針對(duì)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型(pcsk9)的抗原結(jié)合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述了與前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)相互作用的抗原結(jié)合蛋白。闡述了通過給予藥物有效量的針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白治療高膽固醇血癥及其它疾病的方法。闡述了用針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白檢測(cè)樣品中PCSK9的量的方法。
【專利說明】針對(duì)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶KEXIN9型（PCSK9)的抗 原結(jié)合蛋白
[0001] 本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2008年8月22日，申請(qǐng)?zhí)枮?200880113475. 4(PCT/US2008/074097)，發(fā)明名稱為"針對(duì)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶 kexin9型（PCSK9)的抗原結(jié)合蛋白"。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)
[0003] 本申請(qǐng)要求享有于2007年8月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)60/957, 668、于 2007年12月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)61/008, 965及于2008年1月9日提交的美 國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)61/010, 630的優(yōu)先權(quán)，它們以其整體在此引作參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及結(jié)合前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin9型（Proprotein convertase subtilisin kexin type9, PCSK9)的抗原結(jié)合蛋白及使用和制備所述抗原 結(jié)合蛋白的方法。本申請(qǐng)連同電子格式的序列表一起提交。所提供的序列表文件名為 APM0L-003A.txt，于2008年8月12日創(chuàng)建，且大小為296,639字節(jié)，其被更新為文件名為 APM0L-003A_Substitute. TXT的文件，該文件于2010年10月11日星期二創(chuàng)建且大小為 297, 239字節(jié)。該電子格式的序列表中的信息以其全部?jī)?nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
[0005] 各種實(shí)施方案背景
[0006] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin9型（PCSK9)是絲氨酸蛋白酶，其參與調(diào)節(jié) 低密度脂蛋白受體（LDLR)蛋白的水平（Horton等，2007 ;Seidah和Prat，2007)。體外實(shí) 驗(yàn)顯示將PCSK9加到H印G2細(xì)胞能降低細(xì)胞表面LDLR水平（Benjannet等，2004 ;Lagace 等，2006 ;Maxwell等，2005 ;Park等，2004)。對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)顯示，提高PCSK9蛋白水平能降 低肝臟 LDLR 蛋白水平（Benjannet 等，2004 ;Lagace 等，2006 ;Maxwell 等，2005 ;Park 等， 2004)，同時(shí)PCSK9敲除小鼠提高肝臟中LDLR水平（Rashid等，2005)。另外，業(yè)已鑒定了提 高或降低血漿LDL水平的各種人PCSK9突變（Kotowski等，2006 ;Zhao等，2006)。業(yè)已顯 示PCSK9直接與LDLR蛋白作用，與LDLR -起被吞噬，在整個(gè)內(nèi)體途徑中與LDLR共發(fā)生免 疫熒光（Lagace等，2006)。尚未觀察到PCSK9降解LDLR，且未確定其降低胞外LDLR蛋白水 平的機(jī)制。
[0007] PCSK9是絲氨酸蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶（S8)家族中的激素原-前蛋白轉(zhuǎn)化 酶（Seidah等，2003)。人類有9種激素原-前蛋白轉(zhuǎn)化酶，可將其分為S8A和S8B亞家族 (Rawlings 等，2006)。弗林蛋白酶、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6 和 PC7/PC8/LPC/ SPC7被分在亞家族S8B中。來自鼠弗林蛋白酶和PCl的不同結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)及NMR結(jié)構(gòu) 顯示了枯草桿菌蛋白酶樣前域（pro-domain)及催化結(jié)構(gòu)域，并且P結(jié)構(gòu)域（P domain)直 接位于催化結(jié)構(gòu)域的C-末端（Henrich等，2003 Jangrea等，2002)?；谠搧喖易鍍?nèi)的氨 基酸序列的相似性，預(yù)測(cè)所有7個(gè)成員都具有相似的結(jié)構(gòu)（Henrich等，2005)。SKI-1/S1P 和PCSK9被分在亞家族S8A中。這些蛋白之間的序列比較也提示存在枯草桿菌蛋白酶樣前 域及催化結(jié)構(gòu)域（Sakai等，1998 ;Seidah等，2003 ;Seidah等，1999)。在這些蛋白中，位于 催化結(jié)構(gòu)域的C-末端的氨基酸序列更易變，且未提示存在P結(jié)構(gòu)域。
[0008] 激素原-前蛋白轉(zhuǎn)化酶作為酶原表達(dá)，它們經(jīng)過多個(gè)步驟加工成熟。在該加工中 前域的功能是雙重的。前域首先起分子伴侶作用，為催化結(jié)構(gòu)域的適當(dāng)折疊所需（Ikemura 等，1987)。當(dāng)催化結(jié)構(gòu)域折疊后，在前域和催化結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生自身催化。在該初次裂解 反應(yīng)后，前域仍然與催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，然后其起著催化活性抑制物的作用（Fu等，2000)。當(dāng) 條件恰當(dāng)時(shí)，在前域內(nèi)的位點(diǎn)處因第二次自身催化事件繼續(xù)成熟（Anderson等，1997)。在 該第二次裂解事件發(fā)生后，前域和催化結(jié)構(gòu)域分離，成為活性蛋白酶。
[0009] PCSK9 酶原的自身催化發(fā)生在 Glnl52 和 Serl53 (VFAQI SIP)之間（Naureckiene 等，2003)，業(yè)已顯示為其從細(xì)胞分泌所需（Seidah等，2003)。尚未觀察到在PCSK9前域內(nèi) 位點(diǎn)處的第二自身催化事件。純化的PCSK9由兩部分構(gòu)成，它們可通過非還原性SDS-PAGE 分開；為17Kd的前域和為65Kd的催化結(jié)構(gòu)域加上C-末端結(jié)構(gòu)域。尚未分離到?jīng)]有其抑制 性前域的PCSK9, PCSK9的催化活性的測(cè)量值一直是不定的（Naureckiene等，2003 ;Seidah 等，2003)。
[0010] 各種實(shí)施方案概述
[0011] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白。
[0012] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，其包含：A)選自以 下的一個(gè)或多個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH) :(i)來自選自以下的序列中的CDRHl的CDRHl : SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、 79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; (ii)來自選自以下的序列中的 CDRH2 的 CDRH2 :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、 76、77、78、83、69、81和60 ;(iii)來自選自以下的序列中的CDRH3的CDRH3:SEQIDN0:74、 85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、 78、83、69、81和60;和（^)含有一處或多處不超過4個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失或插 入的⑴、（ii)和（iii)的CDRH ;B)選自以下的一個(gè)或多個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL):⑴ 來自選自以下的序列中的 CDRLl 的 CDRLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ;(ii)來自選自以 下的序列中的 CDRL2 的 CDRL2 :SEQIDN0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;(1^)來自選自以下的序列中的 CDRL3 的CDRL3 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、 31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;和（^)含有一處或多處不超過4個(gè)氨基酸的 氨基酸取代、缺失或插入的（i)、（ii)和（iii)的CDRL;或C) 一個(gè)或多個(gè)A)的重鏈CDRH 和一個(gè)或多個(gè)B)的輕鏈⑶RL。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白包含至少一個(gè)A) 的CDRH和至少一個(gè)B)的CDRL。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白包含至少兩個(gè)A) 的CDRH和至少兩個(gè)B)的CDRL。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白包含所述CDRH1、 CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些實(shí)施方案中，A)的CDRH選自以下至少一種： ⑴選自選自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列中的CDRHl的CDRHl氨基酸序列；（ii)選 自選自SEQ ID N0:67、79、89和49的序列中的CDRH2的CDRH2氨基酸序列；（iii)選自選自 SEQ ID N0:67、79、89和49的序列中的CDRH3的CDRH3氨基酸序列；和（iv)含有一處或多 處不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的和（iii)的CDRH。另外，B)的 CDRL選自以下至少一種：⑴選自選自SEQIDN0:12、35、32和23的序列中的CDRL1的CDRL1 氨基酸序列；（ii)選自選自SEQIDN0:12、35、32和23的序列中的CDRL2的CDRL2氨基酸序 列 ；（iii)選自選自SEQIDN0:12、35、32和23的序列中的CDRL3的CDRL3氨基酸序列 ；和 (iv)含有一處或多處不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的和（iii)的 ⑶RL;或C) 一個(gè)或多個(gè)A)的重鏈⑶RH和一個(gè)或多個(gè)B)的輕鏈⑶RL。在某些實(shí)施方案中， A)的⑶RH選自以下至少一種：（i) SEQ ID NO: 67中的⑶RHl氨基酸序列的⑶RHl氨基酸序 列；（ii)SEQIDN0:67中的CDRH2氨基酸序列的CDRH2氨基酸序列 ；（iii)SEQIDN0:67中 的CDRH3氨基酸序列的CDRH3氨基酸序列；和（iv)含有一處或多處不超過2個(gè)氨基酸的氨 基酸取代、缺失或插入的（i)、（ii)和（iii)的CDRH ;所述B)的CDRL選自以下至少一種： (i) SEQIDN0:12中的CDRLl氨基酸序列的CDRLl氨基酸序列；（ii) SEQ ID NO: 12中的CDRL2 氨基酸序列的⑶RL2氨基酸序列；（iii)SEQ ID N0:12中的⑶RL3氨基酸序列的⑶RL3氨基 酸序列；和（iv)含有一處或多處不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的 和（iii)的⑶RL;或C) 一個(gè)或多個(gè)A)的重鏈⑶RH和一個(gè)或多個(gè)B)的輕鏈⑶RL。在某 些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白包含：A) SEQ ID NO: 67中的CDRHl序列的CDRHl、SEQ ID NO: 67 中的 CDRH2 序列的 CDRH2 和 SEQ ID NO: 67 中的 CDRH3 序列的 CDRH3 ;和 B) SEQ ID NO: 12 中的 CDRLl 序列的 CDRLl、SEQ ID NO: 12 中的 CDRL2 序列的 CDRL2 和 SEQ ID NO: 12 中的CDRL3序列的CDRL3。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白包含：具有與選自以下的氨基 酸序列至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)（VH) :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、 51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;和 / 或 具有與選自以下的氨基酸序列至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)（VL) :SEQ ID N0:5、7、 9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、 42、44和46。在某些實(shí)施方案中，VH與選自以下的氨基酸序列具有至少90%序列同一性： SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、47、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、 79、80、76、77、78、83、69、81和60 ;和/或VL與選自以下的氨基酸序列具有至少90%序列 同一性：SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、 33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些實(shí)施方案中，VH選自SEQIDN0:74、85、71、72、 67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;和 / 或 VL 選自 SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、 28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46。
