專利名稱：特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科學(xué)和診斷試劑領(lǐng)域，特別涉及特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其作為診斷和治療試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
B-Raf 蛋白(也稱為 v-raf murine sarcoma viral oncogene homo log BI)是Raf/MiI絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一。該蛋白在調(diào)控細(xì)胞增殖的Ras/Raf/MEK/ERK/MAP級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中期重要作用。B-Raf蛋白的突變?cè)诙喾N人類癌癥，例如黑色素癌、甲狀腺乳頭狀癌、直腸癌、卵巢癌中都存在(Garnett and Marais，Cancer Cell,6:313-319(2004))。這些突變導(dǎo)致B-Raf蛋白的持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞生長(zhǎng)。V600E突變蛋白(第600位的纈氨酸(Valine，V)突變?yōu)楣劝彼?GlutamicAcid,E)的突變蛋白)在黑色素癌和甲狀腺乳頭狀癌中存在十分普遍(Capper et al., ActaNeuropathol，122 (I): 11-19 (2011))。其他的 B-Raf 突變包括 N581S 和 V600K 等。針對(duì)V600E突變蛋白的抑制劑正在研發(fā)中(Chapman et al., N Eng JMed, 364(26):2507-2516(2011))。在這種抑制劑的使用過程中，需要一種能夠特異性結(jié)合突變的B-Raf蛋白但是不結(jié)合野生型B-Raf蛋白的抗體。這種抗體可以被用來快速檢測(cè)少量的取自病人的樣品，用于診斷癌癥。能夠特異性結(jié)合B-Raf突變蛋白的抗體也是治療癌癥所迫切需要的。發(fā)明簡(jiǎn)介本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了分別特異性地識(shí)別B-Raf N581S,B-RafV600E和B-Raf V600K突 變體蛋白的三種單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用。利用本發(fā)明的方法制備出的單克隆抗體能夠分別特異性地識(shí)別B-Raf N581S, B-Raf V600E和B-RafV600K突變體蛋白，而不識(shí)別野生型B-Raf蛋白。在一些操作實(shí)例中，所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位，其特征在于，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列分別是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285,CCTCC C2012122 以及 CCTCC C2012112 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列決定。在進(jìn)一步的操作實(shí)例中，所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位，其特征在于，由分別包含所述雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)域的氨基酸序列的一條重鏈和一條輕鏈組成。在更進(jìn)一步的操作實(shí)例中，抗體或者抗原結(jié)合部位包含上述雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。本發(fā)明的單克隆抗體可以是一種人源化的或者嵌合型的抗體。在某些操作實(shí)例中，這種單克隆抗體是IgG。在一方面，本發(fā)明包括保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122 以及 CCTCC C2012112 的雜交瘤細(xì)胞。CCTCC C201283的分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株M43#-l，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCC C201284的分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株M43#_2，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCC C201285的分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株M43-3，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCC C201283的分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株M43#_l，保藏日期為:2012年6月18日；CCTCCC2012122的分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株M60-28，保藏日期為:2012年8月24日；CCTCCC2012112的分類命名為:雜交瘤細(xì)胞株M73-48，保藏日期為:2012年8月24日.
本發(fā)明包括一種含有所述單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的藥物或者可用于藥物的載體。本發(fā)明還包括一種含有本發(fā)明中提到的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位診斷試劑盒。在一些應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明能夠提供一種癌癥診斷的方法(例如，黑色素癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌)，其主要步驟包括:用本發(fā)明所述的單克隆抗體接觸來自于檢測(cè)目標(biāo)的生物學(xué)樣本；檢測(cè)抗體或者其部分與樣本是否結(jié)合；如果抗體與樣本存在結(jié)合則表明被檢測(cè)對(duì)象是癌癥，或者存在發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在另外的應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明提供一種治療腫瘤病人的方法，包括:檢測(cè)V600E、N581S或者V600K突變形式的B-Raf蛋白是否存在于來自于病人的樣本中；如果其中一個(gè)突變存在，則使用一種B-Raf抑制劑(例如GDC-0879)進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供一種治療癌癥病人(例如，黑色素癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌病人)的方法。該治療方法包括給予病人一種組成成分中含有本發(fā)明的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部分的藥物。