具有輔助降血糖功能的五肽klpgf的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一個(gè)具有輔助降血糖功能的五肽。具體而言，本發(fā)明公開了一種既能抑制α-葡萄糖苷酶活性，也能抑制α-淀粉酶活性的五肽KLPGF，五肽KLPGF的氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Leu-Pro-Gly-Phe。本發(fā)明可用于開發(fā)輔助降血糖的藥物和功能食品。
【專利說(shuō)明】具有輔助降血糖功能的五肽KLPGF

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一個(gè)既能與α -葡萄糖苷酶結(jié)合并能抑制 α-葡萄糖苷酶活性，也能與α-淀粉酶結(jié)合并能抑制α-淀粉酶活性的具有輔助降血糖功 能的五肽KLPGF。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)隨著人類生活水平的不斷提高以及不良飲食習(xí)慣，造成了很多高血糖患 者，糖尿病患病率急劇上升，糖尿病的病理機(jī)制等研宄迫在眉睫，人們迫切需要能有效降低 人體血糖的活性成分。
[0003] 長(zhǎng)久以來(lái)靈芝及冬蟲夏草被人們當(dāng)做降血糖保健食品服用，但是由于原料價(jià)格昂 貴給患者及家屬帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0004] 目前口服抗糖尿病的活性組分迅速發(fā)展，如α -葡萄糖苷酶抑制劑和醛糖還原酶 抑制劑等。研宄發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的許多酶在調(diào)節(jié)血糖過(guò)程中起著重要的作用，可作為抗糖尿病的 作用靶點(diǎn)，為研制治療糖尿病的有效成分提供有效途徑。
[0005] 抑制α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶的活性被認(rèn)為是控制糖尿病的一個(gè)有效策略， 成為輔助降血糖活性成分開發(fā)的一個(gè)新思路。阿卡波糖作為一種新型口服降糖藥，主要是 在腸道內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性抑制葡萄糖甙水解酶，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的半抑制濃度 (IC 50)為 60. 8 μ mol L'
[0006] 從這個(gè)角度出發(fā)，越來(lái)越多的研宄都集中在尋找更有效的酶抑制劑，進(jìn)而開發(fā)更 有效的抗糖尿病的功能成分。
[0007] 隨著研宄的不斷深入，研宄發(fā)現(xiàn)動(dòng)植物多糖具有降血糖的功效，然而關(guān)于生物活 性肽降血糖活性的研宄鮮有報(bào)道。
[0008] 活性肽在生命過(guò)程中重要的作用逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，其作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié) 因子和激素參與受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響著生物體內(nèi)許多重要的生理生化功能，如血壓 調(diào)節(jié)和血糖調(diào)節(jié)等，而且活性肽易于被人體吸收，同時(shí)兼具化學(xué)合成和化學(xué)修飾等特點(diǎn)引 起了人們的極大興趣，也必將推動(dòng)關(guān)于活性肽降血糖功效研宄的不斷深入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有輔助降血糖功能的五肽KLPGF。
[0010] 本發(fā)明所涉及的一些縮寫具有以下含義：
[0011] K ：Lys
[0012] L ：Leu
[0013] P ：Pro
[0014] G ：Gly
[0015] F ：Phe
[0016] Lys :賴氨酸
[0017] Leu:亮氨酸
[0018] Pro :脯氨酸
[0019] Gly :甘氨酸
[0020] Phe :苯丙氨酸
[0021] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種五肽KLPGF，其氨基酸序列為： Lys-Leu-Pro-Gly-Phe0
[0022] 本發(fā)明提供的五肽KLPGF通過(guò)對(duì)α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶的活性進(jìn)行抑制， 進(jìn)而發(fā)揮輔助降血糖的作用，形態(tài)為白色粉末狀。五肽KLPGF抑制α-淀粉酶活性的半抑 制濃度為59. 5±5· 7 ymol L-1，抑制α -葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度為120. 0±4· 0 ymol L'
[0023] 本發(fā)明所提供的五肽KLPGF可委托上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣色@得。
[0024] 本發(fā)明所涉及的檢測(cè)方法如下：
[0025] 1.抑制葡萄糖苷酶活性：
[0026] 抑制α -葡萄糖苷酶活性的檢測(cè)方法具體操作步驟為：取5 μ L的α -葡萄糖苷酶 溶液（l〇unit/ml，溶解在0. lmol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液，ρΗ6. 8)與10 μ L不同濃度的 活性肽溶液（活性肽溶解在10% DMSO溶液中）依次加入到620 μ L 0. lmol/L磷酸鉀緩沖 液（pH值6. 8)，在37. 5°C下預(yù)熱20分鐘后加入10 μ L對(duì)硝基苯基葡萄糖苷（pNPG，IOmmol/ U作為反應(yīng)底物以啟動(dòng)反應(yīng)。
[0027] 反應(yīng)混合液置于37.5 °C條件下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，最后加入650 yL的lmol/L Na2COjS止反應(yīng)，使用紫外可見分光光譜儀在410nm處測(cè)定進(jìn)而算出酶活性。
