Vinexin-β基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種Vinexin-β基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用,屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以Vinexin-β基因敲除小鼠和心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象,通過阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌梗死模型,結(jié)果表明與WT對照小鼠對比,Vinexin-β基因敲除小鼠在MI術(shù)后心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯被抑制,心功能明顯好轉(zhuǎn);而心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯加重,心功能明顯惡化。從而發(fā)現(xiàn)Vinexin-β基因能夠促進(jìn)并加重冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生發(fā)展。因此,Vinexin-β可作為藥物靶標(biāo)篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物,Vinexin-β的抑制劑可用于制備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物。
【專利說明】Vi nex i η- β基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域,特別涉及一種Vinexin-β基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的功能和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見病和多發(fā)病,是人類健康的頭號殺手。缺血性心臟病是造成心血管疾病死亡最主要的原因,心肌梗死(myocardialinfarction, Ml)是缺血性心臟病的常見類型,心肌的血液供應(yīng)阻斷30分鐘以上就會引起各細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的改變和功能障礙,導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆的損傷乃至死亡。在急性心肌梗死發(fā)作后的幾分鐘內(nèi),缺血中央?yún)^(qū)的心肌細(xì)胞便會由于缺血而死亡,是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病之一,近年來冠心病發(fā)病率和死亡率逐步上升?!吨袊难懿蟾?005》是我國發(fā)布的第一部中國心血管病權(quán)威報告,揭示了我國高血壓、血脂異常、肥胖、糖尿病人群的患病率逐年增加,而上述疾病均為冠心病危險因素,冠心病已經(jīng)成為威脅我國人民健康的主要疾病。
[0003]在心肌梗死急性期,梗死區(qū)心肌呈凝固性壞死,心肌間質(zhì)充血、水腫,伴多量炎癥細(xì)胞浸潤。急性期過后,隨著 支持心肌細(xì)胞的膠原基質(zhì)分解,壞死的心肌細(xì)胞發(fā)生滑脫,壞死組織伸展隨后變薄,這是導(dǎo)致早期的左心室擴(kuò)張原因之一,而非壞死區(qū)心肌間質(zhì)也因神經(jīng)內(nèi)分泌的影響發(fā)生重構(gòu)致使心臟的收縮和舒張功能受損并最終導(dǎo)致心力衰竭。心肌發(fā)生梗死后僅有少量心肌細(xì)胞發(fā)生分裂增生,無法有效、完整的修復(fù)心肌組織,因此,梗死區(qū)心肌只能通過纖維組織增生,由無收縮功能的疤痕組織代替,進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的心律失常、心功能不全甚至是死亡。如何讓越來越多的冠心病人得到更有效的治療,達(dá)到降低其病死率,提高生活質(zhì)量的目的,已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的問題。因此對于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物的開發(fā)顯得尤為重要。
[0004]Vinexin和其結(jié)合蛋白粘著斑蛋白(vinculin)是組成細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的重要組成成分,Vinexin與vinculin的結(jié)合直接影響粘著斑的形成,并調(diào)控細(xì)胞_細(xì)胞、細(xì)胞-胞外基質(zhì)的粘附,并最終影響細(xì)胞的遷移、分化、分裂和凋亡等一系列重要細(xì)胞行為。Vinexin包括3個亞型,Vinexin-α , β and Y ,這3種亞型的蛋白都在其N端有一個SoHo (sorbinhomology)結(jié)構(gòu)域和C端的三個SH3 (srchomology 3)結(jié)構(gòu)域,分子結(jié)構(gòu)都高度保守。Vinexin-β在多處表達(dá),尤其在心臟的表達(dá)水平很高。