專利名稱：用于純化聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文報(bào)道了一種使用在SP Sephacryl S500HR柱上的線性梯度洗脫方法來純化聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的方法。
背景技術(shù)：
蛋白在當(dāng)今的醫(yī)療產(chǎn)品中具有重要作用。對(duì)于人應(yīng)用而言，每種治療性蛋白必須符合獨(dú)特的標(biāo)準(zhǔn)。為了確保生物藥物對(duì)人類的安全性，尤其必須除去生產(chǎn)過程中累積的副產(chǎn)物。為了滿足管理規(guī)范，在生產(chǎn)過程之后必須進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟。其中，純度、處理量和收率在確定適宜的純化方法中起重要作用。已經(jīng)報(bào)道了下述治療性蛋白的綴合物:例如，聚乙二醇(PEG)和白介素-6 (EP0442724)，PEG和促紅細(xì)胞生成素(W001/02017)，包含內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素和免疫球蛋白的嵌合分子(US2005/008649)，基于分泌型抗體的融合蛋白(US2002/147311)，包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991 ;人血清白蛋白US5，876，969)，聚乙二醇化的多肽(US2005/0114037)和促紅細(xì)胞生成素融合物。Necina, R.,等人(Biotechnol.Bioeng.60 (1998) 689-698)報(bào)道了用表現(xiàn)出高電荷密度的離子交換介質(zhì)從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中直接捕獲人單克隆抗體。在W089/05157中，報(bào)道了一種通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基直接進(jìn)行陽離子交換處理來純化免疫球蛋白產(chǎn)物的方法。Danielsson, A.，等人，J.1mmun.Meth.115 (1988) 79-88 描述了從小鼠腹水中一步純化單克隆IgG抗體。在W02004/024866中報(bào)道了一種通過離子交換色譜法來純化多肽的方法，其中使用梯度洗脫將目標(biāo)多肽與一種或多種污染物拆分開。在EP0530447中，報(bào)道了一種通過三個(gè)色譜步驟的組合來純化IgG單克隆抗體的方法。Yu，G.，等人，Process Biotechnol.42 (2007) 971-977報(bào)道了單聚乙二醇化的白介素-1受體拮抗劑的容易的純化。Wang，H.，等人，P印tides26 (2005) 1213-1218報(bào)道了通過兩步陽離子交換色譜法來純化在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)的hTFF3。Yun, Q.，等人(Yun，Q.，等人，J.Biotechnol.118(2005)67-74)報(bào)道了通過兩個(gè)連續(xù)的離子交換色譜步驟來純化聚乙二醇化的rhG-CSF
發(fā)明內(nèi)容
本文報(bào)道了一種通過陽離子交換色譜法從反應(yīng)副產(chǎn)物或未反應(yīng)的原料中純化蛋白綴合物的方法，所述蛋白綴合物包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過采用陽離子交換色譜材料SP Sephacryl S500HR和線性梯度洗脫,可以在單個(gè)步驟中以高純度和收率獲得包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的綴合蛋白，其中在柱中已經(jīng)預(yù)先施加了具有確定電導(dǎo)率的緩沖溶液。因而，在一個(gè)方面，本文報(bào)道了一種獲得包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的融合蛋白的方法，所述方法包括下述步驟:a)將具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液施加于包含SP Sephacryl S500HR色譜材料的色譜柱上，b)將一種溶液施加于a)的柱上，所述溶液包含游離的促紅細(xì)胞生成素以及促紅細(xì)胞生成素和聚(乙二醇)的融合蛋白(其中每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子具有一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)殘基)的混合物，c)將具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液施加于所述柱，并由此回收包含2個(gè)或更多個(gè)聚(乙二醇)殘基的融合蛋白，d)向所述柱施加一種溶液，所述溶液具有連續(xù)地且線性地遞增的一直到至少60mS/cm的最終值的電導(dǎo)率，并由此分別回收包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的融合蛋白和游離的促紅細(xì)胞生成素，其中首先獲得包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液是pH值為pH2.5至PH3.5的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液是pH值為pH2.5至pH3.5的磷酸(鹽)緩沖溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟d)中施加的溶液的pH值為pH2.5至pH3.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加具有連續(xù)地且線性地遞增的電導(dǎo)率的溶液是一直到約70.0mS/cm的最終電 導(dǎo)率值。