用于制備疫苗組合物的方法
【專利摘要】一種制備包含一種或多種吸附至氨基酸的抗原的組合物的方法，其中所述方法包括：(i)在中和溶液混合物的情況中混合一種或多種抗原的溶液與氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一種或多種抗原和所述氨基酸的吸附物；(ii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入期望的緩沖液中，由此形成所述組合物；并(iii)回收所述組合物；其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟(i)至(iii)。
【專利說明】用于制備疫苗組合物的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于制造無菌組合物的方法，所述無菌組合物包含結(jié)合至氨基酸的經(jīng)修飾的抗原。
[0002]發(fā)明背景
[0003]疫苗接種是免疫學(xué)原則對人類健康的公知且最成功的應(yīng)用。為了得到引入和批準(zhǔn)，疫苗必須是有效的，并且所有疫苗的效力經(jīng)常受到審查。有效的疫苗必須:誘導(dǎo)期望的免疫應(yīng)答；在貯存時是穩(wěn)定的；并且具有足夠的免疫原性。在非活疫苗的情況中，特別地，經(jīng)常必需控制施用后的抗原釋放。
[0004]已經(jīng)顯示了抗原與懸浮氨基酸的結(jié)合導(dǎo)致施用后抗原的緩慢釋放，由此通過延長暴露在優(yōu)化效力的情況中提高安全性。然而，包含此類抗原的配制劑的制造是成問題的，因為抗原吸附至氨基酸生成需要除去的不想要的化學(xué)副產(chǎn)物。此外，必須在無菌條件下實施方法。由于終產(chǎn)物是懸浮液，它不能通過過濾來滅菌，且由于活性成分是生物學(xué)的，它不能熱滅菌。因而，經(jīng)常通過在無菌套間內(nèi)離心制造無菌懸浮液。
[0005]美國專利4，070, 455描述了細碎的酪氨酸微粒，其具有其中分散的經(jīng)戊二醛處理的變應(yīng)原。該微粒通過混合酪氨酸在含水強酸中的溶液與經(jīng)戊二醛處理的豚草花粉的溶液，然后中和所得的溶液來制備。通過離心取出含有經(jīng)修飾的變應(yīng)原的酪氨酸微細顆粒。
[0006]EP0988862描述了用于免疫接種的抗原、TH-1誘導(dǎo)性佐劑和水微溶性氨基酸的配制劑。該配制劑如下制備，即在中和溶液混合物的情況中混合抗原和THl誘導(dǎo)性佐劑的溶液與微溶性氨基酸或衍生物在含水強酸中的溶液，由此共沉淀微溶性氨基酸和抗原。將所得的沉淀物通過離心自溶液取出，用新鮮緩沖液重建，并添加佐劑。
[0007]使用離心取出氨基酸/抗原沉淀物需要實質(zhì)性程度的無菌暴露和對操作員交互(operator interaction)的高度依賴性。本發(fā)明解決此問題。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的問題，其通過創(chuàng)建使用交叉流過濾分出抗原/氨基酸吸附物的系統(tǒng)實現(xiàn)。該系統(tǒng)改編死端式(dead end)過濾中常規(guī)使用的蒸汽可滅菌的燒結(jié)不銹鋼濾器，這通過在定制設(shè)計的閉合循環(huán)回路系統(tǒng)中納入它們來進行。由于添加新的緩沖液以維持體積和規(guī)格，這容許抗原/氨基酸吸附物和化學(xué)副產(chǎn)物經(jīng)由濾器取出。
[0010]技術(shù)要求基于不能末端滅菌或過濾經(jīng)修飾的變應(yīng)原酪氨酸吸附物(MATA)產(chǎn)物而發(fā)生，所述產(chǎn)物是不溶性的 ，并且必須在無菌設(shè)施中制造。為了確保無菌性，必需開發(fā)密閉的原地清洗(CIP)原地蒸汽(SIP)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的密閉性質(zhì)意味著不得不將不溶性MATA成分在配制和緩沖液更換步驟期間在溶液中維持懸浮。為了實現(xiàn)這點，如本文中描述的那樣開發(fā)連續(xù)交叉流過濾系統(tǒng)。
[0011]由于閉合性質(zhì)和蒸汽滅菌的能力，有可能在無菌套間外部定位硬件(盡管仍在受控生產(chǎn)區(qū)內(nèi))。因此，本發(fā)明與現(xiàn)有生產(chǎn)方法相比具有獨特的優(yōu)點。本發(fā)明的方法通過具有閉合無菌系統(tǒng)來實質(zhì)性降低抗原產(chǎn)物對環(huán)境的暴露。該方法還降低對物理干預(yù)的需要，這使該方法避免錯誤(error)和微生物污染兩者的風(fēng)險。[0012]依照本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備包含一種或多種吸附至氨基酸的抗原的組合物的方法，其中所述方法包括:
[0013]⑴在中和溶液混合物的情況中混合一種或多種抗原的溶液與氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一種或多種抗原和所述氨基酸的吸附物；
[0014](ii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并
[0015](iii)回收所述組合物；