我們研究發(fā)現(xiàn)Vinexin-β基因敲除的小鼠,對主動脈縮窄手術(shù)所引起的心肌肥厚反應(yīng)更加敏感,這表明Vinexin-β在高負(fù)荷所引起的心肌重構(gòu)和衰竭反應(yīng)中是一個很重要的調(diào)節(jié)蛋白(Ke Chen, et al.Vinexin-βprotects against cardiac hypertrophy by blocking the Akt—dependentsignalling pathway.Basic Res Cardiol, 2013,108:338)。到目前為止國際上無文獻(xiàn)報道有關(guān)Vinexin-β基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中應(yīng)用的內(nèi)容。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足,本發(fā)明的目的是確定Vinexin-β基因的表達(dá)與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病之間的相互關(guān)系,提供一種Vinexin-β作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用,進(jìn)而提供一種Vinexin-β的抑制劑在制備保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明以Vinexin-β基因敲除小鼠和心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象,通過阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌梗死模型,結(jié)果表明與WT小鼠(對照組)相比,Vinexin-β基因敲除小鼠死亡率明顯降低,心臟梗死面積明顯減少,心肌肥厚和纖維化的程度明顯減輕,心功能明顯好轉(zhuǎn);而心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠的死亡率明顯升高,心臟梗死面積則明顯增加,且心肌肥厚和纖維化的程度明顯加重。這提示Vinexin-β具有惡化心臟功能的作用,能加重促進(jìn)心肌梗死、心肌肥厚及纖維化的發(fā)展,為研究防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的新靶點和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0007]因此,Vinexin-β基因可作為藥物靶點,構(gòu)建Vinexin-β基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動物模型,用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物;Vinexin-β基因也可作為基因治療中的靶基因,設(shè)計并制備預(yù)防、緩解和/或治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物和/或生物學(xué)試劑,通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的目的。例如以Vinexin-β為靶基因,設(shè)計可干擾Vinexin-β表達(dá)的雙鏈siRNA,通過化學(xué)方法合成以后,注射入人體通過RNA干擾的方法使Vinexin-β基因沉默來治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。贿€可以設(shè)計并構(gòu)建Vinexin-β的突變體,注射后進(jìn)入細(xì)胞,競爭Vinexin-β原形的作用底物,從而抑制Vinexin-β的功能,起到治療目的;此外,還可以以Vinexin-β為祀點設(shè)計小分子化合物抑制劑,利用Vinexin-β基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動物模型,通過篩選,發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制Vinexin-β的分子,從而為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療提供新的治療性分子。
[0008]針對Vinexin-β的上述功能,提供Vinexin-β作為藥物祀標(biāo)在篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物中的應(yīng)用。
[0009]針對Vinexin-β的上述功能,提供Vinexin-β的抑制劑在制備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物中的應(yīng)用。
[0010]一種保護(hù)心臟功能的藥物,包含Vinexin-β的抑制劑。
[0011]一種治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物,包含Vinexin-β的抑制劑。