[0013] 在某些方面，本發(fā)明包括分離的抗原結(jié)合蛋白，其特異性結(jié)合被本文公開的任何 ABP結(jié)合的表位。
[0014] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合 蛋白包含：A) -個(gè)或多個(gè)選自以下至少一種的重鏈CDR(CDRH) :(i)具有與選自以下的序 列之一中的 CDRHl 至少 80%序列同一性的 CDRHl :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、 51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;(ii) 具有與選自以下的序列之一中的⑶RH2至少80%序列同一性的⑶RH2:SEQ ID N0:74、 85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、 78、83、69、81和60;和（丨^)具有與選自以下的序列之一中的^冊(cè)3至少80%序列同一 性的 CDRH3:SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、 64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60 ;B) -個(gè)或多個(gè)選自以下至少一種的輕鏈 ⑶R(⑶RL) :(i)具有與選自以下的序列之一中的⑶RLl至少80%序列同一性的⑶RLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、 37、38、39、40、42、44和46 ; (ii)具有與選自以下的序列之一中的CDRL2至少80 %序列同一 性的CDRL2 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、 32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46 ;和（iii)具有與選自以下的序列之一中的CDRL3 至少 80%序列同一性的 CDRL3 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ;或 C) 一個(gè)或多個(gè) A)的重鏈 ⑶RH和一個(gè)或多個(gè)B)的輕鏈⑶RL。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白包含：A) -個(gè)或多個(gè) 選自以下至少一種的⑶RH : (i)具有與選自以下的序列之一中的⑶RHl至少90%序列同一 性的CDRHl :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、 62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; (ii)具有與選自以下的序列之一中的 CDRH2 至少 90%序列同一性的 CDRH2 :SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、 56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;和（iii)具有與選自以 下的序列之一中的CDRH3至少90%序列同一性的CDRH3 :SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、 58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; B) -個(gè)或多個(gè)選自以下至少一種的CDRL : (i)具有與選自以下的序列之一中的CDRLl至少 90%序列同一性的CDRLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;(^)具有與選自以下的序列之一中 的 CDRL2 至少90%序列同一性的 CDRL2 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ;和（iii)具有與選自 以下的序列之一中的CDRL3至少90%序列同一性的CDRL3:SEQIDN0 :5、7、9、10、12、13、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ; 或C) 一個(gè)或多個(gè)A)的重鏈⑶RH和一個(gè)或多個(gè)B)的輕鏈⑶RL。
[0015] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：A)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH) :(i)選自以下序列內(nèi)的CDRH3的 CDRH3:SEQ ID N0:67、79和49;(ii)在氨基酸序列上與⑴的CDRH3差別在于不超過2 個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3 ;和（iiDXAXAXAXAXgXJuXJdJSE Q ID N0:404)，其中X1選自D、A、R和非氨基酸；X2選自Y、I、G和非氨基酸；X 3選自D、A、G 和非氨基酸；X4選自F、A、L和非氨基酸；X5選自W、L、A和非氨基酸；X6選自S、Y、A和非氨 基酸；X 7選自A、Y、R和非氨基酸；X8選自Y、P和非氨基酸；X9選自Y、G和非氨基酸；X ltl選 自D、G和非氨基酸；X11選自A、M和非氨基酸；X12選自F、D和非氨基酸；X 13選自D、V和非 氨基酸；X14選自V和非氨基酸；B)選自以下至少一種的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL) : (i)選自 選自以下序列內(nèi)的CDRL3的CDRL3:SEQ ID勵(lì)：12、35和23;出）在氨基酸序列上與（1) 的CDRL3差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3 ;和（iii)選自 X1X2X3X4X5X 6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO:405)的 CDRL3 氨基酸序列，其中 X1 選自 Q 和 G ;X2 選自 S、T、A和非氨基酸；X3選自Y、非氨基酸和W ;X4選自D和非氨基酸；X5選自S和非氨基酸； X6選自S和非氨基酸；X7選自L、T和非氨基酸；X8選自非氨基酸、A和S ;X9選自非氨基酸、 G、A和V ;X1(I選自非氨基酸、S、Y和V ;Xn選自非氨基酸和V。
[0016] 在某些方面，本發(fā)明包括分離的抗原結(jié)合蛋白，所述分離的抗原結(jié)合蛋白包含具 有選自以下的氨基酸序列的輕鏈：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、 28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44、46 及其某些組合。
[0017] 在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白特異性結(jié)合被本文公開的抗原結(jié)合蛋白中的至 少一種結(jié)合的表位。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含具有選自以下的 氨基酸序列的重鏈：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、 89、65、79、80、76、77、78、83、69、81、60及其某些組合。在某些實(shí)施方案中，八8?的氨基酸序 列選自SEQ ID N0:12、35、23及其某些組合。在某些實(shí)施方案中，ABP的重鏈包含SEQ ID NO:67 的 CDRH3、SEQ ID NO:67 的 CDRH2 和 SEQ ID NO:67 的 CDRHl，所述輕鏈包含 SEQ ID N0:12的CDRL3、SEQIDN0:12的CDRL2和SEQIDN0:12的CDRL1。在某些實(shí)施方案中，分 離的抗原結(jié)合蛋白為單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、 多特異性抗體或其抗體片段。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白為Fab片段、Fab'片 段、F(ab'） 2片段、Fv片段、雙抗體或單鏈抗體分子。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋 白為人抗體。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白為單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中， 分離的抗原結(jié)合蛋白為IgGl型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在某些實(shí)施方案中，分離的 抗原結(jié)合蛋白為IgG4型或IgG2型。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白與標(biāo)記基團(tuán) 偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白與本文所述抗原結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PCSK9。 在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白為單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、人抗體、人 源化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋 白為Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段、Fv片段、雙抗體或單鏈抗體分子。在某些實(shí)施方 案中，分離的抗原結(jié)合蛋白與標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合蛋白降低 PCSK9與LDLR的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)將分離的抗原結(jié)合蛋白給予受治療者時(shí)，其降 低受治療者中存在的LDL的量。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)將分離的抗原結(jié)合蛋白給予受治療 者時(shí)，其降低受治療者中存在的血清膽固醇的量。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)將分離的抗原結(jié)合 蛋白給予受治療者時(shí)，其降低受治療者中存在的LDLR的量。
[0018] 在某些方面，本發(fā)明包括載體，所述載體包含本文所述核酸分子。在某些實(shí)施方案 中,本發(fā)明包括宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含本文所述核酸分子。
[0019] 在某些方面，本發(fā)明包括與本文公開的抗原結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PCSK9的分離的抗 原結(jié)合蛋白。
[0020] 在某些方面，本發(fā)明包括編碼本文公開的抗原結(jié)合蛋白的核酸分子。
[0021] 在某些方面，本發(fā)明包括藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種本文所述的 抗原結(jié)合蛋白。
[0022] 在某些方面，本發(fā)明包括用于治療或預(yù)防患者中的與高血清膽固醇水平有關(guān)的病 癥的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié)合 蛋白。
[0023] 在某些方面，本發(fā)明包括在受治療者中抑制PCSK9與LDLR結(jié)合的方法，所述方法 包括給予有效量的至少一種本文公開的抗原結(jié)合蛋白。
[0024] 在某些方面，本發(fā)明包括選擇性結(jié)合PCSK9的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合 蛋白以小于IOOpM的K d結(jié)合PCSK9。
[0025] 在某些方面，本發(fā)明包括用于治療或預(yù)防受治療者中的與高血清膽固醇水平有關(guān) 的病癥的方法，所述方法包括同時(shí)或序貫地將有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié) 合蛋白與提高LDLR蛋白的利用率的藥劑給予有需要的受治療者。
[0026] 在某些方面，本發(fā)明包括降低受治療者中的血清膽固醇水平的方法，所述方法包 括給予受治療者有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié)合蛋白。
[0027] 在某些方面，本發(fā)明包括降低受治療者中的血清膽固醇水平的方法，所述方法包 括同時(shí)或序貫地將有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié)合蛋白與提高LDLR蛋白的 利用率的藥劑給予受治療者。
[0028] 在某些方面，本發(fā)明包括提高受治療者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法包括 給予受治療者有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié)合蛋白。
[0029] 在某些方面，本發(fā)明包括提高受治療者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法包括 同時(shí)或序貫地將有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié)合蛋白與提高LDLR蛋白的利 用率的藥劑給予受治療者。
[0030] 在某些方面，本發(fā)明包括藥物組合物，所述藥物組合物包含本文公開的ABP和 提高LDLR蛋白水平的利用率的藥劑。在某些實(shí)施方案中，提高LDLR蛋白的利用率的 藥劑包括他?。╯tatin)。在某些實(shí)施方案中，他汀選自阿托伐他?。╝torvastatin)、 西立伐他?。╟erivastatin)、氟伐他?。╢luvastatin)、洛伐他?。↖ovastatin)、美伐 他?。╩evastatin)、匹伐他?。╬itavastatin)、羅蘇伐他汀（rosuvastatin)、辛伐他汀 (simvastatin)和其某些組合。
[0031] 在某些方面，本發(fā)明包括制備本文所述抗原結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括從分 泌所述抗原結(jié)合蛋白的宿主細(xì)胞制備所述抗原結(jié)合蛋白的步驟。
[0032] 在某些方面，本發(fā)明包括藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種本文所述抗 原結(jié)合蛋白和藥用賦形劑。在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含另外的活性劑。 在某些實(shí)施方案中，所述另外的活性劑選自放射性同位素、放射性核素、毒素或治療藥物及 化療藥物。
[0033] 在某些方面，本發(fā)明包括用于治療或預(yù)防患者中的與高血清膽固醇水平有關(guān)的病 癥的方法。所述方法包括給予有需要的患者有效量的至少一種本文公開的分離的抗原結(jié)合 蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述病癥為高膽固醇血癥。