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種使用本發(fā)明所述單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位作為藥劑治療黑色素癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食道癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌。本發(fā)明包括一種純化的核酸分子，其組成為能夠編碼本發(fā)明中的特異性結(jié)合突變B-Raf蛋白的的單克隆抗體 的重鏈或者輕鏈或者抗原結(jié)合部分的核酸序列。進(jìn)一步本發(fā)明包括含有該核酸序列的載體；該載體優(yōu)化為含有包括可以聯(lián)系到該核酸分子的表達(dá)調(diào)控序列。在一種應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明提供一種含有該核酸分子的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明提供一種能夠產(chǎn)生所述的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的細(xì)胞株。本發(fā)明還包括一種生產(chǎn)特異性結(jié)合突變型而不結(jié)合野生型B-Raf蛋白的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的方法。其步驟包括:在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或者本發(fā)明中提到的細(xì)胞株；純化所述的抗體。本發(fā)明基于單克隆抗體特異性結(jié)合突變型的B-Raf蛋白的發(fā)現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)這些抗體能夠非常好地優(yōu)先結(jié)合突變的B-Raf蛋白(例如帶有N581S、V600E或者V600K突變的B-Raf蛋白)。這些抗體能夠有效地診斷或者治療癌癥等疾病。這些抗體特別能夠有效地檢測(cè)生物樣品中微量的B-Raf蛋白。B-Raf本專利所描述的B-Raf是指鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體BI (v-rafmurine sarcoma viral oncogene homolog BI, B-RAF)的基因或者蛋白(Sithanandam etal.，Oncogene，5 (12):1775-1780 (1990))。該基因或者蛋白也被稱為 B-Raf，BRAF, RAFBI,p94，NS7或者B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p94)。野生型的B-Raf蛋白序列包括SEQID NO:4，野生型B-Raf蛋白的編碼mRNA序列包括SEQ ID NO: 5。B-Raf是ral/mil家族的的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。B-Raf蛋白參與調(diào)控RAS/RAF/MEK/ERK/MAP級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。B-Raf蛋白的突變型式包括的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的插入、刪除、替換等。本專利所描述的B-Raf N581S突變指的是第581位的天冬氨酸(N)被絲氨酸(S)替換的突變；B-RafV600E指的是第600位的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替換的突變；B_Raf V600K指的是第600位的纈氨酸(V)被賴氨酸(K)替換的突變?？贵w與抗原結(jié)合部位本發(fā)明包括特異性結(jié)合突變型B-Raf蛋白但是不結(jié)合野生型B-Raf蛋白的單克隆抗體?！翱贵w”或者“免疫求蛋白Ig”指的是由重鏈(H，大約50-70kDa)和輕鏈(L，大約25kDa)通過二硫鍵鏈接成的四聚體。輕鏈可以是λ輕鏈或者K輕鏈。重鏈可以分為μ、δ、Υ、α、ε，不同重鏈和輕鏈的組合共同決定抗體的類型分別是IgM、IgD、IgG、IgA或者IgE (Fundamental Immunology Ch.7, Paul, ff., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y.(1989))。每條重鏈(有時(shí)稱為H鏈，或者HC)都含有一個(gè)重鏈可變區(qū)(也叫Vh)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)(也叫CH)。重 鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)與組成，分別每條輕鏈(有時(shí)也成為L(zhǎng)鏈，或者LC)也有一個(gè)輕鏈可變區(qū)(也叫 ')和輕鏈恒定區(qū)(CJ。輕鏈恒定區(qū)只含有一個(gè)結(jié)構(gòu)與Q，在輕鏈和重鏈內(nèi)部，可變區(qū)和恒定區(qū)通過一個(gè)大約12個(gè)氨基酸左右的“J”形狀的結(jié)構(gòu)鏈接起來。在重鏈內(nèi)部還有一個(gè)3個(gè)氨基酸左右的“D”形區(qū)域。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以進(jìn)一步被分為超可變區(qū)，也叫互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及穿插中間的略微保守的框架區(qū)域(FR )。這些區(qū)域以此從N端往C端排列為FR 1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸序列排序是根據(jù) Kabat(Proteins of Immunological Interest, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD(1987and 1991))和 Chothia&Lesk(Chothia&Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ;Chothia et al., Nature 342:878-883(1989))的研究結(jié)果分類的。本發(fā)明的內(nèi)容之一是特異性結(jié)合突變型B-Raf蛋白的的單克隆抗體的抗原結(jié)合部位?！翱乖Y(jié)合部位”是指抗體上使其具有特異性識(shí)別并結(jié)合抗原(例如B-Raf蛋白上一段含有特定突變的多肽片段)的功能的一段抗體片段。目前認(rèn)為，抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長(zhǎng)抗體的部分片段來實(shí)現(xiàn)?？贵w的“抗原結(jié)合部位”的特征在于包含:(I) 一個(gè)Fab片段，一個(gè)包含'、Vh、Q、Ch1結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段；(2)—個(gè)F(ab’)2片段，一個(gè)含有通過鉸鏈區(qū)的的二硫鍵連接起來的Fab片段的二價(jià)片段；(3) —個(gè)包含Vh和ChI結(jié)構(gòu)域的Fd片段；