[0012]所述的Vinexin-β的抑制劑優(yōu)選為Vinexin-β基因的siRNA、Vinexin-β基因的RNA干擾載體,Vinexin-β的抗體及其他能夠抑制Vinexin-β表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0013]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Vinexin-β的新功能,即Vinexin-β能夠惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。
[0014]2.基于Vinexin-β在惡化冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的功能,為研制冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物 提供靶標(biāo)。
[0015]3.Vinexin-β的抑制劑可用于制備保護(hù)心臟功能和治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物?!緦@綀D】
【附圖說明】
[0016]圖1是各組小鼠的生存曲線圖。
[0017]A為WT和Vinexin-β-KO小鼠的生存曲線圖;
B為NTG和Vinexin-^-TG小鼠的生存曲線圖;
圖2是WT和Vinexin-β -KO小鼠的表型結(jié)果圖。
[0018]A為小鼠心身比、肺身比及心脛比的統(tǒng)計柱狀圖;
B為心臟組織HE染色、梗死比例及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計柱狀圖;
C為心臟組織天狼星紅染色及膠原容積比例統(tǒng)計柱狀圖;1W指I周;
圖3是NTG和Vinexin-P-TG小鼠的表型結(jié)果圖。
[0019]A為小鼠心身比、肺身比及心脛比的統(tǒng)計柱狀圖; B為心臟組織HE染色、梗死比例及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計柱狀圖;
C為心臟組織天狼星紅染色及膠原容積比例統(tǒng)計柱狀圖;1W指I周;
圖4是WT和Vinexin-β -KO小鼠的心功能檢測結(jié)果圖。
[0020]A為超聲檢測心功能結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖;
B為PV檢測血流動力學(xué)結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖;IW指I周;
圖5是NTG和Vinexin-P-TG小鼠的心功能檢測結(jié)果圖。
[0021]A為超聲檢測心功能結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖;
B為PV檢測血流動力學(xué)結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖;1W指I周。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0023]實驗用動物及飼養(yǎng)
實驗動物:8-10周齡、體重在23.5-27.5g,背景為C57BL/6品系的心臟特異性Cre小鼠(WT,購自Jackson Laboratory,貨號005650)、心臟特異性Vinexin-β基因敲除小鼠(Vinexin- β -Κ0,購自日本RIKEN公司,貨號:01732)、心臟特異性Vinexin- β轉(zhuǎn)基因小鼠(Vinexin- β -TG,心臟特異性Vinexin- β轉(zhuǎn)基因小鼠由武漢大學(xué)心血管病研究所李紅良教授實驗室構(gòu)建)及非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG,同窩對照非轉(zhuǎn)基因小鼠)為實驗對象。
[0024]心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建如下:
轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建信息:擴(kuò)增人Vinexin-β全長基因(NCBI,Gene ID: 10174,ΧΜ_005273370.2),把cDNA連接于心肌肌球蛋白重鏈(a -MHC)啟動子下游,將構(gòu)建的序列通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景),得到心臟特異性Vinexin-P-TG老鼠。上述轉(zhuǎn)基因小鼠制備參照下述文獻(xiàn)制備:Ke Chen ,Lu Gao ,Yu Liu, Yan Zhang,Ding-ShengJiang , Xiang Wei et al.Vinexin-β protects against cardiac hypertrophy byblocking the Akt—dependent signalling pathway.Basic Research in Cardiology(2013) 108:338)
飼養(yǎng)環(huán)境:所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級實驗動物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。飼養(yǎng)條件:室溫在22-24°C之間,濕度在40-70%之間,明暗交替照明時間為12h,自由飲水?dāng)z食。
[0025]【實施例1】心肌梗死(MI)模型獲得