[0034] 在某些方面，本發(fā)明包括在患者中抑制PCSK9與LDLR結(jié)合的方法，所述方法給予 有效量的至少一種本文所述抗原結(jié)合蛋白。
[0035] 在某些方面，本發(fā)明包括以小于IOOpM的Kd結(jié)合PCSK9的抗原結(jié)合蛋白。在某些 實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白以小于K d結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合 蛋白以小于5pM的Kd結(jié)合。
[0036] 在某些方面，本發(fā)明包括用于治療或預(yù)防受治療者中的與高血清膽固醇水平有關(guān) 的病癥的方法，所述方法包括同時(shí)或序貫地將有效量的至少一種本文所述的分離的抗原結(jié) 合蛋白與提高LDLR蛋白的利用率的藥劑給予有需要的受治療者。在某些實(shí)施方案中，所述 提高LDLR蛋白的利用率的藥劑包括他汀。在某些實(shí)施方案中，他汀選自阿托伐他汀、西立 伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀及其某些組合。 [0037] 在某些方面，本發(fā)明包括降低受治療者中的血清膽固醇水平的方法。所述方法包 括給予受治療者有效量的至少一種本文所述的分離的抗原結(jié)合蛋白。
[0038] 在某些方面，本發(fā)明包括在受治療者中降低血清膽固醇水平的方法，所述方法包 括同時(shí)或序貫將有效量的至少一種本文所述的分離的抗原結(jié)合蛋白與提高LDLR蛋白的利 用率的藥劑給予受治療者。在某些實(shí)施方案中，所述提高LDLR蛋白的利用率的藥劑包括他 汀。在某些實(shí)施方案中，他汀選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、 匹伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀及其某些組合。
[0039] 在某些方面，本發(fā)明包括通過給予受治療者有效量的至少一種本文所提供的分離 的抗原結(jié)合蛋白來提高受治療者中的LDLR蛋白水平的方法。
[0040] 在某些方面，本發(fā)明包括提高受治療者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法通 過同時(shí)或序貫地給予受治療者有效量的至少一種本文所述的分離的抗原結(jié)合蛋白與提高 LDLR蛋白的利用率的藥劑來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，所述提高LDLR蛋白水平的利用率 的藥劑包括他汀。在某些實(shí)施方案中，他汀選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他 汀、美伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀和其某些組合。
[0041] 在某些方面，本發(fā)明包括中和抗體，所述中和抗體結(jié)合PCSK9并減少低密度脂蛋 白受體（LDLR)，由此降低PCSK9對(duì)LDLR的作用。在某些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合 PCSK9。在某些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述 抗體結(jié)合SEQ ID NO: 3的31-447位殘基內(nèi)的表位。在某些實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合具有 與SEQ ID NO: 3至少90%同一性的氨基酸序列的PCSK9。
[0042] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的中和抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋 白在SEQ ID NO: 3的31-447位殘基內(nèi)的位點(diǎn)結(jié)合PCSK9。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)所述抗原 結(jié)合蛋白與PCSK9結(jié)合時(shí)，所述抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少一個(gè)相距8?；蚋?近處：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、 S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、 S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、 H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、 V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、 R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、 V346、G352、T353、G365、1368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、 I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、 S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、 G244、M247、I369、S372、C375或C378。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中 的至少一個(gè)相距 8 ?；蚋帲篠153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、 T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、 D367、1368、G370、A371、S373、S376或Q382。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以 下殘基中的至少一個(gè)相距5?；蚋帲篠153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、 D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以 下殘基中的至少兩個(gè)相距5?；蚋帲篠153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、 D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以 下殘基中的至少4個(gè)相距5?；蚋帲篠153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、 D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下 殘基中的至少一個(gè)相距 8 ?；蚋帲篧72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、 S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、 E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、 E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、 G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386 或 Q387。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少一個(gè)相距5?；蚋帲?W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、 G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、 S383或G384。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少兩個(gè)相距5?；?更近處：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、 Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、 Q382、S383或G384。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少4個(gè)相距5 埃或更近處：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、 C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、 S381、Q382、S383或G384。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少一 個(gè)相距 8 ?；蚋帲篠153、S188、1189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、 D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、1154、T187、H193、E195、1196、M201、 V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375 或 C378。在某些實(shí)施方案 中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少一個(gè)相距5?；蚋帲篠153、S188、I189、Q190、 S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377 或F379。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至少兩個(gè)相距5?；蚋?處：S153、S188、1189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、 K243、S373、D374、S376、T377或F379。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基 中的至少四個(gè)相距 5 ?；蚋帲篠153、S188、1189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、 R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377 或 F379。
[0043] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的中和抗體，其中所述抗體結(jié)合PCSK9并降低 PCSK9結(jié)合LDLR的可能性。
[0044] 在某些實(shí)施方案中，涵蓋結(jié)合PCSK9的抗體或抗原結(jié)合分子。所述抗體在SEQ ID NO: 3的31-447位殘基內(nèi)的位點(diǎn)結(jié)合PCSK9。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體或抗原結(jié)合分子 結(jié)合PCSK9時(shí)，其位于與PCSK9的以下殘基中的至少一個(gè)相距8?；蚋帲篠153、1154、 P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、 L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、 W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、 G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、 S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、 D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、 G365、1368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、1189、Q190、S191、 D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、 I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、1369、 5372、 C375 或 C378。
[0045] 在某些實(shí)施方案中，提供封阻抗體與PCSK9在PCSK9殘基的8埃內(nèi)結(jié)合的分離的 抗體或抗原結(jié)合分子。在某些實(shí)施方案中，所述PCSK9殘基選自以下PCSK9殘基中的至少 -f:S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、 S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、 5373、 S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、 H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、 V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、 R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、 V346、G352、T353、G365、1368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、 I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、 S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、 G244、M247、1369、S372、C375 或 C378。
[0046] 在某些實(shí)施方案中，提供在以下位點(diǎn)結(jié)合PCSK9的分離的抗體或抗原結(jié)合分子： 所述位點(diǎn)與LDLR結(jié)合PCSK9的位點(diǎn)重疊。在某些實(shí)施方案中，LDLR結(jié)合PCSK9的位點(diǎn)包 括至少一個(gè)選自以下的氨基酸殘基：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、 C375、T377、C378、F379、V380 和 S381。
[0047] 在某些實(shí)施方案中，提供結(jié)合PCSK9的分離的抗體或抗原結(jié)合分子。在某些實(shí)施 方案中，所述抗體或抗原結(jié)合分子降低EGFa在PCSK9的以下殘基中的至少一個(gè)的8埃內(nèi) 結(jié)合 PCSK9 的可能性：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、 C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、 I368、G370、A371、S373、S376 或 Q382。
[0048] 在某些實(shí)施方案中，提供與PCSK9的表面結(jié)合的抗體、抗原結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合 分子，所述表面與EGFa結(jié)合、Ab21B12結(jié)合和/或31H4結(jié)合的表面重疊。在某些實(shí)施方案 中，提供以與在附圖中所述的相似的方式結(jié)合PCSK9的抗體、抗原結(jié)合蛋白或抗原結(jié)合分 子。
