專利名稱：基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向mri造影劑的制備方法
基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于核磁共振成像造影劑的制備領(lǐng)域，特別涉及一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法。
背景技術(shù)：
一直以來，惡性腫瘤都是危害人類生命的頭號殺手，具有死亡率高、難治療以及惡化迅速等特點(diǎn)。因此，腫瘤的早期診斷和特異性治療顯得尤為重要。目前，腫瘤的檢測手段各種各樣，主要有:超聲成像、CT成像、核醫(yī)學(xué)PET成像以及核磁共振成像(MRI)。隨著核磁共振技術(shù)的發(fā)展，其掃描時間逐漸縮短，分辨率逐漸提高，對于小病灶的檢測也更加準(zhǔn)確，這也使得核磁共振成像技術(shù)成為近幾年發(fā)展起來的新型疾病檢測手段。為了提高M(jìn)RI成像診斷的靈敏度和特異性，有必要選擇合適的MRI造影劑。常規(guī)的MRI造影劑主要分為兩類:一類是T1加權(quán)的MRI造影劑，一類是T2加權(quán)的MRI造影劑。T1加權(quán)的MRI造影劑主要是Gd基配合物，然而，Gd為重金屬元素，小分子Gd試劑在體內(nèi)停留時間過短，其臨床注射劑量較大，且Gd試劑具有很強(qiáng)的腎毒性，特別是對腎功能不全患者危害尤甚。而T2加權(quán)的MRI造影劑主要是超順磁Fe3O4為代表的金屬鐵氧化物納米粒子，超順磁性氧化鐵具有獨(dú)特的磁學(xué)性質(zhì)以及信號強(qiáng)、使用劑量低和好的生物相容性等特點(diǎn)使其成為核磁共振成像的良好造影劑。
作為生物體內(nèi)MRI造影劑，F(xiàn)e3O4納米顆粒必須具有良好的水溶性、穩(wěn)定性、生物相容性、和較高的T2弛豫率。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)是一種水溶性聚胺，其大分子鏈上擁有大量的氨基，不僅為磁性Fe3O4納米顆粒提供了穩(wěn)定存在的屏障，并且使納米Fe3O4顆粒表面帶上了正電荷和功能性基團(tuán)，這就為Fe3O4納米顆粒的表面多功能修飾提供了可行性(Cai et al., ACS Appl.Mater.1nterfaces2013, DO1:10.1021/am302883m;專利公開號 201210277624.9)。聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)是高親水性聚合物，它對納米顆粒的修飾可以提高納米顆粒的水溶性和生物相容性，并延長其在體內(nèi)的血液循環(huán)時間(Peng et al., Biomaterials2012, 33, 1107-1119 ；ffen et al., Biomaterials2013, 34, 1570-1580)。葉酸作為一種靶向分子，具有分子量小、無毒、無免疫原性、生物相容性好、穩(wěn)定性高、廉價易得、易于修飾等多種優(yōu)勢(Shi et al., AdvancedMaterials2008, 20，1671-1678)`。本課題組前期的專利(專利公開號201210277624.9)成果顯示聚乙烯亞胺(PEI)修飾的磁性氧化鐵納米顆?？梢酝ㄟ^簡易的水熱法合成。本發(fā)明采用相同的方法合成了具有良好膠體穩(wěn)定性的PEI包覆的Fe3O4納米顆粒。隨后，F(xiàn)e3O4納米顆粒表面的PEG-FA修飾不僅增加了納米顆粒的水溶性和生物相容性，為進(jìn)一步的體內(nèi)成像應(yīng)用提供了保障；同時也提高了 Fe3O4納米顆粒對腫瘤細(xì)胞或腫瘤部位的靶向性，從而使核磁共振成像診斷更加準(zhǔn)確、靈敏。
檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于用一步水熱合成法制備PEI包覆和FA修飾的Fe3O4納米顆粒及其用于體內(nèi)腫瘤模型靶向MRI研究的相關(guān)報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，該方法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，成本較低。制備的Fe3O4磁性納米顆粒能夠長時間穩(wěn)定分散于水溶液中，不會出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。所用的修飾劑PEI為廉價和環(huán)境友好材料，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。
本發(fā)明的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括:(I)將亞鐵鹽溶解于超純水中，加入NH3 -H2O并于空氣氣氛下攪拌10 20分鐘，然后將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，并將0.lg/mL的超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液也加入到高壓反應(yīng)釜中，攪拌混合均勻后，于130 140°C反應(yīng)2 4小時；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將沉淀磁分離洗滌純化后，即得PEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe3O4-PEI,產(chǎn)物儲存于4°C備用，取3mL真空冷凍干燥，干燥產(chǎn)物儲存于_20°C ；
(2 )將FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2 4h，然后逐滴加入到NH2-PEg-COOH的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)2 4天，透析(用截留分子量為1000的透析袋對蒸餾水透析三天(6次，2L/次))，除去副產(chǎn)物和雜質(zhì)，然后真空冷凍干燥，即得C00H-PEG-FA，儲存在_20°C備用；
(3)將步驟(I)中制備的Fe3O4-PEI納米顆粒用DMSO洗滌后，重新分散于DMSO中，再將DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)I 3天后，產(chǎn)物Fe3O4-PE1-FI分離洗滌，然后分散到DMSO中，并儲存在4°C備用；
(4)步驟(2 )中制備的C00H-PEG-FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，攪拌活化2 4h ;然后將活化的C00H-PEG-FA溶液加入到步驟(3)制備的Fe3O4-PE1-FI溶液中，攪拌反應(yīng)2 4天，再分離洗滌，并分散于超純水中，得到Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液，并儲存在4 °C備用；
(5)向步驟(4)制備的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液中加入三乙胺，并攪拌20 40分鐘；然后向上述溶液中加入乙酸酐，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20 30小時；分離洗滌并分散于超純水中，即制得乙?；漠a(chǎn)物Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒，取ImL真空冷凍干燥后儲存于-20°C，余下4mL儲存于4°C備用。
所述步驟(I)中的亞鐵鹽為FeCl2.4H20，亞鐵鹽、超純水、NH3.H2O的配比為I 1.5g:7.5 8.0mL:6. 0 6.5mL,優(yōu)選1.25g:7.75mL:6.25mL ;亞鐵鹽與超支化聚乙烯亞胺PEI質(zhì)量比為2 3:1，優(yōu)選2.5:1。
所述步驟(I)中的NH3.H2O質(zhì)量百分比濃度為25-28%。
所述步驟(I)中的超支化聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000。
所述步驟(2)中FA、EDC和NHS的摩爾比為1:0.5 1:0.5 1，優(yōu)選1:0.9:0.9,FA和NH2-PEg-COOH的摩爾比為I 3:1，優(yōu)選2:1。
所述步驟(2)中NH2-PEg-COOH的分子量為2000。
所述步驟(3)中FI與Fe3O4-PEI表面氨基的摩爾比為1:45 55，優(yōu)選1:50。
