多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物及其制備方法，該共軛組合物是包括14種不同血清型的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價連接形成的共軛組合物，其中，所述14種不同血清型包括1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。該共軛組合物吸附效果及穩(wěn)定性好，具有針對上述14種血清型的肺炎球菌侵襲的多重免疫原性和保護性能，優(yōu)于已上市的低價次肺炎組合物，且免疫應(yīng)答高于未結(jié)合的組合物。接種含有該共軛組合物的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗可以減少接種針次，簡化免疫程序，同時可有效預(yù)防人及動物因上述14種血清型肺炎球菌所致的疾病，覆蓋更加廣泛，免疫效果更好。
【專利說明】多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)可引起腦膜炎、肺炎等侵入性疾病和中耳炎等非侵入性疾病。據(jù)聯(lián)合國統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年有超過一百萬的兩歲以下兒童死于肺炎球菌引起的疾病。目前，針對肺炎鏈球菌的主要防御手段為多糖疫苗和結(jié)合疫苗，已經(jīng)證實了前者在成年人中的保護效果，但是對于肺炎鏈球菌的主要易感人群，嬰兒和幼兒中的保護力卻很弱。結(jié)合疫苗因其可以在嬰幼兒中引起有效保護和免疫記憶，自2000年首次問世以來，在全世界許多國家被納入免疫計劃或批準上市。
[0003]目前我國僅有7價肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevnar?4皮批準上市，僅能保護7個價次，保護范圍有限，而象其他10價肺炎球菌結(jié)合疫苗Synflorix⑩，13價肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevenar 13⑩,其血清型組合主要針對歐美發(fā)達國家流行情況而設(shè)計，對我國特有的血清型缺乏保護。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物、其制備方法及應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述共軛組合物的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，其是包括14種不同血清型肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價連接形成的共軛組合物；其中，所述14種不同血清型包括1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F。
[0007]本發(fā)明的一種多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，其是由14種不同血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價連接形成的共軛組合物；其中，所述14種不同血清型為 1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F。
[0008]前述的多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，莢膜多糖與載體蛋白質(zhì)的重量比為1:2-2:1，各血清型莢膜多糖的質(zhì)量為血清型1:血清型4:血清型5:血清型6A:血清型7F:血清型9V:血清型14:血清型18C:血清型19A:血清型19F:血清型22F:血清型23F:血清型 33F:血清型 6B=1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2。
[0009]前述的多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，所述載體蛋白質(zhì)應(yīng)為無毒性，且能與肺炎莢膜多糖結(jié)合并且能夠引起多糖免疫原性顯著升高的蛋白質(zhì)，同時易于大量獲得。本發(fā)明的載體蛋白質(zhì)優(yōu)選為白喉類毒素或破傷風(fēng)毒素，更優(yōu)選為白喉類毒素CRM197。上述蛋白質(zhì)載體的獲得，需經(jīng)過菌體發(fā)酵、超濾、純化、脫毒等步驟，均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。
[0010]本發(fā)明還提供制備所述多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物的方法，分別對14種不同血清型(1、4、5、6六、68、7卩、叭、14、18(:、19六、19卩、22卩、23卩和33F)肺炎鏈球菌的莢膜多糖進行分離純化，然后將各血清型莢膜多糖分別與載體蛋白質(zhì)進行共價連接(例如，先將純化的莢膜多糖化學(xué)活化，通過還原胺化法將活化莢膜多糖分別單獨結(jié)合到載體蛋白上)，形成單價共軛物，最后將各型單價共軛物混合，即得多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物。
[0011]其中，肺炎鏈球菌莢膜多糖分離純化的步驟為:
[0012]I)建立肺炎球菌菌種庫，采用工作種子進行肺炎球菌發(fā)酵；
[0013]2)向肺炎球菌發(fā)酵液中加入適量的去氧膽酸鈉進行殺菌并剝離肺炎莢膜多糖；
