Mrna遞送的脂質(zhì)納米顆粒組合物和方法
【專利摘要】本文公開在靶細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生的組合物和方法。本文公開的組合物和方法能夠減輕與蛋白或酶缺乏相關(guān)的疾病。
【專利說(shuō)明】MRNA遞送的脂質(zhì)納米顆粒組合物和方法
[0001]治療蛋白和酶缺乏仍然需要新的途徑和治療方法。例如，溶酶體沉積病是由溶酶體功能缺乏導(dǎo)致的約50種的一組稀有遺傳性代謝疾病，通常由于代謝所需酶缺乏導(dǎo)致。法布里病(Fabry disease)是酶α半乳糖苷酶(GLA)缺乏導(dǎo)致的溶酶體沉積病，其導(dǎo)致稱為神經(jīng)酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide)的糖脂在血管和其他組織中積累，從而引起各種令人痛苦的臨床癥狀。對(duì)于某些疾病，類似于法布里病，有需求代替蛋白或酶，該蛋白或酶通常通過細(xì)胞分泌至血流內(nèi)。增加受影響的蛋白或酶的水平或產(chǎn)量的治療，例如基因治療，能夠提供這些疾病的治療或者甚至治愈這些疾病。然而，為了該目的使用常規(guī)基因治療一直有多處限制。
[0002]常見基因治療包括使用DNA插入所需遺傳信息至宿主細(xì)胞內(nèi)。引入DNA內(nèi)的細(xì)胞通常被一定程度整合至一種或多種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組內(nèi)，使得引入的遺傳物質(zhì)可在宿主中長(zhǎng)期作用。盡管這種持續(xù)的作用可以有巨大益處，但外源性DNA整合至宿主基因組內(nèi)也可具有許多不利作用。例如，將引入的DNA插入完整基因內(nèi)，可能導(dǎo)致妨礙或者甚至完全消除內(nèi)源基因的作用的突變。因此，使用DNA的基因治療可導(dǎo)致對(duì)治療的宿主中關(guān)鍵遺傳功能的損害，例如，消除或者有害地降低關(guān)鍵酶的產(chǎn)生或者中斷調(diào)解細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因，這導(dǎo)致未調(diào)節(jié)或癌性細(xì)胞增殖。此外，使用常見的基于DNA的基因治療，所需基因產(chǎn)品的有效表達(dá)是必須的，從而包含強(qiáng)的啟動(dòng)子序列，這也可導(dǎo)致在細(xì)胞中常見基因表達(dá)調(diào)節(jié)的非期望改變。也可能，基于DNA的遺傳物質(zhì)導(dǎo)致引入非所需抗-DNA抗體，反過來(lái)，這可觸發(fā)可能的致命免疫應(yīng)答。使用病毒載體的基因治療途徑也能夠?qū)е虏焕拿庖邞?yīng)答。在一些情況下，病毒載體甚至可整合至宿主基因組內(nèi)。此外，制備臨床級(jí)別病毒載體也昂貴和耗時(shí)。使用病毒載體對(duì)引入的遺傳物質(zhì)的靶向遞送也難于控制。因此，盡管已經(jīng)評(píng)估使用病毒載體遞送分泌的蛋白的基于DNA的基因治療(美國(guó)專利N0.6，066, 626 ;US2004/0110709)，但由于這些各種原因這些途徑受到限制。
[0003]遞送編碼分泌的蛋白的核酸的這些現(xiàn)有途徑的另一障礙是最終產(chǎn)生的蛋白的水平。在血液中難以達(dá)到所需蛋白的顯著水平，并且量維持時(shí)間不長(zhǎng)。例如，通過核酸遞送產(chǎn)生的蛋白量未達(dá)到正常生理水平。參見，例如，US2004/0110709。
[0004]與DNA相比，使用RNA作為基因治療劑則基本上更加安全，因?yàn)?(I)RNA未涉及穩(wěn)定地整合至轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組內(nèi)，從而消除以下憂慮:引入的遺傳物質(zhì)破壞必需基因的正常功能，或者導(dǎo)致引起有害或致癌作用的突變；(2)有效地翻譯編碼的蛋白無(wú)需外源性啟動(dòng)子序列，從而也避免有害的副作用；(3)與質(zhì)粒DNA(pDNA)相比，信使RNA(mRNA)缺乏免疫CpG基序，從而不會(huì)產(chǎn)生抗-RNA抗體；以及(4)由于RNA的相對(duì)較短的半衰期，由于基于mRNA的基因治療導(dǎo)致的任何有害作用具有有限的持續(xù)時(shí)間。此外，mRNA不需要進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)執(zhí)行它的功能，但DNA必須克服該主要障礙。
[0005]基于mRNA的基因治療過去使用不多的一個(gè)原因是mRNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如DNA穩(wěn)定，特別是當(dāng)它達(dá)到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)處以及將它暴露于降解的酶時(shí)。在mRNA中糖部分的第二個(gè)碳上羥基的存在導(dǎo)致空間 位阻，該空間位阻妨礙mRNA形成DNA的更加穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，因而使得mRNA更加容易水解降解。因此，直至最近，普遍認(rèn)為mRNA對(duì)于抵抗轉(zhuǎn)染方案太不穩(wěn)定。RNA穩(wěn)定修飾上的進(jìn)展激起對(duì)在基因治療中使用mRNA替代質(zhì)粒DNA的更多興趣。諸如陽(yáng)離子脂質(zhì)或高分子遞送媒介物的某些遞送媒介物也可幫助保護(hù)轉(zhuǎn)染的mRNA遠(yuǎn)離內(nèi)源性RNA酶。然而，盡管增加了修飾的mRNA的穩(wěn)定性，但將mRNA以使得可達(dá)蛋白產(chǎn)生的治療水平的方式體內(nèi)遞送至細(xì)胞內(nèi)仍然是個(gè)挑戰(zhàn)，特別是對(duì)于編碼全長(zhǎng)蛋白的mRNA。盡管對(duì)編碼分泌的蛋白的mRNA的遞送已經(jīng)有預(yù)估(US2009/0286852)，但是通過體內(nèi)mRNA遞送實(shí)際產(chǎn)生的全長(zhǎng)分泌的蛋白的水平尚不得而知，并且也沒有理由期望其水平超出由基于DNA的基因治療的水平更高。
[0006]迄今為止，使用mRNA基因治療的顯著進(jìn)展僅在低水平的翻譯不是限制因素的申請(qǐng)中出現(xiàn)，例如使用編碼抗原的mRNA免疫。涉及通過皮內(nèi)注射裸露或魚精蛋白復(fù)合的mRNA針對(duì)腫瘤抗原的接種的臨床試驗(yàn)已經(jīng)表明其可行性、沒有毒性和有前景的結(jié)果。X.Su等人，Mol.Pharmaceutics8:774-787(2011)。遺憾的是，在其他申請(qǐng)中低水平的翻譯極大地限制基于mRNA的基因治療的探索，其需要較高水平的編碼蛋白的mRNA持續(xù)表達(dá)以發(fā)揮生理或治療作用。
[0007] 本發(fā)明提供遞送通過“儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)”導(dǎo)致治療有效水平的分泌的蛋白產(chǎn)生的mRNA基因治療劑的方法。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，編碼分泌的蛋白的mRNA承載在脂質(zhì)納米顆粒中以及體內(nèi)遞送至靶細(xì)胞。然后靶細(xì)胞用作產(chǎn)生治療水平的可溶、分泌的蛋白至循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的儲(chǔ)存來(lái)源。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的分泌的蛋白的水平在正常生理水平上。
[0008]本發(fā)明提供將在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物中mRNA細(xì)胞內(nèi)遞送至一種或多種靶細(xì)胞以產(chǎn)生分泌的功能性蛋白的治療水平的組合物和方法。
[0009]本發(fā)明的組合物和方法用于控制和治療大量疾病，特別是由蛋白和/或酶缺乏引起的疾病，其中蛋白或酶通常由分泌產(chǎn)生。患有這些疾病的個(gè)體可具有潛在遺傳缺陷，其導(dǎo)致蛋白或酶表達(dá)受損，包括例如分泌的蛋白未合成、分泌的蛋白減少合成，或者合成缺乏或具有減弱生理活性的分泌的蛋白。特別地，本發(fā)明的方法和組合物用于治療溶酶體沉積病和/或尿素循環(huán)代謝障礙，這些疾病由于在尿素循環(huán)中涉及的分泌酶的生物合成中一種或多種缺陷發(fā)生。
[0010]本發(fā)明的組合物包含mRNA、轉(zhuǎn)移媒介物以及促進(jìn)與它們接觸和隨后靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染的試劑。mRNA能夠編碼臨床使用的分泌的蛋白。例如，mRNA可編碼功能性分泌的尿素循環(huán)酶或者在溶酶體沉積病中牽涉的分泌的酶。mRNA能夠編碼例如紅細(xì)胞生成素(例如，人ΕΡ0)或者α -半乳糖苷酶(例如，人α -半乳糖苷酶(人GLA))。
[0011]在一些實(shí)施方案中，mRNA能夠包含賦予mRNA穩(wěn)定性(例如，與mRNA的野生型或天然形式相比)的一種或多種修飾以及也可包含相對(duì)于野生型的一種或多種修飾，這些修飾修正在蛋白的相關(guān)異常表達(dá)中牽涉的缺陷。例如，本發(fā)明的核酸可包含對(duì)5'和3'非翻譯區(qū)的一者或兩者的修飾。這些修飾可包括但不限于包含巨細(xì)胞病毒(CMV)即刻早期I (IEl)基因的部分序列、聚A尾巴(poly A tail)、Capl結(jié)構(gòu)或者編碼人生長(zhǎng)激素(hGH)的序列。在一些實(shí)施方案中，將mRNA修飾以降低mRNA免疫原性。
