專利名稱：一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米復(fù)合材料應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來隨著社會人口劇增，生活節(jié)奏的加快，由腫瘤、感染、生理功能減退以及其它病因?qū)е碌慕M織缺(病)損高發(fā)，自然災(zāi)害、工傷事故的頻繁發(fā)生和汽車工業(yè)的發(fā)展及體育運(yùn)動的普及導(dǎo)致的人類意外傷害劇增并具有年輕化的趨勢。以上這些對人類的健康構(gòu)成極大威脅的組織缺(病)損的修復(fù)都需要組織引導(dǎo)再生材料。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成份，屬于結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它的出現(xiàn)使組織引導(dǎo)再生 材料的研究進(jìn)入了一個(gè)新階段。膠原具有(1)特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可引導(dǎo)細(xì)胞生長；(2)無抗原性；(3)可參與愈合過程，并能促進(jìn)細(xì)胞生長；(4)物理機(jī)械性能優(yōu)良；(5)生物相容性好；(6)可降解、吸收等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)是其他天然材料所不可比擬的，因此膠原是一種性能優(yōu)良的可降解醫(yī)用組織引導(dǎo)再生的天然材料。膠原在體內(nèi)以膠原原纖維或稱膠原纖維的形式存在，膠原纖維的基本結(jié)構(gòu)單位是原膠原分子，呈細(xì)棒狀，長300 11111，直徑1.5 nm，相對分子量為2. 85X 105。每一個(gè)原膠原分子均由3條具有左手螺旋結(jié)構(gòu)的a肽鏈組成，3條肽鏈通過互相折疊盤繞形成右手復(fù)合螺旋。膠原特有的三重螺旋結(jié)構(gòu)賦予它良好的生物學(xué)性能，如高拉伸強(qiáng)度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性和低細(xì)胞毒以及促進(jìn)細(xì)胞生長的性能，也同時(shí)使它能與其它物質(zhì)，如羥基磷灰石、碳納米管和細(xì)胞因子等有效結(jié)合，所具有的這些特性都使其成為一種理想的生物醫(yī)用材料和藥物載體。近年來，碳納米管(CNTs)由于具有很大的比表面積，能與高聚物基體有很好的粘接能力，從而有效提高基體的力學(xué)性能，引起了人們廣泛的關(guān)注。它是由碳原子形成的平面六邊形石墨單層為基礎(chǔ)卷曲而成的空心小管，可分為多壁碳納米管和單壁碳納米管。從微觀結(jié)構(gòu)上研究發(fā)現(xiàn)，典型形態(tài)的單壁碳納米管直徑在O. 5-1. 5 nm，長約100-300 nm，這和骨骼、軟骨中膠原纖維的三螺旋結(jié)構(gòu)(直徑1. 5 nm，長300 nm)非常相似。國內(nèi)外研究表明CNTs作為單一支架材料雖具有生物力學(xué)性能佳、良好的細(xì)胞附著率和增殖率的優(yōu)點(diǎn)，但也存在可塑性難度較大、不能降解的缺點(diǎn)，因此，CNTs與膠原支架等材料的復(fù)合有望解決其本身的缺陷。此外，CNTs在養(yǎng)料、藥品供給系統(tǒng)方面有很大的應(yīng)用潛力，可在養(yǎng)料、藥品供給系統(tǒng)與細(xì)胞之間形成圓筒形的渠道，輸送肽、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA或寡核苷酸等物質(zhì)，因此CNTs有可能作為輸送細(xì)胞因子的有效載體從而應(yīng)用于骨、軟骨等組織缺損修復(fù)。本發(fā)明結(jié)合了天然膠原與CNTs的優(yōu)點(diǎn)，制備一種具有組織引導(dǎo)再生作用的碳納米管/膠原基復(fù)合材料，該材料具有良好的生物相容性、組織修復(fù)性能和極低的免疫原性，可應(yīng)用于骨、軟骨等組織病缺損修復(fù)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，該復(fù)合材料是一種具有良好的生物相容性和組織修復(fù)性能的新型組織引導(dǎo)再生材料。