奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體及其制備方法。該脂質(zhì)體由藥物、磷脂、膽固醇類化合物和水相介質(zhì)組成；其中，藥物、磷脂和膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1：2～100：1～35；所述的藥物為奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物。本發(fā)明利用奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的協(xié)同作用，使奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體具有抑制多藥耐藥性和降低用藥毒性的特點(diǎn)。本發(fā)明共載脂質(zhì)體的制備方法，制備工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、控制參數(shù)較少，有利于降低生產(chǎn)成本，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及脂質(zhì)體類藥劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，而化療藥物在腫瘤的治療中一直占據(jù)著不可替代的地位。但由于化療藥物的大量使用，腫瘤細(xì)胞極易對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR),而MDR的產(chǎn)生是目前腫瘤化學(xué)治療失敗的一個(gè)主要原因。
[0003]長(zhǎng)春新堿(Vincristine，VCR)是從夾竹桃科植物長(zhǎng)春花葉中提取出來(lái)的一種二聚吲哚型的生物堿，它自1962年問(wèn)世以來(lái)，一直是應(yīng)用比較多的一種抗腫瘤藥物。VCR對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病、乳腺癌、支氣管肺癌、何杰金及非何杰金淋巴瘤等均具有較為顯著的抗腫瘤活性。目前直接藥用產(chǎn)品為硫酸長(zhǎng)春新堿注射液，長(zhǎng)春新堿雖然抗腫瘤作用良好，但是硫酸長(zhǎng)春新堿注射液的半衰期較短，毒副作用大，神經(jīng)系統(tǒng)毒性和胃腸道系統(tǒng)毒性都較強(qiáng)，另外其注射的局部刺激也較大，這些缺點(diǎn)大大限制了其在臨床上的使用。
[0004]此外，由于長(zhǎng)春新堿、阿霉素等抗腫瘤藥物的大量使用容易使細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，這是當(dāng)下臨床上成功地治療癌癥的一大障礙，為解決這些問(wèn)題，目前主要嘗試采用以下方法來(lái)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性:1)MDR逆轉(zhuǎn)劑；2)化療藥物的化學(xué)修飾；3)聯(lián)用化療敏感藥物；4)運(yùn)用納米粒載體及后兩者(即3)和4)兩者)相結(jié)合。
[0005]奎寧(Quinine)，俗稱金雞納霜，一直以來(lái)是作為一種安全、有效且價(jià)廉的預(yù)防和治療瘧原蟲感染的藥物使用。已有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，奎寧可作為一些耐藥相關(guān)蛋白的抑制劑，與抗癌藥物聯(lián)用，可降低細(xì)胞的多藥耐藥性，從而達(dá)到較好的抑癌效果(Reversal ofMRP-Mediated Doxorubicin Resistance with Quinoline-Based Drugs, [J]BiochemicalPharmacology, 2000, Vol.59, 1`245 - 1252.)，如多藥耐藥蛋白 I (MRPl)0 MRPl 屬于三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)家庭，它能夠廣泛性地將胞內(nèi)的抗癌藥物泵出細(xì)胞外，從而大大削弱藥物的抗癌作用，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥(Pharmacogenomics of ABC transporters andits role in cancer chemotherapy,[J]Drug Resistant Update, 2003，Vol.6，71-84)。以往的技術(shù)中將奎寧與抗癌藥物聯(lián)用用以降低細(xì)胞的多藥耐藥性從而使抗癌藥物達(dá)到較好的抑癌效果時(shí)采用的是注射用奎寧溶液(即奎寧注射液)，但早期研究已表明注射使用奎寧溶液毒性很大，甚至危及生命，而且用作耐藥逆轉(zhuǎn)劑時(shí)往往用量相對(duì)較大，而硫酸長(zhǎng)春新堿注射液半衰期較短，毒副作用大，神經(jīng)系統(tǒng)毒性和胃腸道系統(tǒng)毒性都較強(qiáng)，注射的局部刺激也較大，若奎寧注射液與硫酸長(zhǎng)春新堿注射液聯(lián)用將使毒副作用更為嚴(yán)重，因此迫切需要通過(guò)其它手段給以解決。
[0006]在過(guò)去的20年里，控制藥物釋放和腫瘤靶向的藥物運(yùn)載系統(tǒng)作為一種有吸引力的治療手段被臨床醫(yī)生廣泛應(yīng)用，在運(yùn)用的載體中，有納米粒、白蛋白微球以及脂質(zhì)體等，而脂質(zhì)體作為一種化療藥物載體最近被重新探討，由此發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)體不僅可以改善藥物體內(nèi)分布，并能顯著增加藥物的抗癌效率，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性。藥物用脂質(zhì)體包裹后，能靶向作用于病變部位，從而提高藥物的治療指數(shù)，同時(shí)還可以減少藥物的治療劑量，降低全身不良反應(yīng)，提高用藥安全性。因此，現(xiàn)在關(guān)于長(zhǎng)春新堿的研究多往長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體方向發(fā)展，主要用來(lái)降低長(zhǎng)春新堿的神經(jīng)毒性。目前，已批準(zhǔn)臨床使用或正在進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)的長(zhǎng)春新堿制劑主要是脂質(zhì)體制劑，如注射用長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體，商品名Marqibo，雖然一定程度上減少了藥物的治療劑量，降低了長(zhǎng)春新堿的神經(jīng)毒性及對(duì)正常細(xì)胞的毒性，但是仍存在著容易使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性以致抗癌效果不佳的問(wèn)題。此外，現(xiàn)有的注射用長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體如中國(guó)發(fā)明專利ZL200410014200.9、中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN201210030558.5等中公開的可供靜脈注射的硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體均存在著容易使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性以致抗癌效果不佳的問(wèn)題。