[0012]也涵蓋包括施用本發(fā)明的組合物的治療受試者的方法。例如，提供治療或預(yù)防病癥的方法，其中特定分泌的蛋白的產(chǎn)生和/或特定分泌的蛋白的利用不充足。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的方法能夠用于治療患有一種或多種尿素循環(huán)酶的缺乏或者在溶酶體沉積病中缺乏的一種或多種酶的受試者。[0013]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將在本發(fā)明的組合物中mRNA配制在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物中以促進(jìn)遞送至靶細(xì)胞。涵蓋的轉(zhuǎn)移媒介物可包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或PEG-修飾的脂質(zhì)。例如，轉(zhuǎn)移媒介物可包含以下陽(yáng)離子脂質(zhì)的至少一種:C12-200、DLin-KC2-DMA、D0DAP、HGT4003、ICE、HGT5000 或 HGT5001。在實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移媒介物包含膽固醇(chol)和/或PEG-修飾的脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移媒介物包含DMG-PEG2K。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移媒介物包含以下脂質(zhì)制劑之一:C12-200、DOPE、chol、DMG-PEG2K ；DODAP、DOPE、膽固醇、DMG-PEG2K ;HGT5000、DOPE、chol、DMG-PEG2K ;HGT5001、DOPE、chol、DMG-PEG2K。
[0014]本發(fā)明也提供用于促進(jìn)一種或多種mRNA分子轉(zhuǎn)染和遞送至能夠表現(xiàn)出“儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)”的靶細(xì)胞的組合物和方法。例如，本發(fā)明的組合物和方法涵蓋能夠增強(qiáng)組合物與一種或多種靶細(xì)胞的親和力的靶向脂質(zhì)的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向脂質(zhì)是載脂蛋白-B或載脂蛋白-E以及相關(guān)靶細(xì)胞表達(dá)低密度脂蛋白受體，從而促進(jìn)靶向脂質(zhì)的識(shí)別。本發(fā)明的方法和組合物可用于優(yōu)選地靶向大量靶細(xì)胞。例如，所涵蓋的靶細(xì)胞包括但不限于:肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、β細(xì)胞、腦垂體細(xì)胞、滑膜襯里細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
[0015]在實(shí)施方案中，分泌的蛋白通過靶細(xì)胞產(chǎn)生維持量的時(shí)間。例如，在施用之后，分泌的蛋白可產(chǎn)生大于I小時(shí)、大于4小時(shí)、大于6小時(shí)、大于12小時(shí)、大于24小時(shí)、大于48小時(shí)，或者大于72小時(shí)。在一些實(shí)施方案中,在施用之后，多肽在約6小時(shí)達(dá)峰值水平。在一些實(shí)施方案中， 多肽的表達(dá)維持至少治療水平。在一些實(shí)施方案中，在施用之后，多肽表達(dá)在至少治療水平下大于I小時(shí)、大于4小時(shí)、大于6小時(shí)、大于12小時(shí)、大于24小時(shí)、大于48小時(shí)，或者大于72小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，多肽為在患者血清或組織(例如，肝或肺)可檢測(cè)水平。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)水平的多肽來(lái)自在施用之后大于I小時(shí)、大于4小時(shí)、大于6小時(shí)、大于12小時(shí)、大于24小時(shí)、大于48小時(shí)，或者大于72小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)mRNA組合物的連續(xù)表達(dá)。
[0016]在某些實(shí)施方案中，分泌的蛋白以超過正常生理水平的水平產(chǎn)生。與對(duì)照比較，分泌的蛋白的水平可增加。
[0017]在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是在正常個(gè)體中或者在正常個(gè)體的群體中多肽的基線生理水平。在其他實(shí)施方案中，對(duì)照是在具有相關(guān)蛋白或多肽缺乏的個(gè)體中或者在具有相關(guān)蛋白或多肽缺乏的個(gè)體的群體中多肽的基線生理水平。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照可以是在向其施用組合物的個(gè)體中相關(guān)蛋白或多肽的正常水平。在其他實(shí)施方案中，對(duì)照是在其他治療干預(yù)之上多肽的表達(dá)水平，例如，通過在一個(gè)或多個(gè)可比較時(shí)間點(diǎn)下直接注射相應(yīng)多肽。
[0018]在某些實(shí)施方案中，通過靶細(xì)胞表達(dá)為對(duì)照的至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、30倍、至少100倍、至少500倍、至少5000倍、至少50，000倍或至少100, 000倍的水平的多肽。在一些實(shí)施方案中，在施用之后，相對(duì)對(duì)照的表達(dá)增加倍數(shù)持續(xù)大于I小時(shí)、大于4小時(shí)、大于6小時(shí)、大于12小時(shí)、大于24小時(shí)，或大于48小時(shí)，或者大于72小時(shí)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在血清中檢測(cè)的分泌的蛋白水平為對(duì)照的至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、30倍、至少100倍、至少500倍、至少5000倍、至少50，000倍或者至少100，000倍至少48小時(shí)或者2天。在某些實(shí)施方案中，在施用之后，分泌的蛋白水平可檢測(cè)3天、4天、5天，或者I周或更久。在血清中和/或在組織(例如，肝、肺)中可觀察到分泌的蛋白水平增加。
[0019]在一些實(shí)施方案中，本方法產(chǎn)生所需分泌的蛋白的持續(xù)循環(huán)半衰期。例如，分泌的蛋白可檢測(cè)比通過分泌的蛋白的皮下注射觀察的半衰期長(zhǎng)數(shù)小時(shí)或數(shù)天。在實(shí)施方案中，分泌的蛋白的半衰期維持大于1天、2天、3天、4天、5天，或I周或者更久。
[0020]在一些實(shí)施方案中，施用包括單一或重復(fù)給藥。在某些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)，或通過肺部遞送來(lái)實(shí)施給藥。
[0021]多肽可以是例如紅細(xì)胞生成素、α -半乳糖苷酶、LDL受體、因子VII1、因子IX、a -L-艾杜糖苷酸酶(對(duì)于MPS I)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(對(duì)于MPS II)、肝素-N-硫酸酯酶(對(duì)于MPS ΙΙΙΑ)、α -N-乙酰葡糖胺糖苷酶(對(duì)于MPS 11IB)、半乳糖6-硫酸酯酶(對(duì)于MPS IVA)溶酶體酸酯酶或者芳香基硫酸酯酶-A中的一種或多種。
[0022]某些實(shí)施方案涉及提供細(xì)胞或受試者mRNA的組合物和方法，其至少一部分以基本上小于由mRNA產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)功能性蛋白的量編碼功能性蛋白。換而言之，在某些實(shí)施方案中，遞送至細(xì)胞的mRNA能夠產(chǎn)生一定量的蛋白，該量基本上大于遞送至細(xì)胞的mRNA的量。例如，在給定量時(shí)間內(nèi)，例如向細(xì)胞或受試者施用mRNA開始I小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)或24小時(shí)，通過該mRNA生成的對(duì)應(yīng)蛋白的量可以是實(shí)際向細(xì)胞或受試者施用的mRNA的量的至少1.5倍、2倍、3 倍、5 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、50 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、400 倍、500倍，或者更多倍。這能夠通過質(zhì)量比質(zhì)量計(jì)、摩爾比摩爾計(jì)和/或分子比分子計(jì)來(lái)測(cè)定。能夠以各種方式測(cè)定蛋白。例如，對(duì)于細(xì)胞，測(cè)定的蛋白能夠作為細(xì)胞內(nèi)蛋白、細(xì)胞外蛋白，或者兩者的組合來(lái)測(cè)定。對(duì)于受試者，測(cè)定的蛋白可以是在血清中；在具體一種或多種組織中，例如肝、腎、心臟或腦；在具體細(xì)胞類型中，例如肝或腦的各種細(xì)胞類型之一；或者在血清、組織和/或細(xì)胞類型的任意組合中測(cè)定的蛋白。而且，能夠測(cè)定在施用mRNA之前在細(xì)胞或受試者中內(nèi)源性蛋白的基線量，然后由在施用mRNA之后測(cè)定的蛋白減去該基線量，得到由mRNA生成的對(duì)應(yīng)蛋白的量。以這種方式，mRNA能夠向細(xì)胞或受試者提供大量治療物質(zhì)的儲(chǔ)藏或儲(chǔ)存來(lái)源，例如，如與遞送至細(xì)胞或受試者的mRNA相比。儲(chǔ)存來(lái)源能夠用作由mRNA的多肽表達(dá)的連續(xù)來(lái)源持續(xù)一段時(shí)間。
