專利名稱：一種促肝細胞生長素，其制劑和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促肝細胞生長素，具體講，涉及一種新的促肝細胞生長素，及其制劑和用途。
背景技術(shù)：
促肝細胞生長素是從新鮮乳豬肝臟中提取的小分子量多肽類混合物，分子量在 10,000以下。其藥理作用主要為可刺激正常肝細胞DNA的合成，促進肝細胞再生，對損傷的肝細胞有保護作用，促進肝功能的恢復(fù)，還有調(diào)節(jié)機體的免疫功能和抗肝纖維化作用。臨床上用于治療重型肝炎、慢性活動性肝炎和肝硬化等。目前，針對促肝細胞生長素這一生物制劑類藥物，已經(jīng)有很多專利和文獻報道。在專利ZL03116052. 2中，公開了一種促肝細胞生長素注射液及制備方法，其中的肝細胞生長素為從乳豬中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，占總蛋白含量的60%以上，該促肝細胞生長素是通過以下方法制備1)勻漿；幻攪拌加提取液，室溫下低速60轉(zhuǎn)/min 攪拌一個小時；幻加熱，水浴加熱提取罐，液體溫度達到95°C時停止加熱，保持15 20分鐘；4)過濾力)提純將過濾液上樣至DEAE Sepharose FF柱中，采用含有氯化鈉的PBS溶液進行洗脫，再用超濾膜除鹽。該制備方法的缺點有攪拌時間過長、在高溫條件95°C下加熱時間過長，很容易造成促肝細胞生長素中活性多肽的分解和失活；另外，其提取工藝繁瑣，還需要加鹽的洗脫液洗脫后再脫鹽，這些操作步驟都會損失活性物質(zhì)的含量，造成提取物活性低，提取率低。專利ZL200610047371. 0公開了一種促肝細胞生長素水針劑制劑的制備方法，其中公開了一種促肝細胞生長素溶液的制備方法，包括以下步驟1)選材；幻組織處理；3) 勻漿低溫勻漿2分鐘；4)凍融反復(fù)凍融3次；5)熱變性去除大分子蛋白升溫至85°C，恒溫5分鐘；6)離心；7)分級超濾及病毒滅活一級超濾收集分子量30，OOODa以下的組分； 二級超濾收集分子量為10，OOODa以下的多肽組分，60°C保溫10小時，滅活病毒。該提取方法中采用了反復(fù)凍融的工藝，反復(fù)凍融這一工藝方法極易產(chǎn)生降壓物質(zhì)，并且該工藝方法中熱變性的溫度過高，同樣會造成多肽類物質(zhì)的失活。為此，發(fā)明人提出了一種生物活性大幅度提高的促肝細胞生長素及其制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供一種促肝細胞生長素；本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供這一促肝細胞生長素的制劑；本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供這一促肝細胞生長素的用途。為了完成本發(fā)明的第一發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種促肝細胞生長素，制備方法包括以下步驟(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；
(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，勻漿液冷凍至-20 -;35°C ；(4)將-20 _35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網(wǎng)自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的 1/3 1/2，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝，-18°C以下保存。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(3)中， 勻漿液以10 18°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以4 8°C /min的速度冷凍至-20 -35°C，優(yōu)選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 -5°C，再以3 60C /min的速度冷凍至-20 -;35°C /min。在步驟(5)中，超濾液以10 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以 2 6V /min的速度冷凍至_20 _30°C，優(yōu)選超濾液以12 15°C的速度從室溫冷凍至 0 -5°C，再以3 5°C /min的速度冷凍至-20 _30°C /min ；本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(3)中，質(zhì)量比為水豬肝1.1 1.3 1， 優(yōu)選為質(zhì)量比為水豬肝1.1 1。本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(3)中，勻漿的時間為3 10分鐘，優(yōu)選為 5分鐘。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟⑷中，解凍和加熱的速度為1 10°C / min，優(yōu)選以1 2°C /min的速度升溫至0 5°C，再以4 8°C /min的速度加熱至83°C 85 "C。本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為在步驟(5)中，中空纖維柱過濾的壓力不超過 2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo本發(fā)明的第六優(yōu)選技術(shù)方案為步驟(6)中，解凍的速度為1 10°C /min，優(yōu)選以 1 4°C /min的速度升溫至室溫。