專利名稱：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物芯片，尤其涉及一種冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片。
背景技術(shù)：
一、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化研究背景介紹動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見(jiàn)的進(jìn)行性動(dòng)脈疾病，病變主要累及中等大小的肌層動(dòng)脈，動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，平滑肌細(xì)胞增生，形成局限性斑塊，可使動(dòng)脈壁變硬，嚴(yán)重時(shí)斑塊破裂導(dǎo)致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化血管并發(fā)癥的發(fā)生，老年患者中最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的血管并發(fā)癥是冠心病(不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗塞)和腦卒中。動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展主要經(jīng)歷了四個(gè)循序漸進(jìn)的病理過(guò)程1.脂質(zhì)浸潤(rùn)前期內(nèi)膜改變內(nèi)皮損傷。2.脂質(zhì)條紋泡沫細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞增生。3.纖維斑塊平滑肌纖維化，形成纖維帽。4.復(fù)合病變斑塊鈣化、破裂、潰瘍，中膜病變。動(dòng)脈粥樣硬化的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是動(dòng)脈壁的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分(特別是單核細(xì)胞、血小板和LDL(低密度脂蛋白))、局部血流動(dòng)力學(xué)、環(huán)境及遺傳因素之間一系列復(fù)雜作用的結(jié)果，因而病因并非是單一因素的。動(dòng)脈粥樣硬化作為多基因疾病， 發(fā)病原因不僅涉及到多個(gè)作用不同的基因，而且還涉及到基因-基因、基因-環(huán)境的相互作用?，F(xiàn)在關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理的學(xué)說(shuō)有很多，如滲入脂質(zhì)學(xué)說(shuō)、血管內(nèi)膜損傷學(xué)說(shuō)、 炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、氧化-抗氧化學(xué)說(shuō)及血栓形成學(xué)說(shuō)。所有這些學(xué)說(shuō)都涉及到不同的生物通路，但是現(xiàn)在還沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能夠在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)上得到完整的解釋。多年來(lái)，基于對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化致病危險(xiǎn)因素的長(zhǎng)期研究，科學(xué)家們針對(duì)這些危險(xiǎn)因素開(kāi)展了大量的工作。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶(ACE)和亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)的某些插入、缺失和突變可能使動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病致病的潛在危險(xiǎn)因素。前者是血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能的酶類之一，后者是一種與半胱氨酸代謝有關(guān)的酶。另外，德國(guó)科學(xué)家最近證實(shí)，ATl受體的表達(dá)水平與血管受損過(guò)程緊密聯(lián)系A(chǔ)CE抑制劑會(huì)減少ATl受體的激活，從而改善血管功能不良、 有效的抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。但長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究較多地集中于脂質(zhì)代謝通路中相關(guān)基因的突變及表達(dá)，如副氧酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等。在對(duì)內(nèi)源性一氧化氮合成酶(eNOQ的研究中，現(xiàn)在已有一些研究工作表明eNOS與動(dòng)脈粥樣硬化的緊密關(guān)聯(lián)。 另有美國(guó)科學(xué)家提出了炎癥機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中的作用，并在小鼠試驗(yàn)中得到了一定的證實(shí)。近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性(SNP)和單倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的廣泛運(yùn)用，為在分子水平上研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制開(kāi)辟了全新的思路。同時(shí)，高通量、低成本的SNP檢測(cè)手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)?？焖俜中吞峁┝丝赡?。日本科學(xué)家利用大規(guī)模的病例-對(duì)照研究對(duì)9萬(wàn)多個(gè)相關(guān)基因SNPs進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)50KB的單倍型區(qū)域與心肌梗塞密切相關(guān)，其中包括LTA(lymphotoxin-a ) ,NFKBIL1和 BATl等的多個(gè)SNP位點(diǎn)。在另一研究中，雖然P-選擇素(P-selectin)中S290N和N562D各自與心肌梗塞都沒(méi)有獨(dú)立相關(guān)性，但它們構(gòu)成的單倍型卻與心肌梗塞顯著相關(guān)。此外，SNP 的存在與否以及等位基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示我們多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。