[0023]當(dāng)連同所附實(shí)施例參照本發(fā)明的以下詳細(xì)描述時(shí)，能更好地理解本發(fā)明的以上討論和許多其他特征和附加優(yōu)勢(shì)。本文描述的各實(shí)施方案是附帶的，并且鑒于本文包含的技術(shù)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的方式能夠合并或者一起使用。
[0024]附圖簡(jiǎn)述
[0025]圖1顯示Y CMV的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，其中如果存在，X是GGA。
[0026]圖2顯示3' hGH序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。
[0027]圖3顯示人紅細(xì)胞生成(EPO) mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。該序列能夠在 端上與SEQ ID NO:1旁側(cè)連接以及在:V端上與SEQ ID NO:2旁側(cè)連接。
[0028]圖4顯示人α -半乳糖苷酶(GLA)mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。該序列能夠在5'端上與SEQ ID NO:1旁側(cè)連接以及在3'端上與SEQ ID NO:2旁側(cè)連接。[0029]圖5顯示人α -1抗胰蛋白酶(AlAT) mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。該序列能夠在5’端上與SEQ ID NO:1旁側(cè)連接以及在3’端上與SEQ ID NO:2旁側(cè)連接。
[0030]圖6顯示人因子IX(FIX)mRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。該序列能夠在5’端上與SEQ ID NO:1旁側(cè)連接以及在3’端上與SEQ ID NO:2旁側(cè)連接。
[0031]圖7顯示如通過ELISA測(cè)定的分泌的hEPO蛋白水平的定量。檢測(cè)的蛋白是由通過單次給藥的各種脂質(zhì)納米顆粒制劑靜脈內(nèi)遞送的hEPO mRNA產(chǎn)生的結(jié)果。制劑C12-200(30ug)、HGT4003(150ug)、ICE (IOOug)、D0DAP(200ug)呈現(xiàn)為各檢品(制劑 1-4)的陽(yáng)離子/離子脂質(zhì)組分。數(shù)值基于施用四小時(shí)之后血液樣品。
[0032]圖8顯示經(jīng)單次IV給藥的人EPO mRNA-承載的脂質(zhì)納米顆粒(制劑1_4)處理的小鼠的血細(xì)胞比容測(cè)定值。在施用之后4h(第I天)、24h(第2天)、第4天、第7天和第10天取得所有血液樣品。
[0033]圖9顯示經(jīng)單次IV給藥或者三次注射(第I天、第3天、第5天)的人EP0_mRNA-承載的脂質(zhì)納米顆粒處理的小鼠的血細(xì)胞比容測(cè)定值。在注射之前(第-4天)、第7天和第15天取得全部血液樣品。以(30ug,單次給藥)或者(3xl0ug,第I天、第3天、第5天給藥)施用制劑I ;以(3x50ug,第I天、第3天、第5天給藥)施用制劑2。
[0034]圖10顯示如通過ELISA測(cè)定的分泌的人α -半乳糖苷酶(hGLA)蛋白水平的定量。檢測(cè)的蛋白是由通過脂質(zhì)納米顆粒(制劑I ;30ug單次靜脈內(nèi)給藥，基于包封的mRNA)遞送的hGLA mRNA產(chǎn)生的結(jié)果。檢測(cè)hGLA蛋白48小時(shí)。
[0035]圖11顯示在 血清中hGLA活性。在37 °C下使用基質(zhì)4_甲基傘形酮基-a -D-乳酸吡喃糖苷甲酯(4-MU- a -gal)測(cè)定hGLA活性。數(shù)據(jù)為6至9名個(gè)體測(cè)定值的平均值。
[0036]圖12顯示如通過ELISA測(cè)定在血清中hGLA蛋白水平的定量。由通過C12-200-基脂質(zhì)納米顆粒(C12-200: DOPE: Chol: DMGPEG2K，40: 30: 25: 5(制劑 I) ;30ug 基于包封的mRNA的mRNA，單次IV給藥)遞送的hGLA mRNA產(chǎn)生蛋白。根據(jù)包封的mRNA，每單次靜脈給藥下，監(jiān)控hGLA蛋白72小時(shí)。監(jiān)控hGLA蛋白72小時(shí)。
[0037]圖13顯示如通過ELISA測(cè)定在肝、腎和脾中hGLA蛋白水平的定量。由通過C12-200-基脂質(zhì)納米顆粒(制劑I ;30ug基于包封的mRNA的mRNA，單次IV給藥)遞送的hGLA mRNA產(chǎn)生蛋白。監(jiān)控hGLA蛋白72小時(shí)。
[0038]圖14顯示監(jiān)控hGLA (如在血清(A)和肝⑶中如分泌的MRT-來(lái)源的人GLA蛋白)的蛋白產(chǎn)生的劑量反應(yīng)研究。施用之后24小時(shí)測(cè)定樣品(制劑I;單次給藥，IV，N =4只小鼠/組)，并通過ELISA定量。
[0039]圖15顯示在無(wú)胸腺裸小鼠(40ug/kg劑量)中ERT-基α -半乳糖苷酶和由MRT產(chǎn)生的hGLA蛋白(制劑I ;1.0mg/kg mRNA劑量)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
[0040]圖16顯示如使用ELISA測(cè)定在MRT-處理的法布里小鼠中分泌的hGLA蛋白水平的定量。由通過C12-200-基脂質(zhì)納米顆粒(制劑I ;10ug mRNA/單次靜脈內(nèi)給藥，基于包封的mRNA)遞送的hGLAmRNA產(chǎn)生蛋白。監(jiān)控血清72小時(shí)。
[0041]圖17顯示如通過ELISA測(cè)定在MRT-處理的法布里KO小鼠的肝、腎、脾和心臟中hGLA蛋白水平的定量。由通過C12-200-基脂質(zhì)納米顆粒(制劑I ;30ug基于包封的mRNA的mRNA ;單次IV給藥)遞送的hGLA mRNA產(chǎn)生蛋白。監(jiān)控hGLA蛋白72小時(shí)。將表示正常生理水平的文獻(xiàn)數(shù)值繪圖為虛線。[0042]圖18顯示如使用ELISA測(cè)定在MRT和α -半乳糖苷酶處理的法布里小鼠中分泌的hGLA蛋白水平的定量。兩種療法均為單次靜脈內(nèi)1.0mg/kg劑量給藥。
[0043]圖19顯示如通過ELISA測(cè)定的在MRT和ERT ( α -半乳糖苷酶)-處理的法布里KO小鼠的肝、腎、脾和心臟中hGLA蛋白水平的定量。由通過脂質(zhì)納米顆粒(制劑I ;1.0mg/kg基于包封的mRNA的mRNA，單次IV給藥)遞送的hGLA mRNA產(chǎn)生蛋白。
[0044]圖20顯示在經(jīng)處理和未經(jīng)處理的小鼠的腎中神經(jīng)酰胺三己糖苷(Gb3)和lyso-Gb3的相對(duì)定量。將雄性法布里KO小鼠經(jīng)1.0mg/kg下GLA mRNA-承載的脂質(zhì)納米顆?；蛘擀?半乳糖苷酶單次給藥。量反映施用一周之后Gb3/lyso-Gb3的量。
[0045]圖21顯示在經(jīng)處理和未經(jīng)處理的小鼠的心臟中神經(jīng)酰胺三己糖苷(Gb3)和lyso-Gb3的相對(duì)定量。使用1.0mg/kg下GLAmRNA-承載的脂質(zhì)納米顆?；蛘擀?-半乳糖苷酶的單次給藥來(lái)處理雄性法布里KO小鼠。該量反映在施用一周之后Gb3/lyso-Gb3的定量。[0046]圖22顯示監(jiān)控GLA(如在血清中分泌的MRT-來(lái)源的人GLA蛋白)的產(chǎn)生的劑量反應(yīng)研究。在施用HGT4003 (制劑3)或者HGT5000-基脂質(zhì)納米顆粒(制劑5) 24小時(shí)(單次給藥，IV，N = 4只小鼠/組)之后測(cè)定樣品，并通過ELISA定量。
[0047]圖23顯示如在血清⑷中或者在肝、腎和脾⑶中測(cè)定的hGLA蛋白產(chǎn)生。在施用HGT5001-基脂質(zhì)納米顆粒(制劑6)之后6小時(shí)和24小時(shí)(單次給藥，IV，N = 4只小鼠/組)測(cè)定樣品并通過ELISA定量。
[0048]圖24顯示使用ELISA測(cè)定的分泌人因子IX蛋白水平的定量(平均ng/mL土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。由通過C12-200-基脂質(zhì)納米顆粒(C12-200: DOPE: Chol: DMGPEG2K,40: 30: 25: 5(制劑I) ；30ug mRNA/單次靜脈內(nèi)給藥，基于包封的mRNA)遞送的FIXmRNA來(lái)產(chǎn)生FIX蛋白。監(jiān)控FIX蛋白72小時(shí)(η = 24只小鼠)。
[0049]圖25顯示使用ELISA測(cè)定的分泌人α _1_抗胰蛋白酶(AlAT)蛋白水平的定量。由通過C12-200-基脂質(zhì)納米顆粒(C12-200: DOPE: Chol: DMGPEG2K，40: 30: 25: 5(制劑I) ；30ug mRNA/單次靜脈內(nèi)給藥，基于包封的mRNA)遞送的AlAT mRNA來(lái)產(chǎn)生AlAT蛋白。監(jiān)控AlAT蛋白24小時(shí)。