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有連續(xù)地且線性地遞增的電導(dǎo)率的溶液是具有連續(xù)地且線性地遞增的氯化鈉濃度的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述促紅細(xì)胞生成素是人促紅細(xì)胞生成素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人促紅細(xì)胞生成素具有SEQ ID N0:01或SEQ ID NO:02的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單個(gè)聚(乙二醇)殘基具有20kDa至40kDa的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，以將Img直至4mg融合蛋白施加于Iml色譜材料上的方式，將包含游離的促紅細(xì)胞生成素和促紅細(xì)胞生成素與聚(乙二醇)的融合蛋白(其中每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子具有一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)殘基)的混合物的溶液施加于所述色譜材料上。發(fā)明描述本文報(bào)道了一種使用梯度洗脫方法來純化蛋白的方法，所述蛋白包含一個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子和一個(gè)聚(乙二醇)殘基，其中所述梯度是在SPS^hacryl S500HR柱上的線性電導(dǎo)率梯度，其中在施加包含所述蛋白的溶液之前，已經(jīng)將具有確定電導(dǎo)率的溶液施加在色譜柱上。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知一般的色譜方法和它們的應(yīng)用。參見例如，Heftmann，E.,(編)，Chromatography,第 5 版，Part A !Fundamentals and Techniques, ElsevierScience Publishing Company,紐約(1992) ；Deyl, Z.,(編)，Advanced Chromatographicand Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam，The Netherlands (1998) ;Poole，C.F.，和 Poole，S.K.，Chromatography Today, ElsevierScience Publishing Company，紐約(1991) ;Scopes，Protein Purification:Principlesand Practice，Springer Verlag(1982) ;Sambrook，J.，等人，(編)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor, N.Y., (1989);或 Ausubel，F(xiàn).M.，等人，(編)，Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, Inc.,紐約(1987-1994)。術(shù)語“施加于”表示純化方法的一個(gè)部分步驟，其中使溶液與色譜材料接觸。這表示:a)將溶液加入含有色譜材料的色譜裝置中，或b)將色譜材料加入溶液中。在a)的情況下，溶液通過所述裝置，使色譜材料與溶液中含有的物質(zhì)相互作用。取決于條件(例如pH、電導(dǎo)率、鹽濃度、溫度和/或流速)，溶液中的一些物質(zhì)與色譜材料結(jié)合，從而可以在進(jìn)一步的步驟中從色譜材料回收。留在溶液中的物質(zhì)可在穿流液(flow-through)中找到?！按┝饕骸北硎敬┻^所述裝置后獲得的溶液，其可以是施加的溶液或緩沖溶液，所述施加的溶液或緩沖溶液用于洗滌柱或者用于造成與色譜材料結(jié)合的物質(zhì)的洗脫。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是柱或盒。在b)的情況下，可以將色譜材料(例如作為固體)加入例如含有要純化的目標(biāo)物質(zhì)的溶液中，從而允許色譜材料和溶液中的物質(zhì)之間的相互作用。在相互作用以后,通過例如過濾來除去色譜材料,并且也隨之從溶液中除去與色譜材料結(jié)合的物質(zhì),而未與色譜材料結(jié)合的物質(zhì)保留在溶液中。術(shù)語“結(jié)合和洗脫模式”表示色譜步驟的一種工作模式，其中將含有要純化的目標(biāo)物質(zhì)的溶液施加于色譜材料上，由此使目標(biāo)物質(zhì)與色譜材料結(jié)合。因而，目標(biāo)物質(zhì)保留在色譜材料上，而非目標(biāo)物質(zhì)則·用穿流液或上清液除去。然后在第二步中，用洗脫溶液從色譜材料回收目標(biāo)物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文中報(bào)道的方法以結(jié)合和洗脫模式工作。用于本文報(bào)道的方法中的溶液是粗制溶液或緩沖溶液。術(shù)語“緩沖溶液”表示這樣的溶液:其中由酸性或堿性物質(zhì)的添加或釋放引起的PH變化會(huì)被溶解的緩沖物質(zhì)拉平。可以使用具有這種性質(zhì)的任何緩沖物質(zhì)。通常，使用藥學(xué)上可接受的緩沖物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖溶液選自:由磷酸和/或其鹽組成的磷酸(鹽)緩沖溶液，或由乙酸及其鹽組成的乙酸(鹽)緩沖溶液，或由檸檬酸和/或其鹽組成的檸檬酸(鹽)緩沖溶液，或嗎啉緩沖溶液，或2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖溶液，或組氨酸緩沖溶液，或甘氨酸緩沖溶液，或三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩沖溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖溶液選自磷酸(鹽)緩沖溶液、或乙酸(鹽)緩沖溶液、或檸檬酸(鹽)緩沖溶液、或組氨酸緩沖溶液。任選地，所述緩沖溶液可以包含額外的鹽，例如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。