專利名稱：一種hiv重組亞型dna疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
HIV/AIDS是目前全人類共同面對(duì)的最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前全球現(xiàn)存的HIV病毒攜帶者約為3060萬(wàn) 3610萬(wàn)人；另?yè)?jù)我國(guó)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示截止2007年底，中國(guó)現(xiàn)存艾滋病病毒感染者和病人約70萬(wàn)(55萬(wàn) 85萬(wàn)人)，其中艾滋病病人8. 5萬(wàn) (8萬(wàn) 9萬(wàn)人)。在經(jīng)過(guò)了近25年的研究之后，人類對(duì)艾滋病病毒的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步， 例如在致病機(jī)理方面，人類免疫缺陷病毒(HIV)的基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白相繼被闡明，病毒的受體和輔助受體相繼被發(fā)現(xiàn)；在藥物治療方面，核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)、蛋白酶抑制劑(PI)相繼研制成功，并應(yīng)用于臨床，取得了良好效果，等等。盡管如此，我們離真正克服艾滋病還有很長(zhǎng)一段距離，而造成這一局面的重要原因之一就是HIV病毒的迅速變異。HIV病毒的迅速變異導(dǎo)致了多種不同亞型和重組流行株出現(xiàn)，并且這些亞型和重組株在全球呈現(xiàn)不均勻分布，這在客觀上給HIV疫苗的研究帶來(lái)了極大的困難。在研制出具有廣泛交叉保護(hù)能力的“理想"HIV疫苗之前，根據(jù)特定地區(qū)的HIV-I優(yōu)勢(shì)流行亞型，有針對(duì)性的設(shè)計(jì)疫苗不失為一個(gè)合理的選擇。此外，以往的HIV疫苗研究經(jīng)驗(yàn)提示我們特異性免疫反應(yīng)的廣度對(duì)HIV疫苗的保護(hù)效果十分重要，而提高疫苗免疫反應(yīng)廣度的重要手段之一便是增加疫苗所包含的抗原種類。就HIV-I而言，理想的疫苗不僅要包括feg、P0l、Env 三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，還應(yīng)包括Tat、Nef、Rev等調(diào)節(jié)蛋白。近年來(lái)，特別是在Merck疫苗三期臨床試驗(yàn)失敗后，由多個(gè)病毒抗原基因聯(lián)合構(gòu)成免疫原的疫苗設(shè)計(jì)策略在國(guó)際上逐漸興起，國(guó)內(nèi)這方面研究開(kāi)展較少，尤其是針對(duì)HIV-I AE重組亞型病毒的疫苗研究尚處于空白階段。在HIV-I疫苗研制上，針對(duì)HIV-I胞膜蛋白Env的疫苗已有較多研究，但是已有的針對(duì)HIV -1胞膜蛋白Env疫苗尚不能十分有效的誘導(dǎo)中和抗體。最近，許多研究轉(zhuǎn)向了研制針對(duì)HIV-I病毒相對(duì)比較保守結(jié)構(gòu)蛋白gag和調(diào)節(jié)蛋白tat的疫苗上，Gag蛋白表面富含CTL表位和T輔助細(xì)胞表位，以其為靶蛋白開(kāi)發(fā)的DNA疫苗能誘發(fā)有效的中和抗體和CTL 反應(yīng)，且可能對(duì)不同亞型病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)，因而成為目前HIV疫苗研究的熱點(diǎn)之一。HIV Tat蛋白亦是HIV較為保守的蛋白，在病毒感染早期表達(dá)，并對(duì)病毒生活周期是必需的，Tat 蛋白增加HIV病毒在體內(nèi)傳播的速度，對(duì)Tat蛋白高水平的體液和細(xì)胞免疫與良好的預(yù)后呈正相關(guān)，Tat疫苗所誘導(dǎo)的抗體能中和胞外Tat對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)的損害，控制AIDS相關(guān)疾病的發(fā)生。最近Rezza等通過(guò)對(duì)252只感染HIV-I猴子的動(dòng)物試驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)高水平的 anti-Tat抗體伴隨HIV長(zhǎng)期非進(jìn)展性感染(long-term nonprogression)，而anti-Tat抗體陰性的動(dòng)物則很快進(jìn)展為免疫缺陷。針對(duì)Nef、Rev、Pol等蛋白的單價(jià)疫苗亦有大量研究， 但效果均欠佳。于是有許多研究將重點(diǎn)放在了 HIV-I多基因融合DNA疫苗研制上，因?yàn)橐呙缯T發(fā)的免疫反應(yīng)的廣度對(duì)HIV-I疫苗的保護(hù)效果有著深遠(yuǎn)的影響機(jī)體免疫系統(tǒng)所能識(shí)別的關(guān)鍵表位越多，病毒就越不容易逃逸。而現(xiàn)有的候選疫苗在抗原構(gòu)成上多以HIV-I的結(jié)構(gòu)蛋白為主，主要包含feg、Pol和Env;在調(diào)節(jié)蛋白中，通常僅包含Nef蛋白。從提高疫苗免疫反應(yīng)廣度的角度來(lái)看，這樣的抗原構(gòu)成是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，為了改善這一狀況，很有必要構(gòu)建HIV-I結(jié)構(gòu)蛋白feig、Pol、Env與Tat、Nef、Rev調(diào)節(jié)蛋白基因的融合DNA疫苗并評(píng)價(jià)其免疫原性。我國(guó)是一個(gè)HIV-I多亞型平行流行的國(guó)家，流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國(guó)HIV流行株中，AE重組亞型HIV-I是我國(guó)主要的HIV-I流行亞型之一，本研究擬以該亞型病毒研究對(duì)象，構(gòu)建包括e/^、/7o入識(shí)仏iai、/^/和rer基因在內(nèi)的DNA疫苗，并初步驗(yàn)證其免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)設(shè)計(jì)與合成密碼子優(yōu)化后的融合基因序列，