本發(fā)明還涉及一種促肝細胞生長素的制劑，包括凍干粉針。本發(fā)明還對提取得到的促肝細胞生長素進一步制備成了制劑，其中包括水針劑和粉針劑；凍干粉針劑的配方為促肝細胞生長素10重量份，賦形劑1 100重量份；優(yōu)選促肝細胞生長素10重量份，賦形劑10 00重量份；賦形劑選自葡萄糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇、左旋糖酐等，所述的凍干粉針中還可以包括穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑等，輔料的選擇可依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)選擇進行，也可以通過處方篩選實驗獲得。凍干粉的制備采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。本發(fā)明制備的針劑，通過動物體內(nèi)實驗、體外實驗的檢測，其活性與所提取的促肝細胞生長素的活性相同。本發(fā)明還涉及促肝細胞生長素在制備治療重型肝炎、慢性活動性肝炎或肝硬化藥物中的應(yīng)用。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的解釋和說明。
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本發(fā)明涉及一種促肝細胞生長素，本發(fā)明的促肝細胞生長素的生物活性高，有效活性成分的含量高，降壓物質(zhì)含量低。(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個的完整在骨干不得超過140 克，實驗證實，乳豬的肝臟的促肝細胞生長素的含量更高，大大高于成年豬的含量；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，比例優(yōu)選為水豬肝質(zhì)量比為1. 1 1 ；勻漿液冷凍至-20 -35°c ；勻漿液以10 18°C / min的速度從室溫冷凍至0 -5°C，再以4 8°C /min的速度冷凍至_20 _35°C，優(yōu)選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以3 6°C /min的速度冷凍至-20 -35°C/min。本發(fā)明此處采用了分步快速速凍的方式，發(fā)明人通過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)， 通過分步冷凍的勻漿液，促肝細胞生長素的得率會有所提高。這可能是由于通過對冷凍速度的控制，使勻漿液冷凍產(chǎn)生顆粒大小適宜的冰晶，從而在細胞內(nèi)更加徹底的破壞細胞膜， 釋放出細胞內(nèi)物質(zhì)，使得提取液中有效成分含量大大增加。現(xiàn)有技術(shù)中，采用速凍的方式冷凍的，都是采用同一速度降溫的，但如果降溫速度一直保持很快，就會產(chǎn)生比較大的冰晶， 也對細胞膜的破壞不完全，從而使細胞內(nèi)的物質(zhì)的釋放不完全，造成提取率低下。(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網(wǎng)自然過濾，放入濾布或濾網(wǎng)自然過濾，濾布或濾網(wǎng)的孔徑0. Imm, 濾布或濾網(wǎng)的面積為2 3平方米，速度200ml/min，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；本發(fā)明采用了達到83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，從而進一步保證了產(chǎn)品的活性。解凍和加熱的速度為1 10°C /min，并優(yōu)選階段式升溫的方式，優(yōu)選以1 2V /min的速度升溫至 0 5°C，再以4 8°C/min的速度加熱至83°C 85°C。階段式升溫的好處為先以較慢的速度升溫至零度左右，對于冷凍體，升溫速度過快，會造成冷凍體內(nèi)部和外部的溫差增大， 緩慢升溫可以使冷凍體均勻緩慢的解凍。因為在操作過程中一般采用蒸汽加熱，避免了在蒸汽加熱過程中，外層解凍融化溫度增高，內(nèi)層還未融化，外層的溶液在高溫作用下活性降低的可能。當冷凍體溶解，本發(fā)明采用了較快速升溫的過程，這是因為，如果解凍后還采用較慢的速度，冷凍后的勻漿液中由于細胞分解破裂，釋放出大量的具有活性的蛋白分解酶， 此類活性酶物質(zhì)在一個較長時間內(nèi)處于一種適于其酶解其他物質(zhì)的環(huán)境中，從而會引起其促肝細胞生長素活性物質(zhì)的降解。(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20°c -30°c密封保存；此處的冷凍也采用了分步冷凍，勻漿液以25 40°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以5 10°C / min的速度冷凍至-20 _30°C，優(yōu)選勻漿液以30 35°C的速度從室溫冷凍至0 _5°C， 再以8 10°C /min的速度冷凍至_20 _30°C /min ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過 2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。在現(xiàn)有技術(shù)中，一般采用反復(fù)凍融的方式，對促肝細胞生長素進行提取，然而，反復(fù)凍融易產(chǎn)生降壓物質(zhì)，在實際用藥的安全產(chǎn)生隱患。而采用化學提取、酶提取法，由于在提取過程中，PH變化過大或者酶的作用，最終提取得到的促肝細胞生長素的活性偏低，臨床應(yīng)用的效果也不理想。