[0014]3)對殺菌后的發(fā)酵液進行離心，去除菌體，收集離心上清，然后進行超濾濃縮；
[0015]4)向濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度為25%~45%，攪拌后離心去除核酸；
[0016]5)向上清中加入乙醇使其終濃度達到55%~80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀；
[0017]6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進行多次抽提，去除蛋白；
[0018]7)向上清中加入乙醇，使其終濃度達到55%~80%，離心后收集沉淀，即得純化的肺炎球菌莢膜多糖。
[0019]還可采用本領(lǐng)域熟知的其它純化技術(shù)，如柱層析等方法對肺炎鏈球菌莢膜多糖進行純化。
[0020]本發(fā)明還提供所述多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物在制備用于預(yù)防或治療肺炎鏈球菌所致疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明進一步提供一種多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，其含有所述多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，以及任選賦形劑和/或基于鋁的佐劑。所述基于鋁的佐劑，如氧化鋁、氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等。所述基于鋁的佐劑可市售獲得，也可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法進行制備，所述賦形劑優(yōu)選氯化鈉和/或琥珀酸等。
[0022]前述的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗中，基于鋁的佐劑其終濃度為
0.25-1.0mg/mL,優(yōu)選 0.25-0.8mg/mL。
[0023]前述的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，其可以為噴霧劑、注射劑、凍干劑、膠囊劑、片劑或丸劑等?？赏ㄟ^以下方式進行免疫:皮膚、注射(包括皮下注射、肌肉注射、靜脈注射)、口服、滴鼻或粘膜噴霧等。
[0024]所述多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法包括:將各型單價共軛物分別采用鋁佐劑吸附后混合；或各型單價共軛物混合后再采用鋁佐劑吸附，即得14價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗(14vPnC)。其中，各血清型莢膜多糖含量:6B為4_16 μ g/mL,其余血清型為2-8 μ g/mL,優(yōu)選6B為8 μ g/mL,其余血清型4 μ g/mL ;載體蛋白質(zhì)為30-90 μ g/mL ;鋁含量終濃度為 0.25-1.0mg/mL，優(yōu)選 0.5-0.7mg/mL。
[0025]本發(fā)明的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗可以用于保護或者治療由于肺炎球菌感染引發(fā)肺炎的病人，疫苗可以通過肌肉、皮下、皮內(nèi)途徑注射或經(jīng)過粘膜給藥。該多價結(jié)合疫苗適于接種2、4、6和12-15個月齡的嬰幼兒，也更適合于兒童、青年和成人。
[0026]本發(fā)明是針對我國特有血清型肺炎球菌的流行情況，創(chuàng)造性地選擇了 1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的血清型組合，從而開發(fā)出針對我國特有血清型肺炎球菌的流行情況而設(shè)計的多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，在嚴格控制載體蛋白含量從而減少免疫抑制作用的前提下，提供最大限度的保護。
[0027]采用本發(fā)明方法制備的多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，其吸附效果及穩(wěn)定性較好。該共軛組合物具有針對上述14種血清型的肺炎球菌侵襲的多重免疫原性和保護性能，優(yōu)于已上市的低價次肺炎組合物，且免疫應(yīng)答高于未結(jié)合的組合物。接種本發(fā)明的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗可以減少接種針次，簡化免疫程序，同時可有效預(yù)防人及動物因上述14種血清型肺炎球菌所致的疾病，覆蓋更加廣泛，免疫效果更好。另外，該多價結(jié)合疫苗免疫原性效果遠高于同類多價次的多糖類疫苗，可有效激活2歲以下兒童B細胞，從而產(chǎn)生抗體，并激活記憶B細胞，誘發(fā)免疫記憶反應(yīng)，可以起到更好的保護效果。
[0028]本發(fā)明的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗可以由預(yù)防上述14種血清型肺炎球菌所致的侵襲性疾病，更加方便多效，成本更低。上述14種血清型莢膜多糖的生產(chǎn)，均采用發(fā)酵后純化的方式進行制備， 具有相似的生產(chǎn)工藝，便于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且通過滅活后提純莢膜多糖，使疫苗具有更高的安全性及良好的免疫原性，同時，所述多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物吸附完全，理化性質(zhì)穩(wěn)定，互無干擾。