(2)DNA疫苗的構(gòu)建和體外表達(dá)能力測(cè)定
A 重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行W)瓊脂糖凝膠電泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段長(zhǎng)度為3423bp， 載體片段長(zhǎng)度為5071 bp。電泳結(jié)果顯示酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。DNA 雙向序列測(cè)定結(jié)果顯示插入序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致；
B TRIVN融合蛋白真核表達(dá)用LipofectamineTM 2000將空載體質(zhì)粒與重組質(zhì)粒AE-Gpl45TRN分別轉(zhuǎn)染四31~細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備蛋白樣品進(jìn)行 Western-Blot驗(yàn)證。在各泳道上樣量基本相當(dāng)?shù)那闆r下，Western-Blot結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染產(chǎn)物中出現(xiàn)約190KDa的特異性條帶，與預(yù)期大小一致。本發(fā)明用LipofectamineTM 2000將空載體質(zhì)粒與重組質(zhì)粒AE_Gpl45TRN分別轉(zhuǎn)染四31~細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備蛋白樣品進(jìn)行Western-Blot驗(yàn)證。在各泳道上樣量基本相當(dāng)?shù)那闆r下，Western-Blot結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染產(chǎn)物中出現(xiàn)約190KDa的特異性條帶，與預(yù)期大小一致。本發(fā)明Gpl45-Tat-Rev_Nef編碼基因的密碼子優(yōu)化和基因合成是通過(guò)Los Alamos HIV Database調(diào)取HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在線軟件，按照哺乳動(dòng)物的密碼子偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在抗原基因密碼子優(yōu)化合成過(guò)程中，按照文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)2個(gè)基因分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因簡(jiǎn)稱為 AE-Gp145TRN。本發(fā)明按常規(guī)分子克隆方法將Ml I和EcoR V雙酶切的tat-rev-integrase(c-h alf) -vif-nef基因連接入表達(dá)載體，通過(guò)限制性酶切和DNA測(cè)序的方法對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，采用德國(guó)QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit試劑盒進(jìn)行大量制備，制備好的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒溶于無(wú)菌的PBS溶液中，pH7. 2，調(diào)整濃度為lmg/ml。本發(fā)明采用覆蓋HIV-lAE2f亞型Env，Tat，Rev，htegrase，Vif和Nef全長(zhǎng)蛋白的肽庫(kù)來(lái)進(jìn)行特異性T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)。本發(fā)明以AE重組亞型HIV-I病毒為研究對(duì)象，構(gòu)建包括env、pol、gag、tat、nef 和基因在內(nèi)的DNA疫苗，與AE-TRIVN相比，AE_Gpl45TRN能夠使特異性T細(xì)胞反應(yīng)在Tat、Rev、Nef三個(gè)蛋白間更均勻的分布，提高了疫苗所活化的免疫反應(yīng)廣度。