在對(duì)凝血因子V基因的研究中，中國(guó)人群中未能發(fā)現(xiàn)國(guó)外報(bào)道的與白人女性心肌梗塞發(fā)病具有相關(guān)性的VLeiden突變，卻發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的SNP_G/A16^ (Arg485Lys)突變與APCR及冠心病相關(guān)， 凝血因子V基因可能是中國(guó)人群動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)易感基因。另外，不同人群中SNP及其單倍型的類型和頻率存在的這種差異可能與不同人群對(duì)藥物及環(huán)境因素的反應(yīng)性不同密切相關(guān)。在過(guò)去的50多年來(lái)，大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和遺傳研究已經(jīng)對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化這一復(fù)雜疾病做了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)了一些易感基因與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，例如 ABCAU CYBA, ApoE, LDLR等。更多的與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)繼續(xù)在發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證中。二、基因簡(jiǎn)介UAL0X5AP (rs4468448)AL0X5AP基因位于染色體13ql2區(qū)域，編碼了 5-脂肪氧化酶，是白三烯合成所需的蛋白質(zhì)。白三烯是花生四烯酸在不同類型的炎癥反應(yīng)中的代謝產(chǎn)物，這些炎癥反應(yīng)，包括哮喘，關(guān)節(jié)炎和牛皮癬。這種蛋白質(zhì)定位于質(zhì)膜上，對(duì)其功能的抑制劑阻礙了 5-脂肪氧化酶從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)至細(xì)胞膜，從而抑制5-脂肪氧化酶激活。白三烯合成需要5-脂肪氧化酶。ALCK5錨定于膜表面。結(jié)合花生四烯酸，可以在將花生四烯酸轉(zhuǎn)移至5-脂肪氧化酶過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，如果綁定MK-886，這種化合物會(huì)阻止白三烯合成。2, HFE (rs6918586)HFE染色體定位于6p21. 3，由HFE編碼的蛋白質(zhì)是一種類似于MHC族I型蛋白的膜蛋白，并與beta2微球蛋白相關(guān)。這種蛋白質(zhì)的功能主要是通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)鐵的吸收。鐵儲(chǔ)存紊亂，遺傳性血色素沉著，是一種隱性遺傳性疾病，就是由于這一基因的缺陷所導(dǎo)致的。該基因已經(jīng)報(bào)道的剪接變體至少有9個(gè)。其他變異也被發(fā)現(xiàn)，但其全長(zhǎng)的性質(zhì)尚未確定。3、ITGA2(rs2287950、rs3212556、rsl445941)ITGA2(integrin，alpha 2)編碼整合素α 2鏈，該基因定位于5q23_q31。整合素是由α (120 18 和β (90 IlOkD)兩個(gè)亞單位形成的異二聚體。迄今已發(fā)現(xiàn)16種 α亞單位和9種β亞單位。它們按不同的組合構(gòu)成20余種整合素。α 2亞單位與β 亞單位形成的異二聚體，形成表達(dá)在血小板上的糖蛋白Ia/IIa。整合素是一類十分重要的蛋白質(zhì)受體，大多為親異性細(xì)胞粘附分子，其作用依賴于Ca2+，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，α鏈部分決定了它的配體特異性。絕大多數(shù)動(dòng)植物細(xì)胞均表達(dá)整合素。整合素的多樣性是通過(guò)改變一些整合素mRNA的剪切來(lái)完成的。整合素不同于其他的細(xì)胞表面受體，因?yàn)樗Y(jié)合配體的親和力都很低，在細(xì)胞表面表達(dá)的濃度很高。整合素僅僅可以通過(guò)在局部特定的位置利用最少數(shù)量的整合素來(lái)結(jié)合配體，這被叫做焦點(diǎn)接觸或hemidesmosomes。所以當(dāng)整合素廣泛的分布在細(xì)胞表面的時(shí)候， 并不存在粘附現(xiàn)象。但是當(dāng)整合素在一定區(qū)域聚集的時(shí)候，即焦點(diǎn)接觸，它們?cè)镜妮^弱的親和力在細(xì)胞表面的這個(gè)點(diǎn)得到了增強(qiáng)，這樣就使細(xì)胞具有足夠的粘附能力固定在細(xì)胞外基質(zhì)上面。這是一種非常好的狀態(tài)，因?yàn)榧?xì)胞可以通過(guò)這種方式松散地結(jié)合在大量的基質(zhì)分子上面，但是當(dāng)打破這種焦點(diǎn)接觸失去附著力之后，細(xì)胞仍然有機(jī)會(huì)進(jìn)入外環(huán)境。如果受體被很強(qiáng)的結(jié)合在配體上，細(xì)胞就可能別牢固地結(jié)合在基質(zhì)上，從而失去遷移的能力。4、LAMA4 (rs3777947、rsl016825)LAMA4(laminin, alpha 4)定位于6q21，該基因編碼層粘連蛋白A4。層粘連蛋白是一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白家族，是基質(zhì)膜中主要的非膠原組成。該蛋白涉及到多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞粘附、分化、遷移、信號(hào)傳導(dǎo)等。層粘連蛋白由3個(gè)不同的鏈組成(層粘連蛋白 α、β、Y)，他們形成三個(gè)短臂構(gòu)成的十字結(jié)構(gòu)，每一個(gè)層粘連蛋白鏈都是一個(gè)不同基因編碼的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。5、MMP13(rsl0502009)MMP13編碼了基質(zhì)金屬蛋白酶13，基因定位于llq22. 3，是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) 蛋白質(zhì)家族的成員?；|(zhì)金屬蛋白酶蛋白質(zhì)家族涉及在正常生理過(guò)程中降解細(xì)胞外基質(zhì)， 如胚胎發(fā)育，繁殖，組織重塑，此外在疾病過(guò)程中也同樣發(fā)揮作用，如關(guān)節(jié)炎和腫瘤轉(zhuǎn)移。大多數(shù)基質(zhì)金屬蛋白酶在被分泌時(shí)是無(wú)活性的蛋白前體，被胞外蛋白酶切割激活后發(fā)揮作用。