術(shù)語“連續(xù)洗脫”和“連續(xù)洗脫方法”在本申請(qǐng)中可互換地使用，表示這樣的方法:其中造成洗脫(即從色譜材料回收結(jié)合的化合物)的溶液的電導(dǎo)率連續(xù)地變化(即升高或降低)，即通過一系列小階梯來改變濃度，每個(gè)小階梯不大于造成洗脫的物質(zhì)的濃度的2%或I %的變化。在該“連續(xù)洗脫”中，一個(gè)或多個(gè)條件(例如pH、離子強(qiáng)度、鹽濃度和/或色譜流速)可以線性地或指數(shù)地或漸近地變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變化是線性的。術(shù)語“離子交換色譜材料”表示固定的高分子量基質(zhì)，其帶有共價(jià)結(jié)合的帶電荷的取代基，在離子交換色譜法中用作固定相。為了達(dá)到整體電荷中性，非共價(jià)結(jié)合的抗衡離子與之結(jié)合?！半x子交換色譜材料”具有將其非共價(jià)結(jié)合的抗衡離子交換成周圍溶液中的類似的帶電荷的離子的能力。根據(jù)其可交換的抗衡離子的電荷，“離子交換樹脂”被稱作陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。根據(jù)帶電荷的基團(tuán)(取代基)的性質(zhì)，“離子交換樹脂”被稱作:例如在陽離子交換樹脂的情況下，磺酸樹脂(S)、或磺丙基樹脂(SP)、或羧甲基樹脂(CM) o本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于將氨基酸序列(例如多肽的氨基酸序列)轉(zhuǎn)化成編碼該氨基酸序列的對(duì)應(yīng)核酸序列的步驟和方法。因此，通過它的由各個(gè)核苷酸組成的核酸序列來表征核酸，同樣通過由其編碼的多肽的氨基酸序列來表征核酸。術(shù)語“聚(乙二醇)”或“聚(乙二醇)殘基”表示，含有聚(乙二醇)作為基本部分的非蛋白性的殘基。這樣的聚(乙二醇)殘基可以含有結(jié)合反應(yīng)所必需的其它化學(xué)基團(tuán)，其源自分子的化學(xué)合成，或者是分子的多個(gè)部分的最佳距離的隔離物。這些其它化學(xué)基團(tuán)不用于計(jì)算聚(乙二醇)殘基的分子量。另外，這樣的聚(乙二醇)殘基可以由一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)鏈組成，所述鏈共價(jià)地連接在一起。具有超過一個(gè)PEG鏈的聚(乙二醇)殘基稱作多臂或支鏈聚(乙二醇)殘基。例如，通過向不同的多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)添加聚氧化乙烯，可以制備支鏈聚(乙二醇)殘基。支鏈聚(乙二醇)殘基在例如EP0473084、US5, 932，462中報(bào)道。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚(乙二醇)殘基具有20kDa至35kDa的分子量，且是直鏈聚(乙二醇)殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚(乙二醇)殘基是具有35kDa至40kDa的分子量的支鏈聚(乙二醇)殘基。術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素與聚(乙二醇)殘基的融合”表示，在促紅細(xì)胞生成素的N-端或內(nèi)部賴氨酸殘基處化學(xué)引入的聚(乙二醇)殘基的共價(jià)連接。融合會(huì)產(chǎn)生蛋白綴合物，其包含一個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子和一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)殘基。所述融合方法也稱作聚乙二醇化，且其產(chǎn)物稱作聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素。多肽與聚(乙二醇)殘基的融合/綴合是在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛已知的，且在例如Veronese, F.M.,Biomaterials22 (2001)405-417中綜述。使用不同的官能團(tuán)，可以連接聚(乙二醇)殘基。可以使用具有不同分子量、不同形式、以及不同連接基團(tuán)的聚(乙二醇)(也參見Francis，G.E.,等人，Int.J.Hematol.68(1998) 1-18 ；Delgado, C.，等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Systems9 (1992) 249-304)。促紅細(xì)胞生成素和聚(乙二醇)殘基的融合可以在含有聚(乙二醇)殘基試劑的水溶液中進(jìn)行，參見例如W000/44785。所述融合還可以在固相上 進(jìn)行，參見 Lu，Y.，等人，Reactive Polymers22 (1994) 221-229。根據(jù) W094/01451，還可以產(chǎn)生非隨機(jī)地N-端融合。術(shù)語“使促紅細(xì)胞生成素與聚(乙二醇)融合”和“聚乙二醇化”表示，在聚(乙二醇)殘基與促紅細(xì)胞生成素的N-端和/或內(nèi)部賴氨酸殘基之間形成共價(jià)鍵，以便獲得蛋白綴合物，所述蛋白綴合物包含一個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子和一個(gè)聚(乙二醇)殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用分子量在5kDa至40kDa之間的NHS-活化的直鏈或支鏈PEG分子，在水溶液中進(jìn)行促紅細(xì)胞生成素的聚乙二醇化。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語“在適于結(jié)合的條件下”及其語法上的等價(jià)表述表示，目標(biāo)物質(zhì)(例如聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素)在與固定相(例如離子交換材料)接觸時(shí)與之結(jié)合。