專利名稱：用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療甲氨蝶呤抗性病癥的方法
用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療甲氨蝶呤抗性病癥的方法
背景技術(shù)：
甲氨蝶呤(methotrexate，也稱為“MTX”)作為組合化學(xué)療法方案的一部分用于治療多種癌癥。它是包括急性淋巴母細(xì)胞性白血病在內(nèi)的多種贅生性病癥的治療劑。甲氨蝶呤還用作一些自體免疫性疾病的治療劑，所述自體免疫性疾病包括重癥肌無力、多肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩氏病(Crohn' s disease)、牛皮癬、膿皰性牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis)和硬皮病。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤(包括“10-炔丙基-ΙΟ-dAM”、“普拉曲沙(pralatrexate) ”、“外消旋 PDX，，、“ (2S) _2_[ [4_[ (IRS) _1_[ (2，4- 二氨基蝶啶 _6_ 基)甲基]丁 _3_炔基]苯甲酰基]氨基]戍二酸”、“(2RS) _2_[ [4_[ (IRS) _1_[ (2，4-二氨基蝶 啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸”和“PDX”)是已經(jīng)過測試并且發(fā)現(xiàn)適用于治療癌癥的化合物。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤已得到美國食品藥物管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)作為復(fù)發(fā)性和難治性周圍T細(xì)胞淋巴瘤的治療劑。同時還在對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤在淋巴瘤、肺癌、膀胱癌和乳癌中的使用進(jìn)行研究。10-塊丙基-10-去氮雜氨基蝶呤最初由DeGraw等，"Synthesis andAntitumorActivity of 10-Propargyl-10-deazaaminopterin, " J. Med. Chem. 36:2228-2231 (1993)公開并且顯示可充當(dāng)酶二氫葉酸還原酶(“DHFR”)的抑制劑和充當(dāng)鼠類L1210淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系的生長抑制劑。另外，使用鼠類E0771乳腺腫瘤模型也得到關(guān)于該化合物的抗腫瘤性質(zhì)的一些結(jié)果。美國專利號6，028，071和PCT公布號WO 1998/02163公開了高度純化的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤組合物在異種移植物模型中進(jìn)行測試時具有對抗人腫瘤的功效。利用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤進(jìn)行的后續(xù)研究已顯示其在單獨(dú)使用和與其它治療劑組合時都是有用的。舉例來說，Sirotnak等，Clinical Cancer Research,第6卷，3705-3712 (2000)報(bào)道了共同施用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與丙磺舒(probenecid, cMOAT/MRP樣質(zhì)膜ATP酶的一種抑制劑)會大大增強(qiáng)10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤對抗人實(shí)體腫瘤的功效。已顯示，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與鉬基化學(xué)治療劑的組合對間皮瘤是有效的。(Khokar等，Clin.Cancer Res. 7:3199-3205 (2001))。與吉西他濱(gemcitabine, Gem)共同施用以治療淋巴瘤已公開在W0/2005/117892中。美國專利號6，323，205中公開了 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與紫杉酚的組合是有效的。還已顯示，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤有效用于治療T細(xì)胞淋巴瘤，參見美國專利號7，622，470。其它研究已顯示一種通過測定由樣本表達(dá)的還原型葉酸載體-I蛋白(RFC-I)的量來評估淋巴瘤對用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療的敏感性的方法，其中所表達(dá)RFC-I的水平較高指示對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的敏感性較高，公開于PCT公布號WO 2005/117892中。
10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤被稱為抗葉酸劑/抗代謝物。葉酸通路在細(xì)胞生長和增殖中起關(guān)鍵作用(Appling, 1991 ；0din等，2003)。葉酸(葉酸鹽)通過還原型葉酸載體I (RFC-I)進(jìn)入細(xì)胞，由葉酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)聚谷氨酸化，并且被還原成二氫葉酸，二氫葉酸進(jìn)一步由二氫葉酸還原酶(DHFR)轉(zhuǎn)化成四氫葉酸(THF)。此通路中所涉及的不同酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類重要的細(xì)胞毒性劑(即抗葉酸劑)的靶標(biāo)。甲氨蝶呤是此類別的第一藥劑之一并且首先被用于治療兒童期急性淋巴母細(xì)胞性白血病(Farber等，1948)。從那以后，甲氨蝶呤被廣泛地用于血液系統(tǒng)和實(shí)體癌癥，并且已合理設(shè)計(jì)出了多代新型抗葉酸劑以利用葉酸通路的多個方面(例如，用于結(jié)腸直腸癌的雷替曲塞(raltitrexed) (Cocconi等，1998)和用于惡性胸膜間皮瘤(Vogelzang等，2003)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) (Hanna等，2004)的培美曲塞(pemetrexed))。在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，RFC-1介導(dǎo)葉酸類似物的內(nèi)化。一旦進(jìn)入細(xì)胞，這些類似物就結(jié)合二氫葉酸還原酶(DHFR)，由此消耗嘌呤和胸苷生物合成所需要的細(xì)胞內(nèi)還原型葉酸池，或者這些類似物將在與DHFR結(jié)合之前就被代謝成聚谷氨酸鹽。聚谷氨酸化由葉?；?聚谷氨酸合成酶(FPGS)催化。葉?；?聚谷氨酸水解酶(FPGH，也稱為Y-谷氨?；饷竅GGH])介導(dǎo)這些細(xì)胞內(nèi)聚谷氨酸化的抗葉酸劑的裂解并且因此介導(dǎo)其后續(xù)清除。胸苷酸合成酶(TS)和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基轉(zhuǎn)移酶 (GARFT)也在葉酸代謝中涉及作為“再循環(huán)”酶(因此直接影響可用于DNA合成的核苷酸池)。甲氨蝶呤是一種抗葉酸劑?；趯?xì)胞系的測試，認(rèn)為10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與甲氨蝶呤具有類似的細(xì)胞毒性型態(tài)，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的效力經(jīng)常是甲氨蝶呤的3倍至19倍。甲氨蝶呤抗性通常因?yàn)镈HFR基因的突變和擴(kuò)增而發(fā)生。存在細(xì)胞可能獲得針對此葉酸拮抗劑的作用的免疫力的三種已知途徑。細(xì)胞中甲氨蝶呤的濃度可通過將該藥物移進(jìn)和移出細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改變而減少。舉例來說，如果細(xì)胞借以吸收甲氨蝶呤的轉(zhuǎn)運(yùn)體的數(shù)量減少，那么將會在細(xì)胞中存在較少甲氨蝶呤。此外，細(xì)胞中藥物的濃度可以由聚谷氨酸化和代謝作用的速率改變來調(diào)控。當(dāng)藥物的聚谷氨酸化較慢或者代謝較快時，其可能更易于從細(xì)胞中除去，從而降低其在細(xì)胞中的濃度和活性。DHFR基因的擴(kuò)增引起所存在DHFR的量增加并且已顯示與對甲氨蝶呤治療的反應(yīng)降低有關(guān)。