MMP13基因編碼的蛋白質(zhì)，切割I(lǐng)I型膠原比I型和III型膠原更為有效。它可能參與了骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病理生理變化。6、PONl (rs854560、rs705378、rs854563、rs3917490)PONl (paraoxonase 1)是抗氧化酶系統(tǒng)的重要成員之一，染色體定位于7q21. 3， 編碼二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶，是PON基因家族中的重要成員。二乙基對(duì)硝基苯磷酸酯酶可以水解paroxon產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚。HDL廣泛的分布于各種組織液中，HDL能夠接受并解除脂質(zhì)過(guò)氧化物的毒性，起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用，同時(shí)可以保護(hù)LDL免受氧化變異的影響。 PONl在血清中專門位于HDL上，它可以水解有機(jī)磷酸鹽底物(如磷酸二乙基對(duì)硝基苯基酯)，這點(diǎn)是HDL具備代謝脂質(zhì)過(guò)氧化物和避免其在LDL上累積作用最為可能的解釋。PONl 基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)提示PONl可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有潛在的保護(hù)作用。PONl可以加速磷脂過(guò)氧化物和血小板活化因子的降解，血小板活化因子乙酰水解酶活性可以獨(dú)立的預(yù)測(cè)冠心病。PONl在粥樣硬化進(jìn)展過(guò)程中動(dòng)脈管壁中的免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，最近研究表明在人類冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中PONl有在細(xì)胞外水解脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用。7、SDC2(rs2437770)由SDC2基因編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜(I型)硫酸乙酰肝素蛋白多糖，染色體定位于8q22-23，是體蛋白聚糖蛋白家族成員。體蛋白聚糖可以調(diào)控細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞信號(hào)、組織和細(xì)胞骨架。在體蛋白聚糖-2蛋白(SDC2)的功能，作為一個(gè)不可分割的膜蛋白和細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移的重要參與者，細(xì)胞通過(guò)其受體與細(xì)胞外基質(zhì)間發(fā)生相互作用。目前在幾個(gè)不同類型的腫瘤檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)體蛋白聚糖-2表達(dá)發(fā)生了改變。8、SDC4(rsl981429)SDC4染色體定位于20ql2，由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜(I型)的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，可以作為一個(gè)在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)受體。編碼的蛋白質(zhì)可以成為二聚體，是一個(gè)體蛋白聚糖蛋白家族的成員。9、THBS2(rs9283851、rs9379341、rsll758161)THBS2編碼的凝血酶2屬于凝血酶家族，染色體定位于6q27。這是一個(gè)二硫鍵相連同源三聚體糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用。這種蛋白質(zhì)已被證明作為一個(gè)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的抑制劑。小鼠研究表明，這種蛋白質(zhì)可以調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面性質(zhì)，并涉及到細(xì)胞粘附和遷移。10、VCAMl(rs3176876)VCAMl (vascular cell adhesion molecule 1)基因定位于 Ip32_p31，該基因編碼的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子I是一種細(xì)胞表面糖蛋白，它可以被細(xì)胞因子活化的內(nèi)皮激活表達(dá)， 屬于Ig超家族的成員。VCAMl參與細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用，介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮了極為關(guān)鍵的作用。正常的動(dòng)脈內(nèi)皮可以抵御白細(xì)胞的粘附作用，但是當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞被炎癥反應(yīng)激活之后，VCAMl就會(huì)在內(nèi)皮細(xì)胞表面大量表達(dá)，與單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)它們進(jìn)入內(nèi)皮層。存在高脂血癥時(shí)，修飾型的脂蛋白顆粒在動(dòng)脈內(nèi)膜累積，誘導(dǎo)了 VCAMl的在內(nèi)皮上的大量表達(dá)，從而激發(fā)了炎癥反應(yīng)，形成早期的動(dòng)脈粥樣斑塊。另外，一氧化氮水平也會(huì)抑制VCAMl的表達(dá)。VCAMl 突變動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明VCAMl表達(dá)的減少降低了粥樣硬化斑塊形成的風(fēng)險(xiǎn)。目前有關(guān)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的免疫學(xué)診斷產(chǎn)品及PCR產(chǎn)品單一標(biāo)志物檢測(cè)靈敏度和特異性存在不能兼顧的缺點(diǎn)，鑒于目前檢測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的傳統(tǒng)方法效果不佳， 有必要利用基因芯片技術(shù)開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基因芯片，從而能夠在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展早期即進(jìn)行有效診斷，以提高治愈率降低死亡率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，利用該特定的基因芯片檢測(cè)，對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(冠心病)預(yù)測(cè)和預(yù)警，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。