[0049] 在某些實(shí)施方案中，以上實(shí)施方案為中和抗體或抗原結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案 中，所述抗原結(jié)合蛋白不是LDLR或其片段（例如EGFa)。
[0050] 在某些方面，本發(fā)明包括分離的中和抗體，其中當(dāng)所述抗體與PCSK9結(jié)合時(shí)，抗體 位于與PCSK9的以下殘基中的至少一個(gè)相距8?；蚋帲篠EQ ID N0:3的T468、R469、 M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、 H565、W566、E567、V568、E569、R592、E593、S465、G466、P467、A473、1474、R476、G497、E498、 M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、 L571、H591、A594、S595和H597。在某些實(shí)施方案中，抗體位于與PCSK9的以下殘基中的至 少一個(gè)相距 5 ?；蚋帲篠EQ ID N0:3 的 T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、 A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592 和 E593。
[0051] 在某些方面，本發(fā)明包括分離的抗原結(jié)合蛋白。所述抗原結(jié)合蛋白包含：A)SEQ ID NO :89 中的 CDRHl 序列的 CDRHl、SEQ ID NO :89 中的 CDRH2 序列的 CDRH2 和 SEQ ID NO :89 中的 CDRH3 序列的 CDRH3 ;和 B) SEQ ID NO: 32 中的 CDRLl 序列的 CDRLl、SEQ ID NO: 32 中 的 CDRL2 序列的 CDRL2 和 SEQ ID NO: 32 中的 CDRL3 序列的 CDRL3。
[0052] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白的分離的抗原結(jié)合蛋白， 其中所述分離的抗原結(jié)合蛋白與變體PCSK9蛋白之間的結(jié)合為分離的抗原結(jié)合蛋白與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:303的PCSK9蛋白之間的結(jié)合的50%。在某些實(shí)施方案中，所 述變體PCSK9蛋白在選自以下位點(diǎn)處包含至少一個(gè)殘基突變：如SEQ ID NO: 1所示的207、 208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、 337、519、521和554。在某些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)突變選自R207E、D208R、E181R、 R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。在某些實(shí)施方案 中，所述至少一個(gè)突變選自 D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、 H521R 和 Q554R。
[0053] 在某些方面，本發(fā)明包括抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白以第一種方式結(jié)合SEQ ID勵(lì):303的？051(-9蛋白并以第二種方式結(jié)合？051(9變體。所述？051(9變體在選自以下 的位點(diǎn)處具有至少一個(gè)點(diǎn)突變：SEQ ID NO:303和/或SEQ ID NO: 1的207、208、185、181、 439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和 554。在某些實(shí)施方案中，所述第一種方式包括第一 EC50、第一 Bmax或第一 EC50及第一 Bmax。在某些實(shí)施方案中，所述第二種方式包括第二EC50、第二Bmax或第二EC50及第二 Bmax。第一種方式的值不同于第二種方式的值。在某些實(shí)施方案中，所述第一種方式包括第 一 EC50,其中所述第二種方式涉及第二EC50,其中所述點(diǎn)突變選自：R207E、D208R、E181R、 R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。在某些實(shí)施方 案中，所述第一 EC50與第二EC50相差至少20%。在某些實(shí)施方案中，所述第一 EC50與第 二EC50相差至少50%。在某些實(shí)施方案中，所述第二EC50比第一 EC50的數(shù)值更大。在某 些實(shí)施方案中，第一EC50由多珠粒結(jié)合測(cè)定法（multiplex bead binding assay)來測(cè)定。 在某些實(shí)施方案中，第二EC50大于lum。在某些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白為中和抗 原結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述中和抗原結(jié)合蛋白為競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。在 某些實(shí)施方案中，所述中和抗原結(jié)合蛋白為非競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案 中，所述第一種方式包括第一 Bmax,所述第二種方式包括不同于第一 Bmax的第二Bmax。所 述PCSK9變體具有選自以下的至少一個(gè)點(diǎn)突變：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、 D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。在某些實(shí)施方案中，所述第二Bmax為所述第一Bmax 的約10%。在某些實(shí)施方案中，所述第一 Bmax與所述第二Bmax至少相差20%。在某些實(shí) 施方案中，所述第一 Bmax與所述第二Bmax相差至少50%。
[0054] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合SEQ ID NO: 3的PCSK9蛋白的分離的抗原結(jié)合蛋白， 其中所述抗原結(jié)合蛋白的表位包括以下氨基酸中的至少一個(gè)：SEQ ID N0:1中的207、208、 181、185、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、 519、521 和 554。
[0055] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PCSK9蛋白的分 離的中和抗原結(jié)合蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合蛋白降低LDLR，由此降低PCSK9對(duì)LDLR的 作用。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白為L(zhǎng)DLR非競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施 方案中，抗原結(jié)合蛋白為L(zhǎng)DLR競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。
[0056] 在某些方面，本發(fā)明包括分離的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含：A) SEQ ID NO:49 中的 CDRHl 序列的 CDRHl、SEQ ID NO:49 中的 CDRH2 序列的 CDRH2 和 SEQ ID N0:49 中的CDRH3序列的CDRH3;和B)SEQ ID N0:23 中的CDRLl序列的CDRL1、SEQ ID N0:23 中的CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID N0:23中的CDRL3序列的CDRL3。
[0057] 在某些方面，本發(fā)明包括組合物，所述組合物包含結(jié)晶的PCSK9蛋白和結(jié)合PCSK9 的抗原結(jié)合蛋白。所述組合物包含結(jié)晶的PCSK9蛋白，以至于PCSK9蛋白的三維結(jié)構(gòu)可測(cè) 定為約2. 2?；蚋玫姆直媛省Ｔ谀承?shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白為抗體或其片段。
[0058] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)晶的PCSK9蛋白及至少LDLR蛋白的EGFa部分，其中所 述LDLR蛋白的EGFa部分被PCSK9蛋白結(jié)合，其中所述結(jié)晶的PCSK9蛋白如下：PCSK9蛋白 的三維結(jié)構(gòu)可測(cè)定為約2. 2?；蚋玫姆直媛省Ｔ谀承?shí)施方案中，分子模型在計(jì)算機(jī)可 讀介質(zhì)上。
[0059] 在某些方面，本發(fā)明包括本文所述抗原結(jié)合蛋白在制備用于降低血清膽固醇藥物 中的用途。
[0060] 在某些方面，本發(fā)明包括本文所述的抗原結(jié)合蛋白在制備用于治療或預(yù)防受治療 者中的與高血清膽固醇水平有關(guān)的病癥的藥物中的用途。
[0061] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：A)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RH) :(i)選自選自SEQ ID N0:67、79、89 和49的序列內(nèi)的⑶RHl的⑶RHl ; (ii)在氨基酸序列上與（i)的⑶RHl差別在于不超過2 個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRHl ;和（iii)選自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9Xici(SEQIDNC): 406)的CDRHl氨基酸序列，其中X 1選自G ;X2選自Y、F和G ;X3選自T和S ;X4選自L和F ; X5選自T、S和N5X6選自S和A5X 7選自Y和F5X8選自G、S和Y;X9選自I、M和W;X 1Q選自 S、N和H;B)選自以下至少一種的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RL) :(i)選自選自SEQ ID N0:12、32、 35和23的序列內(nèi)的CDRLl的CDRLl ; (ii)在氨基酸序列上與（i)的CDRL3差別在于不超 過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的⑶RLl ;和（iii)選自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11X 12 X13X14(SEQ ID NO:407)的CDRLl氨基酸序列，其中X1選自T和非氨基酸；X2選自G和S ;X3 選自S、T和G ;X4選自S ;X5選自S ;X6選自N、D和S ;X7選自I、V和N;X8選自G和I ;父9選 自A和G;X10選自G、Y、S和N5X11選自Y和N 5X12選自D、S、T和F5X13選自V;X14選自S、N 和Η。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，單個(gè)ABP或抗體可滿足以上一個(gè)或多個(gè)選擇，并落在該實(shí)施 方案的所述發(fā)明范圍內(nèi)。
[0062] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：Α)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RH) :(i)選自選自SEQ ID Ν0:67、79、89 和49的序列內(nèi)的⑶RH2的⑶RH2 ; (ii)在氨基酸序列上與⑴的⑶RH2差別在于不超過2 個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2 ;和（iii)選自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11X 12X13X14X 15X16X17(SEQ ID N0:408)的CDRH2氨基酸序列，其中X1選自W、S、L和非氨基酸；X2選自V、I 和E ;X3選自S、W和I ;X4選自F、S和N ;X5選自Y、S、D和H ;X6選自N、S和G ;X7選自S和 G ;X8選自N、Y、D和R ;X9選自T、I和E ;X1Q選自N、S、Y和D ;Xn選自Y ;X12選自A和N ;X13 選自Q、D和P ;X14選自K和S ;X15選自L和V ;X16選自Q和K ;X17選自G和S ;B)選自以下 至少一種的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RL) :(i)選自選自SEQ ID NO: 12、32、35和23的序列內(nèi)的 ⑶RL3的⑶RL2 ; (ii)在的氨基酸序列上與（i)的⑶RL3相差不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添 力口、缺失或取代的CDRL2 ;和（iii)選自X1X2X3X4X5X 6X7(SEQIDNOMOg)的CDRL2氨基酸序列， 其中X1選自G、E、S和D ;X2選自N、V和Y ;X3選自S和N5X4選自N、Q和K ;X5選自尺;父6選 自P ;X7選自S。
[0063] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：A)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RH) :(i)選自選自SEQ ID N0:67、79、89 和49的序列內(nèi)的⑶RH3的⑶RH3 ; (ii)在氨基酸序列上與⑴的⑶RH3差別在于不超過2 個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的⑶RH3 ;和（iii)選自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11X 12X13X1 4(SEQ ID N0:410)的⑶RH3氨基酸序列，其中X1選自D和非氨基酸；X2選自Y、A和非氨基 酸；X 3選自D、I和非氨基酸；X4選自F、A和非氨基酸；X5選自W、A和非氨基酸；X 6選自S、L 和非氨基酸；X7選自A、Y、G和非氨基酸；X8選自Y、Q和非氨基酸；X9選自G、Y和L ;X1(I選自 Y、D和V ;Xn選自G、A和P ;X12選自M和F ;X13選自D ;X14選自V和Y ;和B)選自以下至少 一種的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RU :(i)選自選自SEQ ID勵(lì)：12、32、35和23的序列內(nèi)的^此3 的CDRL3 ;(ii)在氨基酸序列上與（i)的CDRL3差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、 缺失或取代的 CDRL3;和（iii)選自 X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11 (SEQ ID N0:411)的 CDRL3 氨基 酸序列，其中X1選自Q、A、G和非氨基酸；X2選自S、V、T和非氨基酸；X 3選自Y、N和1;\選 自S和D ;X5選自S、Y和D ;X6選自S和T ;X7選自L和S ;X8選自S、T和N ;X9選自G、S和 A5Xltl選自S、M、W和Y ;和X11選自V。在某些實(shí)施方案中，任何上述氨基酸可被保守氨基酸 取代所置換。