本發(fā)明采用了兩次凍融、低溫長時間冷凍的方式，最終制備得到了一種活性多肽含量高、產(chǎn)品得率高的促肝細胞生長素，經(jīng)動物實驗和臨床試驗，得到了良好的治療效果。本發(fā)明采用的工藝流程為勻漿液分步冷凍、凍存至少7天-溶解、加熱至83 85°C、調(diào)pH值-分子量20，000中空纖維柱過濾、分子量10，000超濾膜過濾-分步冷凍、凍存至少7天-溶解、濃縮-分子量20，000中空纖維柱過濾-0. 22 μ m除菌過率；1.本發(fā)明的工藝流程中，先將勻漿液分步冷凍，并凍存至少7天后溶解加熱后，濾布易于過濾。凍存7天可使細胞充分破裂，從而使蛋白、多肽等物質(zhì)釋放，從而可使一次冷凍達到反復(fù)凍融的目的，避免了降壓物質(zhì)的產(chǎn)生。2.本發(fā)明熱變性步驟中，僅加熱至至83 85°C并立即撤掉熱源，本發(fā)明通過反復(fù)試驗確定，采用這種方式即可以使大分子蛋白變性，而加熱至更高的溫度或者在85°C這一度下保溫，都會對降低本發(fā)明活性物質(zhì)的活性。3.本發(fā)明對勻漿液采用的是自然過濾的方式，避免了離心等操作對本發(fā)明活性物質(zhì)的活性的影響，節(jié)約能源。4.本發(fā)明采用了在對溶液進行過濾前就調(diào)節(jié)PH的做法。5.本發(fā)明采用了對溶液先采用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，再采用截留分子量10000的超濾膜過濾，并對中空纖維柱過濾的壓力和超濾膜的壓力進行了控制，可防止極少量的高分子物質(zhì)通過濾膜，也可防止膜的損壞。6.本發(fā)明對超濾液再進行一次冷凍、解凍、過濾，從而進一步去除最終產(chǎn)品中的高分子物質(zhì)，再經(jīng)除菌得到一種安全的產(chǎn)品。本發(fā)明還對制備得到的促肝細胞生長素的成分做了進一步的分析，經(jīng)過分析得到本發(fā)明制備的促肝細胞生長素的數(shù)均分子量為10685道爾頓，重均分子量為 11350道爾頓。本發(fā)明制備的促肝細胞生長素具含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0.7%,Try 2. 5%,Lys 1.5%,Arg 9. 1 %，總量占28. 8%。其中，氨基酸的檢測方法采用高效液相色譜檢測。將本發(fā)明制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，具體的峰保留時間和峰面積百分比見色譜圖。本發(fā)明的促肝細胞生長素的微量元素包括Fe 7. 3 7.6ug/ml，k 0. 04 0. 05ug/ml, Mgl40. 5 140. 7ug/ml, Zn 14. 2 14. 4ug/ml, Na 33. 5 33. 7ug/ml, Ca 0. 3 0. 5ug/ml, MnO. 6 0. 7ug/ml, Co 200. 1 200. 3ug/ml 本發(fā)明中微量元素的檢測方法通過原子吸收光譜檢測。本發(fā)明制備的促肝細胞生長素的濃度為15. 0 22. 5mg/ml，優(yōu)選15. 0 21. 7mg/ ml，促肝細胞生長素中活性蛋白質(zhì)的重量占總蛋白重量的71% 75%。其中，活性蛋白的測量方法為促肝細胞生長素通過凝膠色譜等方法分離，經(jīng)7721細胞摻入培養(yǎng)，通過MTT法測定活性組份，并計算活性組份重量的占總質(zhì)量的比例。本發(fā)明的有益效果為1.提取物的有效組份含量濃度提高。原工藝生產(chǎn)的濃度為5. 7 7. Omg/ml，現(xiàn)有工藝生產(chǎn)產(chǎn)品的濃度為15. O 21. 7mg/ml，其中，氨基酸的含量占提取物總質(zhì)量的觀.8%， 活性蛋白質(zhì)的重量占總蛋白重量的71% 75%。2.生物活性增加?，F(xiàn)有技術(shù)中提取物的生物活性值(增殖倍數(shù))為2. 5 3. 5， 本發(fā)明中提取物同量的生物活性值提高到4. 5 6. O。3.安全性提高?，F(xiàn)工藝提取物的高分子量組份(分子量大于10000道爾頓)的百分比由5%降低到不超過3%，從而對人的過敏反應(yīng)基本消除；降壓物質(zhì)的含量降低，現(xiàn)有技術(shù)中0. lmg/kg的用量即產(chǎn)生副反應(yīng)，本發(fā)明的提取物0. 5mg/kg的用量條件下不會產(chǎn)生副反應(yīng)。


圖1為實施例1制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖2為實施例2制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖3為實施例3制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖4為實施例4制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖5為實施例5制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖6為實施例6制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖；圖7為實施例7制備的促肝細胞生長素的高效液相色譜圖。本發(fā)明的具體實施方式
僅限于進一步解釋和說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。
