一種防治老年癡呆的藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種防治老年癡呆的藥物，該藥物是乙酰左旋肉堿（ALC）。本發(fā)明揭示，乙酰左旋肉堿（ALC）能緩減老年性癡呆大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)骨架蛋白tau的異常過度磷酸化、能減少淀粉樣蛋白沉積并改善動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙。乙酰左旋肉堿（ALC）能用于老年性癡呆的預(yù)防和治療。
【專利說明】一種防治老年癡呆的藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及防治老年癡呆的藥物，具體涉及一種容易吸收和透過血腦屏障的藥物在防治老年性癡呆中的新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]老年性癡呆(Alzheimer Disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要癥狀表現(xiàn)為記憶力減退，認(rèn)知能力低下和思維遲鈍，且進(jìn)行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般8~10年。隨著社會老齡化進(jìn)程的加快，AD的患病人數(shù)急劇上升，已成為威脅老齡特別是高齡人口身心健康的嚴(yán)重疾病，并帶來了嚴(yán)重的社會、經(jīng)濟(jì)和家庭問題。
[0003]AD病人主要腦病理改變是形成大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)和大量老年斑、其分子標(biāo)志物分別是異常磷酸化的tau蛋白和β_淀粉樣蛋白(A-beta)。國外學(xué)者已采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在小鼠成功地復(fù)制出β_淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑樣病變，從而使得未來AD治療將減少A-beta沉積作為藥物干預(yù)的靶標(biāo)成為可能。NFTs的數(shù)量與AD臨床癡呆程度正相關(guān)。因此，干預(yù)NFTs對AD的防治尤為重要。自從發(fā)現(xiàn)NFTs的主要成分是異常、過度磷酸化的tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲以來，國內(nèi)外學(xué)者普遍公認(rèn)，骨架蛋白tau的異常、過度磷酸化是NFTs形成的關(guān)鍵步驟。過度磷酸化tau蛋白的聚集不僅以纏結(jié)的形式存在，它也是神經(jīng)氈纖絲和老年斑中的營養(yǎng)不良突起的主要成分。
[0004]目前尚沒有針對老年性癡呆病理特征的特效治療藥物和方法，常用的減緩老年癡呆發(fā)作藥物有:(I)改善膽堿神經(jīng)傳遞藥物:老年癡呆的一個(gè)主要原因是膽堿不足導(dǎo)致記憶衰退。因此乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑通過增強(qiáng)膽堿能作用在老年癡呆治療方面發(fā)揮了重要作用；(2)改善腦血液循環(huán)和腦細(xì)胞代謝的藥物:此類藥物可以擴(kuò)張腦血管以改善老年癡呆患者的糖、蛋白、核酸、脂質(zhì)等代謝障礙；(3)鈣拮抗劑:此類藥物易于通過血腦屏障，選擇性擴(kuò)張腦血管，從而改善記憶`和認(rèn)知功能；(4)激素類藥物:主要緩解女性患者的癥狀。然而，這些藥物僅對中晚期老年性癡呆患者的癡呆癥狀有所輕度改善或延緩癡呆進(jìn)展。因此研發(fā)新的針對老年性癡呆病理學(xué)特征的藥物，成為全球的期待。
[0005]乙酰左旋肉堿(ALC)作為一種重要的食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑，在許多方面得到了廣泛應(yīng)用包括:嬰幼兒食品，減肥食品和運(yùn)動(dòng)員食品等。嬰幼兒合成乙酰左旋肉堿的能力只有成人的15%，市場上以大豆蛋白為基礎(chǔ)的嬰幼兒配方食品和以谷物為主的斷奶食品中，幾乎沒有肉堿。目前已有22個(gè)國家在嬰幼兒奶粉中加入乙酰左旋肉堿。大量的研究資料也證明，大腦和神經(jīng)組織中存有高濃度的乙酰左旋肉堿(ALC)，它可以穿過血腦屏障，提供腦細(xì)胞足夠的能量。隨著衰老的伴生，其含量也顯著的減少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的任務(wù)是提供一種用于預(yù)防和治療老年性癡呆藥物。