[0064] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：A)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH):⑴選自選自SEQ ID NO:47、48、 49、 50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRHl的CDRHl ; (ii)在氨基酸序列上與 (i)的CDRHl差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添力卩、缺失或取代的CDRHl ;和（iii)選 自XAXAXAXAXAJSEQ ID N0:412)的CDRHl氨基酸序列，其中X1選自G、P和A ;X2選 自 Y、W、F、T 和 S ;X3 選自 T、P、S 和 A、C、V、L 和 I ;X4 選自 L、F、I、V、M、A 和 Y ;X5 選自 T、P、 S和 A ;Χ6選自 S、T、A 和 C ;Χ7選自 Y、W、F、T和 S ;Χ8選自 G、P 和 A ;Χ9選自 I、L、V、M、A 和 F;X1Q選自S、T、A和C;B)選自以下至少一種的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRL):⑴選自選自SEQ 10勵(lì)：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的〇)虬1的〇)虬1;(^)在氨基酸 序列上與（i)的CDRL3差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRLl ;和 (iii)選自 ID N0:413)的 CDRLl 氨基酸序列，其中 X1It 自T和S ;X2選自G、P和A ;X3選自T和S ;X4選自S、N、T、A、C和Q ;X5選自S、T、A和C ;X6 選自D和E;X7選自V、I、M、L、F和A;X8選自G、P和A ;X9選自G、A、R、P、V、L、I、K、Q和N; X1。選自 Y、W、F、T 和 S ;Xn 選自 N和 Q5X12 選自 Y、S、W、F、T、A和 C;X13 選自 V、I、M、L、F和 A ;X14 選自 S、T、A 和 C。
[0065] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：A)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH):⑴選自選自SEQ ID N0:47、48、49、 50、 51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH2的CDRH2 ; (ii)在氨基酸序列上與（i) 的CDRH2差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2 ;和（iii)選自X1 X2X3X4X5X6X 7X8X9XiciX11X 12X13X14X15X16X 1^ (SEQ ID N0:414)的 CDRH2 氨基酸序列，其中 X1 選自 ff、 Y和 F;X2 選自 V、I、M、L、F 和 A;X3 選自 S、T、A和 C;X4 選自 A、F、V、L、I、Y 和 M;X5 選自 Y、 W、F、T和S ;Χ6選自N和Q ;Χ7選自G、P和A ;Χ8選自N和Q ;Χ9選自T和S ;X1Q選自N和Q ; X11 選自 Y、W、F、T 和 S ;X12 選自 A、V、L 和 I ;X13 選自 Q、E、N 和 D ;X14 選自 K、R、Q 和 N ;父15選 自L、F、V、I、M、A和Y5X16選自Q和N 5X17選自G、P和A;B)選自以下至少一種的輕鏈互補(bǔ) 決定區(qū)（CDRL) :(i)選自選自 SEQ ID 吣：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中 的⑶RL3的⑶RL2 ; (ii)在氨基酸序列上與（i)的⑶RL3差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨 基酸添加、缺失或取代的CDRL2;和（iii)選自XAXAXA^SEQ ID N0:415)的CDRL2氨 基酸序列，其中X1選自E和D;X2選自V、I、M、L、F和A ;X3選自S、T、A和C;X4選自N和Q; X5選自R、K、Q和N ;X6選自P和A ;X7選自S、T、A和C。
[0066] 在某些方面，本發(fā)明包括結(jié)合PCSK9的分離的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白 包含：A)選自以下至少一種的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（CDRH):⑴選自選自SEQ ID NO:47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH3的CDRH3 ; (ii)在氨基酸序列上與 (i)的CDRH3差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3 ;和（iii)選 自X1X2X3X4X 5XJSEQ ID N0:416)的CDRH3氨基酸序列，其中X1選自G、P、A和非氨基酸；X2 選自Y、W、F、T和S;X3選自G、V、P、A、I、M、L和F;X 4選自M、L、F和I;X5選自D和E;X6選 自V、I、M、L、F和A ;B)選自以下至少一種的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶RL) :(i)選自選自SEQ ID 勵(lì)：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的〇)虬3的〇)虬3;(^)在氨基酸序列 上與（i)的CDRL3差別在于不超過2個(gè)氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3 ;和（iii) 選自XAXAXAXAXJSEQ ID N0:417)的CDRL3氨基酸序列，其中X1選自S、N、T、A、C和 Q;X2選自S、T、A和C;X3選自Y、W、F、T和S;X4選自T和S;X 5選自S、T、A和C;X6選自S、 T、A 和C;X7 選自 N、S、Q、T、A和 C;X8 選自 M、V、L、F、I 和 A;X9 選自 V、I、M、L、F和 A。
[0067] 附圖簡(jiǎn)述
[0068] 圖IA描述具有前域（下劃線）的PCSK9成熟形式的氨基酸序列。
[0069] 圖IB1-IB4描述具有前域（下劃線）及信號(hào)序列（粗體）的PCSK9的氨基酸和核 酸序列。
[0070] 圖2A-2D為各種抗原結(jié)合蛋白的各種輕鏈的序列比較表。圖2C延續(xù)了在圖2A中 開始的序列。圖2D延續(xù)了在圖2B中開始的序列。
[0071] 圖3A-3D為各種抗原結(jié)合蛋白的各種重鏈的序列比較表。圖3C延續(xù)了在圖3A中 開始的序列。圖3D延續(xù)了在圖3B中開始的序列。
[0072] 圖3E-3JJ描述抗原結(jié)合蛋白某些實(shí)施方案的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸和核酸序列。
[0073] 圖3KK描述各種恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
[0074] 圖3LL-3BBB描述抗原結(jié)合蛋白某些實(shí)施方案的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸和核酸序 列。
[0075] 圖3CCC-3JJJ為抗原結(jié)合蛋白某些實(shí)施方案的各種重鏈和輕鏈序列比較表。
[0076] 圖4A為抗原結(jié)合蛋白與人PCSK9的結(jié)合曲線。
[0077] 圖4B為抗原結(jié)合蛋白與人PCSK9的結(jié)合曲線。
[0078] 圖4C為抗原結(jié)合蛋白與獼猴PCSK9的結(jié)合曲線。
[0079] 圖4D為抗原結(jié)合蛋白與獼猴PCSK9的結(jié)合曲線。
[0080] 圖4E為抗原結(jié)合蛋白與小鼠 PCSK9的結(jié)合曲線。
[0081] 圖4F為抗原結(jié)合蛋白與小鼠 PCSK9的結(jié)合曲線。
[0082] 圖5A描述涉及PCSK9及各種抗原結(jié)合蛋白的SDSPAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其證明蛋白的 相對(duì)純度和濃度。
[0083] 圖5B和5C描述來自對(duì)21B12的biacore溶液平衡測(cè)定的圖表。
[0084] 圖描述來自biacore捕獲測(cè)定的動(dòng)力學(xué)圖表。
[0085] 圖5E描述了描繪三種ABP的分庫（binning)結(jié)果的條形圖。
[0086] 圖6A為在體外PCSK9:LDLR結(jié)合測(cè)定中的針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白31H4IgG2 的抑制曲線。
[0087] 圖6B為在體外PCSK9:LDLR結(jié)合測(cè)定中的針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白31H4IgG4 的抑制曲線。
[0088] 圖6C為在體外PCSK9:LDLR結(jié)合測(cè)定中的針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白21B12IgG2 的抑制曲線。
[0089] 圖6D為在體外PCSK9:LDLR結(jié)合測(cè)定中的針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白21B12IgG4 的抑制曲線。
[0090] 圖7A為在細(xì)胞LDL吸收測(cè)定中的抗原結(jié)合蛋白31H4IgG2的抑制曲線，所述細(xì)胞 LDL吸收測(cè)定顯示ABP降低LDL吸收的作用，該作用封阻了 PCSK9的作用。
[0091] 圖7B為在細(xì)胞LDL吸收測(cè)定中的抗原結(jié)合蛋白31H4IgG4的抑制曲線，所述細(xì)胞 LDL吸收測(cè)定顯示ABP降低LDL吸收的作用，該作用封阻了 PCSK9的作用。
[0092] 圖7C為在細(xì)胞LDL吸收測(cè)定中的抗原結(jié)合蛋白21B12IgG2的抑制曲線，所述細(xì)胞 LDL吸收測(cè)定顯示ABP降低LDL吸收的作用，該作用封阻了 PCSK9的作用。
[0093] 圖7D為在細(xì)胞LDL吸收測(cè)定中的抗原結(jié)合蛋白21B12IgG4抑制曲線，所述細(xì)胞 LDL吸收測(cè)定顯示ABP降低LDL吸收的作用，該作用封阻了 PCSK9的作用。
[0094] 圖8A為描述在ABP31H4小鼠中降低血清膽固醇的能力的圖表，相對(duì)于IgG對(duì)照處 理的小鼠該能力有變化（*Ρ〈〇· 01)。
[0095] 圖8Β為描述在ΑΒΡ31Η4小鼠中降低血清膽固醇的能力的圖表，相對(duì)于時(shí)間=零小 時(shí)該能力有變化（#Ρ，〇· 05)。
[0096] 圖8C為描述在C57B1/6小鼠中ΑΒΡ31Η4對(duì)HDL膽固醇水平的影響的圖表 (*ρ〈0· 01)。
[0097] 圖8D為描述在C57B1/6小鼠中ΑΒΡ31Η4對(duì)HDL膽固醇水平的影響的圖表 (#ρ〈0· 05)。
[0098] 圖9描述ΑΒΡ31Η4在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后提高所存在的肝臟LDLR蛋白量的能力的蛋白 印跡分析
[0099] 圖IOA為描述抗原結(jié)合蛋白31Η4在野生型小鼠中相對(duì)降低總血清膽固醇的能力 的圖表。
[0100] 圖IOB為描述抗原結(jié)合蛋白31Η4在野生型小鼠中降低HDL的能力的圖表。
[0101] 圖IOC為描述不同的抗原結(jié)合蛋白31Η4和16F12降低血清膽固醇能力的圖表。
[0102] 圖IlA描述用于測(cè)試抗原結(jié)合蛋白降低血清膽固醇的持續(xù)時(shí)間及能力的注射方 案。
[0103] 圖IlB為描述圖IlA中的方案的結(jié)果的圖表。
[0104] 圖12A描述H印G2細(xì)胞中響應(yīng)他汀與ABP21B12的組合的LDLR水平。
[0105] 圖12B描述!fepG2細(xì)胞中響應(yīng)他汀與ABP31H4的組合的LDLR水平。
[0106] 圖12C描述H印G2細(xì)胞中響應(yīng)他汀與ABP25A7. 1 (非中和抗體，與"25A7"中和抗 體形成對(duì)照）的組合的LDLR水平。
[0107] 圖12D描述在過量表達(dá)PCSK9的H印G2細(xì)胞中響應(yīng)他汀與ABP21B12的組合的LDLR 水平。
[0108] 圖12E描述在過量表達(dá)PCSK9的H印G2細(xì)胞中響應(yīng)他汀與ABP31H4的組合的LDLR 水平。
[0109] 圖12F描述在過量表達(dá)PCSK9的!fepG2細(xì)胞中響應(yīng)他汀與ABP25A7. 1 (非中和抗 體，與"25A7"中和抗體形成對(duì)照）的組合的LDLR水平。
[0110] 圖13A描述各種針對(duì)PCSK9的ABP的不同輕鏈氨基酸序列。點(diǎn)（.）表示為沒有氨 基酸。
[0111] 圖13B描述各種針對(duì)PCSK9的ABP的輕鏈進(jìn)化樹。
[0112] 圖13C描述各種針對(duì)PCSK9的ABP的不同重鏈氨基酸序列。點(diǎn)（.）表示為沒有氨 基酸。
[0113] 圖13D描述各種針對(duì)PCSK9的ABP的重鏈系統(tǒng)樹圖。
[0114] 圖13E描述輕鏈和重鏈⑶R的比較，并指定了從其中得到共有序列的組。
[0115] 圖13F描述第1組和第2組的共有序列。
[0116] 圖13G描述第3組和第4組的共有序列。
[0117] 圖13H描述第1組和第2組的共有序列。點(diǎn)（.）表示同一殘基。
[0118] 圖131描述第2組的共有序列。點(diǎn)（.）表示同一殘基。
[0119] 圖13J描述第3組和第4組的共有序列。點(diǎn)（.）表示同一殘基。
[0120] 圖14A為描述各種ABP(以10mg/kg)在體內(nèi)降低LDL的能力的圖表。
[0121] 圖14B為描述各種ABP(以30mg/kg)在體內(nèi)降低LDL的能力的圖表。
[0122] 圖15A和圖15B為抗原結(jié)合蛋白的各種實(shí)施方案的各種輕鏈的序列比較表。圖 15B延續(xù)了在圖15A中開始的序列。
[0123] 圖15C和圖15D為抗原結(jié)合蛋白的各種實(shí)施方案的各種輕鏈的序列比較表。圖 IOT延續(xù)了在圖15C中開始的序列。
[0124] 圖16A為用于測(cè)試Ab21B12結(jié)合PCSK9的ProCat或VD部分的能力的凝膠的描述。
[0125] 圖16B為用于測(cè)試Ab31H4結(jié)合PCSK9的ProCat或VD部分的能力的凝膠的描述。
[0126] 圖17描述PCSK9及LDLR的EGFa部分的結(jié)構(gòu)。
[0127] 圖18A描述PCSK9及31H4Ab的結(jié)構(gòu)。
[0128] 圖18B描述PCSK9及31H4Ab的結(jié)構(gòu)。
[0129] 圖 19A 描述 PCSK9、31H4Ab 及 21B12Ab 的結(jié)構(gòu)。
[0130] 圖 19B 描述 PCSK9 及 21B12Ab 的結(jié)構(gòu)。
[0131] 圖20A描述PCSK9及來自LDLR的EGFa的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)與已結(jié)合PCSK9的抗體 31H4和21B12的結(jié)構(gòu)重疊。
[0132] 圖20B描述PCSK9和LDLR的結(jié)構(gòu)模型。
[0133] 圖20C描述另一角度的PCSK9和LDLR的結(jié)構(gòu)模型。
[0134] 圖20D描述包括31H4和21B12的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)形式的PCSK9和LDLR的結(jié)構(gòu)模型。
[0135] 圖20E描述圖20D中的結(jié)構(gòu)模型圍繞所標(biāo)注的軸旋轉(zhuǎn)90度。