[0029]動物實驗表明，本發(fā)明的多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對上述14種血清型莢膜多糖的高滴度、特異性抗體，體外實驗表明，由該多價結(jié)合疫苗所誘導(dǎo)的抗體具有明顯的反應(yīng)性與中和活性；特別是組合物中各血清型莢膜多糖的免疫效果不受另一組分的影響與干擾，吸附率大于75%，免疫原性不低于單價共軛物。該多價結(jié)合疫苗具有與各血清型單價結(jié)合原液相同的免疫原性，組合接種可以在不影響療效的基礎(chǔ)上大大減少接種次數(shù)。

【具體實施方式】
[0030]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0031]實施例1肺炎球菌莢膜多糖原液制備
[0032]1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F 血清型肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株均來源于中國藥品生物制品檢定所。將上述菌種進行傳代建立原始種子庫、主種子庫和工作種子庫，代次分別為:原始種子批為第I代，主種子批為第4代，工作種子批為第8代。工作種子批啟開后至接種發(fā)酵罐培養(yǎng)，傳代應(yīng)不超過5代。每代種子采用奶粉做凍干保護劑，凍干保藏。取工作種子在大豆蛋白胨固體培養(yǎng)基劃線挑取菌種，接種于5mL的液體綜合培養(yǎng)基，350C ±2°C培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種到500mL的培養(yǎng)液后經(jīng)過培養(yǎng)再擴增至1L培養(yǎng)液和50L培養(yǎng)液。于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期中止培養(yǎng)，取樣進行純菌檢查，純菌檢查合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入合適量的無菌的去氧膽酸鈉至終濃度為1%殺菌兩小時以裂解細菌細胞并釋放莢膜多糖。將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清液，上清液用100KD截留分子量的超濾膜包超濾濃縮3-10倍。
[0033]用pH7.0左右的磷酸鹽緩沖液對超濾液采進行超濾換液，然后加入無水乙醇，使乙醇終濃度為25%~45%，充分攪拌后離心去除核酸。
[0034]向上清中加入乙醇使其終濃度達到55%~80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀。
[0035]加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進行多次抽提，去除蛋白。
[0036]向上清中加入乙醇，使其終濃度達到55%~80%，離心后收集沉淀，將沉淀采用注射水復(fù)溶，經(jīng)過0.2μ m的無菌濾器除菌過濾后，獲得1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F共14種純化血清型的肺炎球菌莢膜多糖。
[0037]實施例2多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物的制備
[0038]將實施例1中制備的14種肺炎球菌莢膜多糖原液，采用鹽酸進行酸化降解，然后在多糖中加入高碘酸鈉氧化，氧化后檢測多糖的活化度，然后按照多糖:蛋白質(zhì)=1:2-2:1的重量比加入純化后的白喉類毒素CRM197蛋白質(zhì)進行結(jié)合，結(jié)合后加入硼氫化鈉終止結(jié)合反應(yīng)，制備肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合物，結(jié)合物采用超濾透析，去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和多糖，純化后采用0.2 μ m的濾器除菌過濾，即為肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)單價共軛物。
[0039]將上述制備的1、4、5、6々、68、7?、叭、14、18(:、194、19?、22?、23?和 33F 血清型的肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)單價共軛物按照多糖含量4 μ g/mL，6B結(jié)合物按照多糖含量8 μ g/mL混合，即得14價的肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物。
[0040]實施例3多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備
[0041]將實施例2 制備的 1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F^P 33F 血清型的肺炎球菌莢膜多糖- 蛋白質(zhì)單價共軛物按照多糖終濃度4μ g/mL，6B結(jié)合物按照多糖終濃度8 μ g/mL混合，加入磷酸鋁佐劑，制成14價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，鋁含量為
0.25mg/mL。
[0042]將上述制備的14價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，采用低溫干燥的方式制成凍干劑型，使用前采用生理鹽水進行復(fù)溶。
[0043]實施例4多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物的鋁吸附