1.實驗動物分組:雄性C57BL/6背景小鼠(WT)、Vinexin-β基因敲除小鼠(Vinexin- β -Κ0)及心臟特異性Vinexin- β轉(zhuǎn)基因小鼠(Vinexin- β -TG)和非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG),通過結(jié)扎小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌梗死(MI)模型。隨機(jī)分為8組,每組:C57BL/6背景WT小鼠假手術(shù)組(WT Sham)及MI術(shù)組(WT MI),Vinexin-β基因敲除小鼠假手術(shù)組(Vinexin-β-KO Sham)及MI術(shù)組(Vinexin-β-KO MI)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(NTG Sham)及MI術(shù)組(NTG MI)、心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(Vinexin-β -TG Sham)及 MI 術(shù)組(Vinexin-β-TG MI)。
[0026]2.MI模型采用阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌梗死,模型操作流程:
2.1稱重麻醉備皮:用電子天平于動態(tài)模式下準(zhǔn)確稱取小鼠體重(g),用雙蒸水準(zhǔn)確配置3%戊巴比妥鈉溶液,輕輕搖動使其充分溶解,采用80mg/kg體重劑量,計算所需戊巴比妥鈉溶液體積后用ImL注射器準(zhǔn)確抽取相應(yīng)體積溶液,行腹腔注射麻醉小鼠,待小鼠充分麻醉倒(約3min)后,用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛發(fā)(充分暴露手術(shù)區(qū))。
[0027]2.2氣管插管:麻醉一定時間(約20_30min)后,夾趾檢測無反應(yīng)即可開始手術(shù)。打開外置光源、顯微鏡開關(guān),打開呼吸機(jī),設(shè)置好各參數(shù)(呼吸頻率lOObpm、恒壓16-17mmHg),將小鼠門齒用橡皮筋固定在自制斜面上,外置光源照向小鼠頸部,眼科鑷?yán)鲂∈笊囝^,調(diào)節(jié)光源亮度及位置,此時可見小鼠聲門隨呼吸呈開閉運(yùn)動,聲門開啟時將氣管插管沿聲門送入氣管,取下小鼠接上呼吸機(jī),觀察小鼠呼吸狀況,胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致表示插管成功,即可進(jìn)行下步手術(shù),整個手術(shù)過程用加熱墊維持小鼠體溫在37°C左右。
[0028]2.3開胸:小鼠采用右側(cè)臥位,用醫(yī)用膠帶固定好小鼠四肢(左前肢位于右前肢前以充分暴露手術(shù)區(qū)),用醫(yī)用碘酊及75%醫(yī)用酒精對手術(shù)區(qū)皮膚進(jìn)行消毒清潔處理,用眼科剪在左前肢下0.5cm處沿肋骨走向剪開皮膚,逐層分離筋膜、肌肉等組織(盡量避開較大血管,若不能避免則先行阻斷再剪斷血管),用顯微剪于三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟,用顯微直鑷輕輕夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包,充分暴露左冠狀動脈前降支(LAD)或所在區(qū)域。
[0029]2.4結(jié)扎冠狀動脈:于顯微鏡下找到LAD走向或可能所在位置(小鼠LAD走行于左心耳與肺動脈圓錐間,多發(fā)出于左心耳下緣處),用無齒持針器持取7-0帶針縫合線,于左心耳下緣Imm處進(jìn)針,肺動脈圓錐旁出針,進(jìn)針深度0.5mm,寬度為1mm,縫線從LAD下方穿過,穩(wěn)定5s后,在心臟表面結(jié)扎處放置一長度2mm,大小為10號的聚乙烯塑料棒(要求表面光滑,大小為取出棒后結(jié)扎線不會壓迫血管),后在其上打一活結(jié),輕拉以結(jié)扎LAD (力度以能完全阻斷LAD血流為準(zhǔn),寧輕勿重),剪去線頭,結(jié)扎成功,則可見左室前壁明顯由鮮紅色變?yōu)樯n白而不再恢復(fù),同時心電圖顯示sT段抬高和(或)T波高聳或者倒置呈弓背向上單向曲線。6-0縫線完全縫合胸腔開口關(guān)閉胸腔,5ml注射器接套管經(jīng)切口插入胸腔,抽取ImL氣體,平整各層肌肉,合攏皮膚切口暫不縫合(Sham組不結(jié)扎LAD,直接關(guān)胸)。
[0030]2.5關(guān)胸:結(jié)扎完成后,6-0縫線完全縫合胸腔開口(保證無縫隙、無錯位)關(guān)閉胸腔,5mL注射器接套管經(jīng)切口插入胸腔,抽取ImL氣體,6-0縫線由內(nèi)向外逐層縫合各層肌肉,后用5-0縫線將皮膚切口縫合完整。[0031]2.6術(shù)后管理:術(shù)后密切關(guān)注小鼠狀態(tài),有無呼吸異常等。待小鼠自然蘇醒后將小鼠從呼吸機(jī)上取下并取下氣管插管,放入干凈的飼養(yǎng)籠,填寫手術(shù)記錄卡片,放回IVC籠架飼養(yǎng),密切關(guān)注小鼠術(shù)后狀態(tài)以及死亡情況并做好相應(yīng)記錄。
[0032]小鼠心肌梗死模型建立的過程中Sham組均無死亡老鼠,WT MI組有34只小鼠納入實驗,在術(shù)后I周(IW)的時間里死亡17只小鼠;Vinexin-e -KO MI組有21只小鼠納入實驗,術(shù)后I周(1W)死亡5只小鼠;NTG MI組有29只小鼠納入實驗,術(shù)后I周(1W)死亡15只小鼠;TG MI組有50只小鼠納入實驗,術(shù)后I周(IW)死亡39只小鼠。