所述步驟(4)中的C00H-PEG-FA與EDC、NHS的摩爾比為1:4 6:4 6，優(yōu)選1:5:5ο
所述步驟(4)中的C00H-PEG-FA與Fe3O4納米顆粒表面氨基的摩爾比為1:4 6，優(yōu)選1:5。
所述步驟(5)中的三乙胺、乙酸酐與Fe3O4納米顆粒表面的PEI上伯氨基摩爾比為4 6:4 6:1,優(yōu)選 5:5:1。
本發(fā)明先利用一步水熱法合成PEI包裹的Fe3O4磁性納米顆粒，然后將FI和PEG-FA先后修飾在納米顆粒的表面，最后對納米顆粒的剩余表面氨基進(jìn)行乙酰化修飾。
本發(fā)明操作簡便易行，原材料成本低。制備的納米顆粒具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和生物相容性。與沒有葉酸修飾的對照材料相比，葉酸修飾的Fe3O4納米顆粒對腫瘤細(xì)胞或腫瘤部位具有更高的靶向性。該方法制備的葉酸靶向性Fe3O4納米顆粒在MRI分子影像診斷領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用。
本發(fā)明使用X-射線衍射(XRD)、核磁共振波譜(1H NMR)、紫外可見吸收光譜(UV-Vis)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、Zeta電勢及動態(tài)光散射和透射電子顯微鏡( Μ)等方法表征制備的磁性納米顆粒，并通過磁共振成像儀測定納米顆粒的T2弛豫性能，然后利用溶血實(shí)驗(yàn)、MTT法和相差顯微鏡評價納米顆粒的血液相容性和細(xì)胞毒性，再利用流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微成像以及體外和體內(nèi)核磁共振成像實(shí)驗(yàn)檢測葉酸修飾的納米材料對腫瘤細(xì)胞的靶向診斷效果。具體測試結(jié)果如下:
(I)X-射線衍射(XRD )測試結(jié)果
通過對比和分析X-射線衍射圖譜(如圖1),水熱法合成的材料和Fe3O4的圖譜(ICSD20-596) 一致，表明PEI修飾的Fe·3O4晶體結(jié)構(gòu)為四氧化三鐵。
(2)核磁共振分析(1H NMR)的測試結(jié)果
通過對比NH2-PEG-C00H、FA和C00H-PEG-FA三者在氘代DMSO中的氫譜譜峰(如圖2)可知，C00H-PEG-FA在6-9ppm出現(xiàn)的譜峰證明FA已經(jīng)成功連接到PEG上，并通過積分峰面積計算可知，每一個PEG上連接了 0.7個FA。
(3)紫外吸收(UV-Vis)測試結(jié)果
圖3 所示為 Fe3O4-PE1-FI (圖 3a)、FI (圖 3b)和 Fe3O4-PEI (圖 3c)在 300 到800nm的紫外吸收圖譜。從圖中我們可以看出，F(xiàn)e3O4-PEI在400到800nm處沒有明顯的紫外吸收峰，而Fe3O4-PE1-FI在510nm處有一個明顯的紫外吸收峰，從而說明FI成功修飾到Fe3O4-PEI納米顆粒表面。
(4)熱重分析(TGA)測試結(jié)果
為了檢測⑶OH-PEG-FA和對照組中mPEG_C00H在Fe3O4納米顆粒表面的上載量，我們對修飾前后的納米顆粒進(jìn)行了 TGA測試。由圖4可以看出，修飾前納米顆粒的失重量為8.97% (圖4a)，按PEI表面氨基與PEG摩爾比例5:1修飾后，F(xiàn)e3O4-PE1-F1-PEG-FA和對照材料Fe3O4-PE1-FIiiPEG的失重分別是13.23% (圖4b)和14.16% (圖4c);經(jīng)過計算，C00H-PEG-FA和mPEG-COOH的上載率分別為4.26%和5.19%,由此表明C00H-PEG-FA和mPEG-COOH已成功連接到Fe3O4納米顆粒的表面。
(5)納米顆粒Zeta電勢及動態(tài)水力徑測試結(jié)果
納米顆粒表面的大量氨基會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而限制了納米顆粒在生物體內(nèi)的應(yīng)用。所以，我們通過對Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA和對照材料Fe304-PEI_F1-mPEG表面氨基進(jìn)行乙酰化修飾，降低其表面電勢，從而改善納米顆粒的生物相容性。電勢測定結(jié)果(表I)表明，由于大量表面氨基的存在，F(xiàn)e3O4-PE1-F1-PEG-FA和Fe304-PEI_F1-mPEG納米顆粒的表面電勢分別達(dá)到了 +31.01^和+31.511^。經(jīng)過乙?；磻?yīng)之后，得到乙?；腇e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 納米顆粒表面電勢分別降到了 +16.3mV和+16.4mV。結(jié)果顯示，納米顆粒的表面氨基已成功乙?；５?，乙酰化后納米顆粒的表面電勢未達(dá)到中性，這可能是因?yàn)楸砻娌糠钟脕矸€(wěn)定Fe3O4納米顆粒的氨基不能進(jìn)行乙酰化反應(yīng)。乙酰化前后，這些納米顆粒的水動力直徑的測試結(jié)果同樣如表I所示，乙?；蠹{米顆粒的水動力直徑較乙?；奥晕p小，并且制備的納米顆粒的水動力直徑能長時間保持幾乎不變，從而說明了制備的納米顆粒具有良好的膠體穩(wěn)定性。
(6)透射電子顯微鏡(TEM)測試結(jié)果
通過TEM觀察本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和對照組材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒的形態(tài)和粒徑(如圖5所示)。TEM測試結(jié)果顯示Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和對照材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG納米顆粒的形貌均是球形或準(zhǔn)球形。通過分別隨機(jī)測量300個納米顆粒的直徑計算得到制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和對照材料Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG納米顆粒的直徑分別是15.0nm和15.3nm。
(7) T2弛豫率測量結(jié)果
Fe3O4納米材料可以用作核磁共振成像的陰性造影劑，隨著Fe濃度的增加，MRI信號強(qiáng)度逐漸減弱。弛豫率(r2)反映Fe3O4納米粒子作為MRI造影劑的效率，為單位摩爾濃度鐵的橫向弛豫時間，可通過不同濃度下的弛豫時間(T2)的倒數(shù)擬合計算得到。圖6為本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的T2弛豫時間倒數(shù)與Fe濃度的線性擬合圖，可以看出這兩種Fe3O4納米材料的弛豫時間倒數(shù)隨著鐵濃度的增加(在0-0.04mM濃度范圍內(nèi))具有很好的線性關(guān)系。并且通過計算可得本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和對照材料Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG的弛豫率分別達(dá)到了99.64ι Μ 和107.30mM-1s-1、人因此，本發(fā)明所制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG均可作為MRI分子影像學(xué)診斷中的優(yōu)良T2信號衰減造影劑。
(8)血液相容性
具有良好的血液相容性對納米顆粒的體內(nèi)應(yīng)用來說是至關(guān)重要的，因此本實(shí)驗(yàn)評估了本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的血液相容性。圖 7 中顯示了 Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG (圖 7a)和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA(圖7b)在不同濃度(50、100、200、400μ8/πιυ下的溶血性測試結(jié)果。通過對上層清液的吸光光譜進(jìn)行測量來定量評價納米材料的溶血性。如圖7a和7b右上角紫外圖譜顯示，在濃度達(dá)到 400μ g/mL 時，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 的溶血率都小于5%，說明制備的這些納米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物體內(nèi)MRI成像。