[0028] 測(cè)定原理以無(wú)色的對(duì)硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷（pNPG)作反應(yīng)底物，經(jīng)α-葡萄 糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷鍵后釋放出對(duì)硝基苯酚（ρΝΡ)，在堿性條件下對(duì)硝基苯酚是 黃色的，最后通過(guò)監(jiān)測(cè)410nm下的ρΝΡ產(chǎn)生量作為α -1，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定標(biāo) 準(zhǔn)。
[0029] 活性肽對(duì)α -葡萄糖苷酶抑制活性計(jì)算公式如下：
[0030] 抑制活性/%= (ODa-ODb)/ODaX 100
[0031] 式中：0Da為空白對(duì)照組中反應(yīng)完成后在410nm處測(cè)定的吸光度；
[0032] ODb為添加活性肽組中反應(yīng)完成后在410nm處測(cè)定的吸光度。
[0033] 2.抑制淀粉酶活性：
[0034] 抑制淀粉酶活性測(cè)定具體步驟為：取10 μ L的α -淀粉酶水溶液（lunit/L)與 10 μ L不同的濃度活性肽溶液（活性肽樣品用10% DMSO溶解）混合預(yù)熱15分鐘，而后加 入500 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的淀粉溶液（溶解于20mol/L pH 6. 9的磷酸鈉緩沖液）啟動(dòng)反 應(yīng)。
[0035] 反應(yīng)在37. 5°C條件下進(jìn)行5分鐘，滴加600 μ L DNS試劑（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的3， 5-二硝基水楊酸和含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%酒石酸鉀鈉的0. 4mol/L氫氧化鈉溶液）終止反應(yīng)。
[0036] 反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)混合物置于沸水浴中15分鐘，然后冷卻至室溫在540nm處用 UV-2550分光光度計(jì)測(cè)定。
[0037] 淀粉酶抑制活性的測(cè)定原理是建立在淀粉酶將淀粉水解為麥芽糖，麥芽糖與3， 5-二硝基水楊酸發(fā)生還原反應(yīng)生成3-胺基-5-硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，其顏色深淺與糖濃 度成正比。
[0038] 活性肽對(duì)淀粉酶的抑制活性按如下公式進(jìn)行計(jì)算：
[0039] 淀粉酶抑制活性/%= (ODa-ODb)/ODaX 100
[0040] 式中：0Da為空白對(duì)照組中反應(yīng)完成后在540nm處測(cè)定的吸光度；
[0041] ODb為添加活性肽組中反應(yīng)完成后在540nm處測(cè)定的吸光度。
[0042] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0043] 1)、本發(fā)明提供的五肽具有抑制α -淀粉酶活性的作用。
[0044] 2)、本發(fā)明提供的五肽同時(shí)具有抑制α -葡萄糖苷酶活性的作用。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但不限于此。
[0046] 實(shí)施例1、五肽KLPGF對(duì)α -淀粉酶的抑制活性：
[0047] 活性測(cè)定操作步驟：取10 μ L的α -淀粉酶水溶液（lunit/L)與10 μ L不同的濃度 (10 μ Μ、20 μ Μ、40 μ Μ、80 μ Μ、160 μ M和 320 μ Μ)五肽 KLPGF 溶液（用 10% DMSO 溶解）混合 預(yù)熱15分鐘，而后加入500 μ 1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的淀粉溶液（溶解于20mol/L pH 6. 9的磷 酸鈉緩沖液）啟動(dòng)反應(yīng)?；钚詼y(cè)定反應(yīng)條件：在37. 5°C條件下進(jìn)行5分鐘，滴加600 μ LDNS 試劑（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的3, 5-二硝基水楊酸和含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的酒石酸鉀鈉的0. 4mol/ L氫氧化鈉溶液）終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)混合物置于沸水浴中15分鐘，然后冷卻至室 溫在540nm處用UV-2550分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而算出活性肽對(duì)α -淀粉酶的抑制活性。
[0048] 結(jié)果：五肽KLPGF抑制α -淀粉酶活性的半抑制濃度為59. 5 ±5. 7 μ mol L-1。
[0049] 實(shí)施例2、五肽KLPGF對(duì)α -葡萄糖苷酶的抑制活性：
[0050] 活性測(cè)定操作步驟為：取5yL的α-葡萄糖苷酶溶液（l〇unit/ml，溶解在 0· lmol/L pH 6. 8 的磷酸鉀緩沖液，ρΗ6· 8)與 10 μ L 不同濃度（10 μ Μ、20 μ Μ、40 μ M、 80μΜ、160μΜ和320 μΜ)的五肽KLPGF溶液（溶解在10% DMSO溶液中）依次加入到 620 μ L0. lmol/L磷酸鉀緩沖液（pH6. 8)，在37. 5°C下預(yù)熱20分鐘后加入10 μ L對(duì)硝基苯基 葡萄糖苷（pNPG，10mmol/L)作為反應(yīng)底物以啟動(dòng)反應(yīng)?；钚詼y(cè)定反應(yīng)條件：反應(yīng)混合液置 于37. 5°C條件下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘，最后加入650 yL的lmol/L似20)3終止反應(yīng)，使用紫外 可見分光光譜儀在410nm處測(cè)定來(lái)進(jìn)而算出活性肽對(duì)α -葡萄糖苷酶的抑制活性。
[0051] 結(jié)果：五肽KLPGF抑制α -葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度為120. 0±4. 0 μ mol L'
【權(quán)利要求】
1.具有輔助降血糖功能的五肽KLPGF，其特征是：所述五肽KLPGF的氨基酸序列為： Lys-Leu_Pr〇-Gly-Phe 〇
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK104497105SQ201410693316
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】于志鵬, 趙文竹, 勵(lì)建榮 申請(qǐng)人:渤海大學(xué)