[0044]采用兩種方式對多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物進行吸附制備疫苗。
[0045](I)將純化后的 1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F 血清型的肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)單價共軛物先混合，然后與0.5 μ g/mL的磷酸鋁佐劑混合，使多糖含量為:6B 血清型 8μ g/mL，1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F 血清型各為4 μ g/mL，制成14價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗(HvPnC)，鋁佐劑終濃度為0.25mg/mL。
[0046](2)將 1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F血清型的肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)單價共軛物分別與0.5mg/mL的磷酸鋁佐劑混合，使多糖含量為:6B血清型112μ g/mL，其余血清型為56 μ g/mL (其余各血清型按對比例混合)，鋁佐劑濃度為0.25mg/mL，然后將各吸附后的溶液等體積混合，制成終產(chǎn)物。
[0047]檢測上述吸附方式制備的HvPnC的吸附完全性、各型多糖含量回收率。HvPnC各型多糖的吸附效果與各型多糖含量采用免疫濁度法進行檢測。
[0048]多糖吸附完全性與各型多糖回收率計算方法如下:
[0049]吸附完全性:

【權(quán)利要求】
1.多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物，其特征在于，其是包括14種不同血清型肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價連接形成的共軛組合物；其中，所述14種不同血清型包括1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛組合物，其特征在于，其是由14種不同血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白質(zhì)共價連接形成的共軛組合物；其中，所述14種不同血清型為1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛組合物，其特征在于，莢膜多糖與載體蛋白質(zhì)的重量比為1:2-2:1，各血清型莢膜多糖的質(zhì)量為血清型1:血清型4:血清型5:血清型6A:血清型7F:血清型9V:血清型14:血清型18C:血清型19A:血清型19F:血清型22F:血清型23F:血清型 33F:血清型 6Β=1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共軛組合物，其特征在于，所述載體蛋白質(zhì)為白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的共軛組合物，其特征在于，所述載體蛋白質(zhì)為白喉類毒素CRM197。
6.制備權(quán)利要求1-5任一項所述共軛組合物的方法，其特征在于，分別對14種不同血清型肺炎鏈球菌的莢 膜多糖進行分離純化，然后將各血清型莢膜多糖分別與載體蛋白質(zhì)進行共價連接，形成單價共軛物，最后將各型單價共軛物混合，即得多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)共軛組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，肺炎鏈球菌莢膜多糖分離純化的步驟為: O建立肺炎球菌菌種庫，采用工作種子進行肺炎球菌發(fā)酵； 2)向肺炎球菌發(fā)酵液中加入適量的去氧膽酸鈉進行殺菌并剝離肺炎莢膜多糖； 3)對殺菌后的發(fā)酵液進行離心，去除菌體，收集離心上清，然后進行超濾濃縮； 4)向濃縮液中加入無水乙醇，使乙醇終濃度為25%~45%，攪拌后離心去除核酸； 5)向上清中加入乙醇使其終濃度達到55%~80%，攪拌后，離心，去除上清收集沉淀； 6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液體積的苯酚進行抽提，去除蛋白； 7)向上清中加入乙醇，使其終濃度達到55%~80%，離心后收集沉淀，即得純化的肺炎球菌莢膜多糖。
8.權(quán)利要求1-5任一項所述共軛組合物在制備用于預(yù)防或治療肺炎鏈球菌所致疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.多價肺炎球菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，其含有權(quán)利要求1-5任一項所述的共軛組合物，以及賦形劑和/或任選基于鋁的佐劑；其中，基于鋁的佐劑其終濃度為0.25-1.0mg/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，其為噴霧劑、注射劑、凍干劑、膠囊劑、片劑或丸劑。
【文檔編號】A61K47/48GK104069488SQ201310109045
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】高強, 董珊珊, 王新立, 蔡芳, 戈小琴, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興中維生物技術(shù)有限公司