[0050]圖26顯示在氣管內(nèi)施用hEPO mRNA-承載的納米顆粒(測(cè)定的mIU) (C12-200、HGT5000或HGT5001-基脂質(zhì)納米顆粒；分別為制劑1、5、6)之后處理的小鼠的肺臟和血清中檢測(cè)的hEPO蛋白的基于ELISA的定量。施用之后6小時(shí)處死動(dòng)物(η = 4只動(dòng)物/組)。
[0051]示例性實(shí)施方案的描述
[0052]本發(fā)明提供將在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物中mRNA細(xì)胞內(nèi)遞送至一種或多種靶細(xì)胞以產(chǎn)生分泌的功能性蛋白的治療水平的組合物和方法。
[0053]如本文所使用的定性蛋白或酶的術(shù)語(yǔ)“功能性”是指蛋白或酶具有生理活性，或者可選地能夠進(jìn)行如天然或者正常功能的蛋白或酶的相同或者類似的功能。本發(fā)明的mRNA組合物用于治療各種代謝或遺傳疾病，特別是包括蛋白或酶的未表達(dá)、錯(cuò)誤表達(dá)或者缺陷的那些遺傳或者代謝疾病。術(shù)語(yǔ)“治療水平”是指在血液或組織中檢測(cè)的高于對(duì)照水平的蛋白水平，其中對(duì)照可以為正常生理水平，或者在施用mRNA組合物之前受試者的水平。術(shù)語(yǔ)“分泌的”是指在靶細(xì)胞外(細(xì)胞外空間)檢測(cè)的蛋白。在血液中或者在組織中可檢測(cè)到蛋白。在本發(fā)明的上下文中，以最廣意義使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生的”是指至少一種mRNA翻譯至蛋白或酶內(nèi)。如本文所提供，組合物包括轉(zhuǎn)移媒介物。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移媒介物”包括任意標(biāo)準(zhǔn)藥物載體、稀釋劑、賦形劑等，其通常旨在連同包括核酸的生物活性劑一起使用。組合物以及特別是本文描述的轉(zhuǎn)移媒介物能夠遞送mRNA至靶細(xì)胞。在實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移媒介物是脂質(zhì)納米顆粒。
[0054]mRNA
[0055]在本發(fā)明的組合物中mRNA可編碼例如分泌的激素、酶、受體、多肽、肽或者正常分泌的其他目標(biāo)蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，mRNA可任選具有化學(xué)或生物修飾，例如，其改善這些mRNA的穩(wěn)定性和/或半衰期或者其改善或者促進(jìn)蛋白產(chǎn)生。
[0056]本發(fā)明的方法提供任選共同遞送一種或多種獨(dú)特mRNA至靶細(xì)胞，例如，通過聯(lián)合兩種獨(dú)特mRNA至單獨(dú)的轉(zhuǎn)移媒介物內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可將治療性第一 mRNA和治療性第二 mRNA配制在單獨(dú)的轉(zhuǎn)移媒介物內(nèi)，并且施用。本發(fā)明也涵蓋共同遞送和/或共同施用治療性第一 mRNA和第二核酸以促進(jìn)和/或增強(qiáng)治療性第一 mRNA的功能或遞送。例如，這些第二核酸(例如，外源性或合成mRNA)可編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一旦表達(dá)(例如，外源性或者合成mRNA)便可促進(jìn)遞送或者增強(qiáng)第一 mRNA的生物活性?？蛇x地，可將治療性第一 mRNA與用作“陪伴分子”的第二核酸一起施用，例如以引導(dǎo)治療性第一mRNA的折疊。
[0057]本發(fā)明的方法也提供一種或多種治療核酸的遞送以治療單一病癥或者缺乏，其中這些治療核酸各自通過不同作用機(jī)制作用。例如，本發(fā)明的組合物可包含治療性第一 mRNA和緊隨其后的第二核酸，例如，施用該第一 mRNA以矯正內(nèi)源性蛋白或酶缺乏，施用該第二核酸以滅活或者“拆掉”功能不正常的內(nèi)源性核酸和它的蛋白或者酶產(chǎn)品。這些“第二”核酸可編碼諸如mRNA或者siRNA。
[0058]一旦轉(zhuǎn)染，在本發(fā)明的組合物中天然mRNA可衰變，其具有介于30分鐘和數(shù)天之間的半衰期。在本發(fā)明的組合物中mRNA優(yōu)選保留至少一些待翻譯的能力，從而產(chǎn)生功能性分泌的蛋白或者酶。因此，本發(fā)明提供包含穩(wěn)定的mRNA的組合物和施用穩(wěn)定的mRNA的方法。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，mRNA的活性延長(zhǎng)預(yù)期時(shí)間段。例如，mRNA的活性可延長(zhǎng)，使得將本發(fā)明的組合物以半周一次或者每周兩次向受試者施用，或者更優(yōu)選為每月一次、每月兩次、每季一次或者每年一次。本發(fā)明的mRNA的預(yù)期或延長(zhǎng)的活性與由這些mRNA產(chǎn)生的分泌功能性蛋白或酶的量直接相關(guān)。類似地，通過改善或增強(qiáng)mRNA的翻譯制備的修飾，本發(fā)明的組合物的活性可進(jìn)一步延伸或者延長(zhǎng)。而且，通過靶細(xì)胞產(chǎn)生的功能性蛋白或酶的量是遞送至靶細(xì)胞的 mRNA的量和這些mRNA的穩(wěn)定性的函數(shù)。鑒于本發(fā)明的mRNA的穩(wěn)定性可改善或增強(qiáng)的程度，產(chǎn)生的分泌的蛋白或者酶的活性和組合物的給藥頻率可進(jìn)一步延長(zhǎng)。
[0059]因此，在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物中mRNA包含至少一種修飾，其賦予對(duì)核酸的增加或者增強(qiáng)的穩(wěn)定性，包括例如，改善的對(duì)體內(nèi)核酸酶消化的抵抗。如本文所使用，如與本文提供的核酸相關(guān)的這些定義的術(shù)語(yǔ)“修飾”和“經(jīng)修飾”包括至少一種改變，其優(yōu)選增強(qiáng)穩(wěn)定性和導(dǎo)致mRNA比mRNA的野生型或者天然存在版本更加穩(wěn)定(例如，對(duì)核酸酶消化抵抗)。如本文所使用，如與本發(fā)明的核酸相關(guān)(并且特別是與mRNA相關(guān))的這些定義的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”和“穩(wěn)定性”是指增加或者增強(qiáng)對(duì)通過通常能夠降解這些mRNA的諸如核酸酶(即，核酸內(nèi)切酶或者核酸外切酶)的降解的抵抗。增加的穩(wěn)定性能夠包括例如對(duì)通過內(nèi)源性酶(例如，核酸內(nèi)切酶或者核酸外切酶)或在靶細(xì)胞或組織內(nèi)條件的水解或其他破壞敏感性降低，從而增加或者增長(zhǎng)在靶細(xì)胞、組織、受試者和/或細(xì)胞質(zhì)中這些mRNA的停留時(shí)間。本文提供的穩(wěn)定的mRNA分子證實(shí)相對(duì)于它們天然存在、未經(jīng)修飾的對(duì)應(yīng)物(例如，mRNA的野生型版本)具有更久的半衰期。通過如與本發(fā)明的mRNA相關(guān)的這些定義的術(shù)語(yǔ)“修飾”和“經(jīng)修飾”也涵蓋改善或者增強(qiáng)mRNA核酸的翻譯的改變，包括例如，并入在蛋白翻譯的起始中發(fā)揮作用的序列(例如，Kozac共有序列)(Kozak, M, Nucleic AcidsResl5(20):8125-48(1987))。
[0060]在一些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的mRNA進(jìn)行了化學(xué)或生物修飾以導(dǎo)致它們更加穩(wěn)定。對(duì)mRNA的示例性修飾包括堿基的耗竭(depletion)(例如,通過缺失或者通過一種核苷酸取代另一種)或者堿基的修飾，例如，堿基的化學(xué)修飾。如本文所使用的短語(yǔ)“化學(xué)修飾”包括引入不同于在天然存在的mRNA中所見到那些的化學(xué)物質(zhì)的修飾，例如，共價(jià)修飾，例如引入經(jīng)修飾的核苷酸(例如，核苷酸類似物，或者引入在這些mRNA分子中未天然發(fā)現(xiàn)的側(cè)基)。
[0061]此外，合適的修飾包括在密碼子的一種或多種核苷酸中改變，使得密碼子編碼相同氨基酸，但比在mRNA的野生型版本中發(fā)現(xiàn)的密碼子更加穩(wěn)定。例如，已經(jīng)證實(shí)RNA的穩(wěn)定性與更多數(shù)目的胞苷(C)和/或尿苷(U)殘基之間的相反關(guān)系，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺乏C和U 殘基的 RNA 對(duì)大部分 RNA 酶穩(wěn)定(Heidenreich，等人 J Biol Chem269，2131-8 (1994))。在一些實(shí)施方案中，在mRNA序列中C和/或U殘基的數(shù)目減少。在另一實(shí)施方案中，C和/或U殘基的數(shù)目通過編碼特定氨基酸的一種密碼子被編碼相同或者相關(guān)氨基酸的另一種密碼子取代來(lái)降低。
[0062]本發(fā)明的mRNA核酸涵蓋的修飾也包括并入假尿苷。將假尿苷并入本發(fā)明的mRNA核酸內(nèi)可增強(qiáng)穩(wěn)定性和翻譯能力、以及降低體內(nèi)免疫原性。參見，例如，Karik0, K.，等人，Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易得知的方法可進(jìn)行對(duì)本發(fā)明的mRNA的取代和修飾。
