石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白tctp及其編碼基因在抗魚類神經(jīng)壞死病毒方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基因在抗魚類神經(jīng)壞死病毒方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用病毒滴度和實(shí)時(shí)定量PCR檢測了石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP對NNV病毒復(fù)制的抑制作用。本發(fā)明的石斑魚Ec-TCTP是一種具有抗病毒功能的翻譯控制腫瘤蛋白基因，用該基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，并將表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入石斑魚腦細(xì)胞中，得到能過量表達(dá)Ec-TCTP的穩(wěn)定細(xì)胞，具有提高細(xì)胞對病毒感染的耐受能力；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明了石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白確實(shí)具有抑制RNA病毒復(fù)制的特點(diǎn)，石斑魚Ec-TCTP基因克隆和功能分析的研究將對進(jìn)一步研究和開發(fā)抗病功能蛋白具有重要的科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基因在抗魚類神 經(jīng)壞死病毒方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基 因在抗魚類神經(jīng)壞死病毒方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 翻譯控制腫瘤蛋白（Tranlationally Controlled Tumor Protein, TCTP)，又稱 P21、P23以及fortilin。對TCTP蛋白序列研宄分析發(fā)現(xiàn)，TCTP蛋白亞基具有2個(gè)典型的 特征序列，TCTPl和TCTP2,并且?guī)в幸粋€(gè)微管結(jié)合區(qū)（Gachet et al.，1999)和Ca2+結(jié)合區(qū) 域（Kim et al.，2000)。
[0003] 石斑魚，隸屬于自盧形目（Perciformes)、齠科（Settauida)、石斑魚亞科 (Epinephelina)。廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶海域，我國南海及東海南部均有分布， 其中南海較多，常年均可捕獲，以春、夏季為漁獲旺季。據(jù)魚類學(xué)家研宄記載，石斑魚屬種類 較多，全世界有400種以上，我國產(chǎn)的石斑魚亞科有13屬，79種，但目前僅有約6種石斑魚 可人工飼養(yǎng)，石斑魚肉質(zhì)鮮美蛋白含量高，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的食用魚類，也是我國創(chuàng)匯 的優(yōu)良魚類品種（陸忠康，1996)。從20世紀(jì)90年代開始，石斑魚養(yǎng)殖進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖 階段。隨著石斑魚飼養(yǎng)密度的增加，魚體抵抗病原的侵襲和感染的能力有所降低，從而使一 些魚類疾病頻繁爆發(fā)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。由于病毒具有的獨(dú)特生物學(xué)特性和魚類特 有的水生環(huán)境特點(diǎn)，使得魚類病毒性疾病具有很強(qiáng)的傳染性、致病性和嚴(yán)重的破壞力，已經(jīng) 成為魚類重要的致病病源之一。魚類神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV)，是一 種世界范圍內(nèi)流行的海水魚類病毒病，主要發(fā)生在海水魚類種苗生產(chǎn)階段，是近幾年來石 斑魚苗種培育中危害最大的病原，魚苗死亡率高達(dá)90%以上，給石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來 嚴(yán)重的危害。目前對魚類病害的防治，主要是采用抗生素和化學(xué)藥物，造成了藥物殘留、耐 藥性及環(huán)境污染等嚴(yán)重問題。為此，開展魚類免疫抗病的基礎(chǔ)研宄及研制新型抗病基因工 程制品已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。翻譯控制腫瘤蛋白TCTP廣泛存在于動物、植物和真菌中，參與 多種生物學(xué)過程，具有多種生物學(xué)功能，如抗凋亡、抗病毒等（Th aw et al.，2001)，應(yīng)用潛 力很大。目前，石斑魚TCTP對神經(jīng)壞死病毒的抗病毒作用還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP在抗魚類神經(jīng)壞死病 毒方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用病毒滴度和實(shí)時(shí)定量PCR檢測了石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP 對NNV病毒復(fù)制的抑制作用。
[0005] 所述的石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP的編碼基因 Ec-TCTP 在抗魚類神經(jīng)壞死病毒方面的應(yīng)用。