[0007]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的任務(wù)，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:[0008]本發(fā)明提供的用于預(yù)防和治療老年性癡呆藥物的藥物是乙酰左旋肉毒堿，乙酰左旋肉毒喊能用于制備預(yù)防和治療老年性癡呆的藥物。
[0009]本發(fā)明揭示了乙酰左旋肉堿(ALC)能緩減老年性癡呆大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)骨架蛋白tau的異常過度磷酸化、能減少淀粉樣蛋白沉積并改善動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙。乙酰左旋肉堿(ALC)能用于老年性癡呆的預(yù)防和治療。
[0010]實(shí)驗(yàn)資料:
[0011]本發(fā)明通過給大鼠注射乙酰左旋肉堿(ALC)，發(fā)現(xiàn)其可以改善AD樣動(dòng)物模型的老年斑、tau蛋白過度磷酸化與學(xué)習(xí)、記憶障礙。
[0012]具體操作步驟如下:
[0013]1.實(shí)驗(yàn)對象
[0014]雄性wistar大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，SPF級，體重250~320克，45只，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。隨機(jī)分為三組:①正常組(nor) 造模組(con)；③治療組(ALC);每組15只。
[0015]2.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?br> [0016]①正常組:不做處理。
[0017]②造模組:通過尾靜脈注射給予同型半胱氨酸(homocystin, Hcy),每天一次,持續(xù)14天，劑量為400 μ g/kg，構(gòu)建早老性癡呆動(dòng)物模型。
[0018]③治療組:通過大鼠尾靜脈注射同型半胱氨酸(homocystin, Hcy),劑量為400μ g/kg，每天I次，持續(xù)14天；然后大鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天,利量為50mg/kg。`
[0019]3.研究方法
[0020]大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力=Morris水迷宮訓(xùn)練及測試
[0021]海馬磷酸化tau陽性細(xì)胞的顯示:免疫印跡
[0022]海馬磷酸化tau的含量:免疫組化
[0023]海馬有毒性片段Αβ含量:酶聯(lián)免疫吸附法
[0024]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0025]* Ρ〈0.05，與正常組比較
[0026]** Ρ〈0.01，與正常組比較
[0027]# Ρ〈0.05，與造模組比較
[0028]## Ρ〈0.01，與造模組比較
[0029](I)Morris水迷宮訓(xùn)練及測試結(jié)果:見圖1。造模組(con)與正常組相比出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶障礙(圖1)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明水迷宮測試的潛伏期明顯延長，學(xué)習(xí)的時(shí)間延長(圖1)。造模組在目標(biāo)象限停留時(shí)間和距離以及穿越平臺的次數(shù)明顯減少(圖2)，說明記憶能力的減退，造模成功。治療組(ALC)與造模組(con)相比潛伏期時(shí)間變短，目標(biāo)象限停留次數(shù)和穿越平臺次數(shù)增加，其學(xué)習(xí)和記憶能力都得到了良好的改善。
[0030](2)Tau蛋白磷酸化組化結(jié)果:見圖3。正常(nor)組海馬神經(jīng)元排列致密，分層清晰，整齊有序，造模組(con)不僅陽性著色減少，而且海馬神經(jīng)元排列雜亂，乙酰左旋肉堿(ALC)處理組陽性細(xì)胞排列較造模組(con)整齊。造模組(con)腦內(nèi)三個(gè)磷酸化的tau位點(diǎn)絲氨酸214(pS214)，絲氨酸262(pS262)，絲氨酸396(pS396)細(xì)胞著色明顯增強(qiáng)，tau的磷酸化增強(qiáng)。乙酰左旋肉堿(ALC)處理后，治療組(ALC)這些位點(diǎn)的過度磷酸化水平降低。