(4)抗體單臂包含一個(gè)Vi^Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(5)—個(gè)由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Wardet al., (1989)Nature 341:544-546) ； (6) 一個(gè)獨(dú)立的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。更進(jìn)一步地，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域Vh和\是由不同的獨(dú)立基因編碼的，但是可以用基因重組的方式通過合成一個(gè)鏈接區(qū)域?qū)⑺鼈冞B接起來，形成由單鏈蛋白內(nèi)部的Vh和\配對(duì)成單價(jià)分子，也稱為單鏈 Fv (scFv) (Bird et al.Science 242:423-426 (1988) and Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883(1988))。這種單鏈抗體也包括在“抗原結(jié)合部位”的范圍內(nèi)?？贵w的一部分，比如Fab和F(ab’)2片段，可以從全長(zhǎng)的抗體通過常規(guī)的技術(shù)，比如木瓜酶(papain)或者胃蛋白酶(P印sin)酶消化的方法獲得。它們也可以通過下面描述的標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組技術(shù)獲得?？笲-Raf抗體及其抗原結(jié)合部位本發(fā)明的抗體可以用來自于人類B-Raf突變蛋白的抗原免疫非人類的動(dòng)物(例如，小鼠、兔子、大鼠或者倉(cāng)鼠)來制備。這些抗體也可以通過噬菌體展示技術(shù)或者其它的已知的抗體制備技術(shù)獲得。抗原可以是純化的多聚多肽或者多肽，也可以是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多聚多肽或者多肽。特定疾病相關(guān)的突變的B-Raf蛋白包括B-Raf V600E,B-Raf N581S，B-Raf V600K。本發(fā)明中特異性結(jié)合B-Raf V600E蛋白的抗體可以通過多肽KI⑶FGLATEKSRWSGS (SEQIDN0:1)免疫小鼠來獲得。本發(fā)明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC C201283, CCTCCC201284和CCTCC C201285。本發(fā)明中特異性結(jié)合B-Raf V600K蛋白的抗體可以通過多肽KI⑶FGLATKKSRWSGS (SEQ ID NO: 2)免疫小鼠來獲得。本發(fā)明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC C2012122。本發(fā)明中特異性結(jié)合B-Raf N581S蛋白的抗體可以通過多肽SIIHRDLKSNSIFLHED(SEQ ID NO:3)免疫小鼠來獲得。本發(fā)明中的通過該多肽免疫獲得的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)保藏在符合布達(dá)佩斯協(xié)議的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC2012112。本發(fā)明進(jìn)一步包含一種單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位，它們包括由保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112 的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明中的單克隆抗體或許只包含由保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCCC201285,CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈氨基酸序列或者輕鏈氨基酸序列。在某些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗B-Raf抗體或者抗原結(jié)合部位包含一條或者多條由保藏號(hào)為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCCC2012112的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈或者CDR的氨基酸序列。在某些操作實(shí)例中，抗體或者抗原結(jié)合部位包括由保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285,CCTCC C2012122、CCTCC C2012112的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈的所有CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列。在某些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗B-Raf抗體或者抗原結(jié)合部位包含由保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122、CCTCC C2012112 的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。在特定的操作實(shí)例中，抗體或者抗原結(jié)合部位同時(shí)包含由保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCCC201285、CCTCCC2012122、CCTCC C2012112的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈或者輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。B-Raf的結(jié)合特異性
本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位能夠分別特異性地結(jié)合突變型的B-Raf V600E、B-Raf V600K、B-Raf N581S蛋白，但是不結(jié)合野生型的B-Raf蛋白(完全不結(jié)合或者在某種程度上不結(jié)合)。換言之，該抗體或者抗原結(jié)合部位能夠區(qū)分突變型和野生型的人類B-Raf蛋白。該結(jié)合的特異性可以用已知的常用檢測(cè)手段進(jìn)行確認(rèn)，例如免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，流式細(xì)胞分選，免疫共沉淀，免疫熒光，免疫組織化學(xué)染色，表面離子共振(例如BIAC0RE )或者放射免疫實(shí)驗(yàn)等方法。在一些操作實(shí)例中，該抗體能夠特異性地優(yōu)先結(jié)合突變型的B-Raf蛋白，對(duì)于突變型B-Raf蛋白的結(jié)合能力至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)野生型B-Raf蛋白的結(jié)合能力。在某些操作實(shí)例中，本發(fā)明中的抗體或者抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合突變型B-Raf蛋白的解離平衡常數(shù)Kd至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍強(qiáng)于對(duì)野生型B-Raf蛋白的結(jié)合的解離平衡常數(shù)(KD)。