這不一定表示100%的目標(biāo)物質(zhì)與固定相結(jié)合，而表示基本上100%的目標(biāo)物質(zhì)與固定相結(jié)合，即至少50%的目標(biāo)物質(zhì)與固定相結(jié)合、至少75%的目標(biāo)物質(zhì)與固定相結(jié)合、至少85%的目標(biāo)物質(zhì)與固定相結(jié)合、或者95%以上目標(biāo)物質(zhì)與固定相結(jié)合。促紅細(xì)胞生成素和聚(乙二醇)的化學(xué)融合或綴合通常產(chǎn)生不同化合物的混合物，所述化合物例如多聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素、單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素、未聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素、活化的PEG酯的水解產(chǎn)物、以及促紅細(xì)胞生成素本身的水解產(chǎn)物。為了獲得基本上同質(zhì)形式的單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素，必須對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行分離。
因此，本文報(bào)道的一個(gè)方面是，提供一種用于生產(chǎn)基本上同質(zhì)形式的蛋白綴合物的方法，所述蛋白綴合物包含一個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子和單個(gè)聚(乙二醇)殘基，其中所述方法包括下述步驟:a)使用具有20kDa至40kDa的分子量的活化聚(乙二醇)酯，使促紅細(xì)胞生成素
與聚(乙二醇)綴合，b)將在步驟a)中獲得的綴合物施加于SP Sephacryl S500HR色譜材料，所述色譜材料已經(jīng)施加了具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液，c)通過線性電導(dǎo)率梯度洗脫，回收基本上同質(zhì)形式的包含一個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的蛋白(單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素)，并由此生產(chǎn)包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的蛋白綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SP Sephacryl S500HR色譜材料是在色譜柱中。該方法特別適用于純化聚乙二醇化的重組促紅細(xì)胞生成素，后者是糖基化的，即其已由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，在一個(gè)實(shí)施方案中，由CHO細(xì)胞、或HEK293細(xì)胞、或BHK細(xì)胞、或Per.C6 細(xì)胞、或HeLa細(xì)胞生產(chǎn)，并且隨后被化學(xué)地聚乙二醇化。在所述方法的第一步中，促紅細(xì)胞生成素被聚乙二醇化。在聚乙二醇化反應(yīng)中所用的聚(乙二醇)(PEG)聚合物分子具有約20kDa至40kDa的分子量(本文使用的術(shù)語“分子量”應(yīng)當(dāng)被理解為PEG的平均分子量，因?yàn)镻EG作為聚合化合物不是以一種確定的分子量被獲得的，而事實(shí)上是具有一個(gè)分子量分布；術(shù)語“約”表示，在所述的PEG制備物中，一些分子的重量大于標(biāo)示分子量，一些分子的重量小于標(biāo)示分子量，即術(shù)語“約”是指這樣的分子量分布:其中95%的PEG分子具有在標(biāo)不分子量+/-10%以內(nèi)的分子量。例如，30kDa的分子量表示27kDa至33kDa的范圍)。 術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素”和它的縮寫“EP0”是指，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白，或者基本上與之同源的蛋白或多肽，其生物學(xué)性質(zhì)與刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生和刺激骨髓中定向紅系祖細(xì)胞的分裂和分化有關(guān)?？梢匀缦轮苽渲亟M促紅細(xì)胞生成素:通過重組DNA技術(shù)或通過內(nèi)源基因活化(也就是說，通過內(nèi)源性基因活化，表達(dá)促紅細(xì)胞生成素糖蛋白)，在真核細(xì)胞中(例如在CHO細(xì)胞、或BHK細(xì)胞、或HeLa細(xì)胞中)表達(dá)，參見例如 US5, 733，761、US5, 641，670、US5, 733，746、W093/09222、W094/12650、W095/31560、W090/11354、W091/06667和W091/09955。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述促紅細(xì)胞生成素是人EPO0在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人促紅細(xì)胞生成素具有在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人促紅細(xì)胞生成素具有在SEQ ID N0:1中描述的氨基酸序列。術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素”也表示，SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的蛋白的變體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被改變、缺失或插入，并且其具有與未修飾的蛋白(例如在EP1064951或US6，583，272中所報(bào)道的那些)可比較的生物學(xué)活性。變體可以具有含有1-6個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的人促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列。