具體實施例方式實施例1促肝細胞生長素的提取(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5min，比例為水豬肝質(zhì)量比為11 1 ；勻漿液以16°c /min內(nèi)從室溫冷凍至0°C，再以4°C /min的速度冷凍至-35 °C ；(4)將-10 _25°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5，解凍和加熱的速度為1 2 0C /min ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C。其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖1所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 6ug/ml，Se 0. 04ug/ml，Mg 140. 5ug/ml，Zn 14. 2ug/ml, Na 33. 5ug/ml, Ca 0. 3ug/ml, Mn 0. 6ug/ml, Co 200.lug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 3mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例2(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，比例為水豬肝質(zhì)量比為115 1 ；勻漿液以15°C/min的速度從室溫冷凍至-5°C，再以5°C/ min的速度冷凍至-35 °C。(4)將_35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；解凍和加熱的速度以2°C /min 的速度升溫至0°C，再以8°C /min的速度加熱至85°C ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以3°C / min的速度冷凍至_30°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為TC /min升溫至室溫；過濾， 上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖2所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His
80. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 3ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 6ug/ml，Zn 14. 4ug/ml, Na 33. 7ug/ml, Ca 0. 5ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.2ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 5 ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例3(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為11 1;勻漿液以18°c/min的速度從室溫冷凍至-2°c，再以8°C/min的速度冷凍至；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以10°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖3所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 8mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的72%。實施例4(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；CN 102294014 A (3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為11 1 ；勻漿液以15°c /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以4°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為1 10°C /min,優(yōu)選以1 4°C / min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖4所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為21. 2mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的73%。實施例5(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為11 1 ；勻漿液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以6°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將_30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以12°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以5°C / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過
10濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°C以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖5所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 5mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占重量的72%。實施例6(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為1. 2 1 ；勻漿液以18°C /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以5°C /min的速度冷凍至-32°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至84°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為3°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖6所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0.9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為Fe 7. 5ug/ml，Se 0. 05ug/ml，Mg 140. 7ug/ml，Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；
促肝細胞生長素的濃度為21. 7mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例7(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；單個完整豬肝的重量不得超過140 克；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；并用不銹鋼刀切成 2 3塊，以便于勻漿；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，時間為5分鐘，水和豬肝質(zhì)量比為115 1 ；勻漿液以17V /min的速度從室溫冷凍至_5°C，再以7°C /min的速度冷凍至_30°C ；(4)將-30°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6. 5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液以15°C /min的速度從室溫冷凍至_4°C，再以6V / min的速度冷凍至_25°C ；其中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kg；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，解凍的速度為4°C /min的速度升溫至室溫；過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的三分之一，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝于不銹鋼桶中，-18°c以下保存。將制備得到的促肝細胞生長素溶液用高效液相色譜法分析，條件為流動相甲醇水=10 90(體積比)，色譜柱 hypersilODS4. 6X300mm(5um)，波長 256nm，流速 0. Sml/min，共有12個色譜組分峰，其高效液相色譜圖如圖7所示。經(jīng)檢測，所制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，氨基酸的名稱及重量百分比含量為Asp 1. 5%, ThrO. 3%, SerO. 7%, Glu 3. 6%, Pro 0. 9%, Glyl. 2%, Ala 1. 2%, CysO. 2%, Val 0. 9%, Met 0. 5%, lie 0. 9%, Leul. 8%, Tyr 0.4%, Phr 0. 9%, His 0. 7%, Try 2. 5%, Lys 1. 5%, Arg 9. 1%，總量占 28. 8% ；微量元素的含量為 Fe 7. 5ug/ml, Se 0. 05ug/ml, Mg 140. 7ug/ml, Zn 14. 3ug/ml, Na 33. 6ug/ml, Ca 0. 4ug/ml, Mn 0. 7ug/ml, Co 200.3ug/ml ；促肝細胞生長素的濃度為20. 5mg/ml ；促肝細胞生長素中活性組份的重量占總重量的71%。實施例8配方為實施例1提取得到的促肝細胞生長素10重量份，甘露醇90重量份，采用常規(guī)方法配液、除菌、灌裝，凍干。比較例1 不同的制備工藝處理對生物活性的影響工藝1 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)加熱至85°C并保持15分鐘；工藝2 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)直接以2V /min的速度加熱至83°C 85°C ；工藝3 其他工藝處理均與實施例1相同，除在步驟(4)直接以6°C /min的速度加熱至83°C 85°C ；檢測方法同實驗例3，實驗結(jié)果如表1所示；表1:
孔數(shù) 吸光度平均值 刺激指數(shù) 實施例 130.3735.8
エ藝 130. 1393. 5
エ藝 230.1383.4