解離平衡常數(shù)(Kd)可以通過表面離子共振或者流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)得。本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位或許只能結(jié)合一種B-Raf突變蛋白而不能結(jié)合其他的B-Raf突變蛋白(例如B-Raf V600E,B-Raf V600K,B-Raf N581S中的一種)。舉例來說，該抗體特異性地結(jié)合B-Raf V600K蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變B-Raf蛋白的結(jié)合能力。在一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合B-Raf V600K蛋白而不結(jié)合其他突變型的B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf N581S蛋白)。舉例來說，該抗體特異性地結(jié)合B-Raf V600K蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf N581S蛋白)的結(jié)合能力。在另一些操作實(shí)例中，該抗體或許只能結(jié)合B-Raf N581S蛋白而不結(jié)合其他突變型的B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf V600K蛋白)。舉例來說，該抗體特異性地結(jié)合B-Raf N581S蛋白的能力或許至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，或者至少500倍強(qiáng)于其對(duì)其它任何一種突變B-Raf蛋白(例如B-Raf V600E、B-Raf V600K蛋白)的結(jié)合能力。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明中的抗體或者抗原結(jié)合部位能夠特異性結(jié)合含有SEQID NO: 1，2，或者3的B-Raf多肽。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合保藏號(hào)為 CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285, CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的抗原表位或者與其重合的抗原表位。生產(chǎn)抗體的重組方法本發(fā)明包括編碼能夠特異性結(jié)合人類突變型的B-Raf蛋白但是不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的單克隆抗體及其抗原結(jié)合部位的核酸序列。人類突變的B-Raf蛋白包括:V600E, V600K以及N581S。在一些操作實(shí)例當(dāng)中，該核酸分子只編碼單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的重鏈或者輕鏈。在另外一些操作實(shí)例當(dāng)中，該核酸分子同時(shí)編碼單克隆抗體及其抗原結(jié)合部位的重鏈和輕鏈。在一些操作實(shí)例中，該核酸分子編碼保藏號(hào)為CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285, CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112 的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈、輕鏈、重鏈可變區(qū)或者輕鏈可變區(qū)。核算可以是純化的核酸分子。 編碼本發(fā)明抗體的核酸分子可以從任何能夠產(chǎn)生該抗體的來源中獲得。例如，核酸可以從保藏號(hào)為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285,CCTCC C2012122，或者CCTCC C2012112的雜交瘤細(xì)胞中獲得。分離純化編碼抗體的核酸的方法是一種已知的常見的技術(shù)。具體方法可以參見書籍:[美]J.莎姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，第三版，2002年。在一些操作實(shí)例中，編碼本發(fā)明中的單克隆抗體的重鏈的核酸序列可以是由編碼本發(fā)明抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列與一條編碼任意其它來源抗體的重鏈恒定區(qū)的組成的同框編碼序列。類似地，一條編碼本發(fā)明的抗B-Raf蛋白的輕鏈的核酸分子也可以是由編碼本發(fā)明抗體的 ' 結(jié)構(gòu)域的核酸序列與一條編碼任意其它來源的抗體的輕鏈恒定區(qū)的組成的同框編碼序列。在進(jìn)一步的操作實(shí)例中，編碼重鏈可變區(qū)(Vh)和/或者輕鏈可變區(qū)(')的核酸分子被轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)的抗體編碼基因。在一些操作實(shí)例中，編碼Vh或者\(yùn)結(jié)構(gòu)域的核酸序列被分別通過插入到已經(jīng)含有重鏈恒定區(qū)(Ch)或者輕鏈恒定區(qū)(CJ的表達(dá)載體中去的方法構(gòu)建為一個(gè)全長(zhǎng)抗體基因。這樣構(gòu)建的全長(zhǎng)抗體基因的Ch的片段與Q的片段在載體內(nèi)部相連接，并且/或者編碼Vh的片段與編碼\的片段在載體內(nèi)部相連接。在另外的操作實(shí)例中，編碼Vh以及/或者\(yùn)結(jié)構(gòu)域的核酸序列分別通過核酸重組技術(shù)被連接到一個(gè)編碼Ch的片段和/或者編碼Q 的片段上面。編碼人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的基因是已知的。具體參見著作 Kabat et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed., NIH Publ.N0.91-3242，1991。編碼全長(zhǎng)重鏈和/或者輕鏈的核酸分子可以在被引入和純化B-Raf抗體的細(xì)胞株中表達(dá)。可以使用核酸分子實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)大量的B-Raf抗體。也可以用核酸分子來生產(chǎn)嵌合抗體，雙特異性結(jié)合抗體，單鏈抗體，免疫粘附劑，雙頭抗體，突變抗體以及抗體衍生物。如果該核酸分子來自于非人類、非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該核酸分子也可能被用來實(shí)現(xiàn)抗體的人源化。本發(fā)明還包括插入有編碼抗體重鏈、輕鏈或者同時(shí)編碼本發(fā)明的B-Raf抗體或者其抗原結(jié)合部位的核酸分子。該載體可能適合于在原核宿主細(xì)胞,例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明中的抗體或者其抗原結(jié)合部位。常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括很多永生細(xì)胞系都可以用來作為表達(dá)宿主。