為此， 本發(fā)明還提供該冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的制備方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。所述待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因至少包括一種或兩種以上的下述基因 AL0X5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、MMP13、P0N1、SDC2、SDC4、THBS2 禾口 VCAMl0所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要能完成與目的核苷酸序列特異性結(jié)合。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)40個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以20-30個(gè)堿基對(duì)之間的為最佳。所述探針的自身互補(bǔ)序列最好少于6個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。本發(fā)明冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的探針為DNA，至少選自下述一種或兩種以上的探針
(1)與待測(cè)AL0X5AP基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :1所示序列，(b) SEQID NO 1所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQID NO 1所示序列中每條序列有至少70% 同源性的序列；(2)與待測(cè)HFE基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO 2所示序列，(b) SEQ IDNO 2所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :2所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(3)與待測(cè)ITGA2基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :3 SEQ ID NO 5所示序列，(b)SEQ ID NO :3 SEQ ID NO :5所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ IDNO 3 SEQ ID NO 5所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(4)與待測(cè)LAMA4基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :6 SEQ ID NO 7所示序列，(b)SEQ ID NO :6 SEQ ID NO :7所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ IDNO 6 SEQ ID NO 7所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(5)與待測(cè)MMP13基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :8所示序列，(b) SEQ IDNO :8所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :8所示序列中每條序列有至少 70%同源性的序列；(6)與待測(cè)PONl基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :9 SEQ ID NO: 12所示序列，(b)SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 12所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ IDNO 9 SEQ ID NO 12所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(7)與待測(cè)SDC2基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :13所示序列，(b) SEQ IDNO 13所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO 13所示序列中每條序列有至少 70%同源性的序列；(8)與待測(cè)SDC4基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :14所示序列，(b) SEQ IDNO :14所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :14所示序列中每條序列有至少 70%同源性的序列；(9)與待測(cè)THBS2基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :15 SEQ ID NO: 17所示序列，(b)SEQ ID NO :15 SEQ ID NO :17所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 17所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(10)與待測(cè)VCAMl基因雜交的探針，其選自(a) SEQ ID NO :18所示序列，(b) SEQID NO :18所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO 18所示序列中每條序列有至少 70%同源性的序列。優(yōu)選的，本發(fā)明冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的探針選自SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 18所示的序列。所述探針序列可包含1-10個(gè)錯(cuò)配堿基，較佳地，可包含1-5個(gè)錯(cuò)配堿基，更佳地， 可包含1-2個(gè)錯(cuò)配堿基。