[0016]其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟⑴至(iii)。
[0017]優(yōu)選地，氨基酸是微溶性氨基酸。[0018]優(yōu)選地，氨基酸是酪氨酸、色氨酸或其衍生物。更優(yōu)選地，氨基酸是酪氨酸。
[0019]優(yōu)選地，所述一種或多種抗原是用戊二醛修飾的。
[0020]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述一種或多種抗原自花粉、螨、霉、細菌或病毒衍生。
[0021]在一個實施方案中，所述方法包括制備組合物，該組合物包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原，所述方法包括:
[0022](i)用戊二醛修飾一種或多種花粉抗原；
[0023](ii)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經(jīng)修飾的花粉溶液；
[0024](iii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經(jīng)修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經(jīng)修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
[0025](iv)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并
[0026](V)回收所述組合物；
[0027]其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟(iii)至(V)。優(yōu)選地，在EU GMP‘C’級/IS07類環(huán)境中實施步驟(iii)至(V)。優(yōu)選地，在EU GMP ‘B’級/IS05類環(huán)境內(nèi)實施步驟⑴和(ii)。
[0028]在另一個實施方案中，所述方法包括制備組合物，該組合物包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原，其中所述方法包括:
[0029](i)將所述一種或多種花粉抗原提取到溶液中以形成花粉提取物溶液；
[0030](ii)過濾所述花粉提取物溶液以除去固體；
[0031](iii)實施交叉流過濾，并分離包含所述花粉抗原的保留物；
[0032](iv)用戊二醛修飾所述一種或多種花粉抗原；
[0033](V)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經(jīng)修飾的花粉溶液；
[0034](vi)無菌過濾所述經(jīng)修飾的花粉溶液；
[0035](vii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經(jīng)修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經(jīng)修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
[0036](viii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并
[0037](ix)回收所述組合物；
[0038]其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟(vii)至(ix)。優(yōu)選地，在EU GMP‘C’級/IS07類環(huán)境中實施步驟(vii)至(ix)。優(yōu)選地，在EU GMP ‘B’級/IS05類環(huán)境內(nèi)實施步驟⑴和(vi)。
[0039]花粉抗原可以是但不限于剪股穎(Bent)花粉、狐尾草(Foxtail)花粉、黃花茅(Sweet vernal)花粉、三毛草(False oat)花粉、雀麥(Brome)花粉、洋狗尾草(Cresteddogstail)花粉、鴨茅(Cocksfoot)花粉、羊茅(Fescue)花粉、絨毛草(Yorkshire fog)花粉、麥草(Rye grass)花粉、梯牧草(Timothy)花粉、草甸(Meadow)花粉和栽培黑麥(Cultivated rye)花粉。
[0040]優(yōu)選地，所述一種或多種抗原由剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉組成。
[0041 ] 優(yōu)選地，使用0.2 μ m孔徑濾器過濾花粉提取物溶液；
[0042]換言之，優(yōu)選地，組合物包含下組中的所有花粉，所述組由剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉組成。
[0043]優(yōu)選地，將花粉于約2至約8°C，更優(yōu)選地，約5°C提取到酚緩沖鹽水溶液，優(yōu)選為PH6.5(優(yōu)選地，其含有氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸二鈉、80%w/w液化酚和注射用水(WFI))中。