這些細(xì)胞系包括但不限于:中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0)，NSO細(xì)胞，SP2細(xì)胞，HEK293T細(xì)胞，293Freestyle(Invitrogen公司)，NIH3T3細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)，非洲綠猴腎細(xì)胞，人類肝癌細(xì)胞(如IfepG2)，以及A549細(xì)胞。其它可以用于表達(dá)的細(xì)胞有昆蟲細(xì)胞，包括sf9和sf21細(xì)胞。植物宿主細(xì)胞包括:煙草，擬南芥，浮萍，玉米，小麥，番茄，水稻來源的細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括大腸桿菌和放線菌。酵母宿主包括裂殖酵母，釀酒酵母，畢赤酵母。利用不同的細(xì)胞系在不同的培養(yǎng)條件下，或者利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的抗體能夠有不同的糖基化模式。但是不論其糖基化模式是怎樣的，所有由所述的核酸或者含有所述核酸的序列編碼的抗體都是本發(fā)明的內(nèi)容。嵌合與人源化抗體這里所說的嵌合抗體，其特征在于有來自于兩種或者更多種不同的抗體的結(jié)構(gòu)域組成的抗體。例如，嵌合抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可能是來自于保藏號(hào)為CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285, CCTCC C2012122，或者 CCTCC C2012112 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，但是其恒定區(qū)可能是來自于人類抗體。這種嵌合抗體在作為人類的治療藥物時(shí)具有較少的免疫原性。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明抗體的人源化抗體是一種將本發(fā)明中的來源于老鼠的抗體的CDR結(jié)構(gòu)域插入到人類受體抗體中去。因此，嵌合抗體的FR和恒定區(qū)域來自于人類。這種含有人類FR區(qū)域的人源化B-Raf抗體在人類身上比只是恒定區(qū)來自于人類的嵌合抗體具有更小的免疫原性。在一些操作實(shí)例中，人源化抗體的CDR序列可以是來自于保藏號(hào)為 CCTCCC201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285，CCTCC C2012122，或者 CCTCCC2012112 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體?？贵w人源化的方法是一種已知的成熟技術(shù)。修飾與標(biāo)簽抗體本發(fā)明還包 括以上所描述的抗B-Raf單克隆抗體或其抗原結(jié)合部位被至少一種額外分子或集團(tuán)修飾而成的抗體。該修飾可以是用于純化或者檢測(cè)該抗體的，以及/或者增強(qiáng)其治療效果。例如，抗體或者抗原結(jié)合部位可以連接到一種檢測(cè)試劑、標(biāo)簽、細(xì)胞毒性試劑、藥物分子以及/或者蛋白或多肽，以便接到該抗體或者其抗原結(jié)合部位與其它一種分子(例如親和素核心區(qū)域，或者多聚組氨酸標(biāo)簽)的結(jié)合。常見的檢測(cè)標(biāo)簽包括但不限于:放射性同位素(例如125I，131I，35S or 3H),熒光復(fù)合物(例如熒光素，二氯三嗪氨熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，5- 二甲氨基-1-萘磺酰氯苯，熒光素PE，稀土發(fā)光物，傘形酮，丹磺酰氯)，以及酶(例如辣根過氧化物酶，O-半乳糖苷酶，β -半乳糖苷酶，熒光素酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，乙酰膽堿酯酶)。在進(jìn)一步的操作實(shí)例中，本發(fā)明所述抗體或者其部分可以被標(biāo)記生物素，或者已經(jīng)證明可以被另一個(gè)報(bào)告分子(例如亮氨酸拉鏈配對(duì)區(qū)域，二抗結(jié)合位點(diǎn)，金屬集合結(jié)構(gòu)域，表位標(biāo)簽)識(shí)別的多肽表位。在更進(jìn)一步的操作實(shí)例中，任意一種抗體或者其部分可以利用聚乙烯醇(PEG)，甲基或乙基或者糖基經(jīng)行修飾?？笲-Raf抗體或者其抗原結(jié)合部位的診斷用途本發(fā)明的一個(gè)方面是使用所述的抗B-Raf抗體或者其抗原結(jié)合部位作為一種癌癥診斷試劑。癌癥指的是任意一種惡性腫瘤，包括任何階段和級(jí)別的癌癥?？赡苡帽景l(fā)明的單克隆抗體診斷的癌癥具體例子包括但是不限于:黑色素癌，甲狀腺癌(例如甲狀腺乳頭狀癌)，胰腺癌，食道癌，結(jié)腸癌，直腸癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌(例如非小細(xì)胞肺癌)，腦癌，肝癌，胃癌或者造血組織癌(例如毛細(xì)胞白血病)。診斷包括檢測(cè)癌癥的發(fā)展程度，確認(rèn)癌癥的存在，或者癌癥的分型或分類。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明可以提供一種診斷目標(biāo)中癌癥的方法，其步驟包括:用本發(fā)明所述的抗B-Raf單克隆抗體接觸來自于檢測(cè)目標(biāo)的生物學(xué)樣本；檢測(cè)抗體或者其部分與樣本是否結(jié)合；如果抗體與樣本存在結(jié)合則表明被檢測(cè)主體是癌癥，或者存在發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)的樣本可以是血液，血清，淋巴，組織(例如穿刺或者甲醛和石蠟固定的包被切片)?？贵w結(jié)合到樣本上與否可以用常見的的已知技術(shù)檢測(cè)，包括但是不限于:ELISA，RIA,流式細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)，免疫組織化學(xué)，免疫熒光，免疫印跡，或者免疫共沉淀。抗B-Raf抗體或者其部分也可以用一種可以檢測(cè)的標(biāo)記物直接標(biāo)記。如果抗體沒有被標(biāo)記，則可以使用一種能夠結(jié)合B-Raf抗體并能夠被檢測(cè)到的二抗或者其它分子。根據(jù)已有的常識(shí)，特定的二抗能夠特異性地結(jié)合特定的種類和亞型的一抗。例如，如果抗B-Raf抗體是一種小鼠IgG，則二抗必須是一種標(biāo)記的抗小鼠IgG的抗體。其它能夠結(jié)合抗體的分子包括但是不限于Protein A和Protein G。他們都有多種商業(yè)化的形式。例如來自Pierce公司的Protein A和Protein G。適合用來標(biāo)記抗體或者二抗的分子包括但是不限于:酶,輔基，熒光材料，發(fā)光材料，磁性材料以及放射性材料(見上文描述)。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗體或者其部分可以提供在一種包含檢測(cè)抗體結(jié)合試劑的試劑盒中?？笲-Raf抗體或者其部分還可以用來檢查癌癥病人的發(fā)展進(jìn)程，然后決定采取哪一種治療治療方案。例如在治療方案的伴隨檢測(cè)中。醫(yī)務(wù)人員可能根據(jù)B-Raf突變的檢測(cè)結(jié)果來決定對(duì)特定病人最優(yōu)的治療方案。