一種沙棘黃酮的提取方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種沙棘黃酮的提取方法，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得含量有很大提高，本發(fā)明還提供了提供沙棘黃酮在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖藥物中的應用和制備增加骨密度藥物中的應用。
【專利說明】一種沙棘黃酮的提取方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種沙棘黃酮的提取方法及應用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物沙棘為胡頹子科沙棘屬，是一種落葉性灌木，其特性是耐旱，抗風沙，可以在鹽堿化土地上生存，因此被廣泛用于水土保持。國內(nèi)分布于華北、西北、西南等地。沙棘為藥食同源植物。沙棘的根、莖、葉、花、果，特別是沙棘果實含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，可以廣泛應用于食品、醫(yī)藥、輕工、航天、農(nóng)牧魚業(yè)等國民經(jīng)濟的許多領(lǐng)域。沙棘果實入藥具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究，沙棘可降低膽固醇，緩解心絞痛發(fā)作，還有防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。
[0003]沙棘黃酮是主要含異鼠李素(isorhamnetin)、異鼠李素-3-B-D-葡萄糖式(isorhamnetin-3-B-D-glucoside)、異鼠李素-3-B-蕓香糖式 (isorhamnetin-3-B-rutinoside)、槲角素及山奈酹的低糖式(oligosides)。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有沙棘黃酮在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的聯(lián)合應用報道，而目前的提取方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種沙棘黃酮的提取方法。
[0006]本發(fā)明的另一個目的在于提供沙棘黃酮在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞 S180細胞增殖藥物中的應用和制備增加骨密度藥物中的應用。
[0007]技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的:
[0008]一種沙棘黃酮的提取方法，取沙棘，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，CO2流量 l-3ml/g生藥? min,萃取時間150_180min,得超臨界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5 倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物。
[0009]上述沙棘黃酮的提取方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
[0010]上述沙棘黃酮的提取方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2 流量2ml/g生藥? min,萃取時間160min。
[0011]上述沙棘黃酮的提取方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
[0012]上述沙棘黃酮在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖藥物中的應用，沙棘黃酮的提取步驟為:取沙棘，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，CO2流量l_3ml/g生藥? min，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物。
[0013]上述沙棘黃酮在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖藥物中的應用，沙棘黃酮的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%， 所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥? min，萃取時間 160min,所述微波萃取功率500W,每次萃取6分鐘。
[0014]上述沙棘黃酮在制備增加骨密度藥物中的應用，沙棘黃酮的提取步驟為:取沙棘， 加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%， 萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l_3ml/g生藥? min，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到 DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物。
[0015]上述沙棘黃酮在制備增加骨密度藥物中的應用，沙棘黃酮的提取方法中所述CO2 超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力 20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥.min,萃取時間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
[0016]現(xiàn)有技術(shù)中，沙棘黃酮采用醇提的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導致患者用量過大，不方便服用，本發(fā)明制備的沙棘黃酮中異鼠李素得率增加，含量高，純度達53-56%，現(xiàn)有技術(shù)未發(fā)現(xiàn)其在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖藥物中的應用和制備增加骨密度藥物中的應用，表明本品有希望做成這樣的藥物。
【具體實施方式】
[0017]以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0018]實施例1
[0019]取沙棘lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥? min，萃取時間 150min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率 400W,萃取2次，每次4分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物，經(jīng)高效液相色譜法測定異鼠李素的含量為53.6%。
[0020]實施例2
[0021]取沙棘l000g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥? min，萃取時間 180min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W,萃取2次，每次8分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物，經(jīng)高效液相色譜法測定異鼠李素的含量為54.3%。
[0022]實施例3
[0023]取沙棘lOOOg，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥? min，萃取時間 160min，得超臨界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率 500W,萃取2次，每次6分鐘，每次加入的70%乙醇量為2000g，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物，經(jīng)高效液相色譜法測定異鼠李素的含量為55.2%。
[0024]上述實施例中沙棘為胡頹子科多年生灌木或喬木植物沙棘Hippophae rhamnoides Linn.的果實。
[0025]實施例4:沙棘黃酮抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖的實驗研究資料
[0026]I實驗材料
[0027]1.1實驗用細胞株
[0028]C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞(S180)，南京正亮醫(yī)藥科技有限公司實驗室細胞庫， DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0029]1.2實驗藥物
[0030]研究藥物:本發(fā)明沙棘黃酮:按實施例3方法制備。
[0031]藥液儲液:稱取IOOmg沙 棘黃酮，溶于5ml無水乙醇中，0.2 u m濾器過濾，500 U I doff管分裝，-20°C存儲，同時0.2 m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0032]1.3實驗試劑
[0033]DMEM (GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419)；NaHC03 (上海久億化學試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號:2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號:2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批號:2010382);無水乙醇(南京化學試劑有限公司批號:080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ; PBS (實驗室自配)；1.4實驗器材
[0034]萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號:DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD 公司型號:SPECTRA MAX190) ；C02培養(yǎng)箱(FORMA型號:3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號:SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號:S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號: DHG9123A);冰箱(西門子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號:KA-1000) ;0.2iim濾器(MILLIP0RE型號:SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0035]2實驗方法
[0036]I) S180 細胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)，當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3X 104個/ml。
[0037]2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180 U 1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
[0038]3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入得生片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0039]4) 24h 后加入 20 u I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 U I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。 6)同時設置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
[0041]7)結(jié)果以藥物對細胞的抑制率表示:
[0042]細胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
[0043]3統(tǒng)計處理
[0044]采用Microsoft Excel2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以 mean+ S.D.表不。
[0045]4實驗結(jié)果
[0046]MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對S180細胞增殖抑制有差異(P〈0.05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0.01)，當劑量達到 15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0.001)。
`[0047]表1沙棘黃酮對S180細胞增殖抑`制影響研究P:土 SD)
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種沙棘黃酮的提取方法，其特征在于取沙棘，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C， CO2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70% 乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫， 收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沙棘黃酮的提取方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沙棘黃酮的提取方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥? min,萃取時間160min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沙棘黃酮的提取方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W,每次萃取6分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沙棘黃酮在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖藥物中的應用，其特征在于沙棘黃酮的提取步驟為:取沙棘，加入`到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，加入70% 乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上， 50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種沙棘黃酮在制備抑制C57BL/6小鼠纖維肉瘤細胞S180細胞增殖藥物中的應用，其特征在于沙棘黃酮的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量 2ml/g生藥? min,萃取時間160min,所述微波萃取功率500W,每次萃取6分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種沙棘黃酮在制備增加骨密度藥物中的應用，其特征在于沙棘黃酮的提取步驟為:取沙棘，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥？min，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，每次加入的70%乙醇的量為藥材重量的2倍，得萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得沙棘黃酮提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種沙棘黃酮在制備增加骨密度藥物中的應用，其特征在于沙棘黃酮的提取方法中所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，所述CO2 超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥? min，萃取時間160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
【文檔編號】A61P35/00GK103494848SQ201310466687
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:南京正亮醫(yī)藥科技有限公司