本發(fā)明檢測(cè)芯片還包括至少一種對(duì)照探針，所述對(duì)照探針選自陰性對(duì)照探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、雜交對(duì)照探針和固定化對(duì)照探針。所述探針可通過(guò)連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個(gè)自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進(jìn)行[Afanassiev V,HanemannV, Wolfl S. Nucleic Acids Res. 2000,28 :e66 ；USA Patent No. 5556752]。連接臂越長(zhǎng)，雜交效率越高。典型的連接臂包括15 30個(gè)功能基團(tuán)長(zhǎng)度。連接臂可以選用適當(dāng)形式的功能基團(tuán)，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、 聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。所述探針或連接臂通過(guò)連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過(guò) C-C鍵實(shí)現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時(shí)使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過(guò)支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團(tuán)反應(yīng)完成。氨基烷基硅烷、輕基烷基硅烷、2—輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團(tuán)。所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5’ -NH2修飾、5’ -SH修飾、5’ -Poly T(A、C 或G)修飾、5’-生物素修飾、3’-NH2修飾、3’-SH修飾、3’-Poly T(A、C或G)修飾和3’-生物素修飾等。所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過(guò)標(biāo)記的，所述標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記。本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相容，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果即可。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。在本發(fā)明的另一方面，還提供一種上述冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的制備方法，包括如下步驟(1)抽提待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的核酸；(2)設(shè)計(jì)多重PCR引物及SNP特異性探針，PCR引物具有SEQ ID N0:19_SEQ IDNO 54所示序列，SNP特異性探針具有SEQ ID NO I-SEQ ID NO 18所示序列；(3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)所用的引物具有SEQID NO :19_SEQ ID NO力4所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈；G) PCR產(chǎn)物純化；(5)針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性探針延伸反應(yīng)；(6)芯片特異性雜交。本發(fā)明的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片可以有效預(yù)測(cè)對(duì)象罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)， 以及相對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)人群的風(fēng)險(xiǎn)度。彌補(bǔ)了目前免疫學(xué)診斷產(chǎn)品及PCR產(chǎn)品單一標(biāo)志物檢測(cè)靈敏度和特異性不能兼顧的缺點(diǎn)，有利于大范圍的普查和篩查，從而在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展早期即進(jìn)行有效診斷，以提高治愈率降低死亡率，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖
和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件，或按制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1芯片的制備1.樣品基因組DNA制備(1)從樣品抗凝外周血中利用Qiagen FlexiGene DNA Kit (基因組DNA純化試劑盒)(51206)(該試劑盒購(gòu)自Qiagen公司)抽提基因組DNA(目的基因?yàn)锳L0X5AP、HFE、 ITGA2、LAMA4、MMP13、P0N1、SDC2、SDC4、THBS2 禾口 VCAM1)。(2)將樣品DNA進(jìn)行定量，并稀釋到IOng/ μ 1，保證DNA濃度均一。2.設(shè)計(jì)PCR (聚合酶鏈反應(yīng))所用引物及探針序列針對(duì)18個(gè)SNP位點(diǎn)利用www. autoprimer. com設(shè)計(jì)多重PCR(聚合酶鏈反應(yīng))引物與SNP特異性探針。
權(quán)利要求
1.一種冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，其特征在于，所述待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因至少包括一種或兩種以上的下述基因AL0X5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、 MMP13、P0N1、SDC2、SDC4、THBS2 和 VCAMl。