[0044]優(yōu)選地，將提取實施約12-30小時，更優(yōu)選地約14至約24小時，仍更優(yōu)選約18小時。
[0045]優(yōu)選地，使用5-10kDa分子量截留的膜實施如本文中描述的用于分離保留物和/或除去過量戊二醛的交叉流過濾。更優(yōu)選地，膜具有IOkDa分子量截留。
[0046]優(yōu)選地，使用多燒結(jié)不銹鋼濾器，更優(yōu)選5μπι多燒結(jié)不銹鋼濾器，優(yōu)選用1.1-1.3巴的壓力實施用于分出吸附物的交叉流過濾。
[0047]通過在中和混合物(優(yōu)選用NaOH進行)的情況中混合抗原與強酸，優(yōu)選無機酸，優(yōu)選氫氯酸(HCl)中的氨基酸形成包含抗原和氨基酸的吸附物。中和意指將pH調(diào)節(jié)至范圍
6.5至7.5，優(yōu)選6.8至7.2內(nèi)的數(shù)值。期望的是，在中和期間pH無時離開平衡或至少不長時間離開平衡，即移到PH范圍6.5至7.5外部或更優(yōu)選pH范圍6.8至7.2外部。
[0048]優(yōu)選地，強酸是具有約3.5M至約4.5M，優(yōu)選約3.8M的摩爾濃度的HCl。優(yōu)選地，NaOH具有約3至約3.5，優(yōu)選約3.2M的摩爾濃度。
[0049]優(yōu)選地,組合物是疫苗組合物。
[0050]在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物用作疫苗，并且抗原是可用于此類疫苗的抗原。
[0051]在多個實施方案中，可以將佐劑添加至組合物，諸如MPL、3-DMPL或其衍生物或鹽。
[0052]依照本發(fā)明的另一個方面，提供了通過本發(fā)明的方法制備的組合物。
[0053]發(fā)明詳述
[0054]本發(fā)明的多個優(yōu)選特征和實施方案現(xiàn)在會作為非限制性例子描述。
[0055]除非另有指示，本發(fā)明的實踐會采用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。此類技術(shù)在文獻中解釋。參見例如 J.Sambrook, E.F.Fritsch, and T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，Booksl-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M.等(1995 和定期增刊;Current Protocols in Molecular Biology,第 9 章，第 13 章，和第 16 章，John ffiley&Sons, New York, N.Y.) ;B.Roe, J.Crabtree, and A.Kahn, 1996, DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques, John Wiley&Sons;J.M.Polak andJames 0’ D.McGee，1990，In Situ Hybridization:Principles and Practice;OxfordUniversity Press;M.J.Gait (編)，1984，Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach, Irl Press;D.M.J.Lilley and J.E.Dahlbergj 1992,Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methodsin Enzymologyj Academic Press;及 Ε.Μ.Shevach and W.Stroberj 1992 及定期增干丨J，Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons, New York，NY。通過提及將這些通用教科書之每篇收入本文。
[0056]抗原
[0057]術(shù)語“抗原”用于指免疫應(yīng)答的適應(yīng)性(adaptive)元件(即B細胞或T細胞或兩者)可以特異性識別的任何分子。
[0058]優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的抗原是免疫原，即活化免疫細胞以產(chǎn)生針對自身的免疫應(yīng)答的抗原。
[0059]抗原可以通過重組手段或肽合成獲得，或者獲自天然來源或提取物，并且可以自任何活的或非活的生物體衍生。
[0060]抗原可以自細菌衍生，所述細菌諸如例如炭疽(anthrax)、彎曲桿菌(campylobacter)、霍亂(cholera)、白喉(diphtheria)、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(E.coli)、賈第蟲(giardia)、淋球菌(gonococcus)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、乙型流感嗜血菌(Hemophilus influenza B)、不可定型的流感嗜血菌、腦膜炎球菌(meningococcus)、百日咳(pertussis)、肺炎球菌(pneumococcus)、沙門氏菌(salmonella)、志賀氏菌(shigella)、鏈球菌B、A組鏈球菌、破傷風(fēng)(tetanus)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、耶爾森氏菌(yersinia)、葡萄`球菌(Staphylococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種和梭菌屬(Clostridia)物種。