[0033]通過術(shù)后各組小鼠生存狀況的統(tǒng)計,可以發(fā)現(xiàn)Vinexin-β-ΚΟ MI組小鼠的死亡率明顯低于其對照組WT小鼠,Vinexin-P-TG MI的死亡率則明顯高于NTG MI組。應(yīng)用軟件Graph Pad Prism 5繪制各組小鼠的生存曲線(見圖1 ),結(jié)果表明Vinexin-β-KO MI的生存率明顯高于WT MI組,而Sham組無死亡老鼠,沒有明顯差異(Α),相反同樣Vinexin-P-TGMI的生存率則明顯低于NTG MI組(B),說明Vinexin-β-ΚΟ MI組小鼠較低的死亡率可能是由于Vinexin-β基因的缺失而引起的。
[0034]【實施例2】小鼠心肌梗死(MI)模型心臟梗死比例、心肌肥厚及纖維化檢測
1.取材
(I)前期工作:預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的10%甲醛的尿杯,并貼好標(biāo)簽(小鼠編號、組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M10%KC1溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開分析天平,調(diào)零備用,再稱重處死小鼠。
[0035](2)取材:眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂,剪下心臟,迅速置于10%KC1溶液中。待心臟停跳在舒張期后,置于滅菌紗布上,輕輕擠壓心腔內(nèi)液體,蘸干表面液體后,稱重并記錄,將心臟放入相應(yīng)的尿杯中,固定48h后用于病理學(xué)檢測。
[0036](3)相關(guān)測量及計算:取出小鼠肺臟,修剪后濾紙吸干,稱重并記錄。剪開小鼠后肢脛骨處皮膚,測量并記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值(HW/BW),肺重與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值(HW/TL)。
[0037]2.病理學(xué)檢測
2.1制備石臘標(biāo)本切片
由實驗室專業(yè)病理工作人員制備石蠟標(biāo)本切片,主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0038]2.2蘇木精-伊紅(HE )染色 主要步驟為:
55 0C 烘烤 30min — 二甲苯 5min,3 次一100% 酒精 Imin — 95% 酒精 Imin — 70% 酒精I(xiàn)min —雙蒸水Imin —蘇木素溶液5min —水洗Imin — 1%鹽酸酒精l_3s —水洗Imin — Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水100ml) Imin —水洗Imin —伊紅溶液3-5min —蒸餾水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s — 95%酒精I(xiàn)s — 100%酒精30s,3次一二甲苯2min,3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干,顯微鏡拍照。
[0039]心臟梗死比例大小的計算參照公式如下:
梗死比例=心梗區(qū)域的左心室心內(nèi)膜長度/左心室完整心內(nèi)膜周長X100%
心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計:每張圖片選擇3個以上邊界清楚,核大致位于中央的細(xì)胞,用Image-Pro Plus 6.0軟件圈細(xì)胞面積。[0040]2.3天狼星紅(PSR)染色 主要步驟為:
55°C烘烤 30min — 二甲苯 2min,3 次一100% 酒精 Imin — 95% 酒精 Imin — 70% 酒精I(xiàn)min —流水沖洗IOmin —雙蒸水Imin — 0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上,濕盒中染色90min —去除殘液一0.01N鹽酸4s — 70%酒精I(xiàn)次一90%酒精I(xiàn)次—100%酒精30s,3次一二甲苯2min,3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片,顯微鏡拍照。
[0041]PSR染色圖片統(tǒng)計:左室膠原容積分?jǐn)?shù)比例=膠原面積/總面積X 100%ο
[0042]HE染色結(jié)果可見,Sham組心肌排列整齊、細(xì)胞質(zhì)豐富均勻、間質(zhì)正常;MI組部分心肌細(xì)胞核丟失、心肌細(xì)胞呈空泡樣變、梗死區(qū)可見心肌組織紊亂、梗死區(qū)心肌細(xì)胞消失,代之以纖維瘢痕組織。