[0007]中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN02820117.5中公開了一種前膠束組合物，具有含有藥物活性成分的中心的組合物，其中中心包封在含有酯化的C12-C18脂肪酸的膜中，且所述的脂肪酸在組合物中的濃度低于15wt.%，其中心可以是含有一個(gè)含有長(zhǎng)春新堿或奎寧的親水相和一個(gè)含有膽固醇、磷脂、親脂性表面活性劑和未酯化脂肪酸的連續(xù)親水相的脂質(zhì)體；該發(fā)明主要是利用中心包封在含有酯化的C12-C18脂肪酸的膜中前膠束組合物在哺乳動(dòng)物腸內(nèi)，暴露給C12-C18脂肪酸會(huì)導(dǎo)致前膠束轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的膠束，以有效的輸送藥物活性成分到循環(huán)系統(tǒng)中，是一種前藥的制備方案，解決多種藥物無(wú)法口服給藥的難題，是針對(duì)藥物劑型做的研究，并未涉及針對(duì)多種藥物之間的相互作用、降低抗腫瘤藥物的多藥耐藥性等方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種載體選擇面廣、藥物包封率高的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，利用奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的協(xié)同作用，一定程度上克服了多藥耐藥性，并降低了奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物如奎寧和長(zhǎng)春新堿以游離形式使用時(shí)不可忽視的毒副作用。
[0009]本發(fā)明還提供了一種奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體的制備方法，采用薄膜分散法將奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物(如奎寧和長(zhǎng)春新堿)兩者共同裝載入脂質(zhì)體，制得奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物 共載脂質(zhì)體，制備工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、控制參數(shù)較少，有利于降低生產(chǎn)成本，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0010]一種奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，由藥物、磷脂、膽固醇類化合物和水相介質(zhì)組成；其中，藥物、磷脂與膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1:2~100:1~35 ;
[0011]所述的藥物為奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物。
[0012]優(yōu)選的，所述的藥物、磷脂和膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1:6.6~40:1.6~25 ;進(jìn)一步優(yōu)選，藥物、磷脂和膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1:6.6~25:1.6~4。
[0013]所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物為主要的藥效成分，奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的比例可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際需要任意調(diào)整，奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的質(zhì)量比可以是I~100:1~100，優(yōu)選為1:0.5~5，進(jìn)一步優(yōu)選為1:0.5~2。優(yōu)選的用量，奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的協(xié)同增效作用更顯著。
[0014]所述的奎寧類藥物包括奎寧、奎寧與酸所成的鹽中的一種或多種；所述的奎寧與酸所成的鹽可選用一鹽酸奎寧、二鹽酸奎寧、硫酸奎寧等中的一種或多種。
[0015]所述的長(zhǎng)春新堿類藥物包括長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春新堿等中的一種。[0016]所述的磷脂可選用天然磷脂、合成磷脂中的一種或兩種；所述的天然磷脂選用大豆磷脂、卵磷脂中的一種或兩種；所述的合成磷脂選用中性磷脂、負(fù)電性磷脂或聚乙二醇修飾磷脂中的至少一種，合成磷脂具體選用二豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰絲氨酸(PS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)中的至少一種。
[0017]所述的膽固醇類化合物可選用普通膽固醇、聚乙二醇(PEG)修飾的膽固醇中的一種或者兩種，所述的聚乙二醇(PEG)修飾的膽固醇選用聚乙二醇單甲醚膽固醇琥珀酸酯(CHS-PEG)0
[0018]所述的水相介質(zhì)選用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(即PBS緩沖液)或水。所述的磷酸鹽緩沖系統(tǒng)選用PH值為7.0~7.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，優(yōu)選pH值為7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。