[0063]與非翻譯區(qū)相比，在mRNA的編碼區(qū)內(nèi)減少在序列中C和U殘基的數(shù)目的限制可能更大，(即，可能無(wú)法消除信使中存在的所有C和U殘基，但仍然保存信使編碼所需氨基酸序列的能力)。然而，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性呈現(xiàn)出使得在序列中存在的C和/或U殘基的數(shù)目可減少的機(jī)會(huì)，但保持相同編碼能力((即，取決于何種氨基酸通過密碼子編碼，可以有RNA序列的修飾的多種不同可能形式)。例如，Gly的密碼子能夠變?yōu)镚GA或者GGG，而不是GGU或者GGC。
[0064]術(shù)語(yǔ)修飾也包括例如并入非核苷酸連接或經(jīng)修飾的核苷酸至本發(fā)明的mRNA序列內(nèi)(例如，對(duì)編碼功能性分泌的蛋白或酶的mRNA分子的3'和5'端的一端或者兩端的修飾)。這些修飾包括加入堿基至mRNA序列(例如，并入聚A尾巴或者更長(zhǎng)的聚A尾巴)、3' UTR或5' UTR的改變、使mRNA與試劑(例如，蛋白或互補(bǔ)核酸分子)復(fù)合和并入改變mRNA分子的結(jié)構(gòu)的元件(例如，其形成二級(jí)結(jié)構(gòu))。
[0065]據(jù)認(rèn)為，聚A尾巴穩(wěn)定天然信使。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠?qū)㈤L(zhǎng)聚A尾巴加至mRNA分子,從而使得mRNA更加穩(wěn)定。使用各種本領(lǐng)域已知技術(shù)能夠加入聚A尾巴。例如，能夠?qū)㈤L(zhǎng)聚A尾巴加入以使用聚A聚合酶合成或者體外轉(zhuǎn)錄mRNA(Yokoe,等人NatureBiotechnology.19 96 ;14:1252-1256)。轉(zhuǎn)錄載體也能夠編碼長(zhǎng)聚A尾巴。此外，通過直接由PCR產(chǎn)品轉(zhuǎn)錄能夠加入聚A尾巴。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚A尾巴的長(zhǎng)度為至少約90、200、300、400、至少500個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)整聚A尾巴的長(zhǎng)度以控制本發(fā)明的修飾的mRNA分子的穩(wěn)定性，因而轉(zhuǎn)錄蛋白。例如，因?yàn)榫跘尾巴的長(zhǎng)度能夠影響mRNA分子的半衰期，所以能夠調(diào)整聚A尾巴的長(zhǎng)度以修飾mRNA抵抗核酸酶的水平，從而控制在細(xì)胞中蛋白表達(dá)的時(shí)程。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的mRNA分子充分抵抗體內(nèi)降解(例如，通過核酸酶)，從而可在沒有轉(zhuǎn)移媒介物下將它們遞送至靶細(xì)胞。
[0066]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過合并在野生型mRNA中未天然發(fā)現(xiàn)的:V和/或Y未經(jīng)翻譯(UTR)序列能夠修飾mRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠?qū)⑻烊慌詡?cè)連接mRNA和編碼第二、不相關(guān)蛋白的3'和/或5'旁側(cè)序列合并至編碼治療或功能性蛋白的mRNA分子的核苷酸序列內(nèi)，從而對(duì)它進(jìn)行修飾。例如，能夠?qū)⒎€(wěn)定的來(lái)自mRNA分子的Y或Y序列(例如，珠蛋白、肌動(dòng)蛋白、GAPDH、微管蛋白、組蛋白，或者檸檬酸循環(huán)酶)合并至正義mRNA核酸分子的3'和/或5'區(qū)，從而增加正義mRNA分子的穩(wěn)定性。參見，例如，US2003/0083272。
[0067]在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物中mRNA包括mRNA的5'端修飾，從而包括CMV即刻早期I(IEl)基因的部分序列，或其片段(例如，SEQ ID NO:1)以改善核酸酶抗性和/或延長(zhǎng)mRNA的半衰期。除了增加mRNA核酸序列的穩(wěn)定性之外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，包含CMV即刻早期I (IEl)基因的部分序列增強(qiáng)mRNA的翻譯和功能性蛋白或酶的表達(dá)。也涵蓋包含人生長(zhǎng)激素(hGH)基因序列的內(nèi)含物，或其片段(例如，SEQ ID NO:2)至核酸(例如，mRNA)的:V端，從而進(jìn)一步穩(wěn)定mRNA。通常，優(yōu)選的修飾相對(duì)于它們未經(jīng)修飾的對(duì)應(yīng)物改善mRNA的穩(wěn)定性和/或藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(例如，半衰期)，以及包括改善這些mRNA對(duì)體內(nèi)核酸酶消化抗性進(jìn)行的修飾。
[0068]進(jìn)一步涵蓋SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的核酸序列的變體，其中變體維持核酸的功能性質(zhì)，包括穩(wěn)定 大于90 %、大于95 %、大于98%，或者大于99%序列同一性。
[0069]在一些實(shí)施方案中，組合物能夠包含穩(wěn)定試劑。組合物能夠包括直接或間接結(jié)合、并穩(wěn)定mRNA的一種或多種制劑試劑，從而增加在靶細(xì)胞中停留時(shí)間。這些試劑優(yōu)選導(dǎo)致在革G細(xì)胞中mRNA的改善的半衰期。例如，通過合并“穩(wěn)定試劑”可增加mRNA的穩(wěn)定性和翻譯的效率，該“穩(wěn)定試劑”與在細(xì)胞中天然存在的mRNA形成復(fù)合物(參見，例如，美國(guó)專利N0.5，677，124)。
[0070]例如，通過合并聚A和蛋白以及在轉(zhuǎn)移媒介物內(nèi)在承載或包封mRNA之前待體外穩(wěn)定的mRNA能夠完成穩(wěn)定試劑的合并。示例性穩(wěn)定試劑包括一種或多種蛋白、肽、適體、翻譯輔助蛋白、mRNA結(jié)合蛋白和/或翻譯起動(dòng)因子。
[0071]通過使用調(diào)理作用抑制部分也可改善組合物的穩(wěn)定，該調(diào)理作用抑制部分通常為與轉(zhuǎn)移媒介物化學(xué)或物理結(jié)合的大的親水聚合物(例如，通過脂溶性錨嵌入膜自身內(nèi)，或者通過直接與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合)。這些調(diào)理作用抑制親水聚合物形成保護(hù)表面層，其顯著降低脂質(zhì)體通過巨噬細(xì)胞-單核細(xì)胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取(例如，如在美國(guó)專利N0.4，920，016中所述，其全部公開通過引用方式并入本文)。轉(zhuǎn)移媒介物經(jīng)調(diào)理作用抑制部分修飾，因此比它們未經(jīng)修飾的對(duì)應(yīng)物在循環(huán)中保留更長(zhǎng)些。
[0072]當(dāng)RNA與互補(bǔ)核酸分子(例如，DNA或RNA)雜交時(shí)，可使它避免核酸酶而受到保護(hù)(Krieg,等人 Melton.Methods in Enzymology.1987 ; 155，397-415))。雜交的 mRNA 的穩(wěn)定性是可能的，這是由于大部分RNA酶的固有單鏈特異性。在一些實(shí)施方案中，與mRNA復(fù)合選擇的穩(wěn)定試劑是真核蛋白(例如，哺乳動(dòng)物蛋白)。在又一實(shí)施方案中，通過與第二核酸分子雜交能夠修飾mRNA。如果全部mRNA分子與互補(bǔ)核酸分子雜交,則翻譯起始可減少。在一些實(shí)施方案中，mRNA分子的5'非翻譯區(qū)和AUG起始區(qū)可任選保留未被雜交。在翻譯起始之后，即使在高親和力雙鏈體上核蛋白體復(fù)合物的解旋活性能夠發(fā)揮作用，從而使得翻譯能夠進(jìn)行。(Liebhaber.J.Mol.Biol.1992 ；226:2-13 ;Monia 等人，J Biol Chem.1993 ；268:14514-22.)
[0073]應(yīng)理解，用于增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性的任意以上描述的方法可單獨(dú)使用或者聯(lián)合一種或多種任意其他上述方法和/或組合物使用。
[0074]本發(fā)明的mRNA可任選與報(bào)道基因(例如，mRNA的編碼區(qū)的上游或下游)結(jié)合，其例如促進(jìn)確定mRNA遞送至靶細(xì)胞或者組織。合適的報(bào)道基因可包括例如綠色熒光蛋白mRNA (GFP mRNA)、花蟲型熒光素酶mRNA (熒光素酶mRNA)、螢火蟲熒光素酶mRNA或其任意組合。例如，GFP mRNA可與編碼可分泌蛋白的mRNA融合,從而便于證實(shí)mRNA位于用作蛋白產(chǎn)生儲(chǔ)存庫(kù)的靶細(xì)胞中。