(9) MTT細(xì)胞活力和相差顯微鏡測試結(jié)果
通過MTT比色法測定KB細(xì)胞(一種人類上皮癌的細(xì)胞株)的活力來檢測本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的細(xì)胞毒性(如圖 8)。KB 細(xì)胞分別與 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(濃度為10、25、50、75和100 μ g/mL)在37 °C下共培養(yǎng)24小時。然后，經(jīng)MTT處理后在570nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計算細(xì)胞的活力。不同濃度的材料對細(xì)胞增殖的影響以緩沖液PBS處理的細(xì)胞為對照進(jìn)行比較。與PBS對照組相比，F(xiàn)e304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA在實(shí)驗(yàn)濃度O到100 μ g/mL范圍內(nèi)對KB細(xì)胞的存活率沒有顯著性差異，細(xì)胞存活率均在80%以上。這充分說明Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA具有良好的生物相容性，可以應(yīng)用到生物體內(nèi)MRI成像診斷。我們通過相差顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證材料對細(xì)胞的毒性。如圖9所示，不同濃度的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米材料(10、25、50、75 和 100 μ g/mL)處理24小時后的細(xì)胞形態(tài)和PBS處理的細(xì)胞相比，沒有明顯的變化，進(jìn)一步說明了合成材料的良好生物相容。
(10)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果
通過流式細(xì)胞儀檢測KB細(xì)胞對本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG在不同濃度下的吞噬量(如圖10)和處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(如圖11)來檢測葉酸靶向性效果。KB細(xì)胞分別與Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (Fe 濃度為 0.125,0.25,0.5,0.75、1.0、1.25 和 1.5mM)在 37°C下共培養(yǎng)4小時，并且以PBS處理的細(xì)胞作為對照組。然后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的吞噬情況和細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。在圖10中，和對照組相比，隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的吞噬量稍微增加，并且在Fe濃度達(dá)到1.0mM時，吞噬量幾乎不再增力口。但是隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的吞噬量卻一直明顯增加。同樣在圖11中，隨著Fe濃度的增加，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著增加，而Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度增加不明顯。這些結(jié)果說明葉酸的修飾賦予了納米顆粒對KB細(xì)胞的特異靶向能力。
(11)共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果
葉酸的靶向性同樣通過共聚焦顯微鏡來驗(yàn)證，如圖12所示，KB細(xì)胞分別與PBS、本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG (Fe濃度為0.3)在37°C下共培養(yǎng)4小時，然后在油鏡下觀察細(xì)胞吞噬納米顆粒后的熒光信號。在圖12中，經(jīng)過PBS處理的細(xì)胞內(nèi)沒有熒光，F(xiàn)e304-PE1-Ac-F1-mPEG處理的細(xì)胞內(nèi)顯示出比較微弱的熒光信號，而Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA處理的細(xì)胞內(nèi)顯示出很強(qiáng)的熒光信號，這進(jìn)一步說明葉酸修飾的納米顆粒對KB細(xì)胞有更好的祀向性,從而為該材料成功高效地應(yīng)用到體內(nèi)MRI成像提供了可靠的依據(jù)。
(12)體外細(xì)胞MRI成像結(jié)果
在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，我們評價了本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的細(xì)胞MRI成像效果(如圖13所示)，KB細(xì)胞分別與 Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(Fe 濃度為 0.1、0.2、0.4和0.8mM)在37°C下共培養(yǎng)6小時，并且以PBS處理的細(xì)胞作為對照組。在圖13a中，隨著 Fe 濃度的增加，F(xiàn)e304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒處理后的細(xì)胞均表現(xiàn)出MRI信號衰減的趨勢，說明隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對納米顆粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe濃度下，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后的細(xì)胞比對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG處理后細(xì)胞的MRI信號降低更明顯，說明細(xì)胞對Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的吞噬量要大大高于Fe304- PEI_Ac-F1-mPEG納米顆粒。圖13b是細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的納米顆粒處理后的MRI成像信號值，從圖中明顯看出，隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞的MRI信號值均逐漸減少，而且在相同的Fe濃度下，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后細(xì)胞的MRI信號值要明顯低于對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒處理后的細(xì)胞。這些結(jié)果不僅說明制備的納米顆粒具有很好的細(xì)胞MRI成像效果，而且證明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒對KB細(xì)胞的特異靶向性。
(13)體內(nèi)腫瘤MRI成像結(jié)果
通過尾靜脈注射本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照組材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG來評價腫瘤部位的MRI成像效果(如圖14所示)，與注射前的對照組相比較，在注射后30分鐘到4小時內(nèi)，注射對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (Fe:500 μ g)的小鼠腫瘤部位稍微變暗，而注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500yg)的小鼠腫瘤明顯變暗，展示出葉酸修飾的納米顆粒具有明顯的MRI腫瘤診斷效果。在注射后24小時，兩個實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤部位明暗程度都逐漸恢復(fù)，說明此時納米材料隨著血液流通從腫瘤部位逐漸代謝出去(圖14a)。圖14b 是相應(yīng)注射時間的腫瘤MRI信號值變化，在注射后30分鐘到4小時，注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的小鼠腫瘤MRI信號值變化不明顯，而注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA的小鼠腫瘤MRI信號值明顯降低，在注射后24小時，兩個實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤部位MRI信號值均有所增加，這與圖14a的結(jié)果一致。這些結(jié)果說明本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒具有很好的腫瘤靶向能力，能成功應(yīng)用于體內(nèi)靶向MRI腫瘤成像診斷的造影劑。