[0061]或者，抗原可以自病毒衍生，所述病毒諸如例如腺病毒、登革熱I至4血清型、埃博拉病毒(ebola) (Jahrling 等，Arch Virol Suppl，11:135-140，1996)、腸道病毒、肝炎 A 至 E 血清型(Blum，Digestion56:85-95，1995;Katkov, Med ClinNorth Am80:189-200,1996;Lieberman and Greenberg, Adv Pediatr InfectDisll:333-363, 1996;Mast 等，Annu Rev Med47:257-266，1996)、單純皰疹病毒 I 或 2、人免疫缺陷病毒(D^rez等，Vaccinel4:375-382，1996)、流感、日本馬腦炎、麻疹、諾沃克(Norwalk)、乳頭瘤病毒、細小病毒B19、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、輪狀病毒、風(fēng)疹(rubella)、麻疹(rubeola)、痘苗、含有編碼其它抗原諸如瘧疾抗原的基因的痘苗構(gòu)建體、水痘(varicella)、和黃熱病(yellow fever)。寄生物包括例如:溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica) (Zhang 等，Infect Immun63:1349-1355);癥原蟲(Plasmodium) (Bathurst等，Vaccinell:449-456，1993)、弓形體病(Toxoplasmosis)、和螺蟲(Helminth)。
[0062]在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原是變應(yīng)原。術(shù)語“變應(yīng)原”用于描述引發(fā)不想要的免疫超敏感性或變應(yīng)性反應(yīng)的抗原。變態(tài)反應(yīng)是對環(huán)境抗原(變應(yīng)原)的超敏感性應(yīng)答。
[0063]本發(fā)明中使用的變應(yīng)原可以自任何引起變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)衍生，所述物質(zhì)諸如但不限于:花粉(例如剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉、豚草花粉、北艾(Mugwort)花粉、樺樹(Birch)花粉、棺木(Alder)花粉、榛樹(Hazel)花粉、橄欖樹(Olive)花粉、墻草(Pariateria)花粉、槭樹(Maple)(柊葉槭(Acer negundo))花粉、柏樹(Cypress)花粉和日本雪松(Japanese Cedar)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))花粉、食物、昆蟲毒液、霉和動物衍生材料諸如動物軟毛或螨諸如房塵螨(例如粉塵螨(D.farinae)或屋塵螨(D.pteronyssinus)或熱帶無爪螨(Blomia tropicalis))。
[0064]優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的抗原是花粉抗原。優(yōu)選地，花粉抗原是剪股穎花粉、狐尾草花粉、黃花茅花粉、三毛草花粉、雀麥花粉、洋狗尾草花粉、鴨茅花粉、羊茅花粉、絨毛草花粉、麥草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麥花粉。
[0065]抗原可以通過與在幫助避免不想要的不利效應(yīng)的情況中保留或增強抗原的期望的免疫原性特性的已知物質(zhì)(例如但不限于甲醛或戊二醛，優(yōu)選戊二醛)的反應(yīng)來化學(xué)修飾。
[0066]氨基酸
[0067]優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的氨基酸于25°C具有約1.1或更小的g/100ml H2O的水溶解度。特別優(yōu)選的氨基酸是酪氨酸或色氨酸；更加不溶的酪氨酸是優(yōu)選的。這些氨基酸的藥學(xué)可接受衍生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，諸如苯甲基-O-十八烷?；?L-酪氨酸。
[0068]制備
[0069]如下制備本發(fā)明的組合物，即混合抗原的水溶液與氨基酸在含水強酸中的溶液，并中和溶液混合物，由此共沉淀氨基酸和抗原。
[0070]通常，將抗原的水性溶液(優(yōu)選為pH6.3至7.2)與氨基酸在含水強酸中的溶液混合。強酸通常是無機酸，優(yōu)選是氫氯酸。此步驟中使用的抗原溶液通常含有多至0.15g/ml抗原蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，使用的氨基酸溶液是約24%w/v。