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用于骨、軟骨組織病缺損修復(fù)。一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料，該復(fù)合材料由膠原蛋白和碳納米管組成，其中膠原蛋白的質(zhì)量百分比含量為96. 0-99. 8%，碳納米管的質(zhì)量百分比含量為O. 2-4. 0%。所述的膠原蛋白為魚皮膠原蛋白或豬皮、牛皮、跟腱的膠原蛋白。所述的碳納米管為改性的單壁碳納米管，或共價(jià)改性和非共價(jià)改性的多壁碳納米 管。一種制備如上所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的方法包括如下步驟
(1)將富含膠原蛋白的原料機(jī)械去除皮下肌肉、脂肪及結(jié)締組織雜質(zhì)，分切成Imm XI _碎塊后清洗干凈；
(2)用O.01 mol/L氫氧化鈉和體積分?jǐn)?shù)為I %的過氧化氫的混合溶液、10wt%的異丙醇溶液洗滌脫脂；
(3)溶解在pH=2.0-3. O的稀酸溶液中，所述的酸為乙酸、丙酸或丙二酸；
(4)加入蛋白酶，膠原蛋白與蛋白酶的質(zhì)量比為50-100:1，4-5°C下酶解16_24h ；
(5)在離心收集的上清液中加入NaCl或KC1，使終濃度達(dá)到O.9 mol/L，靜置10-12 h，5000 r/min離心20 min，收集得到的沉淀物;
(6)將沉淀物溶于10倍體積的0.5mol/L乙酸溶液中，離心收集上清液；
(7)在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12 h，每3 h換液一次，最后用純化水透析至中性；
(8)取透析后膠原和碳納米管混合，磁力攪拌10h，冷凍干燥后在交聯(lián)劑溶液中交聯(lián)；
(9)用純化水將交聯(lián)后的復(fù)合材料充分沖洗，再次冷凍干燥，取出后置于兩塊四氟乙烯平板間加壓24 h使之平整，得到碳納米管/膠原基復(fù)合材料。所述的蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。所述的交聯(lián)劑配方為0. 2 mol/L核糖+ 10wt%丙酮+ 2wt%氨水，或甲醛、戊二醛、碳化亞胺、雙環(huán)氧化合物、京尼平、原花青素中的一種或幾種。所述的交聯(lián)劑溶液中交聯(lián)劑的質(zhì)量百分含量為0. 3-3%。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明獲得的碳納米管/膠原基復(fù)合材料具有良好的生物相容性、組織修復(fù)性能和極低的免疫原性，所需原料易得，制備工藝條件較溫和，具有廣泛的推廣應(yīng)用價(jià)值。


圖1為碳納米管/膠原基復(fù)合材料場發(fā)射掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :制備碳納米管/膠原基復(fù)合材料，具體步驟如下
(I)將富含膠原蛋白的魚皮機(jī)械去除皮下肌肉、脂肪及結(jié)締組織等雜質(zhì)，分切成約ImmX I _碎塊后清洗干凈；(2)用O.Ol mol/L氫氧化鈉和含體積分?jǐn)?shù)為I %的過氧化氫混合溶液、10%的異丙醇溶液洗滌脫脂；
(3)溶解在pH2. O的乙酸溶液中；
(4)向上述溶液中加入蛋白酶，膠原蛋白與蛋白酶的質(zhì)量比為50:1，4°C下酶解24h ；
(5)在離心收集的上清中加入NaCl，使終濃度達(dá)到O.9 mol/L,靜置12 h,5000r/min離心20 min，收集得到的沉淀物；
(5)將沉淀物溶于10倍體積的0.5mol/L乙酸溶液中，離心收集上清；
(7)在10倍體積的O.lmol/L乙酸溶液中透析12 h，每3 h換液一次，最后用純化水透析至中性；
(8)取透析后膠原按干重96.0%和4%的碳納米管混合，磁力攪拌10h，冷凍干燥后在交聯(lián)劑溶液中交聯(lián)，交聯(lián)液配方0.2 mol.L—1核糖+ 10%丙酮+ 2%氨水；