[0136] 圖20F描述圖20D中的結(jié)構(gòu)模型圍繞所標(biāo)注的軸旋轉(zhuǎn)180度。
[0137] 圖21A描述PCSK9和31A4的結(jié)構(gòu)。
[0138] 圖21B描述PCSK9和31A4的結(jié)構(gòu)。
[0139] 圖21C描述PCSK9和31A4的結(jié)構(gòu)。
[0140] 圖21D描述全長(zhǎng)PCSK9和31A4的結(jié)構(gòu)模型。
[0141] 圖22為一套確定人ABP序列與在大腸桿菌（E. coli)中產(chǎn)生并用于晶體結(jié)構(gòu)的 ABP序列之間的各種差異的ABP序列。
[0142] 圖23為各種分庫結(jié)果的表。
[0143] 圖23A為描述各種分庫結(jié)果的表的第一部分。
[0144] 圖23B為描述各種分庫結(jié)果的表的第二部分。
[0145] 圖23C為描述各種分庫結(jié)果的表的第三部分。
[0146] 圖23D為描述各種分庫結(jié)果的表的第四部分。
[0147] 圖24A描述在非還原條件下的蛋白印跡。
[0148] 圖24B描述在還原條件下的蛋白印跡。
[0149] 圖25A描述PCSK9的表面覆蓋。
[0150] 圖25B描述PCSK9的表面覆蓋。
[0151] 圖25C描述PCSK9的表面覆蓋。
[0152] 圖2?描述PCSK9的表面覆蓋。
[0153] 圖25E描述PCSK9的表面覆蓋。
[0154] 圖25F描述PCSK9的表面覆蓋。
[0155] 圖26為PCSK9的氨基酸序列與PCSK9變體中突變的所有殘基的序列比較，以調(diào)查 不同抗體表位。
[0156] 圖27A描述21B12表位擊中（印itope hit)，其根據(jù)用21B12作圖到PCSK9的晶體 結(jié)構(gòu)上。
[0157] 圖27B描述31H4表位擊中，其根據(jù)用31H4和21B1作圖到PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)上。
[0158] 圖27C描述31A4表位擊中，其根據(jù)用31A4和21B1作圖到PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)上。
[0159] 圖27D描述12H11表位擊中，其根據(jù)用31H4和21B12作圖到PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)上。
[0160] 圖27E描述3C4表位擊中，其根據(jù)用31H4和21B12作圖到PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)上。
[0161] 圖28A為證明各種ABP與PCSK9的不同部分的結(jié)合能力的圖表。
[0162] 圖28B為證明各種ABP與PCSK9的不同部分的結(jié)合能力的圖表。
[0163] 圖28C為比較兩種ABP的LDLR結(jié)合能力的圖表。
[0164] 圖28D為比較兩種ABP的細(xì)胞LDL吸收活性的圖表。
[0165] 某些例示性實(shí)施方案詳述
[0166] 本文公開了結(jié)合PCSK9的抗原結(jié)合蛋白（例如抗體及其功能結(jié)合片段）。在某些 實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白結(jié)合PCSK9并以各種方式防止PCSK9起作用。在某些實(shí)施 方案中，所述抗原結(jié)合蛋白封阻或降低PCSK9與其它物質(zhì)相互作用的能力。例如，在某些實(shí) 施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白以防止或降低PCSK9結(jié)合LDLR的可能性的方式結(jié)合PCSK9。 在其它實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白結(jié)合PCSK9但不封阻PCSK9與LDLR相互作用的能力。在 某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白為人單克隆抗體。
[0167] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，改變PCSK9和LDLR之間的相 互作用可在受治療者中增加可用于結(jié)合LDL的LDLR量，進(jìn)而降低血清LDL的量，導(dǎo)致受治 療者的血清膽固醇水平降低。因此，針對(duì)PCSK9的抗原結(jié)合蛋白可用于各種方法和組合物 中，所述方法和組合物用于治療高血清膽固醇水平的受治療者、處于高血清膽固醇水平風(fēng) 險(xiǎn)中的受治療者或能從降低其血清膽固醇水平獲益的受治療者。因此，本文還闡述用于降 低血清膽固醇、保持血清膽固醇或預(yù)防血清膽固醇增加的各種方法和技術(shù)。在某些實(shí)施方 案中，抗原結(jié)合蛋白允許PCSK9和LDLR之間結(jié)合，但該抗原結(jié)合蛋白防止或降低PCSK9對(duì) LDLR的有害活性。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白防止或降低PCSK9與LDLR結(jié)合。
[0168] 為方便起見，以下章節(jié)大體上概述本文所用術(shù)語的各種含義。在討論了這些之后， 論述了關(guān)于抗原結(jié)合蛋白的大體方面，接著是證明抗原結(jié)合蛋白的各種實(shí)施方案的性質(zhì)及 如何使用它們的具體實(shí)施例。
[0169] 定義和實(shí)施方案
[0170] 應(yīng)該理解，前述一般說明及以下詳述僅為例示性和解釋性，并非限制所要求保護(hù) 的本發(fā)明。在本申請(qǐng)中，除非另外明確說明，否則單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。在本申請(qǐng)中，除非 另外說明，否則"或"的使用意指"和/或"。此外，術(shù)語"包括"以及其它形式例如"包含"的 使用并非限制性的。此外，除非另外明確說明，否則術(shù)語例如"元件"或"組分"既包括包含 一個(gè)單元的元件及組分又包括包含超過一個(gè)亞單元的元件及組分。此外,術(shù)語"部分"的使 用可包括部分的一部分或整個(gè)部分。
[0171] 本文所用章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的，不能理解為限制所述的主題。為任何目的， 本申請(qǐng)中所引用的所有文獻(xiàn)或文獻(xiàn)的部分（包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書籍及論 文）都在此以其整體引作參考。除非另外指出，否則如本發(fā)明所使用，以下術(shù)語應(yīng)理解為具 有以下含義：
[0172] 術(shù)語"前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin9型"或"PCSK9"是指SEQ ID N0:1和 /或3或其片段所述的多肽以及相關(guān)多肽，它們包括但不限于等位基因變體、剪接變體、衍 生變體、取代變體、缺失變體和/或插入變體（包括添加 N-末端甲硫氨酸）、融合多肽和種 間同源物。在某些實(shí)施方案中，PCSK9多肽包括末端殘基，例如但不限于前導(dǎo)序列殘基、靶向 殘基、氣基末端甲硫氣酸殘基、賴氣酸殘基、標(biāo)簽（tag)殘基和/或融合蛋白殘基。"PCSK9" 也被稱為FH3、NARC1、HCH0LA3、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型和神經(jīng)細(xì)胞凋亡 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶I (neural apoptosis regulated convertaselhPCSKg基因編碼前蛋白轉(zhuǎn)化酶 蛋白，所述前蛋白轉(zhuǎn)化酶蛋白屬于分泌性枯草桿菌酶家族（secretory subtilase family) 的蛋白酶K亞家族。術(shù)語"PCSK9"表示前蛋白和前蛋白自身催化后產(chǎn)生的產(chǎn)物兩者。當(dāng)僅 提及自身催化的產(chǎn)物（例如對(duì)于選擇性結(jié)合裂解的PCSK9的抗原結(jié)合蛋白）時(shí)，該蛋白可 稱為"成熟"、"裂解的"、"經(jīng)加工的"或"有活性的"PCSK9。當(dāng)只提及其無活性的形式時(shí)，該 蛋白可稱為"無活性的"、"前形式的"或"未加工的"形式的PCSK9。本文所用術(shù)語PCSK9還 包括天然存在的等位基因，例如突變體D374Y、S127R和F216L。術(shù)語PCSK9還包括結(jié)合了 PCSK9氨基酸序列翻譯后修飾的PCSK9分子，例如業(yè)已被糖基化、PEG化的PCSK9序列、其信 號(hào)序列業(yè)已被裂解的PCSK9序列、其前域業(yè)已從催化結(jié)構(gòu)域中裂解但尚未與所述催化結(jié)構(gòu) 域分離的PCSK9序列（例如圖IA和1B)。
[0173] 術(shù)語"PCSK9活性"包括PCSK9的任何生物學(xué)作用。在某些實(shí)施方案中，PCSK9 活性包括PCSK9與底物或受體相互作用或結(jié)合的能力。在某些實(shí)施方案中，PCSK9活性 由PCSK9結(jié)合LDL受體（LDLR)的能力來表示。在某些實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合LDLR并 催化涉及LDLR的反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，PCSK9活性包括PCSK9改變（例如降低） LDLR利用率的能力。在某些實(shí)施方案中，PCSK9活性包括PCSK9增加受治療者中的LDL 量的能力。在某些實(shí)施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低可用于結(jié)合LDL的LDLR的量 的能力。在某些實(shí)施方案中，"PCSK9活性"包括因 PCSK9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而產(chǎn)生的任何生物學(xué) 活性。例示性活性包括但不限于：PCSK9結(jié)合LDLR ;裂解LDLR或其它蛋白的PCSK9酶活 性；PCSK9結(jié)合除LDLR外的促進(jìn)PCSK9作用的蛋白；PCSK9改變APOB分泌（SunX-M等， "Evidence for effect of mutant PCSK9on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia(突變的 PCSK9 對(duì)載脂蛋白 B 分泌的影響是非比尋常的嚴(yán)重的顯性高膽固醇血癥的原因的證明），Human Mo I e cu I ar GeneticsH: 1161-1169, 2005 和 Ouguerram K 等，"Apolipoprotein BlOOmetabolism inautosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations inPCSK9 (在與 PCSK9突變有關(guān)的常染色體顯性高膽固醇血癥中載脂蛋白BlOO的代謝），Arterioscler thromb Vase Biol. 24:1448-1453, 2004) ;PCSK9在肝臟再生和神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用 (Seidah NG 等，''The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertasel(NARC-I): Liver regeneration and neuronal differentiation (調(diào) 節(jié)分泌性前蛋白轉(zhuǎn)化酶神經(jīng)細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)化酶l(NARC-l):肝臟再生和神經(jīng)元分 化"PNAS100:928-933, 2003);和PCSK9在肝葡萄糖代謝中的作用（Costet等，"H印atic PCSK9expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding proteinic (經(jīng)由膜島素和固醇調(diào)節(jié)性兀件結(jié)合蛋白Ic通過 營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)調(diào)節(jié)肝 PCSK9 表汰）" L Biol. Chem. 281 (10) :6211-18, 2006)。
[0174] 本文所用術(shù)語"高膽固醇血癥"是指膽固醇水平提高到所需水平以上的病癥。在 某些實(shí)施方案中，其是指血清膽固醇水平提高。在某些實(shí)施方案中，所需水平考慮了本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的各種"風(fēng)險(xiǎn)因子"（并由本文闡述或提及）。
[0175] 術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"包括單鏈和雙鏈核苷酸聚合體二者。包含多核苷酸的 核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或經(jīng)修飾形式的任一種類型核苷酸。所述修飾包 括：堿基修飾，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修飾，例如2'，3' -二脫氧核糖；和核苷酸間 連接修飾，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯（phosphoroselenoate)、二硒代磷 酸酉旨（phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate 和氨基憐酸 酉旨（phosphoroamidate)〇
[0176] 術(shù)語"寡核苷酸"意指包含200個(gè)或更少核苷酸的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中， 寡核苷酸長(zhǎng)10-60個(gè)堿基。在其它實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為12、13、14、15、16、17、18、19 或20-40個(gè)核苷酸。寡核苷酸可為單鏈或雙鏈，例如用于構(gòu)建突變基因的單鏈或雙鏈。寡 核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于檢測(cè)測(cè)定的標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記、 熒光標(biāo)記、半抗原或抗原標(biāo)記。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或雜交探針。
[0177] "分離的核酸分子"意指基因組DNA或RNA、mRNA、cDNA或其合成來源（synthetic origin)或某些組合，它們不與所述分離的多核苷酸天然存在于其中的多核苷酸的全部或 部分締合，或它們被連接到在自然狀態(tài)下不與其連接的多核苷酸。應(yīng)該理解，為本發(fā)明目 的，"包含"特定核苷酸序列的"核酸分子"并不包括整個(gè)染色體。"包含"特定核酸序列的分 離的核酸分子除了包含所述特定序列外，還包含編碼至多10個(gè)或甚至至多20個(gè)其它蛋白 或其部分的序列，或可包含可操作地連接的調(diào)控所述核酸序列的編碼區(qū)表達(dá)的調(diào)控序列， 和/或可包含載體序列。