甲氨蝶呤必須與DHFR結(jié)合方能阻止DHFR的活性。如果遺傳改變以減少甲氨蝶呤結(jié)合的方式改變DHFR的結(jié)合區(qū)，那么DHFR可能繼續(xù)活化葉酸并且治療的有效性將降低。所有這些結(jié)果都與對甲氨蝶呤的抗性增加有關(guān)。甲氨蝶呤抗性可能快速獲得并且可以導(dǎo)致治療失敗。因此，克服獲得性甲氨蝶呤抗性的方法將是有用的。發(fā)明概述在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病癥的方法。此方法可包括向所述個體施用有效量的包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治療的個體的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學(xué)上可接受的鹽。在一些實(shí)施方案中，所述病癥為癌癥。在其它實(shí)施方案中，所述病癥為炎癥性病癥。在一個實(shí)施方案中，組合物被配制用于靜脈內(nèi)施用。在另一個實(shí)施方案中，組合物被配制用于口服施用。附圖簡述圖I示出適用于制備10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的合成方案；圖2示出10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和其它葉酸抑制劑對所測試的15種癌細(xì)胞系的敏感性；圖3示出當(dāng)用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或甲氨蝶呤處理時，未處理、經(jīng)過10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤適應(yīng)(DU-PDX)和經(jīng)過甲氨蝶呤適應(yīng)(DU-MTX)的DU-145細(xì)胞的IC5tl ；圖4示出當(dāng)用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或甲氨蝶呤處理時，未處理、經(jīng)過 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤適應(yīng)(HEP-PDX)和經(jīng)過甲氨蝶呤適應(yīng)(HEP-MTX)的HEP2細(xì)胞的IC5tl ；圖5示出10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性細(xì)胞系中葉酸基因的相對mRNA表達(dá)；圖 6 示出 DU145 和 HEP2 敏感性以及 DU-PDX、DU-MTX, HEP-PDX 和 HEP-MTX 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性細(xì)胞系中的DHFR蛋白的蛋白質(zhì)印跡； 圖 7 示出 DU145 和 HEP2 敏感性以及 DU-PDX、DU-MTX, HEP-PDX 和 HEP-MTX 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性細(xì)胞系中的DHFR的mRNA表達(dá)。發(fā)明詳述癌癥患者中與療法有關(guān)的一個持續(xù)問題是對療法的反應(yīng)的個體差異和腫瘤內(nèi)導(dǎo)致化學(xué)療法抗性的遺傳改變?；瘜W(xué)療法涉及施用通常靶向快速分裂的細(xì)胞的藥物。多種化學(xué)治療藥物干擾細(xì)胞分裂之前的DNA復(fù)制，所述藥物包括抗葉酸劑。盡管化學(xué)治療劑已有許多進(jìn)步，但癌細(xì)胞，尤其是晚期癌癥的遺傳不穩(wěn)定性導(dǎo)致了藥物抗性癌癥的高發(fā)生率。在本發(fā)明中，由DU145(前列腺)和HEP2 (頭頸部)癌細(xì)胞系產(chǎn)生具有獲得性甲氨蝶呤和10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性的細(xì)胞系。對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的抗性為親本細(xì)胞的200倍以上的同時，具有獲得性10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性的DU-PDX和HEP-PDX細(xì)胞對甲氨蝶呤展示出交叉抗性；DU_MTX和HEP-MTX細(xì)胞仍對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤展不出顯著的敏感性。觀察到對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與對甲氨蝶呤的獲得性抗性的機(jī)制不同。獲得性10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性在DU-PDX與HEP-PDX細(xì)胞系中與RFClmRNA表達(dá)顯著減少有關(guān)，另外，還觀察到MDRlmRNA表達(dá)少量增加。本發(fā)明還顯示在10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性細(xì)胞中FPGS mRNA表達(dá)稍有減少，表明了聚谷氨酸化在10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性中的作用。三十年前進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，獲得性甲氨蝶呤抗性的常見機(jī)制是DHFR基因擴(kuò)增和由此而引起的酶過度表達(dá)(由Assaraf2007 ；Chen等，1995評述)。因此，在以逐漸遞增濃度的甲氨蝶呤選擇所培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系時，獲得性抗葉酸劑抗性經(jīng)常歸因于DHFR基因擴(kuò)增。實(shí)際上，在本發(fā)明中，具有獲得性甲氨蝶呤抗性的細(xì)胞系HEP-MTX展示出與它的親本對應(yīng)物相比，DHFR蛋白表達(dá)顯著增加，表明在此模型中可能有DHFR基因擴(kuò)增。此種蛋白質(zhì)增加未在10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性細(xì)胞系中觀察至IJ。這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明在這些細(xì)胞系中甲氨蝶呤抗性與10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤抗性的分子機(jī)制不同。如果癌癥的生長速率由于與治療劑接觸而與它在不與治療劑接觸的情況下的生長相比受到抑制，那么所述癌癥對所述治療劑“有反應(yīng)”或?qū)χ委熡小傲己梅磻?yīng)”。癌癥的生長可以多種方式測量，例如可以測量腫瘤的尺寸或適于所述腫瘤類型的腫瘤標(biāo)記的表達(dá)。這些標(biāo)準(zhǔn)定義了所測量的反應(yīng)的類型以及疾病進(jìn)展時間的表征，疾病進(jìn)展時間是腫瘤對治療劑的敏感性的另一個重要的量度。對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤具有反應(yīng)性的特性是一種可變的特性，其中不同的癌癥在不同的條件下對給定的治療劑顯示出不同水平的“反應(yīng)性”。另外，反應(yīng)性的量度可以使用除腫瘤生長尺寸以外的其它標(biāo)準(zhǔn)來評估，包括患者生活品質(zhì)、轉(zhuǎn)移程度等。此外，臨床預(yù)后標(biāo)記和變量可以在適用情況下進(jìn)行評估。如果癌癥的生長速率由于與諸如10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的治療劑接觸而在與它在不與所述治療劑接觸的情況下的生長相比時未受到抑制或受到極低程度的抑 制，那么所述癌癥對于所述治療劑“無反應(yīng)”或具有“較差反應(yīng)”，或?qū)χ委煷嬖谳^差反應(yīng)。如上所述，癌癥的生長可以多種方式測量，例如，可以測量腫瘤的尺寸或適于所述腫瘤類型的腫瘤標(biāo)記的表達(dá)。對治療劑無反應(yīng)的特性是一種高度可變的特性，其中不同的癌癥在不同的條件下對給定的治療劑顯示出不同水平的“無反應(yīng)性”。另外，無反應(yīng)性的量度可以使用除腫瘤生長尺寸以外的其它標(biāo)準(zhǔn)來評估，包括患者生活品質(zhì)、轉(zhuǎn)移程度等。此外，臨床預(yù)后標(biāo)記和變量可以在適用情況下進(jìn)行評估。這種無反應(yīng)性或較差反應(yīng)性癌癥可能無反應(yīng)或最初有反應(yīng)，但后來獲得了抗性。抗性或無反應(yīng)性可針對其它更敏感的癌癥或腫瘤細(xì)胞系或針對相同類型的癌癥或腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行測量。