[0031](3)Tau磷酸化免疫印跡結(jié)果:見圖4。與正常組(nor)相比較，造模組(con)大鼠的大腦海馬內(nèi)tau蛋白在絲氨酸198/199/202，蘇氨酸205，絲氨酸212，絲氨酸214，絲氨酸262，絲氨酸396，絲氨酸404位點(diǎn)，磷酸化水平明顯增高，乙酰左旋肉堿(ALC)處理后，tau磷酸化水平明顯下降。
[0032](4)酶聯(lián)免疫法檢測大鼠皮層Αβ含量:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組(nor)相比較，造模組(con)組大鼠的大腦皮層內(nèi)Αβ含量升高，乙酰左旋肉堿(ALC)處理后，Αβ含量明顯下降。
[0033]5.結(jié)論及用法建議:
[0034]以上結(jié)果顯示給予同型半胱氨酸(homocystin，Hcy)尾靜脈注射的老鼠水迷宮訓(xùn)練及檢測過程中平臺的潛伏期增加，穿越平臺次數(shù)明顯減少說明大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力損傷，檢測早老性癡呆相關(guān)指標(biāo)tau蛋白磷酸化以及Αβ含量后發(fā)現(xiàn)，tau蛋白的磷酸化水平顯著上升，Αβ含量也有明顯升高，這些早老性癡呆的相關(guān)特征的改變，說明大鼠早老性癡呆造模成功。
[0035]跟造模組相比較，在給與了乙酰左旋肉堿(ALC)處理后，檢測老鼠水迷宮行為學(xué)，其學(xué)習(xí)和記憶能力得到了有效的改善；同時(shí)，早老性癡呆相關(guān)指標(biāo)tau蛋白磷酸化以及Αβ含量和造模組比較也有明顯降低，說明乙酰左旋肉堿(ALC)能緩減老年性癡呆大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)骨架蛋白tau的異常過度磷酸化、能減少淀粉樣蛋白沉積并改善動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶障礙。乙酰左旋肉堿(ALC)能用于老年性癡呆的預(yù)防和治療。
[0036]參考徐舒云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，》在其附錄中有一個(gè)表，列出了人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值。我們可以算出大鼠劑量與人的比值:
[0037]大鼠體型系數(shù):0.09標(biāo)準(zhǔn)體重:200g=0.2kg
[0038]大鼠的折算系數(shù)=(體型系數(shù)大鼠*W大鼠2/3) / (體型系數(shù)人*W人2/3)
[0039]= (0.09*0.22/3) /0.1*702/3) *70Χ/0.4
[0040]=0.018
[0041]經(jīng)理論換算后，我們推薦臨床上人的使用劑量為lmg/d，治療階段推薦采用周期療法，連續(xù)服用21天，停用7天為一療程；以預(yù)防保健為主，可減半劑量至0.5mg/d,長期服用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1 為水迷宮測試?yán)鲜笥斡緦W(xué)習(xí)軌跡圖和潛伏期統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖中:**p〈0.01與正常組比較；##p〈0.01與造模組比較。正常組，不做任何處理；造模組，同型半胱氨酸(homocystin, Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型；治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天，劑量為50mg/kg。
[0043]雄性wistar大鼠隨機(jī)分為三組①正常組:不做處理造模組:同型半胱氨酸(homocystin, Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型,每天一次,持續(xù)14天,劑量為400 μ g/kg 治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天，劑量為50mg/kg ;分別進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練及測試。