(8)用純化水將交聯(lián)后的復(fù)合材料充分沖洗，再次冷凍干燥，取出后置于兩塊四氟乙烯平板間加壓24 h使之平整，得到碳納米管/膠原基復(fù)合材料(見圖1)。(9)將得到的碳納米管/膠原基復(fù)合材料裁成fO. 5 mm、高0·3±0·05 mm的圓柱體，無菌條件下用高密度聚乙烯(HDPE)薄膜袋密封包裝后經(jīng)25. O kGy劑量b射線照射，然后于5-8 °C儲存?zhèn)溆?。?shí)施例2 :制備碳納米管/膠原基復(fù)合材料，具體步驟如下
(1)將富含膠原蛋白的魚皮機(jī)械去除皮下肌肉、脂肪及結(jié)締組織等雜質(zhì)，分切成約ImmX I _碎塊后清洗干凈；
(2)用0.01 mol/L氫氧化鈉和含體積分?jǐn)?shù)為I %的過氧化氫混合溶液、10%的異丙醇溶液洗滌脫脂；
(3)溶解在pH3. O的丙二酸溶液中；
(4)向上述溶液中加入蛋白酶，膠原蛋白與蛋白酶的質(zhì)量比為100:1，5°C下酶解16h ；
(5)在離心收集的上清中加入KC1，使終濃度達(dá)到0.9mol/L,靜置10 h,5000r/min離心20 min,收集得到的沉淀物；
(6)將沉淀物溶于10倍體積的0.5mol/L乙酸溶液中，離心收集上清；
(7)在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12 h，每3 h換液一次，最后用純化水透析至中性；
(8)取透析后膠原按干重99.8%和0. 2%的碳納米管混合，磁力攪拌10 h，冷凍干燥后在0. 3%甲醛溶液中交聯(lián)；
(9)用純化水將交聯(lián)后的復(fù)合材料充分沖洗，再次冷凍干燥，取出后置于兩塊四氟乙烯平板間加壓24 h使之平整，得到碳納米管/膠原基復(fù)合材料。(10)將得到的碳納米管/膠原基復(fù)合材料裁成f0. 5 mm、高0. 3±0. 05 mm的圓柱體，無菌條件下用HDPE薄膜袋密封包裝后經(jīng)25. O kGy劑量b射線照射，然后于5_8°C儲存?zhèn)溆?。?shí)施例3 :碳納米管/膠原基復(fù)合材料的骨、軟骨組織病缺損修復(fù)作用，具體步驟如下
(I)動物分組取健康6月齡骨髂成熟的新西蘭兔18只，雌雄不限，體重2. 6 - 3. 4 kg。將動物隨機(jī)分成3組手術(shù)對照組、膠原材料組和碳納米管/膠原基復(fù)合材料組，每組6只。
(2)手術(shù)操作實(shí)驗(yàn)動物用3%戊巴比妥鈉(I mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定，膝關(guān)節(jié)備皮、消毒和鋪單。無菌條件下經(jīng)雙膝內(nèi)側(cè)縱向切一長約3-4 cm切口，外推髕骨使之脫位，暴露骸股關(guān)節(jié)面。在關(guān)節(jié)面中央鉆一直徑4 mm、深5 mm的圓形骨/軟骨缺損，刮除缺損處殘余軟骨和骨碎片。按上述分組，碳納米管/膠原基復(fù)合材料組植入按上述實(shí)施例所述方法制備的碳納米管/膠原基復(fù)合材料，膠原材料組植入不含碳納米管的膠原材料，手術(shù)對照組只造成圓形缺損，不植入任何材料，最后無菌縫合傷口。術(shù)中動物因麻醉或意外死亡用額外兔子補(bǔ)齊。術(shù)后連續(xù)肌注青霉素3 d，40萬u/只。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果術(shù)后第12周耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死動物，肉眼觀察切口愈合情況，取材，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和阿爾辛藍(lán)染色。結(jié)果可見手術(shù)對照組缺損的大部分未被完全填充，染色結(jié)果顯示缺損區(qū)纖維組織大量增生，無序排列，軟骨下骨未見修復(fù)；碳納米管/膠原基復(fù)合材料組缺損絕大多數(shù)被填充，新生組織表面有光澤，與周圍軟骨界限較模糊。染色結(jié)果顯示新生組織與周圍軟骨和軟骨下骨整合緊密、上層細(xì)胞形態(tài)與正常軟骨組織相似，呈柱狀排排列，并有較多異染的蛋白聚糖成分；膠原材料組與碳納米 管/膠原基復(fù)合材料組結(jié)果類似，但其軟骨下骨的修復(fù)效果較碳納米管/膠原基復(fù)合材料組為差。