這些類型的癌癥也可以稱為對特定化學(xué)治療劑具有“抗性”的癌癥，如甲氨蝶呤抗性癌癥可能最初對甲氨蝶呤具有抗性，或者可能在用甲氨蝶呤或另一種化學(xué)治療劑進(jìn)行的一次治療過程或多次治療過程中獲得了對甲氨蝶呤的抗性。所述抗性可能是由葉酸通路蛋白、葉酸輸入通路之一中的蛋白質(zhì)的一處突變或多處突變所致，或者由與對甲氨蝶呤的反應(yīng)相關(guān)的任何其它蛋白質(zhì)所致。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病癥的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和它的藥學(xué)上可接受的鹽。腫瘤獲得對原先對它們具有毒性的藥物作用的抗性的能力可以產(chǎn)生抗性。這種獲得性抗性可能由染色體破壞引起。滲透性降低是固有抗性的常見形式。藥物的變更或者失活也許是藥物抗性的最常見機(jī)制。藥物抗性還可能由其所作用的目標(biāo)位點(diǎn)改變引起。諸如癌癥的病癥獲得甲氨蝶呤抗性的情形可通過主治醫(yī)師或本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員進(jìn)行評價來確定，并且包括治療時病癥消退或靜止，接著在一定時間的治療期后病癥進(jìn)展。已觀察至IJ，在包括癌癥在內(nèi)的許多病癥中，多種病癥對治療表現(xiàn)出獲得性抗性。因此在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療在用甲氨蝶呤治療期間獲得了甲氨蝶呤抗性的葉酸通路依賴性疾病或惡性腫瘤的方法，所述方法包括施用治療有效量的包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學(xué)上可接受的鹽的組合物?！爸委煛笨梢砸庵甘褂茂煼▉眍A(yù)防或抑制進(jìn)一步腫瘤生長，以及引起腫瘤收縮，和提供更長的存活時間。治療還意圖包括預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。如果癌癥或腫瘤的至少一種癥狀(如由反應(yīng)性/無反應(yīng)性、進(jìn)展時間或本領(lǐng)域中所已知和本文中所描述的指標(biāo)所確定)得到減輕、終止、減緩、最小化或抑制，那么所述腫瘤“受到抑制”或“得到治療”。如本文所進(jìn)一步描述，按照使用治療方案(例如10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤)進(jìn)行的治療腫瘤的任何癥狀(身體或其它方面)的任何改善都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，一般來說，本文所使用的術(shù)語“治療”意指減輕癥狀、在暫時或永久的基礎(chǔ)上消除癌癥或炎癥性病癥的病因、減緩癥狀的出現(xiàn)和/或病癥的進(jìn)展，或者預(yù)防疾病(即，防治性治療)。接受防治性治療的受試者一般為由于例如遺傳易感性、飲食、暴露于致病原、暴露于病原體等而有癌癥或炎癥性病狀風(fēng)險的哺乳動物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的組合物可以包括10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤，包括“高度純化”的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤，和10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的非對映體。如本發(fā)明說明書和其權(quán)利要求書中所用，“高度純化”的組合物含有大致上不含會干擾10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的抗腫瘤活性的其它葉酸衍生物(尤其是10-去氮雜氨基蝶呤)的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物可以包括用于將10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤配制成適用于治療用途的劑量單位形式的載體或賦形劑，以及另外的非葉酸治療劑。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤在碳10 (ClO)和碳19 (C19)位置含有不對稱中·心。在一個實(shí)施方案中，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤包括ClO手性中心R構(gòu)型與S構(gòu)型的約I: I外消旋混合物，和彡98. 0%的C19手性中心的S型非對映體。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤包括ClO非對映體I3DX-IOa [S構(gòu)型]化學(xué)名稱(2S) -2- [ [4- [ (IS)-I-[ (2，4- 二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 -3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，和rox-iob [R構(gòu)型]化學(xué)名稱(2S)-2-[[4-[(lR)-l-[(2，4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 _3_炔基]苯甲?；鵠氨基]戊二酸。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以使用DeGraw等的美國專利號5，354，751的實(shí)施例7中公開的方法合成，所述美國專利涉及制造10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤并且以引用方式整體并入本文。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤還可通過美國專利號6，028，071，尤其實(shí)施例I中呈現(xiàn)的方法來合成，所述美國專利以引用方式并入本文。為了產(chǎn)生10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的非對映體，可如本文和其它處所教導(dǎo)合成10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤，并且最終產(chǎn)物或較早中間產(chǎn)物隨后可以被用作起始物質(zhì)來分離ClO非對映體。或者，可以采用手性合成，其中由多種起始物質(zhì)中的任一種直接制備大致上純的PDX-IOa和/或rox-10b?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域中已知的用于分離對映體或非對映體的手性柱來分離最終10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或較早中間體的非對映體。適用于分離非對映體的手性柱包括可從日本的大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會社(Daicel ChemicalIndustries Ltd.，Japan)獲得的手性柱CHIRALPAK AD，使用乙醇作為流動相。在一些實(shí)施方案中，葉酸通路依賴性疾病或病癥是癌癥。在其它實(shí)施方案中，葉酸通路依賴性疾病或病癥是炎癥性病癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥或炎癥性病癥是最初對甲氨蝶呤至少在一定程度上敏感，然后獲得甲氨蝶呤抗性的病癥。確定葉酸通路疾病或病癥是否對甲氨蝶呤具有固有或獲得性抗性的方法可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定，并且可以包括諸如培養(yǎng)或獲得相關(guān)細(xì)胞(如來自患者的腫瘤細(xì)胞)并且測定與對甲氨蝶呤的抗性和/或敏感性相關(guān)的各種葉酸通路酶的表達(dá)水平的方法。另一所述方法為測定和/或監(jiān)測患者對甲氨蝶呤治療的反應(yīng)以揭示固有或獲得性抗性。可對相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行基因型分析或表型分析以測定指示甲氨蝶呤抗性的標(biāo)記的相對表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的表型測定包括從患者獲得腫瘤外植體，培養(yǎng)所述外植體的部分，從所述外植體培育出相關(guān)細(xì)胞的單層，使所述單層暴露于藥物候選物，以及評估藥物候選物改變腫瘤細(xì)胞表型的能力。