[0007] 所述的石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP的編碼基因 Ec-TCTP，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 本發(fā)明是通過以下步驟來檢測石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP及其編碼基因?qū)︳~ 類神經(jīng)壞死病毒復(fù)制的抑制作用的：
[0009] (1)、根據(jù)已知的石斑魚Ec-TCTP基因 CDNA全長序列，設(shè)計(jì)如下構(gòu)建真核表達(dá)載體 的特異性引物：
[0010] pcDNA-TCTP-S ：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA
[0011] pcDNA-TCTP-R ：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG
[0012] 引物pcDNA-TCTP-S含有限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點(diǎn)，pcDNA-TCTP-R含有限制 性內(nèi)切酶BamHI識別位點(diǎn)；
[0013] (2)、提取石斑魚肝臟組織RNA，并以RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，再以石斑魚 cDNA為模板，采用步驟（1)中設(shè)計(jì)的特異性引物，在PCR擴(kuò)增體系中對Ec-TCTP基因的cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)回收純化Ec-TCTP基因片段；
[0014] (3)、使用Hind III和BamHI對步驟⑵純化得到的Ec-TCTP基因片段進(jìn)行雙酶切 獲得帶有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的Ec-TCTP基因，同時(shí)用HindIII和BamHI對真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 進(jìn)行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抽質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切檢測，確定真核重組表達(dá)載體構(gòu) 建成功；
[0015] (4)、培養(yǎng)石斑魚腦細(xì)胞（GB)，轉(zhuǎn)染去內(nèi)毒素質(zhì)粒pcDNA3. 1和pcDNA3. 1-Ec-TCTP， 用G418篩選過表達(dá)細(xì)胞系；
[0016] (5)、NNV感染穩(wěn)定篩選的細(xì)胞系，于12和24小時(shí)收集樣品，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Ec-TCTP對NNV病毒復(fù)制的作用，同時(shí)檢測病毒滴度變化。
[0017] 所述的真核表達(dá)載體為pcDNA3. 1。
[0018] 本發(fā)明的石斑魚Ec-TCTP是一種具有抗病毒功能的翻譯控制腫瘤蛋白基因，用該 基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，并將表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入石斑魚腦細(xì)胞中，得到能過量表 達(dá)Ec-TCTP的穩(wěn)定細(xì)胞，具有提高細(xì)胞對病毒感染的耐受能力；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明了石斑魚翻譯 控制腫瘤蛋白確實(shí)具有抑制RNA病毒復(fù)制的特點(diǎn)，石斑魚Ec-TCTP基因克隆和功能分析的 研宄將對進(jìn)一步研宄和開發(fā)抗病功能蛋白具有重要的科學(xué)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0019] 圖1為石斑魚肝組織RNA電泳檢測圖，1和2泳道為RAN ;
[0020] 圖2為Ec-TCTP基因擴(kuò)增電泳圖，M為DL2000,1-7泳道為PCR產(chǎn)物；
[0021] 圖3為真核重組表達(dá)載體pcDNA3. I-Ec-TCTP PCR檢測電泳圖，M為DL2000,1-3泳 道為菌落PCR產(chǎn)物，4泳道為對照；
[0022] 圖4為穩(wěn)定篩選GB細(xì)胞系，1為GB細(xì)胞，2為穩(wěn)定篩選pcDNA3. 1細(xì)胞系，3為穩(wěn)定 篩選 pcDNA3. I-Ec-TCTP 細(xì)胞系；
[0023] 圖5為PCR檢測穩(wěn)定篩選細(xì)胞系，1為對照，2為pcDNA3. 1，3為 pcDNA3. I-Ec-TCTP ；
[0024] 圖6為病毒滴度檢測Ec-TCTP基因?qū)Σ《緩?fù)制的影響，其中，pcDNA3. 1和 pcDNA3. I-Ec-TCTP 的顯著性差異用 one-way ANOVA 分析，分別用# 表示（ρ〈0· 01) (N= 3);
[0025] 圖7為NNV感染穩(wěn)定篩選細(xì)胞系后的RNA檢測圖，1-2為pcDNA3. 1細(xì)胞系12和 24小時(shí)樣品，3-4為pcDNA3. I-Ec-TCTP細(xì)胞系12和24小時(shí)樣品；
[0026] 圖8為NNV病毒CP和RdRp基因的表達(dá)，其中，A為NNV病毒CP基因的表達(dá)，B為 NNV病毒RdRp基因的表達(dá)；pcDNA3. 1和pcDNA3. I-Ec-TCTP的顯著性差異用one-way ANOVA 分析，分別用**表示（P〈〇. 01) (N = 3)。

【具體實(shí)施方式】：
[0027] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制.