[0071]將抗原和氨基酸的溶液的所得混合物中和。期望的是，在中和期間溶液的pH無時偏離平衡或至少不長時間偏離平衡。若想要的話，此條件可以通過有力攪拌溶液并通過僅使用需要量的堿滿足。有用地，可以將各種緩沖劑諸如緩沖鹽水溶液添加至抗原溶液以幫助混合和中和階段期間的pH控制。
[0072]實施中和的特別有用的方法分開要流入抗原溶液中的氨基酸和中和性堿溶液的流。添加的溶液的流速受到PH狀態(tài)，即受到設(shè)備控制，所述設(shè)備調(diào)節(jié)一種或兩種溶液的流動，使得反應(yīng)混合物的PH在預(yù)先確定的水平保持基本上恒定。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了最佳結(jié)果通常通過范圍6.5至7.5，優(yōu)選6.8至7.2內(nèi)的pH控制獲得，盡管精確的pH可以隨抗原的性質(zhì)而變化。
[0073]中和的結(jié)果是氨基酸的立即沉淀，在所述氨基酸之內(nèi)和/或之上吸留和/或吸附抗原溶液。
[0074]交叉流過濾
[0075]可用于分級各種顆粒的方法是交叉流過濾或切向流過濾(TFF)。交叉流過濾是一種使用膜以基于大小或分子量差異來分出液體溶液或懸浮液中的組分的分離方法。在交叉流過濾中，將要過濾的溶液或懸浮液以交叉流模式通過膜表面。過濾的驅(qū)動力是跨膜壓。濾液通過膜表面的速度也控制過濾速率，并且?guī)椭乐鼓ざ氯?。由于交叉流過濾使保留物再循環(huán)通過膜表面，使膜阻塞最小化，維持高過濾速率，并且增強產(chǎn)物回收。
[0076]交叉流過濾裝置一般包含泵、進料溶液貯器、過濾模塊和用于連接這些元件的導(dǎo)管。使用中，將進料溶液從進料溶液貯器引導(dǎo)至過濾模塊，此時將來自過濾模塊的保留物從過濾模塊再循環(huán)到進料溶液貯器，直到獲得期望體積的保留物。
[0077]優(yōu)選地，維持1.1至1.3巴的壓力使用5μπι孔徑多燒結(jié)不銹鋼濾器實施本發(fā)明中用于分出包含經(jīng)修飾的抗原和氨基酸的吸附物的交叉流過濾。
[0078]閉合系統(tǒng)
[0079]閉合系統(tǒng)是一種分離的系統(tǒng)，其防止組合物暴露于系統(tǒng)外部的環(huán)境。組合物僅暴露于構(gòu)成閉合系統(tǒng)的管道和機器組件的緊接環(huán)境。本發(fā)明的閉合系統(tǒng)防止組合物的污染。它通過確保組合物相對于系統(tǒng)外部的環(huán)境密封，防止污染物進入該系統(tǒng)來實現(xiàn)這點。
[0080]佐劑
[0081]可以將佐劑添加至通過本發(fā)明的方法生成的組合物。優(yōu)選地，佐劑是THl誘導(dǎo)性佐劑。THl誘導(dǎo)性佐劑是增強針對抗原的THl應(yīng)答的佐劑。
[0082]可以通過測定針對抗原的抗體的概況(profile)測定佐劑作為THl誘導(dǎo)性佐劑的有效性，所述抗體源自施用也包含各種佐劑的疫苗中的此抗原。
[0083]優(yōu)選地，佐劑是經(jīng)修飾的脂多糖。如美國專利N0.4，912，094中描述的，腸細菌脂多糖(LPS)是一種有力的免疫刺激物。然而，它也能引發(fā)有害的且有時致命的應(yīng)答。現(xiàn)在已知與LPS有關(guān)的內(nèi)毒素活性源自其脂質(zhì)A組分。因而，更優(yōu)選地，本發(fā)明使用脂質(zhì)A的脫毒衍生物。Ribi ImmunoChem生產(chǎn)一種最初稱為精制脫毒內(nèi)毒素(RDE),但是已經(jīng)被稱為單磷酰脂質(zhì)A(MPL)的脂質(zhì)A衍生物。如美國專利No，4，912，094中描述的，MPL通過在中等強度礦物酸溶液(例如0.1N HCl)中將自革蘭氏陰性細菌(例如沙門氏菌)的無庚糖突變體獲得的LPS或脂質(zhì)A回流30分鐘左右的時段來生成。此處理導(dǎo)致還原性末端葡糖胺的位置I處的磷酸模塊的喪失。另外，在此處理期間從非還原性葡糖胺的6’位置除去核心碳水化合物。
[0084]然而，優(yōu)選地，使用經(jīng)修飾的LPS或脂質(zhì)A，其中脫毒脂質(zhì)A保留附著于非還原性葡糖胺的6’位置的核心模塊。LPS和脂質(zhì)A的此類衍生物也記載于美國專利N0.4，912，094。更詳細地，美國專利4，912，094披露了一種經(jīng)修飾的脂多糖，其通過僅選擇性除去脂多糖中與所述脂多糖的位置3’處的還原性末端葡糖胺酯連接的β_羥基肉豆蘧酰基殘基的方法獲得，所述方法包括使所述脂多糖進行堿水解?？梢栽诒景l(fā)明中使用此類脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、二磷酰脂質(zhì)A (DPL)和LPS。如此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用MPL、DPL或LPS，其中還原性末端葡糖胺的位置3’是脫_0_?；?。這些化合物分別稱為3-DMPL、3-DDPL 和 3-DLPS。
[0085]在美國專利4，987，237中，描述了具有下式的MPL衍生物:
[0086]
【權(quán)利要求】