エ藝 330.1383.4比較例2 不同的制備エ藝處理對產(chǎn)率的影響エ藝1 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以30°C /min的速度 從室溫冷凍至-35 °C ；エ藝2 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(3)中，勻漿液以10°C /min的速度 從室溫冷凍至-35 °C ；エ藝4 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以15°C /min的速度 從室溫冷凍至-25 °C ；エ藝5 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(5)中，勻漿液以5°C /min的速度 從室溫冷凍至-25 °C /min ；エ藝6 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存48小時；エ藝7 其他エ藝處理與實施例1相同，在步驟(4)和步驟(6)中，凍存72小時；實驗結(jié)果見表2:表2:
單位產(chǎn)量(mg/g) 實施例16. 58
エ藝15. 45
エ藝25.34
エ藝35.18
エ藝44. 54
エ藝54. 38
エ藝65.35
エ藝75. 26實驗例1體內(nèi)實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗雄性Wistar大鼠，1；35 190g，在戊巴比妥鈉(％ig/100g體重)麻醉下進行32% 的肝部分切除，術(shù)后4 6小時經(jīng)腹腔注射生理鹽水細1、本發(fā)明實施例1 7制備的促肝細胞生長素20mg，于30小時固定于肝右葉中下1/3處取材，Bouin’ s液固定，包埋切片，6u H. Ε.染色，有絲分裂計數(shù)，如表3所示表3:
動物數(shù)有絲分裂百分率倍數(shù)P值對照組80.9440.166促肝細胞生長素實施例153.1150.5233.3<0.001促肝細胞生長素實施例253.4040.4943.7<0.001促肝細胞生長素實施例353.2570.4273.6<0.001促肝細胞生長素實施例453.3640.4993.6<0.001促肝細胞生長素實施例553.3710.5233.5<0.001促肝細胞生長素實施例653.4120.4873.7<0.001促肝細胞生長素實施例 53.4070.5043.6<0.001實驗例2體外實驗取實施例1 7制備的促肝細胞生長素作為實驗藥品，進行以下實驗雄性豚鼠200 300G，經(jīng)心臟采血自私，無菌取出心臟，沖洗后剪碎與100目尼龍網(wǎng)上輕研，過濾，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液制備肝細胞懸液，細胞計數(shù)為5 7 X IO5個 /ml,0. 2%臺盤藍染色活率為81%。當成活率高于70%時進行M孔板培養(yǎng)，每孔加Iml含血清1640培養(yǎng)液，37°C,5% CO2,培育4小時，吸取各孔上清液，正常對照組不加促肝細胞生長素，實驗組每孔加含有40 μ g促肝細胞生長素的無血清1640培養(yǎng)液，24小時每孔加2uci 的3H-dTR, 7°C,5%C02,培育2. 5小時，分別收集各孔的細胞，用0. OlMPBS沖洗3次，涂于玻璃纖維濾紙片上，37°C干燥過夜，將紙片放入閃爍杯中，加閃爍液5ml，閃爍計數(shù)器測各樣品的CPM值。表4本發(fā)明促肝細胞生長素對體外肝細胞DNA3H-ClTR參入量的影響
孔數(shù)CPM值倍數(shù)P值對照組36565. 3空白組31579.2促肝細胞生長素實施例1327423.65.5<0.001促肝細胞生長素實施例2329417.45.9<0.001促肝細胞生長素實施例3330414.66.1<0.001促肝細胞生長素實施例4326924.45.4<0.001促肝細胞生長素實施例5328420.25.7<0.001促肝細胞生長素實施例6327423.05.5<0.001促肝細胞生長素實施例 3299166.0<0.001實驗例3體外實驗MTT法1.取實施例1 7制備的促肝細胞生長素，用RPMI-1640培養(yǎng)液制成每Iml中含多肽IOOyg的溶液。2.用10%的小牛血培養(yǎng)液培養(yǎng)SMMC-7721細胞至對數(shù)增長期，用0. 25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二鈉消化液消化，加10%小牛血清培養(yǎng)液稀釋至每Iml中含2. 5X IO4 5 X IO4個細胞，將上述細胞懸液在96孔細胞板上鋪板，每孔100 μ 1，其中3孔加10%小牛血清培養(yǎng)液100 μ 1作為空白對照，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4小時使其貼壁。供試品組，每孔加供試品溶液100 μ 1，每批供試品均做3個孔，細胞對照組和空白對照組每孔分別加RPMI-1640培養(yǎng)液100 μ 1，置37°C，5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，結(jié)束培養(yǎng)前4小時取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液 (Ph7. 3)洗一次，然后再每孔中加入上述磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 3) 100 μ 1和MTT溶液20 μ 1，
繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，其吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μ 1 二甲基亞砜，搖勻，在酶標儀上以 550nm的波長處分別測定其吸收度A值；并計算刺激指數(shù)；其中刺激指數(shù)為(供試品組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值)與(對照組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值)的比值。