[0028] 實(shí)施例中所涉及的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為日本寶生物工程有限公司（大連）產(chǎn)品，感受態(tài)細(xì)胞、 宿主菌及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑和反 轉(zhuǎn)錄酶購自invitrogen公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；PCR儀為Veriti? 96孔PCR儀購 自ABI (美國Applied Biosystems by Life Technologies)儀器，瓊脂糖電泳系統(tǒng)購自北 京六一儀器廠，蛋白質(zhì)電泳購自BiaRacL抗生素及培養(yǎng)基等均為分子生物學(xué)以及基因工程 實(shí)驗(yàn)室常用國產(chǎn)試劑。
[0029] 所有引物序列均在英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方 法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0030] 實(shí)施例1 :
[0031] 真核重組表達(dá)載體pcDNA3. I-Ec-TCTP的構(gòu)建
[0032] 首先根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的TCTP序列（JN413677)，設(shè)計(jì)一對引物，并以石斑魚肝組織提 取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到Ec-TCTP基因的序列，回收并純化Ec-TCTP 全長基因片段；利用HindIII和BamHI對空載體pcDNA3. 1進(jìn)行雙酶切，回收純化Ec-TCTP 基因片段以及載體大片段PCDNA3. 1，然后連接、化學(xué)法轉(zhuǎn)化DH5a菌株獲得重組質(zhì)粒 pcDNA3. 1-Ec-TCTP。具體構(gòu)建過程如下：
[0033] 一、石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP基因 Ec-TCTP的cDNA擴(kuò)增
[0034] URNA 提取
[0035] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道的Ec-TCTP(JN413677)基因 cDNA全長序列，設(shè)計(jì)如下構(gòu)建真 核重組表達(dá)載體的特異性引物：
[0036] pcDNA-TCTP-S ：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA
[0037] pcDNA-TCTP-R ：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG
[0038] 下劃線標(biāo)注分別為酶切位點(diǎn)HindIII和BamHI。
[0039] 同時(shí)以石斑魚肝組織為材料，使用Trizol法提取總RNA，具體操作如下：用液氮將 0. Ig石斑魚肝組織研磨成粉末以后，加入Iml Trizol提取液，室溫放置5min，使其充分裂 解，再加入氯仿，振蕩混勻15分鐘，室溫放置15min。4°C 12000g離心15min。加入0. 5ml 異丙醇混勾，室溫放置5-1〇111；[11。4<€ 1200(^離心10111；[11，加入1111175%乙醇，溫和振蕩離心 管，懸浮沉淀。4°C 8000g離心5min，室溫晾干。加入50ul DEPC H2O待溶解充分后測0.D 值定量RNA濃度。RNA提取的結(jié)果如圖1所示。
[0040] 2、cDNA 合成
[0041 ] 以RNA為模板，用Superscript? III反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，具體步驟為：總RNA 2 μ 1 (約 5 μ g)、01igo(d Τ)201 μ l、10mM dNTP 1 μ 1、DEPC 處理水補(bǔ)足總體積 13 μ I ;65°C 處理5min后，轉(zhuǎn)至冰上IOmin ;加入5X第一鏈緩沖液4 μ 1、0. IMDTT 1 μ 1、RNA酶抑制劑 1 μ 1，1 μ 1 反轉(zhuǎn)錄酶（invitrogen)，25 度 5min 后，50°C反應(yīng) 60min 后；70°C 15min 使反轉(zhuǎn) 錄酶失活，得到cDNA序列。