1.一種制備包含一種或多種吸附至氨基酸的抗原的組合物的方法，其中所述方法包括: (i)在中和溶液混合物的情況中混合一種或多種抗原的溶液與氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一種或多種抗原和所述氨基酸的吸附物； (?)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并 (iii)回收所述組合物； 其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟(i)至(iii)。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述氨基酸是酪氨酸。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其中所述一種或多種抗原是用戊二醛修飾的。
4.依照任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述一種或多種抗原是自花粉衍生的。
5.依照權(quán)利要求1的方法，其包括制備包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原的組合物，其中所述方法包括: (i)用戊二醛修飾所述一種或多種花粉抗原； (?)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經(jīng)修飾的花粉溶液； (iii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經(jīng)修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經(jīng)修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物；` (iv)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并 (V)回收所述組合物； 其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟(iii)至(V)。
6.依照權(quán)利要求1的方法，其包括制備包含一種或多種用戊二醛修飾且吸附至酪氨酸的花粉抗原的組合物，其中所述方法包括: (i)將所述一種或多種花粉抗原提取到溶液中以形成花粉提取物溶液； (?)過濾所述花粉提取物溶液以除去固體； (iii)實施交叉流過濾，并分離包含所述花粉抗原的保留物； (iv)用戊二醛修飾所述一種或多種花粉抗原； (v)使用交叉流過濾除去過量的戊二醛以形成經(jīng)修飾的花粉溶液； (vi)無菌過濾所述經(jīng)修飾的花粉溶液； (vii)在中和溶液混合物的情況中混合所述經(jīng)修飾的花粉溶液與酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述經(jīng)修飾的花粉和所述酪氨酸的吸附物； (viii)通過交叉流過濾將所述吸附物分出入緩沖液中，由此形成所述組合物；并 (ix)回收所述組合物； 其中在無菌環(huán)境中且在閉合系統(tǒng)內(nèi)實施步驟(vii)至(ix)。
7.依照任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述組合物包含下述花粉抗原:剪股穎(Bent)花粉、狐尾草(Foxtail)花粉、黃花茅(Sweet vernal)花粉、三毛草(False oat)花粉、雀麥(Brome)花粉、洋狗尾草(Crested dogstail)花粉、鴨茅(Cocksfoot)花粉、羊茅(Fescue)花粉、絨毛草(Yorkshire fog)花粉、麥草(Rye grass)花粉、梯牧草(Timothy)花粉、草甸(Meadow)花粉和栽培黑麥(Cultivated rye)花粉。
8.依照權(quán)利要求6或7的方法，其中使用酚緩沖溶液于約2至約8°C實施提取步驟(i)達約18小時。
9.依照權(quán)利要求5至8中任一項的方法，其中使用具有5至IOkDa分子量截留的膜實施使用交叉流過濾除去過量的戊二醛。
10.依照任一前述權(quán)利要求的方法，其中使用多燒結(jié)不銹鋼濾器實施使用交叉流過濾分出包含所述抗原和所述氨基酸的吸附物。
11.依照權(quán)利要求10的方法，其中所述多燒結(jié)不銹鋼濾器是5μπι孔徑濾器。
12.依照任一前述權(quán)利要求的方法，其中通過在用摩爾濃度約3.2Μ的的NaOH中和混合物的情況中混合所述抗原與摩爾濃度約3.8Μ的HCl中的氨基酸形成包含所述抗原和所述氨基酸的吸附物。
13.依照任一前述權(quán)利要求的方法，其中將所述組合物稀釋至期望的濃度以供胃腸外(parental)使用。
14.依照任一前述權(quán)利要求的方法，其中將佐劑添加至所述組合物。
15.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述佐劑是MPL、3-DMPL或其衍生物或鹽。
16.通過任一前述權(quán)利要求的方法制備的組合物。
【文檔編號】A61K39/00GK103608034SQ201280030190
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月21日
【發(fā)明者】M.斯金納, S.休英斯, D.帕克, R.波倫 申請人:過敏療法（英國）有限責(zé)任公司