本發(fā)明的基因型分析通過任何已知的方法來完成。優(yōu)選方法包括將從患者獲得的細(xì)胞的基因型或其部分與已知與一般或特定同所評價的治療候選物相關(guān)的藥物抗性有關(guān)的基因型進(jìn)行比較。舉例來說，患者細(xì)胞中存在已知或懷疑會賦予對治療候選物的抗性的多態(tài)變體將會將所述候選物從針對所述細(xì)胞的潛在治療劑中篩選出去?；颊呒?xì)胞的遺傳特征通過下文所述的本領(lǐng)域已知的方法(例如測序、多態(tài)現(xiàn)象)進(jìn)行測定?；颊呋蛐蛯λ幬锟剐缘挠绊懣赏ㄟ^參考將與抗性相關(guān)的已知突變或多態(tài)現(xiàn)象分類的遺傳數(shù)據(jù)庫或文庫來確定。雖然不受任何機(jī)制束縛，但細(xì)胞中與對甲氨蝶呤的抗性或獲得性抗性有關(guān)的突變的實(shí)例包括但不限于DHFR mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)相對于敏感性細(xì)胞或相對于獲得抗性之前的細(xì)胞有所增加。在一些實(shí)施方案中，癌癥或炎癥性病癥對甲氨蝶呤具有獲得性抗性。欲治療的癌 癥包括例如前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌和T細(xì)胞淋巴瘤。對于T細(xì)胞淋巴瘤，存在多種適于使用本發(fā)明的非對映體治療的病狀，并且所述病狀包括(a)淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤，其中惡性腫瘤在來自胸腺的原始淋巴祖細(xì)胞中發(fā)生；(b)成熟或周圍T細(xì)胞贅生物，包括T細(xì)胞前淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞粒狀淋巴細(xì)胞性白血病、侵襲性NK細(xì)胞白血病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(蕈樣肉芽腫/塞扎里綜合癥(Sezary syndrome))、退行性大細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞型、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(包括與HTLV-I相關(guān)者)和血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤，和皮下脂膜炎性T細(xì)胞淋巴瘤；以及(c)最初累及淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)并且從未生長成真正的濾泡型態(tài)的周圍T細(xì)胞淋巴瘤。欲治療的其它癌癥包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。 本文所用的術(shù)語“炎癥性病癥”是指由炎癥引起或者癥狀包括炎癥的任何病癥。舉例來說，由炎癥引起的炎癥性病癥可以是敗血性休克，并且癥狀包括炎癥的炎癥性病癥可以是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的炎癥性病癥包括但不限于心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、克羅恩氏病、炎癥性腸病、全身性紅斑狼瘡、多肌炎、敗血性休克、移植物抗宿主疾病、哮喘、鼻炎、牛皮癬和濕疹。在一個實(shí)施方案中，欲治療的炎癥性病癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本文所用的術(shù)語“患者”或“哺乳動物”是指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農(nóng)畜，以及動物園或伴侶動物，如狗、馬、貓、牛等。哺乳動物優(yōu)選為人。用于本發(fā)明用途的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤通常將如本領(lǐng)域中所已知以對正進(jìn)行治療的患者提供最有效的治療(從功效和安全性的觀點(diǎn)來看)的給藥方案向患者施用。在進(jìn)行本發(fā)明的治療方法時，根據(jù)本發(fā)明用于甲氨蝶呤抗性病癥和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌癥的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以本領(lǐng)域中已知的任何有效方式施用，如通過口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、目艮內(nèi)、陰道、直腸、顱內(nèi)或皮內(nèi)途徑，這取決于所治療癌癥的類型和開處方的醫(yī)師基于例如公布的臨床研究的結(jié)果所作出的醫(yī)學(xué)判斷。根據(jù)本發(fā)明用于甲氨蝶呤抗性病癥和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌癥的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以被配制成藥物制劑的一部分。具體劑型將取決于施用方法，但可以包括片劑、膠囊、口服液和可注射溶液用于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、顱內(nèi)或腹膜內(nèi)施用等。劑量可表示為mg/m2?；蛘?，劑量可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員可接受的任何方式表示為毫克/公斤體重。一種獲得以毫克/公斤體重表示的等同劑量的方法包括應(yīng)用轉(zhuǎn)換因子O. 025mg/kg,對于普通人來說約等同于lmg/m2。根據(jù)此計(jì)算，150mg/m2的劑量約等同于約3. 75mg/kg0適用于治療甲氨蝶呤抗性病癥和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌癥的腫瘤學(xué)的劑量包括以下給藥方案。在一個實(shí)施方案中，這些劑量是靜脈內(nèi)劑量。舉例來說，每天每平方米體表面積約IOmg至120mg的劑量(每天每公斤體重約O. 25mg至3mg)為適當(dāng)?shù)?。以下劑量也是適合的每周一次30mg/m2(約O. 75mg/kg)持續(xù)3周接著停藥一周、每周一次30mg/m2(約O. 75mg/kg)持續(xù)6周接著停藥一周，或按每周一次持續(xù)6周的時程逐漸遞增10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的劑量。適當(dāng)時可基于患者耐受性和惡性腫瘤的類型使用較低劑量。當(dāng)使用頻率較低的施用時可利用較高劑量。因此，在一般意義上，10mg/m2至275mg/m2(約O. 25mg/kg至約6. 9mg/kg)的劑量適用于各種給藥時程，例如約 100mg/m2至275mg/m2(約2. 5mg/kg至約6. 87mg/kg)之間每兩周一次的劑量，和約10mg/m2至150mg/m2(約O. 25mg/kg至約3. 75mg/kg)之間或者更具體來說約10mg/m2與60mg/m2之間每周一次的劑量。使用與美國專利號6，323，205中所描述的方案類似的方案來確定適合劑量在本領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明用于甲氨蝶呤抗性病癥和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌癥的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以每劑約10mg/m2至約275mg/m2(約0. 25mg/kg至約6. 87mg/kg)的量施用。本發(fā)明的方法還包括按以下施用根據(jù)本發(fā)明用于甲氨蝶呤抗性病癥和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌癥的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤每周一次；所施用的劑量為約10mg/m2(0. 25mg/kg)或約30mg/m2 (0. 75mg/kg);施用量為每劑約 10mg/m2 至約 150mg/m2(約 0. 25mg/kg 至約 3. 75mg/kg);每兩周一次；以及所施用的劑量為約100mg/m2至約275mg/m2 (約2. 5mg/kg至約6. 9mg/kg)。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明用于甲氨蝶呤抗性病癥和/或10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤敏感性癌癥的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以如下量施用約0. 