[0178] 除非另外明確說明，否則本文所述的任何單鏈多核苷酸序列的左手端為5'端；雙 鏈多核苷酸序列的左手方向稱為5'方向。將5'到3'添加新生RNA轉(zhuǎn)錄物的方向稱為轉(zhuǎn) 錄方向；將具有與RNA轉(zhuǎn)錄物相同的序列且其5'為RNA轉(zhuǎn)錄物的5'端的DNA鏈上的序列 區(qū)稱為"上游序列";將具有與RNA轉(zhuǎn)錄物相同的序列且其3'為RNA轉(zhuǎn)錄物的3'端的DNA 鏈上的序列區(qū)稱為"下游序列"。
[0179] 術(shù)語"調(diào)控序列"是指可影響與其連接的編碼序列的表達(dá)及加工的多核苷酸序列。 所述調(diào)控序列的性質(zhì)可視宿主生物體而定。在特定實(shí)施方案中，用于原核生物的調(diào)控序列 可包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。例如，用于真核生物的調(diào)控序列可包括包 含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。"調(diào)控序列" 可包括前導(dǎo)序列和/或融合伴侶序列。
[0180] 術(shù)語"載體"意指用于將蛋白編碼信息轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的任何分子或?qū)嶓w（例如 核酸、質(zhì)粒、噬菌體或病毒）。
[0181] 術(shù)語"表達(dá)載體"或"表達(dá)構(gòu)建體"是指適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并含有指導(dǎo)和/或調(diào)控 (結(jié)合宿主細(xì)胞）一個(gè)或多個(gè)可操作地與其連接的異源編碼區(qū)的表達(dá)的核酸序列的載體。 表達(dá)構(gòu)建體可包括但不限于：影響或調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯的序列；和若存在內(nèi)含子，則影響可操 作地與其連接的編碼區(qū)的RNA剪接的序列。
[0182] 本文所用"可操作地連接"意指使用該術(shù)語的組分處于允許所述組分在合適的條 件下實(shí)行其固有的功能的關(guān)系中。例如，讓"可操作地連接"到蛋白編碼序列的載體中的調(diào) 控序列與蛋白編碼序列連接，以便在與調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄活性兼容的條件下完成所述蛋白編 碼序列的表達(dá)。
[0183] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"意指業(yè)已被或能夠被核酸序列轉(zhuǎn)化并藉此表達(dá)目的基因的細(xì)胞。 不管后代在形態(tài)上或在遺傳構(gòu)成上與原始母細(xì)胞是否相同，只要后代存在目的基因，該術(shù) 語就包括所述母細(xì)胞的后代。
[0184] 術(shù)語"轉(zhuǎn)染"意指細(xì)胞吸收外來或外源DNA，當(dāng)將所述外源DNA引入到細(xì)胞膜內(nèi) 時(shí)所述細(xì)胞就被"轉(zhuǎn)染"了。多種轉(zhuǎn)染技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知并公開于本文中。參見例如 Graham 等，1973, Virology52:456 :Sambrook 等，2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)），見上述；Davis 等，1986, Basic Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)基本方法），Elsevier ;Chu等，1981, Genej^: 197。所述技術(shù)可用于將 一種或多種外源DNA部分引入到合適的宿主細(xì)胞中。
[0185] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指細(xì)胞中遺傳特性的改變，當(dāng)細(xì)胞被修飾成含有新DNA或RNA時(shí)， 所述細(xì)胞就被轉(zhuǎn)化了。例如，當(dāng)通過經(jīng)由轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它技術(shù)引入新遺傳物質(zhì)來對(duì)細(xì)胞天 然狀態(tài)進(jìn)行遺傳修飾時(shí)，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化了。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化的DNA可通過在物理上整合到 細(xì)胞染色體而與細(xì)胞DNA重組，或可作為染色體外元件不被復(fù)制而短暫保留，或可作為質(zhì) 粒獨(dú)立復(fù)制。當(dāng)轉(zhuǎn)化的DNA隨著細(xì)胞分裂復(fù)制時(shí)，認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)被"穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化"了。
[0186] 術(shù)語"多肽"或"蛋白"意指如下大分子：具有天然蛋白的氨基酸序列的大分子，所 述天然蛋白即由天然存在且為非重組的細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白；或所述大分子由遺傳工程改造的 或重組的細(xì)胞產(chǎn)生，所述術(shù)語包括具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或具有所述天然序 列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。該術(shù)語還包括氨基酸聚合體，其中 一個(gè)或多個(gè)氨基酸為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物及聚合體。術(shù)語"多肽"和"蛋 白"特別涵蓋PCSK9抗原結(jié)合蛋白、抗體或序列，其具有抗原結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸 的缺失、添加和/或取代。術(shù)語"多肽片段"是指與全長(zhǎng)天然蛋白相比具有氨基末端缺失、羧 基末端缺失和/或中間缺失的多肽。所述片段還可含有與天然蛋白相比經(jīng)修飾的氨基酸。 在某些實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度為約5-500個(gè)氨基酸。例如，片段長(zhǎng)度可為至少5、6、8、10、14、 20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個(gè)氨基酸。有用的多肽片段包括抗體 的免疫學(xué)功能片段，包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在PCSK9結(jié)合抗體情況下，有用的片段包括但不限于 CDR區(qū)、重鏈和/或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域、抗體鏈的部分或僅其含兩個(gè)CDR的可變區(qū)等。
[0187] 提及的術(shù)語"分離的蛋白"意指如下主題蛋白：（1)脫離通常與其一起存在的至 少某些其它蛋白的蛋白；（2)基本上脫離同一來源（例如來自同樣的物種）的其它蛋白的 蛋白；（3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)的蛋白；（4)已經(jīng)與和其天然結(jié)合的多核苷酸、脂類、 糖類或其它物質(zhì)的至少約50%分開的蛋白；（5)與和其并不天然結(jié)合的多肽可操作地結(jié)合 (通過共價(jià)或非共價(jià)作用）的蛋白；或（6)非天然存在的蛋白。通常"分離的蛋白"構(gòu)成既 定樣品的至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。基因組DNA、cDNA、mRNA或 合成來源或其任何組合的其它RNA可編碼所述分離的蛋白。優(yōu)選地，分離的蛋白基本上脫 離在其天然環(huán)境中存在的干擾其治療、診斷、預(yù)防、研究或其它用途的蛋白或多肽或其它污 染物。
[0188] 術(shù)語"氨基酸"包括其在本領(lǐng)域中的一般含義。
[0189] 多肽（例如抗原結(jié)合蛋白或抗體）的"變體"包含相對(duì)于另一多肽序列在氨基酸 序列中插入、缺失和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。變體包括融合蛋白。
[0190] 術(shù)語"同一性"是指通過比對(duì)和比較序列而確定的兩個(gè)或多個(gè)多肽分子或兩個(gè)或 多個(gè)核酸分子序列之間的關(guān)系。"同一性百分率"意指被比較的分子內(nèi)的氨基酸或核苷酸 之間相同殘基的百分比，其基于被比較的大小最小的分子計(jì)算。對(duì)于這些計(jì)算，優(yōu)選通過 特定的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序（即"算法"）來解決比對(duì)中的空位（如果存在的話）?？?用于計(jì)算比對(duì)的核酸或多肽同一'丨生的方法包括如下文獻(xiàn)中所述的方法：Computational Molecular Biology (計(jì)算機(jī)化的分子生物學(xué)），（Lesk, A. Μ·編輯），1988, New York:Oxford University Press ；Biocomputing Informatics and Genome Pro jects (生物計(jì)算信息學(xué) 和基因組計(jì)劃），（Smith, D.W.編輯），1993, New York:Academic Press ;Computer Analysis of Sequence Data, Parti (序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析，第 I 部分），（Griffin,A.M·和 Griffin, H. G.編輯），1994, New Jersey:Humana Press ；von Heinje, G. , 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物學(xué)序列分析），New York:Academic Press ;Sequence Analysis Primer(序列分析引物），（Gribskov,M.和 Devereux, J.編輯），1991,New York:M. Stockton Press ;和 Carillo 等，1988, SIAM J.AppliedMath. 48:1073。
[0191] 在計(jì)算同一性百分率時(shí)，通常以得到序列之間的最大匹配的方式來比對(duì)待比 較的序列?？捎糜跍y(cè)定同一性百分率的計(jì)算機(jī)程序的一個(gè)實(shí)例為GCG程序包，其包括 GAP(Devereux等，1984,Nucl. AcidRes. 12:387 :Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。將計(jì)算機(jī)算法GAP用于比對(duì)待測(cè)定序列同一1丨生百分比的兩個(gè)多 肽或多核苷酸。根據(jù)其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)（由算法來確定 "匹配跨度（matched span)"）。結(jié)合所述方法使用空位開放罰分（計(jì)算為3x平均對(duì)角線 (average diagonal),其中所述"平均對(duì)角線"為所用比較矩陣的對(duì)角線的平均值；所述"對(duì) 角線"為通過特定比較矩陣分配給每一完美的氨基酸匹配的分值或數(shù)值）和空位延伸罰分 (其通常為空位開放罰分的1/10倍）以及比較矩陣?yán)鏟AM250或BL0SUM62。在某些實(shí)施方 案中，所述算法也使用標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣（對(duì)于PAM250比較矩陣，參見Dayhoff等，1978, Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集），5:345_352 ;對(duì)于 BL0SUM62 比較矩陣，參見 Henikoff 等，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:10915-10919)。
[0192] 在用GAP程序測(cè)定多肽或核苷酸序列的同一性百分率中可采用的參數(shù)實(shí)例以下：
[0193] ?算法：Needleman 等，1970, J. Mol. Biol. 48:443-453
[0194] ?比較矩陣：來自Henikoff等，1992,上述的BL0SUM62
[0195] ?空位罰分：12 (但對(duì)末端空位不罰分）
[0196] ?空位長(zhǎng)度罰分：4
[0197] ?相似性閥值：0
[0198] 用于比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列的某些比對(duì)設(shè)計(jì)（alignment scheme)可導(dǎo)致僅兩個(gè)序 列的短區(qū)域匹配，即使在兩個(gè)全長(zhǎng)序列間沒有顯著的關(guān)系，這種小比對(duì)區(qū)也可具有極高的 序列同一性。因此，如果需要產(chǎn)生跨越靶標(biāo)多肽的至少50個(gè)或其它數(shù)目的鄰接氨基酸的比 對(duì)，則可調(diào)整所選擇的比對(duì)方法（GAP程序）。
[0199] 本文所用的20種常規(guī)（例如天然存在的）氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。參見 Immunology-ASynthesis (免疫學(xué)一合成）（第 2 版，E. S. Golub 和 D. R. Gren,編輯，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，為任何目的其在此引作參考。20種常規(guī)氨基酸 的立體異構(gòu)體（例如D-氨基酸）、非天然氨基酸例如a -，α -二取代的氨基酸、N-烷基氨 基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可為本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸實(shí)例包括： 4_羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、ε -Ν，N，N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰基賴氨酸、0-磷酸絲 氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲?；琢虬彼?、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、〇 -N-甲基精 氨酸和其它相似的氨基酸和亞氨基酸（例如4-羥基脯氨酸）。在本文所用的多肽記號(hào)中， 左手方向?yàn)榘被┒朔较颍沂址较驗(yàn)轸然┒朔较?，與標(biāo)準(zhǔn)用法和習(xí)慣一致。
[0200] 同樣地，除非另外說明，否則單鏈多核苷酸序列的左手端為5'端；雙鏈多核苷酸 序列的左手方向被稱為5'方向。將5'到3'方向添加新生RNA轉(zhuǎn)錄物稱為轉(zhuǎn)錄方向；將具 有與RNA轉(zhuǎn)錄物相同序列且其5'為RNA轉(zhuǎn)錄物的5'端的DNA鏈上的序列區(qū)稱為"上游序 列";將具有與RNA轉(zhuǎn)錄物相同序列且其3'為RNA轉(zhuǎn)錄物的3'端的DNA鏈上的序列區(qū)稱為 "下游序列"。