( 14)體內(nèi)組織分布結(jié)果
為了研究納米顆粒的生物組織分布情況，ICP-AES用來測量在注射后24小時各個重要器官中鐵的含量(圖15)。從圖中可看出在注射對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500yg)納米顆粒后，肝、脾和肺中鐵的含量較注射前均明顯增加，而在其他的器官，比如:心、腎和腫瘤，鐵的聚集較少。同時需要指出的是，注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的小鼠腫瘤部位鐵的含量明顯高于注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒的情況。這些結(jié)果不僅證明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA對腫瘤部位具有很好的靶向性，而且說明本發(fā)明制備的納米顆粒能在小鼠體內(nèi)正常的代謝清除。
有益.效果
(I)本發(fā)明采用簡單的“一步”水熱法制備水溶性良好的PEI包覆的Fe3O4納米顆粒，然后在納米顆粒表面先后連接FI和PEG-FA分子，最后對納米顆粒的表面氨基進(jìn)行乙酰化修飾得到用于MRI造影劑的Fe3O4納米顆粒；此法操作工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離，所用均為廉價的和環(huán)境友好的材料，具有實(shí)施商業(yè)化的前景；
(2)本發(fā)明制備的Fe3O4納米顆粒能夠長時間地穩(wěn)定分散于水溶液中，沒有出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象；PEI的包覆增加了 Fe3O4納米顆粒的穩(wěn)定性，PEG-FA的表面修飾不僅增加了 Fe3O4納米顆粒的生物相容性和親水性，而且賦予納米顆粒對腫瘤細(xì)胞或者腫瘤部位的靶向特異性；這些優(yōu)點(diǎn)使制備的葉酸靶向性Fe3O4納米顆粒可以有效地用作體內(nèi)MRI成像的陰性造影劑。


圖1是本發(fā)明制備的Fe3O4-PEI的X-射線衍射圖2 是 FA (a)、NH2-PEG-C00H (b)和 COOH-PEG-FA (c)在氘代 DMSO 中的核磁共振氫譜譜圖3是本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-FI (a)、FI (b)和Fe3O4-PEI (C)的紫外吸收圖-1'Tfe1曰；
圖4 是本發(fā)明制備的 Fe3O4-PE1-FI (a)、Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA (b)和對照材料Fe304-PE1-F1-mPEG (c)的熱重分析圖5是對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (a, b)和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (c，d)的透射電鏡圖片和尺寸分布直方圖6 是對照材料 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和本發(fā)明制備的 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的T2弛豫時間倒數(shù)與Fe濃度的線性關(guān)系圖7是對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (a)和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (b)納米顆粒的溶血實(shí)驗(yàn)紫外圖譜，右上角插圖顯示的是圖中放大的紫外吸收圖譜，右下角插圖從左到右依次是水、PBS、50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL和400 μ g/mL納米顆粒處理2小時并離心后的人血紅細(xì)胞圖片；
圖8是MTT法測試的KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照)、對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(濃度范圍在0-100 μ g/mL)處理24小時后的細(xì)胞活力；
圖9是KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照，a, g)、對照材料Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG(b: 10 μ g/mL, c:25 μ g/mL, d:50 μ g/mL, e:75 μ g/mL, f: 100 μ g/mL)和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(h: 10 μ g/mL, 1: 25 μ g/mL, j: 50 μ g/mL, k: 75 μ g/mL,1:100 μ g/mL)處理24小時后的細(xì)胞形態(tài)；
圖10是KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照，a, i)、對照材料Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG(Fe 濃度范圍 b:0.125，c:0.25，d:0.5，e:0.75，f:l.0，g:l.25 和 h:l.5mM)和本發(fā)明制備的 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納 米顆粒(Fe 濃度范圍 j:0.125，k:0.25，1:0.5,m:0.75, η: 1.0,ο:1.25和ρ:1.5mM)處理4小時后流式細(xì)胞分析圖11是KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液、對照材料Fe304-PE1-Ac_F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe濃度范圍在0.125-1.5mM)處理4小時后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；
圖12是KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照，a_d)、對照材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG(e-h)和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(i_l) (Fe濃度為0.3mM)處理4小時后細(xì)胞的共聚焦顯微成像圖片；
圖13是KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液、對照材料Fe3O4-PE I _Ac_F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe濃度范圍在0.1-0.8mM)處理6小時后的細(xì)胞T2MRI成像圖片(a)和相應(yīng)的MRI信號值變化(b)；
圖14是尾靜脈注射對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe:500 μ g)后不同時間點(diǎn)小鼠腫瘤的T2MRI成像圖片Ca)和相應(yīng)的MRI信號值變化(b)；