圖1是DNA疫苗AE-Gp 145TRN的酶切鑒定結(jié)果，1泳道為AE-Gp 145TRN的BamHI/ XbaI雙酶切產(chǎn)物。圖2重組質(zhì)粒AE_Gpl45TRN的體外表達(dá)驗(yàn)證，1泳道為空載體對(duì)照，3泳道為 AE-Gpl45TRN的轉(zhuǎn)染后產(chǎn)物，1泳道與3泳道的蛋白上樣量基本一致。圖3各組間總T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度的比較。圖4特異性T細(xì)胞反應(yīng)在不同病毒蛋白間分布的比較。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒感受態(tài)大腸桿菌DH5 α和轉(zhuǎn)染用細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá) HIV-lAE2f tat~rev~integrase (c-hafl)-vif-nef1 融合基因的 DNA 疫苗由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院提供。工具酶和主要試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和其他工具酶均購(gòu)自大連寶生物公司。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)hvitrogen公司。質(zhì)粒大量提取盒 EndoFree Plasmid Giga Kit 購(gòu)自德國(guó) QIAGEN 公司。Mouse IFN-y ELISP0T 試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。本研究中采用覆蓋HIV_lAE2f亞型Env，Tat，Rev，htegrase (C-half 144 aas)，Vif和Nef全長(zhǎng)蛋白的肽庫(kù)來(lái)進(jìn)行特異性T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)。編碼基因的密碼子優(yōu)化和基因合成通過(guò)Los Alamos HIV Database調(diào)取 HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在線軟件(http://www. jcat. de/)，按照哺乳動(dòng)物的密碼子偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化。為了消除野生型的tat、基因潛在安全隱患，在抗原基因密碼子優(yōu)化合成過(guò)程中，我們按照文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)上述2個(gè)基因分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變 Tat (C27S/K51T/R55L/G79A)，Nef (K144R/D174K)，合成基因簡(jiǎn)稱為 AE_Gpl45TRN。疫苗構(gòu)建、鑒定和大量制備按常規(guī)分子克隆方法將Ml I和EcoR V雙酶切的t at-rev-integrase (c-half) -vif-nef基因連接入表達(dá)載體，通過(guò)限制性酶切和DNA測(cè)序的方法對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，采用德國(guó)QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit試劑盒進(jìn)行大量制備，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將制備好的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒溶于無(wú)菌的PBS溶液中(ρΗ7· 2)，調(diào)整濃度為lmg/ml。體外轉(zhuǎn)染與表達(dá)鑒定在6孔板中接種5X IO6個(gè)/ml 293T細(xì)胞2 ml，培養(yǎng)過(guò)夜， 至細(xì)胞鋪滿各孔的90%-95%，換用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM，每孔2 ml。隨后，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。4 后收取細(xì)胞，制備蛋白樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE。電泳所得的凝膠進(jìn)行濕轉(zhuǎn)OOO mA電流，120 min)，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。放入5%脫脂奶里封閉1 h，按1 :100 加入稀釋的HIV-I陽(yáng)性血清，室溫反應(yīng)2 h，PBST洗滌3次，再加入1 :2000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體，室溫反應(yīng)1 h，PBST洗滌3次，加入DAB底物進(jìn)行膜上顯色。動(dòng)物免疫將體重為18 22 g的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組空載體對(duì)照組、AE-TRIVN免疫組和AE-Gpl45TRN免疫組。分別于0、2、4、7周在小鼠右側(cè)脛前肌注射100 μ g DNA。于第9周分離脾細(xì)胞進(jìn)行免疫檢測(cè)。細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)ELISP0T平板每孔加入100 μ 1包被抗體，4°C包被過(guò)夜后用1640完全培養(yǎng)基洗滌3次，加入封閉液200 μ 1/孔，室溫封閉2 h，棄去封閉液，將分離的小鼠脾細(xì)胞按2 X IO5每孔加入ELISP0T板，實(shí)驗(yàn)孔加入多肽(終濃度4 μ g/ml)，陽(yáng)性孔加入PMA (終濃度20 ng/ml)和ionomycine (終濃度500 ng/ml)，空白對(duì)照只加入脾細(xì)胞， 補(bǔ)充1640完全培養(yǎng)基至100 μ 1,37°C,5%C02孵育20 h，棄去細(xì)胞懸液，每孔加入200 μ 1 去離子水洗2次后換用PBST溶液洗滌3次，甩去洗液，拍干，用含10%血清的PBS按1 :250 稀釋檢測(cè)抗體，每孔加入100 μ 1，室溫孵育2 h。