它的由于T細(xì)胞活化所引起的疾病的預(yù)防或治療用藥物組合物是有用的。另外，通過將受試物質(zhì)與RGM接觸，選擇使RGM的活性水平降低的受試物質(zhì)，能夠篩選抑制T細(xì)胞活化的物質(zhì)。
文檔編號A61K45/00GK102811739SQ20108006337
公開日2012年12月5日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者山下俊英, 久保武一 申請人:田邊三菱制藥株式會社