25mg/kg與約4mg/kg之間的量；約0. 75mg/kg與約3mg/kg之間；約I. 0mg/kg與約2. 5mg/kg之間的量；約O. 25mg/kg或約O. 75mg/kg的量(或以體表面積(BSA)計(jì)的等同量)。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可與其它細(xì)胞毒性和抗腫瘤化合物組合使用，所述化合物包括長春花生物堿，如長春花堿、諾維本(navelbine)和長春地辛(vindesine);核苷酸類似物，如吉西他濱、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷；烷基化劑，如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)或異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；順鉬(cisplatin)或卡鉬(carboplatin)；甲酰四氫葉酸；紫杉燒，如紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel);抗CD20單克隆抗體，含有或不含放射性同位素；和抗生素，如阿霉素(doxorubicin)和絲裂霉素(mitomycin)。也可使用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與這些其它抗腫瘤劑中的多種或與生長因子抑制劑和抗血管生成劑的組合。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與其它藥劑可同時施用，或者作為常用治療方案的一部分組合利用，在所述治療方案中10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤與一種或多種其它藥劑在不同時間施用。舉例來說，其它藥劑可在相對于10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤施用之前、之后立即或之后一段時間(例如24小時)施用。因此，除非另外指定，否則出于本申請的目的，術(shù)語施用一般指同時施用或指藥物按平行治療方案中的任一順序在所述藥物之間有或無時間間隔的情況下依序施用。對于炎癥性病癥的治療，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以通過口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或鞘內(nèi)途徑給予。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將存在其它途徑。對于包括但不限于牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的炎癥性病癥的治療，劑量可包括以下。用于成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多關(guān)節(jié)型青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的本發(fā)明方法包括每周一次口服施用約Img至約30mg ;在一個實(shí)施方案中，每周一次施用約7. 5mg。其它劑量可包括每周一次給予10mg/m2?？芍饾u調(diào)整劑量以達(dá)到最佳反應(yīng)。在較高劑量下，如超過20mg/m2/wk,或O. 65mg/kg/wk至I. Omg/kg/wk,通過肌肉內(nèi)或皮下給藥可達(dá)成更好的吸收。適當(dāng)?shù)膭┝窟€可包括每周7. 5mg,或者約O. 5mg與約IOmg之間的分次口服劑量；在一個實(shí)施方案中，劑量可為2. 5mg的分次口服劑量，以12小時的時間間隔持續(xù)三次給藥，按每周一次的時程給予。劑量在它有效的情況下可以持續(xù)，并且包括持續(xù)長達(dá)兩年和更長時 間的療法。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤適合與葉酸以及維生素B12補(bǔ)充劑組合使用以減少治療的副作用。舉例來說，可以用葉酸(開始一周每天lmg/m2，隨后用10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤治療，或者在不以體表面積(BSA)計(jì)的情況下每天口服(p.o.)lmg);和B12(每月lmg/m2，或者每8-10周肌肉內(nèi)(I. M.)給予Img(不以BSA計(jì))，或者每天口服Img(不以BSA計(jì)))對患者進(jìn)行治療。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤被配制用于口服施用。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤被配制用于靜脈內(nèi)施用。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以多種不同劑型施用。舉例來說，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以優(yōu)選口服或胃腸外施用。10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可與各種藥學(xué)上可接受的惰性載體一起以片劑、膠囊、錠劑、藥片、硬糖、粉末劑、噴霧劑、霜劑、油膏、栓劑、膠凍、凝膠、糊劑、洗劑、軟膏、酏齊U、糖漿劑等形式施用。所述劑型的施用可以單次或多次給藥進(jìn)行。載體包括固體稀釋劑或填充劑、無菌水性介質(zhì)和各種無毒有機(jī)溶劑和其它載體?？梢詫诜幬锝M合物適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行甜化和/或調(diào)味。對于10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的口服施用，將含有一種或兩種活性劑的片劑與各種賦形劑(如微晶纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘氨酸)中的任一種以及各種崩解劑(如淀粉(且優(yōu)選為玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉)、海藻酸和某些復(fù)合硅酸鹽)連同造粒粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和阿拉伯膠)進(jìn)行組合。另外，潤滑劑諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉通常非常適用于壓片的目的。還可采用類似類型的固體組合物作為明膠膠囊中的填充劑；在這方面優(yōu)選的物質(zhì)還包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。當(dāng)希望含水混懸液和/或酏劑用于口服施用時，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可與各種甜味劑或調(diào)味劑、著色物質(zhì)或染料，并且必要時與乳化劑和/或懸浮劑以及如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各種類似組合的稀釋劑進(jìn)行組合。含有本發(fā)明的組合物的片劑可以通過壓制或模制，任選地在一種或多種輔助成分或助劑存在下來制備。壓制的片劑可以通過在適合的機(jī)器中壓制任選地與粘合齊U、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合的呈自由流動形式(如粉末或顆粒)的活性成分來制備。模制的片劑可以通過在適合的機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀化合物的混合物來制備。各片劑優(yōu)選含有約O. 05mg至約IOg活性成分并且各藥囊或膠囊優(yōu)選含有約O. 05mg至約IOg活性成分；片劑同樣可適當(dāng)?shù)睾忻苛Ｆ瑒┘s2. 5mg活性成分或每粒片劑約7. 5mg0對于10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的胃腸外施用，可以采用溶液，以及包含活性劑或其相應(yīng)水溶性鹽的無菌水溶液。所述無菌水溶液優(yōu)選經(jīng)過適當(dāng)緩沖，并且還優(yōu)選用例如足量生理鹽水或葡萄糖賦予等滲性。這些特定水溶液尤其適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射的目的。油性溶液適于關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下注射的目的。