[0075]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“使轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)染”是指細(xì)胞內(nèi)引入mRNA至細(xì)胞內(nèi)，或者優(yōu)選至靶細(xì)胞內(nèi)。引入的mRNA可以穩(wěn)定地或者暫時(shí)維持在靶細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染效率”是指通過靶細(xì)胞吸收的經(jīng)過轉(zhuǎn)染的mRNA的量。在實(shí)踐中，在轉(zhuǎn)染之后，通過靶細(xì)胞表達(dá)的報(bào)道核酸產(chǎn)物的量來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。優(yōu)選實(shí)施方案包括具有高轉(zhuǎn)染效率的組合物，特別是最小化通過非靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 介導(dǎo)的副作用的那些組合物。證實(shí)高轉(zhuǎn)染效率的本發(fā)明的組合物改善合適劑量的mRNA遞送至靶細(xì)胞的可能性，同時(shí)最小化可能系統(tǒng)副作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移媒介物能夠遞送大的mRNA序列(例如，至少lkDa、l.5kDa、2kDa、
2.5kDa、5kDa、10kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa，或者更多的 mRNA)。使用一種或多種可接受試劑能夠配制mRNA，其提供遞送這些mRNA至靶細(xì)胞的媒介物。通常根據(jù)大量因素來(lái)選擇合適的試劑，其中，所述因素包括mRNA的生物或化學(xué)性質(zhì)、預(yù)期施用途徑、這些mRNA將暴露的期望生物環(huán)境以及預(yù)期靶細(xì)胞的具體性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，諸如脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移媒介物在未損害生物活性下包封mRNA。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于非靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)移媒介物證實(shí)優(yōu)選和/或大量結(jié)合靶細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移媒介物遞送它的內(nèi)容物至靶細(xì)胞，使得將mRNA遞送至合適的亞細(xì)胞區(qū)室，例如細(xì)胞質(zhì)。
[0076]轉(zhuǎn)移媒介物
[0077]在實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物中轉(zhuǎn)移媒介物是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物，例如，脂質(zhì)納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，可選擇和/或制備轉(zhuǎn)移媒介物以最佳化mRNA遞送至靶細(xì)胞。例如，如果靶細(xì)胞是肝細(xì)胞，則轉(zhuǎn)移媒介物的性質(zhì)(例如，尺寸、電荷和/或pH)可優(yōu)選有效地遞送這些轉(zhuǎn)移媒介物至靶細(xì)胞、降低免疫清除和/或促進(jìn)在該靶細(xì)胞中停留?？蛇x地，如果靶細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，用于治療神經(jīng)變性疾病施用的mRNA可特異性靶向腦或者脊髓組織)，則轉(zhuǎn)移媒介物的選擇和制備必須考慮到在血腦屏障內(nèi)滲透和保留和/或直接遞送這些轉(zhuǎn)移媒介物至這些靶細(xì)胞的可替代方式的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可與促進(jìn)外源性mRNA的轉(zhuǎn)移的試劑聯(lián)合使用(例如，干擾或改善血腦屏障的滲透性，從而增加外源性mRNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的試劑)。
[0078]通過本發(fā)明涵蓋脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物的使用以促進(jìn)核酸遞送至靶細(xì)胞。脂質(zhì)體(例如，脂質(zhì)體脂質(zhì)納米顆粒)通常用于研究、工業(yè)和醫(yī)學(xué)的各種應(yīng)用中，特別是它們用作體內(nèi)診斷或治療化合物的轉(zhuǎn)移媒介物(Lasic, Trends Biotechnol.,16 =307-321,1998 ；Drummond等人，Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999),以及它的特征通常在于通過一個(gè)或多個(gè)雙層的膜由外部介質(zhì)隔離的具有內(nèi)部水空間的極小囊泡。通常通過兩性分子形成脂質(zhì)體的雙層膜，例如包含空間隔離的親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域的合成或天然來(lái)源的脂質(zhì)(Lasic, Trends Biotechnol., 16:307-321,1998)。通過兩親性聚合物和表面活性劑(例如，聚合囊(polymerosome)、微囊(niosome)等)也能夠形成脂質(zhì)體的雙層膜。
[0079]在本發(fā)明的上下文中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物通常用于轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA至靶細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，制備含有所需核酸的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物。合并所需實(shí)體(例如，核酸)至脂質(zhì)體內(nèi)的過程通常稱為“承載”(Lasic，等人，F(xiàn)EBS Lett.,312:255-258,1992)。脂質(zhì)體合并的核酸可完全或者部分位于脂質(zhì)體的內(nèi)部空間中、在脂質(zhì)體的雙層膜內(nèi)，或者與脂質(zhì)體膜的外表面相締合。將核酸合并至脂質(zhì)體內(nèi)在本文中也稱為“包封”，其中核酸全部包含在脂質(zhì)體的內(nèi)部空間內(nèi)。合并mRNA至諸如脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移媒介物內(nèi)的目的通常是為了使核酸免受可含有酶或化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境，這些酶或化學(xué)物質(zhì)降解核酸和/或系統(tǒng)或?qū)е潞怂峥焖倥判沟氖荏w。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇的轉(zhuǎn)移媒介物能夠增強(qiáng)其中包含的mRNA的穩(wěn)定性。脂質(zhì)體能夠使得包封的mRNA到達(dá)靶細(xì)胞和/或可優(yōu)選使得包封的mRNA到達(dá)靶細(xì)胞，或者可選地限制這些mRNA遞送至其他位置或細(xì)胞，其中施用的mRNA的存在可無(wú)用或者為所需。而且，將mRNA并入諸如陽(yáng)離子陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移媒介物也促進(jìn)遞送這些mRNA至靶細(xì)胞內(nèi)。[0080]理想地，制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物以包封一個(gè)或多個(gè)所需mRNA，使得組合物證實(shí)具有高轉(zhuǎn)染效率和增強(qiáng)的穩(wěn)定性。盡管脂質(zhì)體能夠促進(jìn)引入核酸至靶細(xì)胞內(nèi)，但作為共聚物的多聚陽(yáng)離子(例如，聚L-賴氨酸和魚精蛋白)的加入能夠促進(jìn)、并在一些情況下體外和體內(nèi)顯著增加在大量細(xì)胞系中多種類型的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率2-28倍(參見N.J.Caplen 等人，Gene Ther.1995 ；2:603 ；S.Li，等人，Gene Ther.1997 ;4，891)。
[0081]脂質(zhì)納米顆粒
[0082]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，配制作為脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)移媒介物。如本文所使用，短語(yǔ)“脂質(zhì)納米顆?！笔侵赴环N或多種脂質(zhì)(例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和PEG-修飾的脂質(zhì))的轉(zhuǎn)移媒介物。優(yōu)選地，配制脂質(zhì)納米顆粒以遞送一個(gè)或多個(gè)mRNA至一種或多種靶細(xì)胞。合適的脂質(zhì)的顆粒包括例如磷脂?；衔?例如，磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)鞘脂類、腦苷脂類和神經(jīng)節(jié)苷脂)。也涵蓋使用作為轉(zhuǎn)移媒介物的聚合物，無(wú)論單獨(dú)或者與其他轉(zhuǎn)移媒介物聯(lián)合使用。合適的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸交酯共聚物、聚己內(nèi)酯、右旋糖酐、白蛋白、明膠、海藻酸、膠原、殼聚糖、環(huán)糊精、樹狀高分子和聚乙烯亞胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于它的能力來(lái)選擇轉(zhuǎn)移媒介物以便于mRNA轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞。