[0019]所述的水相介質(zhì)主要是用于乳化磷脂和膽固醇得到脂質(zhì)體，其用量并沒有嚴(yán)格的限制，以能夠得到脂質(zhì)體懸液為宜。
[0020]本發(fā)明所述的原料均可采用現(xiàn)有產(chǎn)品，如現(xiàn)有市售產(chǎn)品。
[0021]所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟:
[0022]將磷脂和膽固醇類化合物溶于有機(jī)溶劑中，再加入用有機(jī)溶劑溶解的藥物，充分溶解后混合均勻，除去有機(jī)溶劑，然后加入水相介質(zhì)混合均勻，分離出游離藥物，得到奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體。
[0023]上述步驟中，所述的有機(jī)溶劑選用無(wú)水乙醇或者氯仿(三氯甲烷)。所述的有機(jī)溶劑用于溶解磷脂、膽固醇類化合物和藥物，其用量并沒有嚴(yán)格的限制，以能夠完全溶解目標(biāo)物質(zhì)(如磷脂、膽固醇類化合物和/或藥物)為宜。
[0024]上述步驟中，除去有機(jī)溶劑`，然后加入水相介質(zhì)后，可通過(guò)高壓勻乳、超聲或微射流進(jìn)行粉碎，使其混合均勻，得到粒徑低于IOOnm的脂質(zhì)體懸液。
[0025]上述步驟中，分離出游離藥物的方法可采用S印hadex G_50凝膠柱層析法或透析法。
[0026]所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體可作為抗癌藥物治療癌癥等疾病，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較高的殺傷力。
[0027]本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀(Malvern Zetasizer Nano_S90,英國(guó))檢測(cè)粒徑。
[0028]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0029]( I)本發(fā)明奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體使奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物協(xié)同作用，從而提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，并且奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的協(xié)同作用相對(duì)可以減少藥物的使用量，減小了毒副作用。
[0030](2)本發(fā)明奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，能夠有效抑制細(xì)胞的多藥耐藥性，可以明顯逆轉(zhuǎn)單一長(zhǎng)春新堿類藥物脂質(zhì)體的耐藥性。
[0031](3)在奎寧的毒性范圍內(nèi)(<50μ g/ml)，奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體隨著奎寧類藥物的量的增多，半抑制濃度(IC50)降低。
[0032](4)本發(fā)明磷脂選擇面廣，可使用天然卵磷脂或大豆磷脂，也可使用合成的中性磷脂或負(fù)電性磷脂等。
[0033]( 5 )通過(guò)本發(fā)明方法制得的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，藥物包封率可達(dá)到70%以上，粒徑可低于lOOnm，具有包封率高、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0034](6)采用薄膜分散法將奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物同時(shí)裝載入脂質(zhì)體，制備奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，制備方法操作簡(jiǎn)便，且包封率高，可控性和重現(xiàn)性好。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明權(quán)利范圍的限制。
[0036]實(shí)施例1
[0037]稱取350mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和70mg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和20mg—鹽酸奎寧(即長(zhǎng)春新堿和一鹽酸奎寧均溶解于無(wú)水乙醇中，下同)，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為38.6nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為70.39%，載藥量為3.35%。
[0038]實(shí)施例2
[0039]稱取400mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和40mg —鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為45.8nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為83.90%，載藥量為3.36%ο
[0040]實(shí)施例3
[0041 ] 稱取400mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和80mg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和IOmg —鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為35.7nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為79.20%，載藥量為3.30%ο
[0042]實(shí)施例4
[0043]稱取500mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和80mg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的IOmg長(zhǎng)春新堿和IOmg—鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為40.6nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為90.90%，載藥量為1.57%。
[0044]實(shí)施例5