圖15是尾靜脈注射對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(Fe:500 μ g)后24小時，F(xiàn)e元素在小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、腎、和腫瘤)的組織分布。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1
將1.25g FeCl2.4H20倒入燒杯中，加入7.75mL的超純水，溫和攪拌下，加入6.25mLNH3.H2O,將上述混合液在空氣氣氛下連續(xù)攪拌10分鐘，使二價鐵充分被氧化，接著將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中。將0.5g PEI超聲溶解于5mL水溶液中，用移液槍將其轉(zhuǎn)入反應(yīng)釜中，與反應(yīng)釜中溶液充分混勻，于134°C反應(yīng)3小時。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將所得到的黑色沉淀Fe3O4-PEI磁分離除去上清液，再加適量超純水超聲分散，再磁分離，如此重復(fù)超純水洗滌五次，以除去雜質(zhì)，然后重新分散于20mL超純水中，即得PEI包覆的Fe3O4納米顆粒(Fe3O4-PEI )。取3mL納米顆粒溶液，真空冷凍干燥用于X-射線衍射檢測。XRD結(jié)果顯示了 Fe3O4-PEI納米顆粒的晶體結(jié)構(gòu)為四氧化三鐵(見附圖1)。
實(shí)施例2
取17.65mg FA,6.90mg EDC 和 4.14mg NHS 于一反應(yīng)瓶中，加入 5mL DMSO 使其完全溶解，并攪拌活化3h。取40mg NH2-PEg-COOH溶解于5mL DMSO中。然后將上述活化的溶液(5mL)逐滴加入到NH2-PEg-COOH的DMSO溶液(5mL)中，攪拌反應(yīng)三天。用截留分子量為1000的透析袋對蒸餾水透析三天(6次，2L/次)，除去副產(chǎn)物和雜質(zhì)，將產(chǎn)物C00H-PEG-FA冷凍干燥后儲存在_20°C備用；
FA、NH2-PEg-COOH和合成的C00H-PEG-FA的核磁氫譜分析如圖2所示，C00H-PEG-FA在6-9ppm出現(xiàn)的譜峰說明FA已經(jīng)成功連接到PEG上。通過積分峰面積計算可知，每一個PEG上連接了 0.7個FA。
實(shí)施例3
取實(shí)施例1制備的Fe3O4-PEI水溶液6.24mL(30mg)用DMSO洗三次，再將Fe3O4-PEI重新分散于6mL DMSO中，然后將溶解在2mL DMSO中的FI (0.84mg)溶液逐滴加入到上述6mL Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)一天后，磁分離除去上清液，再加適量超純水超聲分散，再磁分離，如此重復(fù)純水洗滌`3次，以除去雜質(zhì)，然后重新分散于IOmL DMSO中，即得到產(chǎn)物 Fe3O4-PE1-F10 分別取 25 μ L Fe3O4-PEI (實(shí)施例 1)、FI 和 Fe3O4-PE1-FI (實(shí)施例 3)的DMSO溶液于2mL離心管中，再向其中加700 μ L超純水，超聲均勻，測紫外吸收(見附圖3)。紫外可見光譜測試結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4-PEI在400到800nm處沒有明顯的紫外吸收峰，而Fe3O4-PE1-FI在510nm處有一個明顯的紫外吸收峰，從而說明FI成功修飾到Fe3O4-PEI納米顆粒表面。
實(shí)施例4
取12.39mg 實(shí)施例 2 制備的 C00H-PEG_FA、5.18mg EDC 和 3.1lmg NHS 分別溶于2mLDMS0,并將溶液混合后攪拌活化3h。然后將活化的C00H-PEG-FA溶液(6mL)逐滴加入到5mL實(shí)施例3制備的Fe3O4-PE1-FI溶液中，攪拌反應(yīng)三天，再用超純水磁分離洗滌3次，產(chǎn)物Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA重新分散于5mL超純水中，并取0.5mL真空冷凍干燥，同時取對照材料Fe304-PE1-F1-mPEG (對比例 1)0.5mL 和 Fe3O4-PE1-FI (實(shí)施例 3)0.5mL 真空冷凍干燥，然后對三種材料進(jìn)行熱重分析(如圖4所示XTG測試結(jié)果表明，修飾前Fe3O4-PE1-FI納米顆粒的失重量為8.97%(圖4a)，按PEI表面氨基與PEG摩爾比例5:1修飾后，F(xiàn)e3O4-PE1-F1-PEG-FA和對照材料Fe3O4-PE1-FIiiPEG的失重分別是13.23% (圖4b)和14.16% (圖4c);經(jīng)過計算，C00H-PEG-FA和mPEG-COOH的上載率分別為4.26%和5.19%,由此表明C00H-PEG-FA和mPEG-COOH已成功連接到Fe3O4納米顆粒的表面。
實(shí)施例5
向?qū)嵤├?制備的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液(4mL)中加入18 μ L三乙胺(密度為0.726 0.729g/mL,濃度為99.0%)，并攪拌30分鐘。然后向上述溶液中逐滴加入12.2μ L乙酸酐(密度為1.08g/mL，濃度為98.5%)(三乙胺、乙酸酐與Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA的表面氨基摩爾比=5:5:1 )，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24小時。產(chǎn)物用超純水磁分離洗滌3次，并重新分散到5mL超純水中，即制得乙?；腇e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒。取本發(fā)明制備的 Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA (實(shí)施例 4)、Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (實(shí)施例 5)及對比例 I 中的對照材料 Fe304-PE1-F1-mPEG和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 各 0.lmL，然后用超純水分別配制成1.5mL的水溶液用于測表面電勢和水動力直徑(如表I)。電勢測定結(jié)果表明，由于大量表面氨基的存在，F(xiàn)e3O4-PE1-F1-PEG-FA和Fe3O4-PE1-FIiiPEG的表面電勢分別達(dá)到了 +31.0mV和+31.5mV。經(jīng)過乙?；磻?yīng)之后，得到的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒表面電勢分別降到了 +16.3mV和+16.4mV。結(jié)果顯示，納米顆粒的表面氨基已成功乙?；?。但是，乙?；蠹{米顆粒的表面電勢未達(dá)到中性，這可能是因?yàn)楸砻娴牟糠钟脕矸€(wěn)定四氧化三鐵納米顆粒的氨基不能進(jìn)行乙酰化反應(yīng)。乙酰化前后，納米顆粒的水動力直徑的測試結(jié)果同樣如表I所示，乙?；蠹{米顆粒的水動力直徑較乙?；奥晕⒆冃?，并且納米顆粒的水動力直徑能長時間保持幾乎不變，從而說明了制備的納米顆粒具有良好的膠體穩(wěn)定性。
實(shí)施例6
分別取乙酰化后的對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (對比例I)和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (實(shí)施例5)納米顆粒水溶液各5 μ L，然后用超純水配制成100 μ L的納米顆粒懸浮液。分別取配制的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒懸浮液各5μ L滴 在銅網(wǎng)表面，并在空氣中晾干后用于TEM測試(如圖5所示)。TEM結(jié)果顯示Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的形貌均為球形或準(zhǔn)球形。通過分別隨機(jī)測量300個納米顆粒的直徑計算得到Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒的直徑分別是15.0nm和15.3nm。
實(shí)施例7