[0201] 保守氨基酸取代可涵蓋非天然存在的氨基酸殘基，其通常通過化學(xué)肽合成而不是 通過生物系統(tǒng)合成而引入。它們包括肽模擬物和其它逆向或反向形式的氨基酸部分。
[0202] 可基于常規(guī)側(cè)鏈性質(zhì)將天然存在的殘基分類：
[0203] 1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ;
[0204] 2)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ;
[0205] 3)酸性：Asp、Glu ;
[0206] 4)堿性：His、Lys、Arg ;
[0207] 5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro ;和
[0208] 6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
[0209] 例如，非保守取代可涉及將這些類別之一的成員交換為另一類別的成員。所述被 取代的殘基可例如引入到與非人抗體同源的人抗體的區(qū)域內(nèi)，或引入到所述分子的非同源 區(qū)域內(nèi)。
[0210] 根據(jù)某些實(shí)施方案，在改變抗原結(jié)合蛋白或PCSK9蛋白時(shí)，可考慮氨基酸的親水 性指數(shù)（hydropathic index)。基于每種氨基酸的疏水性及電荷性質(zhì)指定其親水性指數(shù)。 它們是：異亮氨酸（+4.5);纈氨酸（+4.2);亮氨酸（+3.8);苯丙氨酸（+2.8);半胱氨酸/ 胱氨酸（+2.5);甲硫氨酸（+1.9);丙氨酸（+1.8);甘氨酸（-0.4);蘇氨酸（-0.7);絲氨酸 (-〇. 8);色氨酸（-〇. 9);酪氨酸（-1. 3);脯氨酸（-1. 6);組氨酸（-3. 2);谷氨酸（-3. 5);谷 氨酰胺（-3. 5);天冬氨酸（-3. 5);天冬酰胺（-3. 5);賴氨酸（-3. 9);和精氨酸（-4. 5)。
[0211] 氨基酸親水性指數(shù)在賦予蛋白相互作用生物學(xué)功能中的重要性為本領(lǐng)域所了解。 Kyte等，J. Mol. Biol.，157:105-131 (1982)。已知某些氨基酸可取代具有相似親水性指數(shù) 或分值的其它氨基酸而仍保留相似的生物學(xué)活性。在某些實(shí)施方案中，在基于親水性指數(shù) 進(jìn)行改變時(shí)，包括親水性指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸的取代。在某些實(shí)施方案中，包括在±1內(nèi) 的氨基酸的取代，在某些實(shí)施方案中，包括±0. 5內(nèi)的氨基酸的取代。
[0212] 本領(lǐng)域還了解，可基于親水性進(jìn)行相似氨基酸的有效取代，尤其是當(dāng)藉此形成的 生物學(xué)功能蛋白或肽意欲用于如本例子一樣的免疫學(xué)實(shí)施方案時(shí)。在某些實(shí)施方案中， 由其鄰接的氨基酸的親水性所決定的蛋白的最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性 (即蛋白的生物學(xué)特性）相關(guān)。
[0213] 以下為給這些氨基酸殘基分配的親水性值：精氨酸（+3. 0);賴氨酸（+3. 0);天冬 氨酸（+3.0±1);谷氨酸（+3.0±1);絲氨酸（+0.3);天冬酰胺（+0.2);谷氨酰胺（+0.2); 甘氨酸（〇);蘇氨酸（-0.4);脯氨酸（_0.5±1);丙氨酸（-0.5);組氨酸（-0.5);半胱氨 酸（-1.0);甲硫氨酸（-1.3);纈氨酸（-1.5);亮氨酸（-1.8);異亮氨酸（-1.8);酪氨酸 (-2.3);苯丙氨酸（-2.5)和色氨酸（-3.4)。在某些實(shí)施方案中，在基于相似的親水值進(jìn)行 改變時(shí)，包括親水值在±2內(nèi)的氨基酸的取代，在某些實(shí)施方案中，包括在±1內(nèi)的氨基酸 的取代，而在某些實(shí)施方案中，包括在±0. 5內(nèi)的氨基酸的取代。人們還可基于親水性由一 級(jí)氨基酸序列確定表位。這些區(qū)域也被稱為〃表位核心區(qū)"。
[0214] 例示性氨基酸取代示于表1中
[0215] 表 1
[0216] 氨基酸取代
[0217]
【權(quán)利要求】
1. 分離的中和抗原結(jié)合蛋白，所述中和抗原結(jié)合蛋白結(jié)合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸 序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合蛋白降低PCSK9對(duì)LDLR的降低LDLR的作用。
2. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的分離的中和抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原 結(jié)合蛋白為L(zhǎng)DLR非競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。
3. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的分離的中和抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原 結(jié)合蛋白為L(zhǎng)DLR競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。
4. 選擇性結(jié)合PCSK9的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白以小于100 pM的Kd結(jié) 合PCSK9。
5. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白以 小于10 pM的Kd結(jié)合。
6. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白以 小于5 pM的Kd結(jié)合。
7. 結(jié)合SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白的分離的抗原結(jié)合蛋白，其中在所述分離的抗原 結(jié)合蛋白與PCSK9蛋白變體之間的結(jié)合小于所述分離的抗原結(jié)合蛋白與SEQ ID NO: 1的 PCSK9蛋白之間的結(jié)合的50%。
8. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的分離的人抗原結(jié)合蛋白，其中所述變體 PCSK9蛋白包含選自SEQ ID NO: 1所示的以下位置的殘基的至少一個(gè)突變：207、208、185、 181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、 521 和 554。
9. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的分離的人抗原結(jié)合蛋白，其中所述至少一 個(gè)突變選自 R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、 A413R 和 E582R。
10. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的分離的人抗原結(jié)合蛋白，其中所述至少 一個(gè)突變選自 D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R 和 Q554R。
11. 以第一種方式結(jié)合SEQ ID NO: 303的PCSK 9蛋白的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原 結(jié)合蛋白以第二種方式結(jié)合PCSK9變體，其中所述PCSK9變體具有在選自SEQ ID NO: 303 的以下位置處的至少一個(gè)點(diǎn)突變：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、 582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521 和 554,其中所述第一種方式包含第一 EC50、第一 Bmax或第一 EC50和第一 Bmax，其中所述第二種方式包含第二EC50、第二Bmax 或第二EC50和第二Bmax，其中所述第一種方式的值不同于所述第二種方式的值。
12. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一種方式 包含第一 EC50,其中所述第二種方式包含第二EC50,其中所述點(diǎn)突變選自：R207E、D208R、 E181R, R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。
13. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一 EC50與所 述第二EC50至少有20%不同。
14. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一 EC50與所 述第二EC50至少有50%不同。
15. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第二EC50在數(shù) 值上大于所述第一 EC50。
16. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一 EC50由多 元珠粒結(jié)合測(cè)定來測(cè)定。
17. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第二EC50大于 I uM。
18. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白 為中和抗原結(jié)合蛋白。
19. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合 蛋白為競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。
20. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合 蛋白為非競(jìng)爭(zhēng)性中和抗原結(jié)合蛋白。
21. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一種方式包 含第一 Bmax，其中所述第二種方式包含不同于所述第一 Bmax的第二Bmax，并且其中所述 PCSK9變體具有選自以下的至少一個(gè)點(diǎn)突變：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、 D313R、D337R、R519E、H521R 和 Q554R。
22. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第二Bmax為所 述第一 Bmax的約10%。
23. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一 Bmax與所 述第二Bmax相差至少20%。
24. 本文要求保護(hù)的抗原結(jié)合蛋白中任一種的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一 Bmax與所 述第二Bmax相差至少50%。
25. 分離的抗體，所述分離的抗體在與LDLR結(jié)合PCSK9的位點(diǎn)重疊的位點(diǎn)處結(jié)合 PCSK9。
26. 中和抗體，所述中和抗體結(jié)合PCSK9并降低PCSK9對(duì)低密度脂蛋白受體（LDLR)的 降低LDLR的作用。
27. 中和抗體，所述中和抗體結(jié)合PCSK9,其中所述抗體在SEQ ID NO: 3的31-447位 殘基內(nèi)的位點(diǎn)處結(jié)合PCSK9。
28. 權(quán)利要求27的抗體，其中所述抗體結(jié)合SEQ ID NO: 3的31-447位殘基內(nèi)的表位。
29. 藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-28中任何一項(xiàng)的至少一種抗原結(jié)合 蛋白和可藥用賦形劑。
30. 編碼權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白的核酸分子。
31. 制備抗原結(jié)合蛋白的方法，所述抗原結(jié)合蛋白結(jié)合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列 的PCSK9蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白降低PCSK9對(duì)LDLR的降低LDLR的作用，所述方法包 括： 提供包含編碼所述抗原結(jié)合蛋白的核酸序列的宿主細(xì)胞；和 使所述宿主細(xì)胞保持在其中表達(dá)所述抗原結(jié)合蛋白的條件下。
32. 降低受治療者血清膽固醇水平的方法，所述方法包括給予所述受治療者有效量的 分離的中和抗原結(jié)合蛋白，所述中和抗原結(jié)合蛋白結(jié)合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的 PCSK9蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合蛋白降低PCSK9對(duì)LDLR的降低LDLR的作用。
33. 用于治療或預(yù)防與患者中的高血清膽固醇水平有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括 給予需要治療或預(yù)防的患者有效量的分離的中和抗原結(jié)合蛋白，所述中和抗原結(jié)合蛋白結(jié) 合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合蛋白降低PCSK9對(duì) LDLR的降低LDLR的作用。
34. 用于治療或預(yù)防與受治療者中的高血清膽固醇水平有關(guān)的病癥的方法，所述方法 包括給予需要治療或預(yù)防的受治療者有效量的分離的中和抗原結(jié)合蛋白，并同時(shí)或序貫地 給予提高LDLR蛋白的利用率的藥劑，其中所述分離的抗原結(jié)合蛋白結(jié)合包含SEQ ID NO: 1 氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原結(jié)合蛋白降低PCSK9對(duì)LDLR的降低LDLR的 作用。
35. 權(quán)利要求31-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述提高LDLR蛋白的利用率的藥劑包括他 汀。
36. 權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述他汀選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟 伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅蘇伐他汀、辛伐他汀及它們的某些組 合。
37. 權(quán)利要求1-22的抗原結(jié)合蛋白在制備用于降低血清膽固醇的藥物中的用途。
38. 權(quán)利要求1-22的抗原結(jié)合蛋白在制備用于治療或預(yù)防與受治療者中的高血清膽 固醇水平有關(guān)的病癥的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P3/06GK104311665SQ201410218672
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2007年8月23日
【發(fā)明者】S.M.杰克遜, N.P.C.沃克, D.E.皮佩爾, 單倍, 沈文彥, J.C.Y.陳, C.T.金, R.R.克徹姆, C.梅林, T.A.卡拉貝奧, 曹瓊 申請(qǐng)人:安姆根有限公司