治療方案可以是手術(shù),放射性治療,藥物治療(包括化學(xué)治療與靶向治療)，或者以上多種治療方式的結(jié)合。舉例來說，本發(fā)明包括一種治療癌癥病人的方法，其特征在于包括:檢查來自病人的生物樣本是否帶有V600E、V600K或者N581S突變；如果存在某種突變則對(duì)病人給予B-Raf抑制劑治療。B-Raf抑制劑可能是一種siRNA，反義RNA，微小RNA藥物，抗B-Raf抗體或者小分子化合物。例如，B-Raf抑制劑可以是威羅菲尼片(ZELB0RAF )，索拉非尼(BAY43-9006，NEXAVAR )，帕尼單抗，⑶C-0879，PLX-4720，GSK211843 6/SB590885，AZ628，RAF265 (CHIR-265)或者 XL281。在給予病人抗B-Raf藥物的靶向治療之前檢測(cè)是否存在B-Raf突變對(duì)于治療十分有意義?？笲-Raf抗體及其抗原結(jié)合部位的治療應(yīng)用本發(fā)明同樣提供一種抗體及其抗原結(jié)合部位作為治療性藥物的應(yīng)用包括用本發(fā)明的抗體或者其部分作為治療人類的應(yīng)用，以及使用抗體或者其部分作為制造用于治療人類癌癥藥物的應(yīng)用。這些人類癌癥包括黑色素癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，結(jié)腸癌，直腸癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，腦癌，肝癌，胃癌或者造血組織癌。詳細(xì)的癌癥種類亦可參閱上文的描述。在一些操作實(shí)例中，醫(yī)務(wù)人員給予能夠?qū)μ囟膊∵_(dá)到有效劑量的本發(fā)明的抗體或者部分，一般是一種嵌合的或者人源化的抗體或者部分，從而實(shí)現(xiàn)減緩或者治療該疾病，防止癌癥轉(zhuǎn)移或者進(jìn)一步發(fā)展。抗體的給藥方式可以是例如:注射或者浸注?？贵w或者部分的劑量可以由醫(yī)務(wù)人員決定，大致范圍為0.1到100毫克/公斤體重，更優(yōu)地為0.5到50毫克/公斤體重，更優(yōu)地為I到20毫克/公斤體重，更優(yōu)地為I到10毫克/公斤體重。治療的效果可以通過監(jiān)測(cè)例如腫瘤體積縮小的程度來說明。本發(fā)明的治療性藥物的成分除了所述的單克隆抗體或者其部分以外，可能包括一種可接受的藥劑載體?？山邮艿乃巹┹d體其特征在于，可以是一種溶劑，分散劑，包被劑，抗菌劑和抗真菌劑，滲透平衡劑和吸附延緩劑，其特征是具有生理兼容性。在很多情況下，優(yōu)先的載體包括滲透平衡劑，例如糖類，多聚醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉組分。其它可以接受的藥劑材料包括濕潤(rùn)劑或者少量的輔劑，例如濕潤(rùn)劑，乳化劑，保護(hù)劑或緩沖液，它們能夠增加抗體的保質(zhì)期或者效果。在一些操作實(shí)例中，本發(fā)明的抗B-Raf抗體或者其部分被與其它一種和/或者多種治療藥物，診斷藥物，或者預(yù)防劑混合在一起。治療藥物包括但不限于具有不同細(xì)微特異性差異的結(jié)合不同靶標(biāo)的抗B-Raf抗體，以及B-Raf抑制劑，例如抑制劑可以是威羅菲尼片(ZELB0RAF ),索拉非尼(BAY43-9006，NEXAVAR )，帕尼單抗，⑶C-0879(Hoeflich et al.，Cancer Res,69(7):3042-3051(2009)), PLX-4720(Tsai etal.PNAS,105:3041 - 3046(2004)), GSK2118436/SB590885(Kefford et al., J Clin Oncol2010;28: (suppl;abstr 8503)), AZ628, RAF265(CHIR-265)(Mordant et al., Mol CancerTher 2010;9:358-368(2010)，Su et al., Clin Cancer Res, 18(8):2184-2198(2012))或者 XL281 (Schwartz et al.，J.Clin.0ncol.，27 (Suppl):3513.39 (2009))。本發(fā)明的藥劑組成可能含有一種“治療有效劑量”或者“預(yù)防有效量”的本發(fā)明的抗體或者抗原結(jié)合部位?！爸委熡行┝俊笔侵冈谝欢ǖ寞煶毯蛣┝肯?，要達(dá)到有治療效果的有效藥物量?？贵w及其抗原結(jié)合部分的治療有效劑量可能根據(jù)多種因素，例如疾病進(jìn)程，年齡，性別，體重，以及抗體或者抗體部分能夠在個(gè)體內(nèi)所引起的反應(yīng)能力而有所不同。治療有效劑量也包含了該抗體或者抗原結(jié)合部位的有利作用強(qiáng)于任何毒性或者不利作用的意思。“預(yù)防有效量”是指在一定的療程和劑量下，要達(dá)到有預(yù)防效果的有效藥物量。通常由于預(yù)防藥物都是在疾病發(fā)生之前或者疾病早期使用，因此預(yù)防有效量可能會(huì)小于治療有效量。除非特別聲明，這里所用的所有的技術(shù)或者科學(xué)屬于都與一般熟知本發(fā)明領(lǐng)域的人員的常識(shí)相一致?？尚Х碌姆椒ê筒牧显谙旅鎸⑦M(jìn)行詳細(xì)描述，盡管與這里描述的相似或者同樣的方法和材料也可以用來檢驗(yàn)本發(fā)明。所有的參考文獻(xiàn)都詳細(xì)列出。盡管引用了大量的文獻(xiàn)，但是這些引用并不表明承認(rèn)任何文獻(xiàn)是該領(lǐng)域的常識(shí)。本專利描述過程中使用的“包含” “包括”應(yīng)當(dāng)被理解為表明包含所述的完整對(duì)象或者群體對(duì)象，而不是排除任何其他的對(duì)象或者群體對(duì)象。材料、方法和實(shí)例僅是為了說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限制。以下實(shí)例是為了描述本發(fā)明的方法與材料。對(duì)描述的條件或參數(shù)適當(dāng)?shù)男薷幕蛘咄忍鎿Q通常符合本領(lǐng)域技術(shù)人員的明顯常識(shí)，因此依然屬于本發(fā)明的精神和范圍。


圖1顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012112的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf N581S蛋白，卻不能結(jié)合野生型的B-Raf蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型B-Raf蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型B-Raf N581S蛋白。泳道3含有HEK293T細(xì)胞表達(dá)的野生型B-Raf蛋白。泳道4含有HEK293T細(xì)胞表達(dá)的突變型B-RafN581S蛋白。圖2 顯示保藏號(hào)為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285 的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf V600E蛋白，卻不能結(jié)合野生型的B-Raf蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型B-Raf蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型B-Raf V600E蛋白。泳道3含有HEK293T細(xì)胞表達(dá)的野生型B-Raf蛋白。泳道4含有HEK293T細(xì)胞表達(dá)的突變型B-Raf V600E蛋白。