[0045]稱取500mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，置于燒瓶中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg硫酸長(zhǎng)春新堿和20mg—鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mLPBS(磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml硫酸長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該硫酸長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為37.6nm，用Sephadex G-50凝膠柱層析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，硫酸長(zhǎng)春新堿包封率為80.90%，載藥量為2.70%。
[0046]實(shí)施例6
[0047]稱取500mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和IOOmg膽固醇溶解于4mL無(wú)水乙醇中，再加入用2ml無(wú)水乙醇溶解的20mg硫酸長(zhǎng)春新堿和20mg —鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為39.6nm,用Sephadex G_50凝膠柱層析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物,長(zhǎng)春新堿包封率為83.90%，載藥量為2.80%。
[0048]實(shí)施例7
[0049]稱取420mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、80mg磷脂酰乙醇胺(PE)和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和20mg —鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mLPBS ( 磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為43.6nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為97.90%，載藥量為3.26%。
[0050]實(shí)施例8
[0051]稱取500mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)，50mg膽固醇和聚乙二醇單甲醚(分子量為2000)膽固醇琥珀酸酯(CHS-PEG2000) 50mg溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和20mg—鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為45.7nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為94.90%，載藥量為3.16%。
[0052]實(shí)施例9
[0053]稱取400mgDSPC、IOOmgDPPG和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和20mg—鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為35.9nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為96.50%，載藥量為3.22%。
[0054]實(shí)施例10
[0055]稱取480mg 二豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、120mg磷脂酰絲氨酸(PS)和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg長(zhǎng)春新堿和20mg —鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mLPBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該長(zhǎng)春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為41.7nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，長(zhǎng)春新堿包封率為98.90%，載藥量為2.82%。
[0056]對(duì)比例I
[0057]稱取500mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg硫酸長(zhǎng)春新堿，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS(磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液,潤(rùn)旋5min,最后用細(xì)胞粉碎儀超聲IOmin,得到5ml硫酸長(zhǎng)春新堿單載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該硫酸長(zhǎng)春新堿單載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為48.9nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，硫酸長(zhǎng)春新堿包封率為96.41%，載藥量為3.21%。
[0058]對(duì)比例2
[0059]稱取500mg大豆磷脂(磷脂酰膽堿純度>76%)和IOOmg膽固醇溶解于6mL無(wú)水乙醇中，再加入用4ml無(wú)水乙醇溶解的20mg—鹽酸奎寧，充分溶解后混合均勻，然后減壓蒸去有機(jī)溶劑乙醇，使磷脂等成膜材料在燒瓶底部形成均勻脂膜，然后加入5mL PBS (磷酸鹽，pH=7.4)緩沖液，渦旋5min`，最后用細(xì)胞粉碎儀超聲lOmin，得到5ml —鹽酸奎寧單載脂質(zhì)體懸液，測(cè)得該一鹽酸奎寧單載脂質(zhì)體懸液的平均粒徑(數(shù)均)為58.6nm，用透析法分離脂質(zhì)體和未被包封在內(nèi)的游離藥物，奎寧包封率為86.41%，載藥量為2.88%。
[0060]細(xì)胞毒性對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0061]將作為對(duì)照組I的游離硫酸長(zhǎng)春新堿水溶液和作為對(duì)照組2的游離一鹽酸奎寧水溶液、對(duì)比例制備的脂質(zhì)體、實(shí)施例制備的各種長(zhǎng)春新堿類藥物和奎寧類藥物不同比例的脂質(zhì)體分別用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用MTT (噻唑藍(lán))比色法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，步驟如下:
[0062]對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的的癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化、含0.05%吐溫-20的PBS緩沖液(即:含
0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液)洗滌、離心后將其制備成濃度為IX 104/ml~5 X 104/ml的細(xì)胞懸液，將該懸液按100 μ I/孔均勻加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1000~5000個(gè)。將細(xì)胞板置于37°C孵箱中，孵育24h，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞融合貼壁生長(zhǎng)。分別將載藥脂質(zhì)體及奎寧溶于生理鹽水中，所有溶液以其中長(zhǎng)春新堿的含量為基準(zhǔn)，稀釋成不同濃度，向上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入上述不同濃度的長(zhǎng)春新堿溶液25ul/孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入32 μ I濃度為5mg/ml噻唑藍(lán)(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出上清液，加Λ 200 μ I 二甲基亞砜(DMS0)，然后振搖5min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570nm處的OD值，記錄結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)3次，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。
[0063]IC50即50%抑制濃度或半抑制濃度，是抑制半數(shù)癌細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)的藥物濃度，IC50值越低，說(shuō)明細(xì)胞毒性作用越大。試驗(yàn)中IC5tl值由IC5tl.exe軟件計(jì)算得到。并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同一奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物比例，不同種類的磷脂和膽固醇對(duì)于IC5tl幾乎沒有影響。
[0064]對(duì)照組1、對(duì)照組2、對(duì)比例1、對(duì)比例2及實(shí)施例2、3、4和5制備的脂質(zhì)體對(duì)兩種敏感細(xì)胞株HCT-8 (結(jié)腸癌細(xì)胞)和MCF-7 (人乳腺癌細(xì)胞)及對(duì)應(yīng)的耐藥細(xì)胞株HCT-8/V和MCF-7/A的IC5tl ( μ g/ml)值，如表1和表2所示:
【權(quán)利要求】
1.一種奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，由藥物、磷脂、膽固醇類化合物和水相介質(zhì)組成；其中，藥物、磷脂和膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1:2~100:1~35 ； 所述的藥物為奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物； 所述的奎寧類藥物為奎寧、奎寧與酸所成的鹽中一種或多種； 所述的長(zhǎng)春新堿類藥物為硫酸長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春新堿中的一種； 所述的膽 固醇類化合物為膽固醇、聚乙二醇修飾的膽固醇中的一種或者兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的藥物、磷脂和膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1:6.6~40:1.6~25。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的藥物、磷脂和膽固醇類化合物的質(zhì)量比為1:6.6~25:1.6~4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的奎寧與酸所成的鹽為一鹽酸奎寧、二鹽酸奎寧、硫酸奎寧中的一種或兩種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的磷脂為天然磷脂、合成磷脂中的一種或兩種；所述的天然磷脂為大豆磷脂、卵磷脂中的一種或兩種；所述的合成磷脂為中性磷脂、負(fù)電性磷脂或聚乙二醇修飾磷脂中的一種或兩種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的合成磷脂為二豆蘧酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰甘油酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一種或兩種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的水相介質(zhì)為磷酸鹽緩沖系統(tǒng)或水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖系統(tǒng)為pH值為7.0~7.6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體，其特征在于，所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物的質(zhì)量比為I~100:1~100。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 將磷脂和膽固醇類化合物溶于有機(jī)溶劑中，再加入用有機(jī)溶劑溶解的藥物，充分溶解后混合均勻，除去有機(jī)溶劑，然后加入水相介質(zhì)混合均勻，分離出游離藥物，得到奎寧類藥物和長(zhǎng)春新堿類藥物共載脂質(zhì)體。
【文檔編號(hào)】A61K31/475GK103520159SQ201310459568
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】邱利焱, 許玉珍 申請(qǐng)人:邱利焱