將本發(fā)明制備的Fe304-pE1-Ac-F1-pEG-FA (實(shí)施例5 )納米顆粒和對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (對比例I)通過ICP-AES測試法測得溶液中Fe元素的濃度，再在EP管中用超純水配制Fe濃度依次為0.0025,0.005,0.01,0.02和0.04mM的水溶液2mL，通過T2磁共振成像測定材料在不同的Fe濃度下的T2弛豫效應(yīng)(如圖6所示)。弛豫率測試結(jié)果表明 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG 納米顆粒的 T2 弛豫時間倒數(shù)在 Fe濃度為0.0025-0.04mM范圍內(nèi)隨著鐵濃度的增加具有很好的線性關(guān)系。并且通過計算可知Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (99.64ι Μ )和 Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG (107.30ι Μ 都具有良好的T2弛豫效應(yīng)和r2弛豫率。因此，本發(fā)明所制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG均可作為MRI分子影像學(xué)診斷中的優(yōu)良T2信號衰減造影劑。
實(shí)施例8
為了使制備的納米顆粒能安全地用于體內(nèi)生物成像診斷，本實(shí)驗(yàn)評價了制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照材料Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的血液相容性。稱取凍干的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(實(shí)施例5)和對照材料Fe3O4-PE1-Ac-FI_mPEG(對比例I)各Img,分別分散于PBS中配制成lmg/mL的濃度為母液，然后用PBS依次配制濃度為50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL和400 μ g/mL的納米顆粒懸浮液。取適量的人新鮮血液，首先離心(2000rpm/min，5min)去上清液，然后將血紅細(xì)胞用PBS洗滌5次，收集健康的紅細(xì)胞并用PBS稀釋10倍。再將Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米材料(50-400 μ g/mL)與紅細(xì)胞混合靜置2小時后，IOOOOrpm離心lmin，拍照并測上清液的紫外吸光光譜。該過程以PBS作為陰性對照，超純水作為陽性對照。圖 7 中顯示了 Fe304-PE1-Ac-FI_mPEG (圖 7a)和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (圖 7b)在濃度50、100、200、400μ g/mL下的溶血性測試結(jié)果。通過測量上層清液的吸光度值定量評價納米材料的溶血性。如圖7a和7b右上角紫外圖譜顯示,在濃度達(dá)到400 μ g/mL時，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG的溶血率都小于5%，說明制備的這些納米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物體內(nèi)MRI成像。
實(shí)施例9
以KB細(xì)胞為模型細(xì)胞評價本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒和對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG對細(xì)胞增殖的影響。稱取凍干的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒(實(shí)施例5)和對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (對比例I)各lmg，然后分別分散于無菌PBS中配制成lmg/mL的PBS溶液，并用紫外照射過夜殺菌。然后在超凈工作臺用無菌 PBS 配制濃度為 10、25、50、75 和 100 μ g/mL 的無菌 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA和Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒懸浮液。KB細(xì)胞種植于96孔板后分別與Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纟內(nèi)米顆粒(濃度為 10、25、50、75 和100 μ g/mL)在37°C下共培養(yǎng)24小時。然后，向培養(yǎng)板孔中加入20 μ L ΜΤΤ，繼續(xù)在37°C下培養(yǎng)4小時后，棄去培養(yǎng)液，并加入150 μ L DMSO,振蕩15分鐘后在570nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計算細(xì)胞的活力(如圖8)。不同濃度的材料對細(xì)胞增殖的影響以緩沖液PBS為對照進(jìn)行比較。與對照組相比，F(xiàn)e304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA在實(shí)驗(yàn)濃度O到100 μ g/mL范圍內(nèi)對KB細(xì)胞的存活率沒有顯著性差異，細(xì)胞存活率都在80%以上。這充分說明合成的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA均具有良好的生物相容性，可以應(yīng)用到生物體內(nèi)MRI成像檢測。我們通過相差顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證了材料對細(xì)胞的毒性。如圖9所示，不同濃度的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米材料(10、25、50、75和100 μ g/mL)處理24小時后的細(xì)胞形態(tài)和PBS處理的細(xì)胞相比，沒有明顯的變化，進(jìn)一步說明了合成的材料的良好生物相容性。
實(shí)施例10
通過流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的Fe304-PE1 -Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA處理后KB細(xì)胞對材料的吞噬量(如圖10)和細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(如圖11)評價葉酸靶向性效果。通過ICP-AES測定實(shí)施例9中l(wèi)mg/mL的無菌Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA PBS 溶液中 Fe 的濃度，然后用無菌PBS分別配制成Fe濃度為0.125,0.25,0.5,0.75、1.0、1.25和1.5mM的兩種納米顆粒懸浮液。KB細(xì)胞以2X IO5/孔種植于12孔板，過夜培養(yǎng)后再分別與Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(Fe 濃度為 0.125,0.25,0.5,0.75、1.0、1.25 和1.5mM)在37°C下共培養(yǎng)4小時，并且以PBS處理的細(xì)胞作為對照組。共培養(yǎng)后細(xì)胞用PBS清洗三次，再用胰酶消化并離心，棄上清液，將細(xì)胞懸浮于ImL PBS中。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞對納米顆粒的吞噬情況和處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。圖10中，和對照組(PBS處理細(xì)胞)相比，隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的吞噬量稍微增加，并且在Fe濃度達(dá)到1.0mM時，吞噬量幾乎不再增加。但是隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA的吞噬量卻一直明顯增加。同樣在圖11中隨著Fe濃度的增加，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著增加，而對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG處理后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度增加不明顯。這說明葉酸的修飾賦予了納米顆粒對表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞的特異祀向能力。