圖3顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012122的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf V600K蛋白，卻不能結(jié)合野生型的B-Raf蛋白的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜。泳道I含有大腸桿菌表達(dá)的野生型B-Raf蛋白。泳道2含有大腸桿菌表達(dá)的突變型B-Raf V600K蛋白。泳道3含有HEK293T細(xì)胞表達(dá)的野生型B-Raf蛋白。泳道4含有HEK293T細(xì)胞表達(dá)的突變型B-RafV600K蛋白。圖4顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012112的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf N581S蛋白，卻不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型B-Raf (上面)和突變型B-Raf N581S蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與B-Raf蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)B-Raf N581S蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)。圖5 顯示保藏號(hào)為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285 的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf V600E蛋白，卻不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型B-Raf (上面)和突變型B-Raf V600E蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與B-Raf蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)B-Raf V600E蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)。圖6顯示保藏號(hào)為CCTCC C2012122的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf V600K蛋白，卻不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖譜。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)分別指示野生型B-Raf (上面)和突變型B-Raf V600K蛋白(下面)的表達(dá)。紅色熒光信號(hào)能夠指示該抗體與B-Raf蛋白的結(jié)合，并且只在表達(dá)B-Raf V600K蛋白的細(xì)胞(下面)中出現(xiàn)。圖7保藏號(hào)為CCTCC C2012112的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf N581S蛋白，卻不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)圖譜。棕色信號(hào)指示抗體結(jié)合到癌細(xì)胞中的B-Raf N581S突變蛋白上。藍(lán)色信號(hào)指示細(xì)胞核。圖8 保藏號(hào)為 CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285 的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf V600E蛋白，卻不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)圖譜。棕色信號(hào)指示抗體結(jié)合到癌細(xì)胞中的B-Raf V600E突變蛋白上。藍(lán)色信號(hào)指示細(xì)胞核。圖9保藏號(hào)為CCTCC C2012122的細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合B-Raf V600K蛋白，卻不能結(jié)合野生型B-Raf蛋白的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)圖譜。棕色信號(hào)指示抗體結(jié)合到癌細(xì)胞中的B-Raf V600K突變蛋白上。藍(lán)色信號(hào)指示細(xì)胞核。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1特異性結(jié)合B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的生產(chǎn)含有B-Raf突變蛋白氨基酸序列的多肽通過合成獲得。詳細(xì)的多肽序列在下表中列出，相對(duì)野生型蛋白的突變氨基酸加下劃線標(biāo)示:表1突變的B-Raf多肽
權(quán)利要求
1.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，不能識(shí)別B-Raf野生型蛋白的單克隆抗體，或者抗原結(jié)合蛋白，該單克隆抗體特異性識(shí)別的B-Raf突變蛋白包括:第581位的天冬酰胺(Asparagine, N)突變?yōu)榻z氨酸(Serine, S)的突變蛋白(B-Raf N581S)；第600位的纈氨酸(Valine，V)突變?yōu)楣劝彼?Glutamic Acid, E)的突變蛋白(B-RafV600E);或者第600位的纈氨酸(Valine，V)突變?yōu)橘嚢彼?Lysine，K)的突變蛋白(B-RafV600K)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID NO:3的B-Raf蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID NO:1的B-Raf蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，特異性結(jié)合于含有多肽序列SEQ ID NO:2的B-Raf蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，由一條重鏈和一條輕鏈組成；重鏈和輕鏈的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列分別是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC C2012112、CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC/C201285 以及 CCTCC C2012122 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的⑶R1、⑶R2以及⑶R3的氨基酸序列決定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，所述雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體重鏈和輕鏈的組成分別包含重鏈和輕鏈的可變區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，包含有所述的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，包括抗原結(jié)合部位，是一種人源化或者嵌合型抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至6及8任一項(xiàng)所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述單克隆抗體是一種IgG。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體，其特征在于，保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏號(hào)為CCTCCC2012112、CCTCC C201283/CCTCCC201284/CCTCC C201285 以及 CCTCCC2012122 的三株雜交瘤細(xì)胞。