所有這些溶液在無菌條件下的制備都可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)技術(shù)容易地完成。出于獸醫(yī)學(xué)的目的，活性劑可以使用任何形式和通過上文描述的任何途徑單獨(dú)或一起向動物施用。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤以膠囊、大 丸劑(bolus)、片劑、液體藥液形式、通過注射或作為植入物施用。作為替代方案，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤可以與動物飼料一起施用，并且出于此目的，可制備濃縮的飼料添加劑或預(yù)混物用于正常動物飼料。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)獸醫(yī)學(xué)規(guī)范以常規(guī)方式制備所述制劑。本發(fā)明還包括一種治療需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治療的個體的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤和它的藥學(xué)上可接受的鹽。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指由藥學(xué)上可接受的無毒堿或酸制備的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物呈酸性時，它的相應(yīng)鹽可以常規(guī)地由藥學(xué)上可接受的無毒堿(包括無機(jī)堿和有機(jī)堿)制備。由所述無毒堿產(chǎn)生的鹽包括鋁鹽、銨鹽、鈣鹽、銅鹽(銅鹽和亞銅鹽)、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽(錳鹽和亞錳鹽)、鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽以及類似鹽。特別優(yōu)選者是銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽和鈉鹽。在一個實(shí)施方案中，鹽是鹽酸鹽。由藥學(xué)上可接受的有機(jī)無毒堿產(chǎn)生的鹽還包括伯胺、仲胺和叔胺以及環(huán)狀胺和取代胺(如天然存在的和合成的取代胺)的鹽?？梢孕纬甥}的其它藥學(xué)上可接受的有機(jī)無毒堿包括離子交換樹脂，如精氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、N'，N' - 二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、還原葡糖胺、葡糖胺、組氨酸、海巴明(hydrabamine)、異丙胺、賴氨酸、甲基還原葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因(procaine)、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺、緩血酸胺等。除上述常用劑型外，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤(包括其各組分的藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物和多晶型物)還可以通過控制釋放方式和/或遞送裝置施用。除非另外指出，否則本發(fā)明說明書與權(quán)利要求書中所用的表示成分、尺寸、反應(yīng)條件等的量的所有數(shù)值應(yīng)理解為在所有情況下都被術(shù)語“約”修飾。在本申請和權(quán)利要求書中，除非另外特別說明，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。另外，除非另外說明，否則“或”的使用意指“和/或”。此外，術(shù)語“包括(including) ”以及其它形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具限制性。同樣，除非另外特別說明，否則如“要素”或“組分”的術(shù)語涵蓋包含一個單元的要素和組分以及包含超過一個單元的要素和組分。
本發(fā)明在某種程度上基于展示了具有獲得性甲氨蝶呤抗性的細(xì)胞將仍保留對普拉曲沙的敏感性，而獲得了普拉曲沙抗性的細(xì)胞也將獲得甲氨蝶呤抗性的數(shù)據(jù)。對于普拉曲沙敏感性的預(yù)測遺傳因素，由DU145 (前列腺)和HEP2 (頭頸部)癌細(xì)胞系產(chǎn)生對所述藥物具有獲得性抗性的兩個細(xì)胞系。在對普拉曲沙的抗性為親本細(xì)胞的200倍以上的同時，DU-PDX和HEP-PDX對甲氨蝶呤展示出部分交叉抗性。普拉曲沙獲得性抗性與RFC-I表達(dá)減少和MDRl表達(dá)增加有關(guān)。Fotoohi等(2009)描述了在甲氨蝶呤抗性細(xì)胞中RFC-I的mRNA水平下調(diào)超過兩倍的抗葉酸劑抗性白血病細(xì)胞系，強(qiáng)調(diào)了內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)在抗葉酸劑抗性中的重要作用。類似的數(shù)據(jù)在早先由Jansen(1998)、Rothen(2004)和Ifergan(2003)使用其它甲氨蝶呤抗性細(xì)胞模型獲得。MDRl表達(dá)增加似乎并未在所觀察到的獲得性普拉曲沙抗性中起作用，這是因?yàn)橐种芃DRl并未恢復(fù)普拉曲沙敏感性。已顯示，F(xiàn)PGS活性降低在人白血病CCRF-CEM細(xì)胞中與獲得性甲氨蝶呤抗性有關(guān)(Mauritz，2002)。在一項(xiàng)研究中，在普拉曲沙抗性細(xì)胞中觀察到FPGS表達(dá)稍有減少，表明了聚谷氨酸化在普拉曲沙抗性中的作用。三十年前進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，獲得性甲氨蝶呤抗性的另一個常見機(jī)制是DHFR基因擴(kuò)增和由此而引起的酶過度表達(dá)(由Assaraf 2007 ；Chen等，1995評述)。在此研究中，具有獲得性甲氨蝶呤抗性的細(xì)胞系HEP-MTX展示出DHFRmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)與它的親本對應(yīng)物相比顯著·增加。在普拉曲沙抗性細(xì)胞系中未觀察到DHFR表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明在這些細(xì)胞系中甲氨蝶呤抗性與普拉曲沙抗性的分子機(jī)制不同。因此，本發(fā)明顯示，令人驚奇的是，對甲氨蝶呤具有抗性的細(xì)胞系對普拉曲沙并不具有抗性和/或?qū)ζ绽潮Ａ袅烁叩枚嗟脑济舾行?。本發(fā)明的其它目標(biāo)、優(yōu)點(diǎn)和新型特征對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說在研究以下實(shí)施例后將變得顯而易見，所述實(shí)施例不意圖具有限制性。另外，如上所述的和如以下權(quán)利要求書部分中所要求的本發(fā)明的各種實(shí)施方案和方面各自將在以下實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例以下實(shí)施例僅出于說明的目的而提供并且不意圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :圖I示出適用于制備10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的合成方案。將60%NaH的油分散液(I. 06g，26. 5mmol)于18mL過篩脫水的THF中的混合物冷卻到0°C。用升對酞酸二甲酯(5. 0g,24mmol.，圖I中的化合物I)于無水THF(7mL)中的溶液處理冷混合物，并且將所述混合物在0°C下攪拌I小時。添加炔丙基溴(26. 4mmol)，并且將混合物在00°C下再攪拌I小時，然后在室溫下攪拌16小時。用2.4mL 50%乙酸處理所得混合物，然后傾倒至240mL水中。用乙醚(2X150mL)萃取混合物。合并乙醚萃取物，經(jīng)過Na2SO4干燥，并且濃縮成橙黃色油狀物。進(jìn)行硅膠(600mL 230-400篩目)色譜，用環(huán)己烷-EtOAc (8:1)洗脫，得到呈白色固體狀的產(chǎn)物α-炔丙基升對酞酸二甲酯(化合物2) (4. 66)，通過TLC (環(huán)己烷-Et0Ac，3:l)顯示所述產(chǎn)物為均質(zhì)的。然而，對此產(chǎn)物獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示其為想要的產(chǎn)物2與二炔丙基化化合物的混合物。沒有檢測到起始物質(zhì)I。HPLC顯示單炔丙基化產(chǎn)物與二炔丙基化產(chǎn)物的比率為約3: I。