[0044]實(shí)驗(yàn)所采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)包括圓形水池直徑120cm，高60cm ;圓柱形有機(jī)玻璃平臺直徑10cm，高40cm。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26±2°C，平臺放置于某一象限的中心位置，并沒于水面下約2cm。訓(xùn)練時(shí)將大鼠從任一象限1/2弧度處頭面向池壁輕放于水中，檢測其潛伏期(即大鼠從入水點(diǎn)起到找到平臺所用的時(shí)間)、路徑作為衡量大鼠學(xué)習(xí)記憶和測試成績的指標(biāo)。每只大鼠每天在4個(gè)象限共訓(xùn)練4次，每次游泳時(shí)限為60s，即在60s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，潛伏期記為60s，由測試者引導(dǎo)其上臺，休息30s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。首先訓(xùn)練時(shí)間為6天，在第7天的時(shí)候，記錄大鼠找到平臺期所需時(shí)間，記錄大鼠找到平臺所需潛伏期。
[0045]結(jié)果顯示跟正常組相比造模組大鼠游泳軌跡混亂，找到平臺所需潛伏期時(shí)間最長，說明大鼠學(xué)習(xí)能力受到損傷，在給予乙酰左旋肉堿(ALC)后，治療組大鼠跟造模組相比軌跡重新恢復(fù)簡單，潛伏期變短，學(xué)習(xí)能力得到明顯改善。(**P〈0.01，與正常組比較；##Ρ〈0.01，與造模組比較)
[0046]圖2為水迷宮測試?yán)鲜蟠┰狡脚_次數(shù)及時(shí)間和距離統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖中:*ρ〈0.05與正常組比較；#p〈0.01與正常組比較；#ρ〈0.05與造模組比較;##ρ<0.01與造模組比較。正常組，不做任何處理；造模組，同型半胱氨酸(homocystin，Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型；治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天，劑量為50mg/kg。
[0047]Morris水迷宮測試系統(tǒng)經(jīng)過6天訓(xùn)練，大鼠學(xué)會如何尋找平臺后。休息一天，去平臺，計(jì)算3分鐘內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間并分析其在平臺所在位置的穿越次數(shù)，以評價(jià)其記憶能力。
[0048]結(jié)果表明造模組大鼠穿越平臺的時(shí)間和距離最短，次數(shù)最少，說明造模組老鼠的記憶能力受到損害，不記得平臺的位置；治療組大鼠跟造模組相比穿越平臺的時(shí)間和距離恢復(fù)到正常一致，穿越平臺次數(shù)也相應(yīng)增加，其記憶能力在給予乙酰左旋肉堿(ALC)后得到明顯恢復(fù)。(*P〈0.05，與正常組比較；#P〈0.01，與正常組比較；#P〈0.05，與造模組比較；##Ρ〈0.01，與造模組比較)`[0049]圖3為大鼠海馬內(nèi)tau蛋白三個(gè)磷酸化位點(diǎn)pS396，pS214，pS262磷酸化免疫組化結(jié)果。
[0050]正常組,不做任何處理；造模組，同型半胱氨酸(homocystin, Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型；治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC),每天一次,持續(xù)14天,劑量為50mg/kg。
[0051]阿爾茲海默癥病人的腦內(nèi)往往伴隨著Tau的過度磷酸化，通過檢測tau蛋白磷酸化位點(diǎn)的磷酸化情況可以反映正常老鼠和阿爾茲海默癥模型老鼠的差異。
[0052]雄性wistar大鼠隨機(jī)分為三組①正常組:不做處理造模組:同型半胱氨酸(homocystin, Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天，劑量為50mg/kg。水迷宮訓(xùn)練完成后，用4%多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液(PB)進(jìn)行心臟灌注固定腦組織，待取出腦組織后再在上述固定液中后固定6h，即可作振蕩切片。免疫組化采用ABC法，二氨基聯(lián)苯氨(diaminobezidin, DAB)顯色。
[0053]正常(nor)組海馬神經(jīng)元排列致密，分層清晰，整齊有序，造模組(con)不僅陽性著色減少，而且海馬神經(jīng)元排列雜亂，乙酰左旋肉堿(ALC)處理組陽性細(xì)胞排列較造模組(con)整齊。造模組(con)腦內(nèi)三個(gè)磷酸化的tau位點(diǎn)絲氨酸214(pS214),絲氨酸262(pS262)，絲氨酸396(pS396)細(xì)胞著色明顯增強(qiáng)，tau的磷酸化增強(qiáng)。乙酰左旋肉堿(ALC)處理后，治療組(ALC)這些位點(diǎn)的過度磷酸化水平降低。