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刺激指數(shù)=供試品組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值對照組3孔吸收度平均值-空白對照組3孔吸收度平均值
表5
孔數(shù)吸光度平均值刺激指數(shù)對照組30.114
空白組30.060
促肝細胞生長素實施例1 30.3735.8促肝細胞生長素實施例230.3525.促肝細胞生長素實施例330.3575.促肝細胞生長素實施例430.3625.促肝細胞生長素實施例530.3685.促肝細胞生長素實施例630.3735.促肝細胞生長素實施例 30.3685權(quán)利要求
1.一種促肝細胞生長素，其特征在于，所述的促肝細胞生長素的制備方法包括以下步驟(1)選材原材料選用當天宰殺的新鮮乳豬肝；(2)組織處理乳豬肝除去筋膜、結(jié)蒂等組織后，用純水洗凈；(3)室溫下與注射用水混合，勻漿的速度為800 1000轉(zhuǎn)/分，勻漿液冷凍至-20°C -35°C ；(4)將-20°C _35°C凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83°C 85°C后立刻撤掉加熱源，放入濾布或濾網(wǎng)自然過濾，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至6. 5 ；(5)將調(diào)節(jié)至PH為6.5的溶液用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至_20°C _30°C密封保存；(6)將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，上清液用反滲透膜濃縮至原體積的1/3 1/2，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0. 22um的濾膜除菌后分裝，-18°C 以下保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟⑶，勻漿液以10 18°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以4 8°C /min 的速度冷凍至-20 -35°C，優(yōu)選勻漿液以12 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C， 再以3 6°C /min的速度冷凍至-20 -;35°C /min。在步驟(5)中，超濾液以10 15°C /min的速度從室溫冷凍至0 _5°C，再以2 6°C / min的速度冷凍至-20 _30°C，優(yōu)選超濾液以12 15°C的速度從室溫冷凍至0 _5°C， 再以3 5°C /min的速度冷凍至-20 _30°C /min ；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟⑶中，質(zhì)量比為水豬肝1. 1 1. 3 1，優(yōu)選為質(zhì)量比為水豬肝1. 1 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(3)中，勻漿時間為3 10分鐘，優(yōu)選為5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟中，解凍和加熱的速度為1 10°c /min，優(yōu)選以1 2V /min的速度升溫至0 5°C，再以4 8°C /min的速度加熱至83°C 85°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(5)中，中空纖維柱過濾的壓力不超過2. 3kg，截留分子量10000的超濾膜的壓力不超過2. 5kgo
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于，所述的肝細胞生長素制備方法中的步驟(6)中，解凍的速度為1 10°C /min，優(yōu)選以1 4°C /min的速度升溫至室溫。
8.一種含有權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素的制劑，其特征在于，所述的制劑包括水針和凍干粉針。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其特征在于，所述的凍干粉針劑的組成為促肝細胞生長素和甘露醇。
10.權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素在制備治療重型肝炎、慢性活動性肝炎或肝硬化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促肝細胞生長素，其制備方法包括以下步驟選材；組織處理；室溫下與注射用水混合，勻漿，勻漿液冷凍至-20℃～-35℃；將凍存至少7天的勻漿液解凍后，加熱至83℃～85℃后立刻撤掉加熱源，過濾，調(diào)節(jié)PH值至6.5；用截留分子量20000的中空纖維柱過濾，然后經(jīng)截留分子量10000的超濾膜過濾，超濾液冷凍至-20℃～-30℃密封保存；將凍存至少7天的超濾液解凍，過濾，濃縮，濃縮液經(jīng)截留分子量10000的中空纖維柱過濾，再經(jīng)0.22um的濾膜除菌后分裝，-18℃以下保存。本發(fā)明還涉及該促肝細胞生長素的制劑、用途。本發(fā)明的促肝細胞生長素活性高、產(chǎn)率高，使用安全。
文檔編號A61P1/16GK102294014SQ20111026498
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者孔祥平, 張宜俊, 張海松, 楊富強, 陳光明, 陳陽述 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院