PBST洗滌3次后，用含10%血清的PBS按 1 100稀釋HRP標(biāo)記抗體，每孔加入100 μ 1于ELISP0T板中，室溫孵育1 h。棄掉液體，拍干。每孔加入100 μ 1底物，閉光放置5-30 min后用去離子水終止顯色。晾干，用北京賽智ChampSpot III酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均值的統(tǒng)計(jì)比較使用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，以p<0. 05作為差異有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例2
A 重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行W)瓊脂糖凝膠電泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段長(zhǎng)度為3423bp， 載體片段長(zhǎng)度為5071 bp。電泳結(jié)果顯示酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，結(jié)果參見(jiàn)圖1。 DNA雙向序列測(cè)定結(jié)果顯示插入序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致；
B TRIVN融合蛋白真核表達(dá)用LipofectamineTM 2000將空載體質(zhì)粒與重組質(zhì)粒AE-Gpl45TRN分別轉(zhuǎn)染四31~細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備蛋白樣品進(jìn)行 Wiestern-Blot驗(yàn)證。在各泳道上樣量基本相當(dāng)?shù)那闆r下，Western-Blot結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染產(chǎn)物中出現(xiàn)約190KDa的特異性條帶，與預(yù)期大小一致(圖2)，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。HIV-lae2f gpl45/tat/rev/nef 3417bp，序列中 1 2109 :gpl45，2122 2415 :tat 突變?cè)O(shè)計(jì)(C27S/K51T/R55L/G79A) ,2428^2793 :rev, 2806^2417 :nef 突變?cè)O(shè)計(jì)(K144R/ D174K)，粗體顯示的是由四個(gè)甘氨酸組成的連接子，克隆位點(diǎn)5、端)(ba 端BamH I。免疫原性評(píng)價(jià)
在DNA疫苗的設(shè)計(jì)上，主要解決了以下兩方面的問(wèn)題 (1) DNA疫苗的安全性，包括Tat蛋白的突變失活、整合酶的去除野生型的HIV-I Tat蛋白有潛在毒性，它不僅能夠激活處于靜息狀態(tài)的HIV-I前病毒，還能夠?qū)λ拗骷?xì)胞造成負(fù)面影響。為了消除野生型Tat的負(fù)面影響，我們將在序列設(shè)計(jì)過(guò)程中按照文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)Tat蛋白進(jìn)行突變失活，共涉及四個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，分別為 C27S，K51T，R55L和G79A。上述四個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合突變既能夠很好的消除Tat蛋白對(duì)病毒基因和細(xì)胞基因調(diào)節(jié)作用，同時(shí)又不會(huì)削弱Tat的免疫原性。此外，為了避免整合酶可能帶來(lái)的潛在危險(xiǎn)，我們亦將其從Pol蛋白去除。疫苗的免疫原性
構(gòu)建env-tat-nef-rev融合基因DNA疫苗，提高疫苗免疫反應(yīng)廣度。a.免疫結(jié)束后3周無(wú)菌分離小鼠脾細(xì)胞，采用HIV-lAE2f肽庫(kù)刺激后，用Elispot 方法進(jìn)行特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)。顯示的結(jié)果為扣掉本底(未加肽刺激孔的斑點(diǎn)數(shù))后的每10萬(wàn)個(gè)脾淋巴細(xì)胞的Elispot斑點(diǎn)數(shù)；每只小鼠的總反應(yīng)強(qiáng)度是將Tat，Rev和Nef共三個(gè)肽池的斑點(diǎn)數(shù)疊加后的結(jié)果。從總T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度來(lái)看AE-TRIVN(148士91 SFCs/ΙΟ6脾細(xì)胞)顯著高于Gpl45-TRN(55 ±28 SFCs/106脾細(xì)胞)，p=0. 017(圖3)。將總T細(xì)胞反應(yīng)按肽庫(kù)分解后，我們發(fā)現(xiàn)AE-TRIVN所激發(fā)的特異性T細(xì)胞反應(yīng)主要集中于Rev ；Gpl45_TRN 所激發(fā)的總T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度雖然相對(duì)較弱，但卻能使特異性T細(xì)胞反應(yīng)在Tat、Rev和Nef 三個(gè)抗原間的更加均勻的分布(圖4)。 