[0083]本發(fā)明涵蓋使用脂質(zhì)納米顆粒作為包含陽(yáng)離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移媒介物以包封和/或增加mRNA遞送至用作蛋白產(chǎn)生儲(chǔ)存庫(kù)的靶細(xì)胞內(nèi)。如本文所使用，短語(yǔ)“陽(yáng)離子脂質(zhì)”是指在諸如生理PH的選擇的pH下攜帶凈正電荷的任意數(shù)目的脂質(zhì)類型。通過包括不同比率的采用一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和PEG-修飾的脂質(zhì)的多組分脂質(zhì)混合物可制備涵蓋的脂質(zhì)納米顆粒。已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述多種陽(yáng)離子脂質(zhì)，其中許多均為市售。[0084]在本發(fā)明的組合物和方法中使用的特別合適的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括在通過引用方式并入本文的國(guó)際專利公開W02010/053572中描述的那些，以及最特別地，在W02010/053572的段落[00225]中描述的C12-200。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法采用包括在2012年3月29日提出美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/617，468(通過引用方式并入本文)中描述的可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米顆粒，例如，(15Z，18Z)-N，N-二甲基-6-(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基)二十四碳-15，18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z, 18Z) -N,N-二甲基-6- ((92，122)-十八-9，12-二烯-1-基)二十四碳 _4，15，18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z, 18Z)-N, N-二甲基-6-((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基)二十四碳-5，15，18-三烯-1-胺(HGT5002)。
[0085]在一些實(shí)施方案中，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨或者"DOTMA"。(Feigner 等人(Proc.Nat' I Acad.Sc1.84，7413 (1987);美國(guó)專利N0.4，897，355)。能夠單獨(dú)配制DOTMA或者能夠聯(lián)合中性脂質(zhì)、二油基磷脂酰基-乙醇胺或"DOPE"或者其他陽(yáng)離子或非陽(yáng)離子脂質(zhì)配制至脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移媒介物或脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)，并且這些脂質(zhì)體能夠用于增加核酸遞送至靶細(xì)胞內(nèi)。其他合適的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括例如5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基酰胺或者"DOGS" 2，3-二油基氧基-N-[2 (精胺-氨甲酰基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨或"DOSPA" (Behr 等人 Proc.Nat.' I Acad.Sc1.86，6982(1989);美國(guó)專利 N0.5，171，678 ;美國(guó)專利 N0.5，334，761) ; 1，2-二油?；?3-二甲基銨-丙烷或"D0DAP"、1，2_ 二油酰基-3-三甲基銨-丙烷或"D0TAP"。涵蓋的陽(yáng)離子脂質(zhì)也包括I，2-二硬脂?；趸?N，N-二甲基-3-氨基丙烷或"DSDMA"、1，2_ 二油基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷或"DODMA"、1，2-二亞油基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷或"DLinDMA"、1，2-二亞油?；趸?N，N-二甲基-3-氨基丙烷或"DLenDMA"、N_ 二油烯基-N，N-二甲基氯化銨或"DODAC "、N，N-二硬脂?；?N，N-二甲基溴化銨或"DDAB "、N-(I，2-雙肉豆蘧基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨或"DMRIE "、3-二甲基氨基-2-(膽留-5-烯-3-β -氧基丁烷-4-氧基)-1-(順式，順式_9，12-十八二稀氧基)丙烷或"CLinDM A " >2-[5 '-(膽留_5~稀-3- β_氧基)_3' _氧雜戍氧基)_3_ 二甲基-1-(順式,順式_9 ' , 1~2 ' _十八二稀氧基)丙烷或"CpLinDMA"、N,N-二甲基-3，4-二油基氧基芐胺或"DMOBA"、1，2-Ν，N' -二油基氨甲?；鵢3_ 二甲基氨基丙烷或"DOcarbDAP"、2，3-二亞麻?；趸?N，N-二甲基丙胺或"DLinDAP"、1，
2-Ν，N' -二亞油基氨甲?；?3-二甲基氨基丙烷或"DLincarbDAP"、1，2-二亞麻?；奔柞；?3-二甲基氨基丙烷或"DLinCDAP"、2，2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]- 二氧戍燒或"DLin-K-DMA" >2,2- 二亞油基-4- 二甲基氣基乙基-[I，3]_ 二氧戍燒或"DLin-K-XTC2-DMA"，和 2_(2，2_二 ((9Z, 12Z)-十八-9，12-二烯-1-基)-1，3-二氧戊環(huán)-4-基)-N，N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(參見，W02010/042877 ;SempIe 等人，NatureBiotech.28:172-176 (2010))，或其混合物。(Heyes, J.，等人，J Controlled Releasel07:276-287(2005) ；Morrissey, DV.，等人，Nat.Biotechnol.23 (8):1003-1007(2005) ;PCT 公開 W02005/121348A1)。
[0086]通過本發(fā)明也涵蓋膽固醇基陽(yáng)離子脂質(zhì)的使用。能夠單獨(dú)或者聯(lián)合其他陽(yáng)離子或者非陽(yáng)離子脂質(zhì)使用這些膽固醇基陽(yáng)離子脂質(zhì)。合適的膽固醇基陽(yáng)離子脂質(zhì)包括例如，DC-Chol (N, N-二甲基-N-乙基氨甲?；懝檀?、1，4_雙(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人 Biochem.Biophys.Res.Comm.179, 280 (1991) ；ffolf 等人 BioTechniques23,139 (1997);美國(guó)專利 N0.5，744，335)，或 ICE。
[0087]此外，由市售得到多種試劑以增加轉(zhuǎn)染效率。合適的例子包括LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)、LIPOFECTAMINE(DOSPA:D0PE) (Invitrogen)、LIP0FECTAMINE2000 (Invitrogen)、FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS)和 EFFECTENE。
[0088]也涵蓋陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如二烷基氨基-基、咪唑基、和胍基脂質(zhì)。例如，某些實(shí)施方案涉及包含一種或多種咪唑基陽(yáng)離子脂質(zhì)的組合物，例如，如通過以下結(jié)構(gòu)(I)表示的咪唑膽固醇酯或"ICE"脂質(zhì)(35，101?，131?，1710-10，13-二甲基-17-(00-6-甲基庚烷-2-基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17_ 十四氫-1H-環(huán)戊[a]菲-3-基
3-(1Η-咪唑-4-基)丙酸酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，遞送mRNA的轉(zhuǎn)移媒介物可包含一種或多種咪唑基陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如，如通過結(jié)構(gòu)⑴表示的咪唑膽固醇酯或"ICE"脂質(zhì)(3S，10R, 13R, 17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷 _2_ 基)-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯。