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步證明使用本發(fā)明的碳納米管/膠原基復(fù)合材料植入軟骨/軟骨下骨病缺損部位，可有效的誘導(dǎo)軟骨和軟骨下骨(骨組織)的生成和重構(gòu)，從而達(dá)到恢復(fù)骨、軟骨組織病缺損修復(fù)的目的。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于該碳納米管/膠原基復(fù)合材料應(yīng)用于骨、軟骨組織病缺損修復(fù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于該復(fù)合材料由膠原蛋白和碳納米管組成，其中膠原蛋白的質(zhì)量百分比含量為96. 0-99. 8%，碳納米管的質(zhì)量百分比含量為O. 2-4. 0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于所述的膠原蛋白為魚皮膠原蛋白或豬皮、牛皮、跟腱的膠原蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于所述的碳納米管為改性的單壁碳納米管，或共價(jià)改性和非共價(jià)改性的多壁碳納米管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的制備方法包括如下步驟(1)將富含膠原蛋白的原料機(jī)械去除皮下肌肉、脂肪及結(jié)締組織雜質(zhì)，分切成Imm XI_碎塊后清洗干凈；(2)用O.01 mol/L氫氧化鈉和體積分?jǐn)?shù)為I %的過氧化氫的混合溶液、10wt%的異丙醇溶液洗滌脫脂；(3)溶解在pH=2.0-3. O的稀酸溶液中，所述的酸為乙酸、丙酸或丙二酸；(4)加入蛋白酶，膠原蛋白與蛋白酶的質(zhì)量比為50-100:1，4-5°C下酶解16_24h ；(5)在離心收集的上清液中加入NaCl或KC1，使終濃度達(dá)到O.9 mol/L，靜置10-12 h， 5000 r/min離心20 min，收集得到的沉淀物;(6)將沉淀物溶于10倍體積的0.5mol/L乙酸溶液中，離心收集上清液；(7)在10倍體積的0.1mol/L乙酸溶液中透析12 h，每3 h換液一次，最后用純化水透析至中性；(8)取透析后膠原和碳納米管混合，磁力攪拌10h，冷凍干燥后在交聯(lián)劑溶液中交聯(lián)；(9)用純化水將交聯(lián)后的復(fù)合材料充分沖洗，再次冷凍干燥，取出后置于兩塊四氟乙烯平板間加壓24 h使之平整，得到碳納米管/膠原基復(fù)合材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于所述的蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于所述的交聯(lián)劑配方為0. 2 mol/L核糖+ 10wt%丙酮+ 2wt%氨水,或甲醒、戍二醒、碳化亞胺、雙環(huán)氧化合物、京尼平、原花青素中的一種或幾種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于所述的交聯(lián)劑溶液中交聯(lián)劑的質(zhì)量百分含量為0. 3-3%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種碳納米管/膠原基復(fù)合材料的應(yīng)用，該碳納米管/膠原基復(fù)合材料應(yīng)用于骨、軟骨組織病缺損修復(fù)。本發(fā)明獲得的碳納米管/膠原基復(fù)合材料具有良好的生物相容性、組織修復(fù)性能和極低的免疫原性，所需原料易得，制備工藝條件較溫和，具有廣泛的推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號A61L27/02GK103007357SQ20121056730
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者張其清, 王建華, 賀超龍, 程娘梅, 陳名懋 申請人:福建省博特生物科技有限公司