[0043]WT和Vinexin-β -KO小鼠MI模型后的表型結(jié)果見圖2。Sham組中WT小鼠和KO小鼠的服/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;WT小鼠MI術(shù)后I周的HW/BW、LW/BW.HW/TL高于其Sham組;MI術(shù)后I周,KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較WT小鼠明顯降低(A)。HE染色切片可觀察到:大體可見MI術(shù)后I周(IW)梗死區(qū)明顯變薄、成白色且疤痕,高倍顯微鏡可觀察到Sham組心肌肌原纖維細(xì)胞排列整齊、致密,形態(tài)完整,胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰;MI組肌絲排列紊亂、松散,心肌細(xì)胞體積明顯增大,形態(tài)不規(guī)整,胞核深染、增大、畸形,核仁模糊,而KO組則無WT組明顯;KO小鼠MI術(shù)后心肌梗死比例、心肌細(xì)胞橫截面積均小于MI組WT小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(B)。PSR染色后,我們發(fā)現(xiàn)MI組心室心肌間質(zhì)膠原含量較Sham組增加,膠原增粗,排列紊亂成網(wǎng)絡(luò)狀;K0小鼠MI術(shù)后膠原含量較WT小鼠MI術(shù)后增加較少;Sham組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(C)。
[0044]圖3是NTG和Vinexin-P-TG小鼠MI模型后的表型結(jié)果。同樣TG小鼠MI術(shù)后I周的 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL 高于其 Sham 組;MI 術(shù)后 I 周 TG 小鼠的 HW/BW、LW/BWL 及 HW/TL增大的程度明顯高于NTG小鼠(A)。HE染色切片表明,Sham組均無明顯梗死,MI術(shù)后TG小鼠的梗死比例遠(yuǎn)大于NTG組,MI組較Sham組的心臟均增大,且MI術(shù)后TG小鼠心臟增大的程度遠(yuǎn)大于NTG小鼠,同時可觀察到:TG小鼠MI術(shù)后心肌細(xì)胞橫截面積也大于Sham組,同時顯著高于NTG小鼠MI組(B)。PSR染色可見,TG小鼠MI術(shù)后心肌間質(zhì)膠原含量遠(yuǎn)大于NTG小鼠MI組(C)。
[0045]【實施例3】心肌梗死(MI)模型小鼠心功能檢測 I超聲檢測心功能
1.1前期準(zhǔn)備
(I)麻醉機(jī)準(zhǔn)備:先連接氧氣瓶和麻醉機(jī)上的進(jìn)氣接口,再擰開麻醉機(jī)上加藥口密封蓋,迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門,調(diào)整流量控制閥的旋鈕,出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。
[0046](2)待測小鼠準(zhǔn)備:待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后,左胸前區(qū)剃毛,將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi),以1.5-2.0%異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。
[0047]1.2心功能檢測
小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位,并在剃毛區(qū)均勻涂抹耦合劑。采用高頻超聲診斷儀,頻率為15MHz,選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面,測量小鼠心率(HR)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS)。[0048]2 PV檢測血流動力學(xué)
2.1前期準(zhǔn)備
(I)麻醉機(jī)準(zhǔn)備:同超聲檢測心功能部分。
[0049](2)待測小鼠準(zhǔn)備:待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后,頸部手術(shù)區(qū)剃毛,并用濕紗布擦拭去毛。將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi),以1.5-2.0%異氟烷以維持麻醉深度,避免麻醉過深或過淺。
[0050]2.2 PV 檢測
碘酒及75%酒精消毒后,剪開小鼠頸部皮膚,依次分離肌肉和軟組織,并游離出右頸總動脈,于血管下穿過雙線并結(jié)扎遠(yuǎn)心端,同時活結(jié)結(jié)扎近心端。用血管剪在遠(yuǎn)心端剪一切口(1/3-1/2管徑),于體視顯微鏡下將Millarl.4F超微導(dǎo)管迅速插入右頸總動脈,同時穿一縫線將導(dǎo)管和血管結(jié)扎。打開近心端活結(jié),將導(dǎo)管沿右頸總動脈-升主動脈插入左心室內(nèi),連接Powerlab生物信號采集處理系統(tǒng)。觀察記錄儀上波形情況,調(diào)節(jié)導(dǎo)管的位置使波形圖清晰且穩(wěn)定。監(jiān)測小鼠心率(HR)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室內(nèi)壓最大上升速率(dP/dt max)及左室內(nèi)壓最小上升速率(dP/dt min)等指標(biāo)。
[0051]本研究運(yùn)用M型超聲心動圖和血流動力學(xué)檢測評價心肌肥厚和心功能。由Laplace定理 可知:S=Pr/2h,P為心室內(nèi)壓,r為心腔內(nèi)徑,h為心壁厚度。在心臟壓力負(fù)荷過重的情況下,為適應(yīng)心臟做功增加,室壁厚度增加,左室室壁應(yīng)力增加,提高心臟收縮功能起到早期代償?shù)臋C(jī)制;但持續(xù)的壓力超負(fù)荷,可促進(jìn)心肌肥厚,導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死及凋亡,心臟的收縮和/或舒張功能受到損害,最終發(fā)展為慢性心力衰竭甚或心源性猝死。