通過本領(lǐng)域已知的多種測(cè)定法，可以確定聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的比活性。純化的聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的生物活性會(huì)使得，通過給人患者注射施用所述蛋白，導(dǎo)致與未注射的或?qū)φ战M的受試者相比，骨髓細(xì)胞會(huì)增加網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)生。通過Bristow,A.,PharmeuropaSpec.1ssue Biologicals BRP Erythropoietin Bio97_2 (1997) 31-48 的方法，可以試驗(yàn)根據(jù)在本文中報(bào)道的方法獲得和純化的聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的生物活性。
通過將適當(dāng)?shù)男揎椧刖幋a促紅細(xì)胞生成素的核苷酸序列中，或通過肽合成，可以制備促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，在促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列內(nèi)刪除殘基、和/或插入殘基、和/或置換殘基?？梢赃M(jìn)行刪除、插入和置換的任意組合，以獲得最終的構(gòu)建體，前提條件是，最終的構(gòu)建體具有與人促紅細(xì)胞生成素可比較的生物活性。保守氨基酸置換顯示在表I中“優(yōu)選置換”的標(biāo)題下。更多的實(shí)質(zhì)變化提供在表I中，在“示例性置換”的標(biāo)題下，并在下面參照氨基酸側(cè)鏈類別進(jìn)行了描述。可以將氨基酸置換引入人促紅細(xì)胞生成素中，并針對(duì)人促紅細(xì)胞生成素的生物活性的保留來篩選產(chǎn)物。表I
權(quán)利要求
1.一種用于獲得蛋白的方法，所述蛋白包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基，所述方法包括下述步驟: a)將溶液施加于包含SPSephacryl S500HR色譜材料的柱，所述溶液包含促紅細(xì)胞生成素以及促紅細(xì)胞生成素與聚(乙二醇)的綴合物的混合物，在所述綴合物中每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子具有一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)殘基，所述柱已經(jīng)施加了具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液， b)將具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液施加于所述柱，由此回收游離的聚(乙二醇)和包含2個(gè)或更多個(gè)聚(乙二醇)殘基的蛋白， c)向所述柱施加溶液，并由此分別回收包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的蛋白和促紅細(xì)胞生成素，其中首先回收包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的蛋白，所述溶液具有線性地遞增的一直到約62.5mS/cm的最終值的電導(dǎo)率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液是pH值為pH2.5至pH3.5的溶液。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述具有約21mS/cm的電導(dǎo)率的溶液是PH值為pH2.5至pH3.5的磷酸(鹽)緩沖溶液。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，未將所述包含促紅細(xì)胞生成素以及促紅細(xì)胞生成素與聚(乙二醇)的綴合物的混合物的溶液調(diào)至約21mS/cm的電導(dǎo)率，在所述綴合物中每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子具有一個(gè)或多個(gè)聚(乙二醇)殘基。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，具有線性地遞增的電導(dǎo)率的所述溶液是具有線性地遞增的氯化鈉 濃度的溶液。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，具有線性地遞增的電導(dǎo)率的所述溶液的PH值為pH2.3至pH3.5。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述促紅細(xì)胞生成素是人促紅細(xì)胞生成素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述人促紅細(xì)胞生成素具有SEQID NO:Ol或SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述單個(gè)聚(乙二醇)殘基具有20kDa至40kDa的分子量。
全文摘要
本文報(bào)道了一種通過陽離子交換色譜法從反應(yīng)副產(chǎn)物或未反應(yīng)的原料中純化蛋白的方法，所述蛋白包含促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過采用調(diào)節(jié)至21mS/cm的電導(dǎo)率的陽離子交換SP SephacrylS500HR色譜材料和線性梯度洗脫，可以在單個(gè)步驟中以高純度和收率獲得促紅細(xì)胞生成素和單個(gè)聚(乙二醇)殘基的融合蛋白。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103118708SQ201180044060
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者羅伯托·法爾肯施泰因, 沃爾夫?qū)た硕魅R因, 沃爾夫?qū)靸?nèi), 哈特穆特·舒里希(死亡) 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司