b.技術(shù)方案分三步進(jìn)行第一步，從Los Alamos HIV Database中調(diào)取HIV_1AE2F 的Env、Gag, Pol、Tat、Rev、Nef蛋白的氨基酸序列，經(jīng)過(guò)必要的突變修飾之后，將其按人體細(xì)胞的密碼子偏好逆向翻譯成DNA序列，并送公司合成。第二步，利用合成基因構(gòu)建DNA疫苗，體外驗(yàn)證基因表達(dá)情況。第三步，DNA疫苗接種Balb/C小鼠，檢測(cè)小鼠體內(nèi)的特異性免疫反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)設(shè)計(jì)與合成密碼子優(yōu)化后的融合基因序列，(2)DNA疫苗的構(gòu)建和體外表達(dá)能力測(cè)定，A 重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行W)瓊脂糖凝膠電泳，其中，Gpl45TRN融合基因的片段長(zhǎng)度為3423bp， 載體片段長(zhǎng)度為5071 bp,電泳結(jié)果顯示酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，DNA雙向序列測(cè)定結(jié)果顯示插入序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致；B TRIVN融合蛋白真核表達(dá)用LipofectamineTM 2000將空載體質(zhì)粒與重組質(zhì)粒AE-Gpl45TRN分別轉(zhuǎn)染四31~細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備蛋白樣品進(jìn)行 Western-Blot驗(yàn)證，在各泳道上樣量基本相當(dāng)?shù)那闆r下，Western-Blot結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染產(chǎn)物中出現(xiàn)約190KDa的特異性條帶，與預(yù)期大小一致。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于， Gpl45-Tat-Rev_Nef編碼基因的密碼子優(yōu)化和基因合成是通過(guò)Los Alamos HIV Database 調(diào)取HIV-lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在線軟件，按照哺乳動(dòng)物的密碼子偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在抗原基因密碼子優(yōu)化合成過(guò)程中，按照文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)2個(gè)基因分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變:Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因簡(jiǎn)稱為 AE_Gpl45TRN。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于，按常規(guī)分子克隆方法將Sal I和EcoR V雙酶切的tat-rev-integrase (c-half)-vif-nef基因連接入表達(dá)載體，通過(guò)限制性酶切和DNA測(cè)序的方法對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后，采用德國(guó) QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit試劑盒進(jìn)行大量制備，制備好的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒溶于無(wú)菌的PBS溶液中，pH7. 2，調(diào)整濃度為lmg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，其特征在于，采用覆蓋HIV_lAE2f亞型Env，Tat, Rev, Integrase, Vif和Nef全長(zhǎng)蛋白的肽庫(kù)來(lái)進(jìn)行特異性 T細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種HIV重組亞型DNA疫苗的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)與合成密碼子優(yōu)化后的融合基因序列，DNA疫苗的構(gòu)建和體外表達(dá)能力測(cè)定。本發(fā)明以AE重組亞型HIV-1病毒為研究對(duì)象，構(gòu)建包括env、pol、gag、tat、nef和rev基因在內(nèi)的DNA疫苗，與AE-TRIVN相比，AE-Gp145TRN能夠使特異性T細(xì)胞反應(yīng)在Tat、Rev、Nef三個(gè)蛋白間更均勻的分布，提高了疫苗所活化的免疫反應(yīng)廣度。
文檔編號(hào)A61P31/18GK102210874SQ20111012761
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者盧微, 呂國(guó)才, 楊益大, 楊萍, 王曉燕, 謝玨, 鄭臨 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)