[0052]圖4是WT和Vinexin- β -KO小鼠的超聲和PV檢測結(jié)果。與WT Sham組相比,WT小鼠MI術(shù)后I周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現(xiàn)為反映心肌肥厚的指標(biāo)LVEDd、LVESd增大,而反映心功能的指標(biāo)EF、FS則下降。MI術(shù)后I周,KO小鼠心肌肥厚的指標(biāo)增大的程度及反應(yīng)心功能的指標(biāo)下降的程度與WT小鼠相比較小,HR各組之間則無明顯差異。Sham組WT小鼠與KO小鼠的以上指標(biāo)之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(A)。通過血流動力學(xué)指標(biāo)的檢測,我們觀察到WT小鼠在MI術(shù)后I周的EF、dp/dt max和dp/dt min均比其Sham組降低,KO小鼠MI術(shù)后EF、dp/dt max和dp/dt min降低的程度較WT組小,且有統(tǒng)計學(xué)差異,HR在Sham組和MI組均無明顯差異(B)。因此Vinexin- β -KO小鼠MI術(shù)后較WT組的小鼠心功能明顯好轉(zhuǎn)。
[0053]圖5是NTG和VinexinUG小鼠的超聲和PV檢測結(jié)果。MI術(shù)后I周,與NTG小鼠相比,TG小鼠心肌肥厚的指標(biāo)LVEDcULVESd增大的程度及反應(yīng)心功能的指標(biāo)EF、FS下降的程度則大于NTG組。Sham組NTG小鼠與TG小鼠的以上指標(biāo)之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(A)。通過血流動力學(xué)指標(biāo)的檢測,我們觀察到MI術(shù)后I周NTG小鼠EF、dp/dt max和dp/dt min均比其Sham組降低,TG小鼠MI術(shù)后EF、dp/dt max和dp/dt min降低的程度則大于NTG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,HR各組均無明顯差異(B)。因此Vinexin-β -TG小鼠MI術(shù)后較NTG組的小鼠心功能明顯惡化。
[0054]我們的研究成果表明,Vinexin-β基因敲除后,小鼠心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯較WT組小鼠低,而心臟特異性Vinexin-β轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯升高。證明Vinexin-β基因在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病模型中有著重要的惡化作用。[0055]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式 ,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.Vinexin-β作為藥物祀標(biāo)在篩選保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。
2.Vinexin-β作為藥物靶標(biāo)在篩選治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物中的應(yīng)用。
3.Vinexin-β的抑制劑在制備保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。
4.一種保護(hù)心臟功能的藥物,其特征在于:包含Vinexin-β的抑制劑。
5.Vinexin-β的抑制劑在制備治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物中的應(yīng)用。
6.一種治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的藥物,其特征在于:包含Vinexin-β的抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的應(yīng)用,其特征在于:所述的Vinexin-β的抑制劑優(yōu)選為Vinexin- β基因的siRNA、Vinexin-β基因的RNA干擾載體或Vinexin-β的抗體及其他能夠抑制Vinexin-β表達(dá)的抑制劑中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的藥物,其特征在于:所述的Vinexin-β的抑制劑優(yōu)選為Vinexin- β基因的siRNA、Vinexin-β基因的RNA干擾載體或Vinexin-β的抗體及其他能夠抑制Vinexin-β 表達(dá)的抑制劑中的一種。
【文檔編號】A61K39/395GK103893763SQ201410144058
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】李紅良, 萬埝, 張艷, 蔣丁勝, 王丕曉 申請人:武漢大學(xué)