11.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，該單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位的藥物，以及可以藥用的載體。
12.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種診斷B-Raf突變的診斷試劑盒，其組成含有權(quán)利要求1至7所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位。
13.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種診斷腫瘤的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)用權(quán)利要求1至7所述的任意一種單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位接觸需要檢測(cè)的生物樣本；(2)檢測(cè)單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位是否與樣本發(fā)生結(jié)合，而結(jié)合指示樣本存在癌癥或者發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷方法中，常見的癌癥類型包括:直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。
15.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種治療癌癥病人的方法，其特征在于: (1)檢測(cè)來自于病人的生物學(xué)樣品中是否含有B-RafN581S, V600E或者V600K突變，并且 (2)如果存在上述突變，對(duì)該病人給予B-Raf蛋白抑制劑的治療。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述治療方法中，B-Raf蛋白抑制劑包括:反義RNA (antisense RNA)，小干涉RNA(siRNA),微小RNA (miRNA)藥物，抗B-Raf單克隆抗體藥物，帕尼單抗(panitumumab),威羅菲尼(vemurafenib),索拉非尼(Sorafenib),西妥昔單抗(Cetuximab), Raf-265,PLX-4032,⑶C-0879。
17.根據(jù)權(quán)利要 求15所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述治療癌癥病人的方法，給予病人含有權(quán)利要求11的組成成分的藥物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或17所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述治療癌癥病人的方法中，常見的癌癥類型包括:直腸癌，乳頭狀甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌。
19.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求1至8的單克隆抗體或者抗原結(jié)合部位用于癌癥治療藥物的生產(chǎn)過程，常見的癌癥種類包括:黑色素癌，直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，食道癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，肺癌，或者造血組織癌。
20.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種純化的核酸分子，包含能夠編碼權(quán)利要求1至8所述單克隆抗體的重鏈或者其一個(gè)抗原結(jié)合部位，或者能夠編碼輕鏈或者其一個(gè)抗原結(jié)合部位，或者能夠同時(shí)編碼二者的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種載體分子，含有可以聯(lián)系到該核酸分子的表達(dá)調(diào)控序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種宿主細(xì)胞，含有該核酸分子。
23.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，包含權(quán)利要求1至7的一種細(xì)胞株，其含有所述的單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位。
24.特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，一種生產(chǎn)單克隆抗體或者其抗原結(jié)合部位的方法，所生產(chǎn)的抗體或者抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合人類突變的B-Raf蛋白，而不結(jié)合人類野生型的B-Raf蛋白。其步驟包括: (1)根據(jù)權(quán)利要求22，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，或者根據(jù)權(quán)利要求23，在釋放的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞株； (2)提純所述的抗體部分。
全文摘要
本發(fā)明公開了特異性識(shí)別B-Raf突變蛋白的單克隆抗體、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物科學(xué)和藥物載體領(lǐng)域。利用本發(fā)明的方法制備出的三種單克隆抗體分別可以特異性識(shí)別三種B-Raf N581S，B-Raf V600E和B-RafV600K突變蛋白。這三種單克隆抗體可以用于檢測(cè)動(dòng)物或者人體組織中的B-Raf蛋白是否含有N581S、V600E和V800K突變，能為臨床上皮膚癌等多種癌癥的診斷和治療提供依據(jù)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103172744SQ20121036760
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者黃新云 申請(qǐng)人:武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司