[0089]
【權(quán)利要求】
1.一種組合物，其包含(a)至少一種mRNA分子,所述mRNA分子的至少一部分編碼功能性分泌多肽；以及(b)包含脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)移媒介物。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述mRNA編碼在患有溶酶體沉積病的個(gè)體中異常缺乏的酶。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述mRNA編碼功能性紅細(xì)胞生成素或者功能性α -半乳糖苷酶多肽。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述RNA分子包含賦予所述RNA分子穩(wěn)定性的至少一種修飾。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述RNA分子包含所述RNA分子的5'非翻譯區(qū)的修飾。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述修飾包括Capl結(jié)構(gòu)的內(nèi)含物。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述RNA分子包含所述RNA分子的3'非翻譯區(qū)的修飾。
8.權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述修飾包括聚A尾巴的內(nèi)含物。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含促進(jìn)所述RNA分子轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的試劑。
10.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)。
11.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種PEG-修飾的脂質(zhì)。
13.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含C12-200。
14.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含DLinKC2DMA、CHOL、DOPE和DMG-PEG-2000。
15.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含C12-200、DOPE、CHOL和DMGPEG2K。
16.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含可切割的脂質(zhì)。
17.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是凍干的。
18.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是復(fù)溶的凍干組合物。
19.權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述靶細(xì)胞選自肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、β細(xì)胞、腦垂體細(xì)胞、滑膜襯里細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
20.一種治療患有功能性多肽缺乏的受試者的方法，其包括施用包含以下的組合物:(a)至少一種mRNA，所述mRNA的至少一部分編碼所述功能性分泌多肽；以及(b)包含脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)移媒介物，其中在施用所述組合物之后，所述mRNA表達(dá)在靶細(xì)胞中以產(chǎn)生所述功能性分泌多肽。
21.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述mRNA編碼功能性紅細(xì)胞生成素、α-半乳糖苷酶、LDL受體、因子II1、因子IX、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、肝素-N-硫酸酯酶、α -N-乙酰葡糖胺糖苷酶、半乳糖6-硫酸酯酶、β -半乳糖苷酶、溶酶體酸酯酶或者芳香基硫酸酯酶-A多肽；以及(b)轉(zhuǎn)移媒介物，其中在施用所述組合物之后，所述mRNA表達(dá)在靶細(xì)胞中以產(chǎn)生功能性分泌多肽。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述功能性分泌多肽是在患有溶酶體沉積病的個(gè)體中異常缺乏的酶。
23.權(quán)利要求21所述的方法,其中所述mRNA分子包含賦予所述mRNA分子穩(wěn)定性的至少一種修飾。
24.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述mRNA分子包含所述mRNA分子的Y非翻譯區(qū)的修飾。
25.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述修飾包含Capl結(jié)構(gòu)的內(nèi)含物。
26.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述mRNA分子包含所述mRNA分子的3^非翻譯區(qū)的修飾。
27.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述修飾包括聚A尾巴的內(nèi)含物。
28.權(quán)利要求21所述的方法，其進(jìn)一步包含促進(jìn)所述mRNA分子轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的試劑。
29.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)。
30.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)。
31.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種PEG-修飾的脂質(zhì)。
32.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含C12-200。
33.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含DLinKC2DMA、CHOL,DOPE和DMG-PEG-2000ο
34.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含C12-200、DOPE、CHOL和DMGPEG2K。
35.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含可切割的脂質(zhì)。
36.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物是凍干的。
37.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物是復(fù)溶的凍干組合物。
38.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述靶細(xì)胞選自肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、骨細(xì)胞、干細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、β細(xì)胞、腦垂體細(xì)胞、滑膜襯里細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、白細(xì)胞、粒細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
39.一種治療患有功能性多肽缺乏的受試者的方法，其包括施用包含以下的組合物:(a)至少一種mRNA，所述mRNA的至少一部分編碼所述功能性分泌多肽；以及(b)包含脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)移媒介物，其中在施用所述組合物之后，所述mRNA在靶細(xì)胞中被翻譯以在施用之后在所述靶細(xì)胞中產(chǎn)生至少最小治療水平的功能性多肽超過I小時(shí)。
40.一種在靶細(xì)胞中產(chǎn)生功能性分泌多肽的方法，其包括施用包含以下的組合物:(a)至少一種mRNA，所述mRNA的至少一部分編碼所述功能性分泌多肽；以及(b)包含脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)移媒介物，其 中在施用所述組合物之后，所述mRNA在靶細(xì)胞中被翻譯以在施用之后產(chǎn)生至少最小治療水平的功能性多肽超過I小時(shí)。
【文檔編號(hào)】A61K31/132GK103906527SQ201280036309
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月8日
【發(fā)明者】B·C·吉爾德, F·德羅莎, M·哈特萊因 申請(qǐng)人:夏爾人類遺傳性治療公司