實(shí)施例11
進(jìn)一步通過共聚焦顯微鏡來驗(yàn)證葉酸的靶向性效果，先將蓋玻片放置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中并用1640培養(yǎng)基浸泡12h，然后每孔補(bǔ)充1.0mL培養(yǎng)基并接種5X104個KB 細(xì)胞，過夜后分別與 PBS、Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(Fe濃度為0.5mM)在37 °C下共培·養(yǎng)4小時，接著用PBS清洗三次，然后依次用2.5%戊二醛(0.5mL)固定15分鐘、hochest33343 (0.8mL)染色30分鐘，最后將蓋玻片放置于載玻片上，通過油鏡觀察細(xì)胞的形貌。如圖12所示，經(jīng)過PBS處理的細(xì)胞內(nèi)沒有熒光，對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG處理的細(xì)胞內(nèi)顯示出比較微弱的熒光信號，而Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA處理的細(xì)胞內(nèi)顯示出很強(qiáng)的熒光信號，這進(jìn)一步說明葉酸修飾的納米顆粒對表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞有靶向特異性，從而為該材料成功高效地應(yīng)用到體內(nèi)MRI成像提供了可靠的依據(jù)。
實(shí)施例12
體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)之前，我們評價了納米顆粒的細(xì)胞MRI成像效果，通過ICP-AES測定實(shí)施例 9 中 lmg/mL 的無菌 Fe3O4-PE1-Ac-FIiiPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA PBS溶液中Fe的濃度，然后用無菌PBS分別配制成Fe濃度為0.1、0.2、0.4和0.8mM的兩種納米顆粒懸浮液。KB細(xì)胞以3X IO6/孔種植于6孔板，培養(yǎng)過夜后，分別與PBS、Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 納米顆粒(Fe 濃度為 0.1,0.2,0.4和0.8mM)在37°C下共培養(yǎng)6小時，在培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞用PBS清洗5次，再胰酶消化、離心、過濾，最后分散在ImL PBS (含0.5%瓊脂糖)中。用核磁共振成像儀測各細(xì)胞樣品的T2弛豫效應(yīng)(如圖13)。在圖13a中，隨著Fe濃度的增加，F(xiàn)e304-PE1-Ac_F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后的細(xì)胞均表現(xiàn)出MRI信號衰減的趨勢，說明隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞對納米顆粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在同樣的Fe濃度下，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后的細(xì)胞比Fe304-PEI_Ac-F1-mPEG處理后細(xì)胞的MRI信號降低更明顯，說明細(xì)胞對Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的吞噬量要大大高于Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒。圖13b是細(xì)胞被不同濃度的納米顆粒處理后的MRI成像信號值，從圖中明顯看出，隨著Fe濃度的增加，細(xì)胞的MRI信號值均逐漸減少，而且在相同的Fe濃度下，F(xiàn)e3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒處理后細(xì)胞的MRI信號值要明顯低于Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒處理后的細(xì)胞。這些結(jié)果不僅說明制備的納米顆粒具有很好的細(xì)胞MRI成像效果，而且證明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的特異靶向性。
實(shí)施例13
將本發(fā)明制備的Fe304-pE1-Ac-F1-pEG-FA (實(shí)施例5)和對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (對比例I)的水溶液用PBS離心洗滌3次后重新分散于2mL PBS中，并用ICP-AES測定各溶液中Fe的濃度。然后用無菌PBS配制相同體積且含有相同F(xiàn)e質(zhì)量的 Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG 和 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 的 PBS 溶液。KB 細(xì)胞接種至Ij裸鼠體內(nèi)，三周后待腫瘤直徑達(dá)到1.0-1.2cm時，通過尾靜脈注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒PBS溶液來評價腫瘤部位的MRI成像效果(如圖14所示)。與注射前的對照組相比較，在注射后30分鐘到4小時內(nèi)，注射0.5mL對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG (Fe:500 μ g)的小鼠腫瘤部位稍微變暗，而注射0.5mLFe304-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500 μ g)的小鼠腫瘤明顯變暗，展示出葉酸修飾的納米顆粒具有明顯的MRI腫瘤診斷效果。在注射后24小時，兩個實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤部位明暗程度都逐漸恢復(fù)，說明此時納米材料隨著血液流通從腫瘤部位逐漸代謝出去(圖14a)。圖14b是相應(yīng)注射時間的腫瘤MRI信號值變化，在注射后30分鐘到4小時，注射對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG的小鼠腫瘤MRI信號值變化不明顯，而注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA的小鼠腫瘤MRI信號值明顯降低。在注射后24小時，兩個實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤部位MRI信號值均有所增加，這與圖14a的結(jié)果一致。這些結(jié)果說明該制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒具有很好的腫瘤靶向能力，能成功應(yīng)用于體內(nèi)腫瘤靶向MRI成像診斷的造影劑。
實(shí)施例14
以種有腫瘤的裸鼠(實(shí)施例13)為模型動物檢測對照材料Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和本發(fā)明制備的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒尾靜脈注射24小時后鐵的組織分布(圖15 )。向裸鼠尾靜脈注射0.5mL實(shí)施例13配制的Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500 μ g) PBS溶液24小時后，處死小鼠，取出各個器官并稱重，然后切成小片段，并加入3mL王水(鹽酸/硝酸；體積比3:1)浸泡2天，用ICP-AES測定各個組織 器官中鐵的濃度。從圖15中可看出在注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe:500μ g)納米顆粒后，肝、脾和肺中鐵的含量較注射前均明顯增加，而在其他的器官，比如:心、腎和腫瘤，鐵的聚集較少。但需要指出的是，注射Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的小鼠腫瘤部位鐵的含量明顯高于注射Fe304-PE1-Ac-F1-mPEG納米顆粒的情況。這些結(jié)果不僅證明了 Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA對腫瘤部位具有很好的靶向性，而且說明該發(fā)明制備的納米顆粒能在小鼠體內(nèi)正常的代謝清除。