因?yàn)槎脖a(chǎn)物不同于化合物1，不會在下一個反應(yīng)步驟中產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物，所以此物質(zhì)適于轉(zhuǎn)化成化合物3。在用于在合成中繼續(xù)反應(yīng)的產(chǎn)物中不存在起始化合物I對于在轉(zhuǎn)化獲得最終產(chǎn)物期間避免連續(xù)形成ΙΟ-dAM是非常重要的，這是因?yàn)閷ⅵ│?dAM從10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤中完全除去是非常困難的。通過將O. 36g 60%NaH(9mmol)的油分散液與IOmL無水DMF組合形成混合物并且將所述混合物冷卻到0°C -5V。用第一反應(yīng)的產(chǎn)物(化合物2) (2. 94g，12mmol)于IOmL無水DMF中的溶液逐滴處理冷混合物，然后在(TC下攪拌30分鐘。冷卻到-25 °C后，逐滴添加2,4, 二氨基-6-(溴甲基)-蝶啶氫溴酸鹽-O. 22-丙醇(1.00g，2.9mmOl)于IOmL無水DMF中的溶液，同時使溫度維持在接近_25°C。經(jīng)過2小時的時間使攪拌過的混合物的溫度上升至-KTC。再在-10°C下持續(xù)2小時后，使溫度上升至20°C，在室溫下繼續(xù)攪拌超過2小時。然后通過添加固體CO2將反應(yīng)物調(diào)節(jié)至pH 7。在真空中濃縮以除去溶劑后，將殘余物與乙醚一起攪拌并且收集不溶于乙醚的物質(zhì)，用水洗滌，并且在真空中干燥，得到1.49g粗產(chǎn)物。將此粗產(chǎn)物溶解于CHCl3-Me0H(10:l)中以便施加至硅膠管柱上。用相同的溶劑系統(tǒng)洗脫，得到10-炔丙基-10-甲氧羰基-4-脫氧-4-氨基-10-去氮雜蝶酸甲酯(化合物3)，根據(jù)TLC其為均質(zhì)的，產(chǎn)率為40%(485mg)。將攪拌過的化合物3(400mg,0. 95mmol)于2_甲氧基乙醇(5mL)中的懸浮液用水 (5mL)，然后用10%氫氧化鈉溶液(3.9mL)處理。在室溫下攪拌混合物4小時，期間形成溶液。用乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH 8并且在高真空下濃縮。將所得殘余物溶解于15mL水中并且酸化至PH 5. 5-5. 8，引起沉淀物形成。收集沉淀物，用水洗滌并且在真空中干燥，回收到340mg化合物4 (91%產(chǎn)率)。HPLC分析指示產(chǎn)物純度為90%。通過在15mL DMSO中在115°C _120°C下加熱10分鐘使化合物4(330mg)脫去羧基。10分鐘后進(jìn)行HPLC測試，證實(shí)了轉(zhuǎn)化基本上完成。通過在真空中蒸餾(40°C浴槽)除去DMS0。將殘余物與O. 5NNa0H —起攪拌，得到澄清溶液。用IN HCl酸化至pH 5.0，得到呈黃色固體狀的10-炔丙基-4-脫氧-4-氨基-10-去氮雜蝶酸(化合物5)，產(chǎn)率為70%。HPLC指示此階段的產(chǎn)物純度為90%。使用BOP試劑(六氟磷酸苯并三唑-I-基氧基三(二甲氨基)鱗(287mg，O. 65mmol,奧德里奇化學(xué)公司(Aldrich Chemical Co.))在含有三乙胺(148mg, I. 46mmol)的DMF (IOmL)中使化合物5 (225mg, O. 65mmol)與L-谷氨酸二甲酯鹽酸鹽(137mg，O. 65mmol)偶合。在20°C _25°C下攪拌混合物3小時，然后蒸發(fā)至干燥。將殘余物與水一起攪拌并且收集水不溶性粗產(chǎn)物，并且在真空中干燥。通過硅膠色譜(用含有三乙胺(0.25體積%)的CHCl3-MeOH(10:1)洗脫)對粗產(chǎn)物(350mg)進(jìn)行純化，回收到165mg 10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤二甲酯(化合物6，50%產(chǎn)率)，根據(jù)TLC(CHCl3-MeC)H 5:1)其為均質(zhì)的。將化合物6(165mg，0.326mmol)懸浮于添加有 O. 72mL (O. 72meq) IN NaOH 的 IOmL經(jīng)過攪拌的MeOH中。在室溫下持續(xù)攪拌直至在數(shù)小時后形成溶液為止。將溶液在20°C -25°C下保持8小時，然后用IOmL水稀釋。在減壓下蒸發(fā)除去甲醇，并且將濃縮了的水溶液在20°C-25°C下再留置24小時。然后，HPLC顯示酯水解完成。用乙酸將澄清的水溶液酸化至PH 4.0，使得10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤以淺黃色固體形式沉淀出，收集、水洗并且在真空中干燥了的產(chǎn)物重122mg(79%產(chǎn)率)。通過元素分析、質(zhì)子NMR和質(zhì)譜進(jìn)行的測定與指定的結(jié)構(gòu)完全一致。HPLC分析指示純度為98%并且確定所述產(chǎn)物不含10-去氮雜氨基蝶呤。在此情況下，10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的量(如通過HPLC峰面積所測定)接近98%，并且處理軟件未檢測到對應(yīng)于10-去氮雜氨基蝶呤的峰，盡管在此區(qū)域中存在少許基線波動。實(shí)施例2 為探究10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤對不同實(shí)體腫瘤類型的活性，研究了 15種人實(shí)體腫瘤細(xì)胞系對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的細(xì)胞毒性活性的敏感性。材料和方法細(xì)胞系一組人結(jié)腸癌(HT29、HCT116、C0L0205、HCC2998)、乳癌(MCF7、MDA-MB-435)、月市癌(H0P62、H0P92)、卵巢癌(0VCAR3、IGR0V1)、前列腺癌(DU145、PC3)和頭頸癌(SCC61、HEP2、SQ20B)細(xì)胞系是購自ATCC(Rockville, MD)和美國國家癌癥研究所(NationalCancerInstitute)保藏中心。在補(bǔ)充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位πιΓ1青霉素(penicillin)和100 μ M πιΓ1鏈霉素(streptomycin)的RPMI培養(yǎng)基中將細(xì)胞培育成單層。 細(xì)胞毒性測定所產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)都是一式兩份進(jìn)行的三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用如先前所述進(jìn)行的MTT測定(Hansen，1989)來測定細(xì)胞活力。簡單來說，將細(xì)胞以每孔2X IO3個細(xì)胞的密度接種在96孔板中。孵育細(xì)胞120小時，然后在37°C下添加0.4mg πιΓ1的MTT染料(3_[4，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基溴化四唑鎗鹽，持續(xù)4小時。將單層懸浮于O. Iml DMSO中并且使用微板讀數(shù)器測量560nm下的吸光度。陽性和陰性對照組分別包括具有未處理的細(xì)胞或含MTT而無細(xì)胞的培養(yǎng)基的孔。由線粒體脫氫酶催化黃色水溶性四唑鎗鹽MTT轉(zhuǎn)化成紫色不溶性甲臜，并且將所述轉(zhuǎn)化用于估算活細(xì)胞的數(shù)目。將對應(yīng)于未處理細(xì)胞的對照值視作100%并且經(jīng)過處理的樣品的活力表示為占對照組的百分比。IC5tl值測定為使細(xì)胞活力降低50%的濃度。為了進(jìn)行單個藥劑研究，接種細(xì)胞并且靜置24小時，之后用遞增濃度的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤處理72小時。孵育后，將細(xì)胞回收至不含化合物的培養(yǎng)基中持續(xù)48小時，之后使用MTT測定來測定生長抑制作用。蛋白質(zhì)印跡分析在含有50mM HEPES(pH 7.6)、150mM NaCl、l%Triton X_100、2mM 釩酸鈉、IOOmMNaF和0. 4mg. πιΓ1苯甲基磺酰氟的緩沖液中使細(xì)胞溶解。用等量的蛋白質(zhì)(20 μ g-50 μ g/泳道)進(jìn)行SDS-PAGE并且轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上。用抗裂解型PARP、抗裂解型胱天蛋白酶3、抗胱天蛋白酶9 (法國Saint Quentin Yvelines的賽信通生物試劑有限公司(Cell Signaling, Saint Quentin Yvelines, France))、抗 DHFR(法國的艾碧康公司(Abeam, France))、抗β-肌動蛋白(法國Saint-QuentinFallavier的西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich, Saint-QuentinFallavier, France))特異性一抗，隨后用連接有過氧化物酶的二抗探測膜并且通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。圖2示出所測試的15種人癌細(xì)胞系對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的相對敏感性。發(fā)現(xiàn)9種細(xì)胞系對10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤的細(xì)胞毒性活性敏感(IC50<0. I μ Μ),而發(fā)現(xiàn)6種細(xì)胞系具有相對抗性(IC5(i>9 μ Μ)。單個藥劑抗增殖作用。在如表I所展示的15種癌細(xì)胞系中檢驗(yàn)普拉曲沙的抗增殖作用。時程實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)細(xì)胞暴露于普拉曲沙72小時之時達(dá)到最佳抗增殖作用(