3.如權(quán)利要求1或2所述的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針為 DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針為 DNA，至少選自下述一種或兩種以上的探針(1)與待測(cè)AL0X5AP基因雜交的探針，其選自(a)SEQID NO :1所示序列，(b) SEQID NO: 1所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :1所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(2)與待測(cè)HFE基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO 2所示序列，(b) SEQ IDNO :2所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :2所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(3)與待測(cè)ITGA2基因雜交的探針，其選自(a)SEQID NO :3 SEQ ID NO :5所示序列， (b) SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 5所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ IDNO 3 SEQ ID NO 5所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(4)與待測(cè)LAMA4基因雜交的探針，其選自(a)SEQID NO :6 SEQ ID NO :7所示序列， (b) SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 7所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ IDNO 6 SEQ ID NO 7所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(5)與待測(cè)MMP13基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :8所示序列，(b) SEQ IDNO 8 所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :8所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(6)與待測(cè)PONl基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :9 SEQ ID N0:12所示序列， (b) SEQID NO 9 SEQ ID NO 12所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ IDNO 9 SEQ ID NO 12所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(7)與待測(cè)SDC2基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :13所示序列，(b) SEQ IDNO 13所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :13所示序列中每條序列有至少70% 同源性的序列；(8)與待測(cè)SDC4基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :14所示序列，(b) SEQ IDNO 14所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :14所示序列中每條序列有至少70% 同源性的序列；(9)與待測(cè)THBS2基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :15 SEQ ID NO: 17所示序列，(b)SEQ ID NO :15 SEQ ID NO 17所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 17所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(10)與待測(cè)VCAMl基因雜交的探針，其選自(a)SEQ ID NO :18所示序列，(b) SEQID NO 18所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO :18所示序列中每條序列有至少70% 同源性的序列。
5.如權(quán)利要求4所述的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針選自 SEQ ID NO :1 SEQID NO 18 所示的序列。
6.一種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)抽提待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的核酸；(2)設(shè)計(jì)多重PCR引物及SNP特異性探針，PCR引物具有SEQID NO :19_SEQ IDNO :54 所示序列，SNP特異性探針具有SEQID NO I-SEQ ID NO 18所示序列；(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)所用的引物具有SEQID NO :19_SEQID NO力4所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈；G) PCR產(chǎn)物純化；(5)針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性探針延伸反應(yīng)；(6)芯片特異性雜交。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。所述待測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因至少包括一種或兩種以上的下述基因ALOX5AP、HFE、ITGA2、LAMA4、MMP13、PON1、SDC2、SDC4、THBS2和VCAM1。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了上述冠狀動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防檢測(cè)芯片的制備方法。通過(guò)本發(fā)明的芯片檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)罹患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(冠心病)的風(fēng)險(xiǎn)，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102191313SQ201010127870
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月18日
發(fā)明者王穎, 金力, 黃薇 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心, 上海南方基因科技有限公司