對比例I
將1.25g Fe(II)鹽溶解于7.75mL超純水中，再加入6.25mL NH3.Η20并于空氣氣氛下攪拌10分鐘，然后將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中。取0.5g PEI溶解于5mL超純水中，并將該5mL PEI水溶液也加入到高壓反應(yīng)釜中，攪拌混合均勻后，于134°C反應(yīng)3小時。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將沉淀磁分離洗滌純化后，重新分散于20mL超純水中，即得PEI包裹的納米顆粒Fe3O4-PEI,產(chǎn)物儲存于4°C備用。產(chǎn)物表征見圖1 ;
取6.24mL上述步驟制備的Fe3O4-PEI納米顆粒(30mg)用DMSO洗滌三次后，重新分散于6mL DMSO中。取0.84mg FI，并將其溶解于2mL DMSO中。然后將DMSO溶解的FI溶液(2mL)逐滴加入到上述6mL Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)一天后，產(chǎn)物Fe3O4-PE1-FI用超純水磁分離洗滌3次，然后分散到IOmL DMSO中，并儲存在4°C備用。產(chǎn)物表征見圖3 ；
取10.80mg mPEG_C00H、5.18mg EDC 和 3.1lmg NHS 分別溶于 2mL DMSO,并將溶液混合后攪拌活化3h。然后將活化的mPEG-COOH溶液(6mL)逐滴加入到5mL上述制備的Fe3O4-PE1-FI溶液(5mL)中，攪拌反應(yīng)三天，再用超純水磁分離洗滌3次，產(chǎn)物Fe304-PE1-F1-mPEG重新分散于5mL超純水中后儲存于4°C備用。產(chǎn)物表征見圖4和表I ;向上述步驟制備的Fe304-PE1-F1-mPEG納米顆粒水溶液(4mL)中加入18yL三乙胺，并攪拌30分鐘。然后向上述溶液中逐滴加入12.2μ L乙酸酐，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24小時。產(chǎn)物用超純水磁分離洗滌3次，并重新分散到5mL超純水中，即制得對照材料乙?；腇e304-PE1-AC-F1-mPEG納米顆粒，取2mL真空冷凍干燥后儲存于_20°C，余下3mL儲存于4°C備用。產(chǎn)物表征見圖5-15和表I。
表1.Fe304-PE1-F1-mPEG，F(xiàn)e304-PE1-Ac-F1-mPEG, Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA 和Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA納米顆粒的電勢和水動力直徑.
權(quán)利要求
1.一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括: (1)將亞鐵鹽溶解于超純水中，加入NH3.H2O并于空氣氣氛下攪拌，然后將混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，并將0.lg/mL的超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液也加入到高壓反應(yīng)釜中，攪拌混合均勻后，于130 140°C反應(yīng)2 4小時；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將沉淀分離洗滌純化后，即得PEI包裹的四氧化三鐵納米顆粒Fe3O4-PEI ； (2)將FA溶解于DMSO中后，先用EDC和NHS活化2 4h，然后逐滴加入到NH2-PEG-C00H的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)2 4天，透析，然后真空冷凍干燥，即得C00H-PEG-FA ； (3)將步驟(I)中制備的Fe3O4-PEI納米顆粒用DMSO洗滌后，重新分散于DMSO中，再將DMSO溶解的FI溶液加入到上述Fe3O4-PEI的DMSO溶液中，攪拌反應(yīng)I 3天后，產(chǎn)物Fe3O4-PE1-FI分離洗滌，然后分散到DMSO中； (4)步驟(2)中制備的C00H-PEG-FA以及EDC和NHS溶解于DMSO后，攪拌活化2 4h;然后將活化的C00H-PEG-FA溶液加入到步驟(3)制備的Fe3O4-PE1-FI溶液中，攪拌反應(yīng)2 4天，再分離洗滌，并分散于超純水中，得到Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液； (5)向步驟(4)制備的Fe3O4-PE1-F1-PEG-FA納米顆粒水溶液中加入三乙胺，并攪拌20 40分鐘；然后向上述溶液中加入乙酸酐，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20 30小時；分離洗滌并分散于超純水中，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的亞鐵鹽為FeCl2.4Η20，亞鐵鹽、超純水、NH3 -H2O的配比為I 1.5g: 7.5 8.0mL: 6.0 6.5mL,亞鐵鹽與超支化聚乙烯亞胺PEI質(zhì)量比為2 3:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的NH3.H2O質(zhì)量百分比濃度為25-28%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的超支化聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中FA、EDC和NHS的摩爾比為1:0.5 1:0.5 1，F(xiàn)A和NH2-PEg-COOH的摩爾比為I 3:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中NH2-PEg-COOH的分子量為2000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中FI與Fe3O4-PEI表面氨基的摩爾比為1:45 55。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中的C00H-PEG-FA與EDC、NHS的摩爾比為1:4 6:4 6。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中的C00H-PEG-FA與Fe3O4納米顆粒表面氨基的摩爾比為1:4 6。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中的三乙胺、乙酸酐與Fe3O4納米顆粒表面的PEI上伯氨基摩爾比為4 6:4 6:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于葉酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒的靶向MRI造影劑的制備方法，包括FA連接到NH2-PEG-COOH上形成COOH-PEG-FA；水熱法合成PEI包覆的Fe3O4納米顆粒(Fe3O4-PEI)；Fe3O4-PEI納米顆粒表面修飾異硫氰酸熒光素(FI)；COOH-PEG-FA連接到Fe3O4納米顆粒的表面；最后對Fe3O4納米顆粒表面PEI剩余氨基進(jìn)行乙?；揎椧栽黾悠渖锵嗳菪裕糜贛RI成像診斷。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作；制備的Fe3O4磁性納米顆粒具有良好的膠體穩(wěn)定性、生物相容性和腫瘤靶向性，在體內(nèi)腫瘤靶向診斷領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K49/12GK103143041SQ20131010539
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者沈明武, 李靜超, 蔡紅東, 史向陽, 張貴祥, 鄭林豐 申請人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院