圖1Α)。普拉曲沙的IC5tl的范圍為O. Ol ±O. 002 μ M(針對前列腺癌細(xì)胞系PC3)至>350 μ M(針對MDA-MB-435細(xì)胞系)。有趣的是，觀察到以下兩組細(xì)胞系的IC5tl相差超過100倍一組包括PC3、SCC61、DU145、HT29、HOP62、SQ20B、HOP92、HEP2 和 IGROVl 細(xì)胞展示 IC5(l〈0. I μ M，而 Colo205、HCC2998、MCF7、HCTl 16、0VCAR3 和 MDA-MB-435 細(xì)胞顯示 IC5tl 值 >9 μ M。將普拉曲沙的抗增殖作用與甲氨蝶呤和多種常用的抗代謝物(如培美曲塞、5-FU和5' -DFUR、活性卡培他濱(capecitabine)代謝物)的作用進(jìn)行比較(圖IB和表I)。普拉曲沙的IC5tl平均起來為對于甲氨蝶呤所觀察到的IC5tl的近乎十分之一。這兩種抗葉酸劑的細(xì)胞毒性特征在利用相同的兩組不同的敏感性和抗性細(xì)胞系的情況下為類似的。普拉曲沙的細(xì)胞毒性特征不同于5-FU、5^ -DFUR和培美曲塞的細(xì)胞毒性特征，表明普拉曲沙與這些其它抗代謝物之間在代謝、作用機(jī)制和/或抗性方面存在差異。有趣的是，在普拉曲沙與培美曲塞(一種被認(rèn)為主要是胸苷酸合成酶(TS)抑制劑的抗葉酸劑)之間觀察到有限的交叉敏感性。葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中所涉及的基因的表達(dá)在該組癌細(xì)胞系中分析已知涉及于抗葉酸劑敏感性的基因的表達(dá)。通過qRT-PCR測定DHFR、FPGS, TS/TYMS(胸苷酸合成酶)、SCL19AI/RFC-1、GARFT(甘氨酰胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶)、SLC25A32 (線粒體葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體/載體)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體BI (ABCB1或MDR1)mRNA表達(dá)(圖3A)。所述細(xì)胞系表達(dá)不同水平的這些葉酸通路基因，但在普拉曲沙敏感性與TS、SCL19AI/RFC-1、GARFT, SLC25A32和MDRl的mRNA表達(dá)之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。普拉曲沙敏感性細(xì)胞表達(dá)的DHFR(普拉曲沙的一種靶標(biāo))水平相對高于“抗性”組,但并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性(P=O. 083，圖3A)。普拉曲沙敏感性細(xì)胞表達(dá)的FPGS mRNA水平顯著高于抗性細(xì)胞(t-檢驗(yàn)，p=0. 002)?？傊?，發(fā)現(xiàn)FPGS mRNA表達(dá)與普拉曲沙敏感性(IC5tl)之間趨向于正相關(guān)(R2=O. 47，p〈0. 01)，表明聚谷氨酸化在普拉曲沙抗增殖活性中具有重要作用。為了確定葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在普拉曲沙活性中的潛在作用，我們使9種普拉曲沙敏感性細(xì)胞系在藥物暴露72小時后獲得的IC5tl值與SCL19A1/RFC-1和SLC25A32的mRNA表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)(圖3B)。表達(dá)高水平SCL19A1/RFC-1和SLC25A32mRNA的細(xì)胞展示出較高的普拉曲沙敏感性，表明SCL19A1/RFC-1和SLC25A32在普拉曲沙的細(xì)胞吸收方面具有潛在作用。 表I. 一組人癌細(xì)胞系在暴露于普拉曲沙、甲氨蝶呤、5-FU、5' -DFUR或培美曲塞72小時后的細(xì)胞毒性(IC50，μ Μ)。
細(xì)胞系*普拉曲沙甲氨蝶呤培美曲塞5-FUSt-PFilR
PO0.010.12.71.525
SCOSl0.0110.030.0151.23.2
DU1450.0150.30.048728ΗΤ290.020.220.023316 ΗΟΡ620.0230.150.02978380 SQ20B0.030.260.0251027 ΗΟΡ920,0310,60.0218135 ΗΕΡ20.050.250.186250 IGROVl0-08033300829
權(quán)利要求
1.一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病癥的方法，其中所述方法包括向患有甲氨蝶呤抗性病癥的所述個體施用藥學(xué)有效量的包含10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述病癥為癌癥。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中欲治療的所述癌癥為前列腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述病癥為炎癥性病癥。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述炎癥性病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述組合物被配制用于口服施用。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述組合物被配制用于靜脈內(nèi)施用。
8.一種治療需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治療的個體的方法，其中所述方法包括向所述個體施用包含有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學(xué)上可接受的鹽的組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述病癥為癌癥。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中欲治療的所述癌癥為前列腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸道癌癥、卵巢癌和骨肉瘤。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述病癥為炎癥性病癥。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述炎癥性病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述組合物被配制用于口服施用。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述組合物被配制用于靜脈內(nèi)施用。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述甲氨蝶呤抗性病癥為已獲得對甲氨蝶呤的抗性的病癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療個體的甲氨蝶呤抗性病癥的方法，其中所述方法包括向所述個體施用有效量的10-炔丙基-10-去氮雜氨基蝶呤或它的藥學(xué)上可接受的鹽。
文檔編號A61K31/495GK102984940SQ201180026765
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者G·J·普隆克 申請人:阿羅斯治療公司