[0054]圖4為大鼠海馬內(nèi)tau蛋白磷酸化位點(diǎn)磷酸化水平免疫印跡結(jié)果。正常組，不做任何處理；造模組，同型半胱氨酸(homocystin, Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型；治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天，劑量為50mg/kg。
[0055]水迷宮訓(xùn)練完成后，頸椎脫臼斷頭處死大鼠，迅速取出大腦腦組織置于0-40C 0.05M Tris緩沖鹽溶液(TB, ρΗ7.0)內(nèi)，快速分離雙側(cè)海馬，制成10%的蛋白勻漿，在1000rmp離心5分鐘，取上清，測定蛋白含量后備用。
[0056]分別檢測tau蛋白不同位點(diǎn)的磷酸化水平，包括pS396，pS404，pS212，pS205 ;檢測非磷酸化位點(diǎn)taul的水平以及總tau R134d的水平變化。DMlA為內(nèi)參條帶，證明蛋白上樣量的一致性。通過與總tauR134d比較,造模組非磷酸化位點(diǎn)taul磷酸化水平明顯減少,磷酸化位點(diǎn)PS396，pS404, pS212，pS205磷酸化水平明顯增加，tau發(fā)生過度磷酸化；治療組給藥乙酰左旋肉堿(ALC)后，tau的過度磷酸化得到緩和，恢復(fù)和正常組相近水平。
[0057]圖5酶聯(lián)免疫法測定大鼠皮層Αβ水平結(jié)果。圖中:**p〈0.01與正常組比較；##p<0.01與造模組比較。正常組,不做任何處理；造模組，同型半胱氨酸(homocystin,Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型；治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC),每天一次,持續(xù)14天,劑量為50mg/kg。
[0058]樣品制備同免疫印跡，用Αβ 1-40或Αβ 1-42的抗體進(jìn)行包被后漂洗，加入樣品，用四甲基聯(lián)苯胺(3, 3’，5, 5’-tetramethylbenzidine, TMB)顯色，并在分光光度計(jì)上波長450nm讀數(shù)。
[0059]阿爾茲海默癥病人的另一病理學(xué)特征是腦內(nèi)Αβ的聚集，Αβ的產(chǎn)生是由于對其前體APP的剪切錯(cuò)誤導(dǎo)致的，可以產(chǎn)生兩種剪切片段Αβ 1-40和Αβ 1-42。其中，Αβ 1-42具有較高的毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模組老鼠中Aβ 1-42片段的釋放明顯增多，乙酰左旋肉堿(ALC)治療后，治療組A β 1-42回到正常組A β 1_42釋放水平,進(jìn)一步證明乙酰左旋肉堿(ALC)能夠改善阿爾茲海默癥模型老鼠出現(xiàn)的病理特征。(**Ρ〈0.01，與正常組比較；##Ρ〈0.01，與造模組比較)
[0060]圖6為銀染大鼠皮層神經(jīng)元結(jié)果。正常組，不做任何處理；造模組，同型半胱氨酸(homocystin, Hcy)尾靜脈注射構(gòu)建阿爾茲海默病變老鼠模型；治療組:阿爾茲海默病變模型老鼠灌胃給予乙酰左旋肉堿(ALC)，每天一次，持續(xù)14天，劑量為50mg/kg。
[0061]樣品制備同免疫組化法，2% -4%硝酸銀孵育30min，用10&甲醛還原顯色。
[0062]銀染結(jié)果顯示，與正常組相比較，造模組大鼠皮層神經(jīng)元胞體出現(xiàn)明顯的嗜銀著色增強(qiáng)，提示有蛋白質(zhì)異常沉積，神經(jīng)元的退變；而灌胃處理乙酰左旋肉堿(ALC)后，治療組嗜銀著色減弱，神經(jīng)元退變 減少。
【權(quán)利要求】
1.乙酰左旋肉毒堿在制備用于預(yù)防和治療老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于預(yù)防和治療老年性癡呆藥物，其特征在于含有活性成分乙酰左旋肉毒堿。
3.一種用于預(yù)防和治療老年性癡呆的藥物制劑，其特征在于，它由作為活性成分的乙酰左旋肉毒堿和 藥學(xué)上可接受的載體和/或添加劑組成。
【文檔編號】A61P25/28GK103816143SQ201410082815
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】朱鈴強(qiáng), 譚璐, 周鵬, 王雄, 劉丹 申請人:華中科技大學(xué)