[0042] 3、擴(kuò)增Ec-TCTP基因的cDNA序列
[0043] 以反轉(zhuǎn)錄總cDNA為模板、使用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R進(jìn)行PCR擴(kuò) 增 Ec-TCTP 基因。PCR 的 20 μ 1 體系為：Ex_Taq 緩沖液（10Χ)2· 5 μ l、Ex_TaqO. 2 μ l、cDNA 模板 1 μ I、IOmM dNTP 0· 4 μ I、10 μ M pcDNA-TCTP-S 引物 1 μ I、10 μ M pcDNA-TCTP-R 引物 1以1、使用(1(1!120補(bǔ)足2(^1。反應(yīng)條件為：94°0 21^11，30個(gè)循環(huán)，94°0變性3〇8,60°0退火 30s，72°C有延伸30s，72°C反應(yīng)5min。將PCR產(chǎn)物在I. 0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳檢測（如圖2所示）。
[0044] 電泳后，對目的條帶進(jìn)行回收，回收使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen DNA片段 純化試劑盒）具體操作步驟參照產(chǎn)品說明書。取3μ1用于瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0045] 二、回收DNA片段后，使用BamHI和HindIII對質(zhì)粒pcDNA3. 1和目的片段進(jìn)行雙酶 切分別獲得Ec-TCTP基因和pcDNA3. 1雙酶切片段，電泳回收純化后，分別在16°C連接16h， 獲得真核重組表達(dá)載體PcDNA3. 1-Ec-TCTP。
[0046] 具體操作如下：向0. 5ml的離心管中分別加入質(zhì)粒DNA(K)Ong/ μ 1) 2 μ 1、 BamHI (Takara)0.5yl、HindIII 0·5μ1、10ΧΚ buffer 2μ1，使用ddH20 補(bǔ)足 20μ1;37? 反應(yīng)8h ;使用I. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收Ec-TCTP基因和pcDNA3. 1載體，將回收 片段進(jìn)行連接，其具體步驟為：Ec-TCTP DNA 3 μ 1 (約300ng)、pcDNA3. 1載體1 μ I (IOOng/ μ 1)、Ligation Solution I 4μ1，金屬浴中 16°C 過夜連接。
[0047] 使用化學(xué)法將pcDNA3. I-Ec-TCTP大腸桿菌DH5 α中，具體步驟為：將感受態(tài)大腸 桿菌大腸桿菌DH5 α 100 μ 1加入6 μ 1質(zhì)粒體系中；混合液冰浴20min，42°C熱刺激90s，冰 浴2min ;加入900 μ I SOC液體培養(yǎng)基，37°C、150rpm搖床培養(yǎng)60min ;然后在超凈臺上吸取 300 μ 1轉(zhuǎn)入帶有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用無菌三角玻璃棒涂布均勻；37°C過 夜培養(yǎng)；挑取白斑于加有Amp抗性液體LB培養(yǎng)基中37°C、200rpm搖床培養(yǎng)12h ;提取質(zhì)粒， 進(jìn)行電泳檢測。利用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R對菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有擴(kuò)增 條件和之前菌落PCR相同（結(jié)果如圖3所示）。
[0048] 過量表達(dá)Ec-TCTP穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選
[0049] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0050] (1)、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：石斑魚腦細(xì)胞GB細(xì)胞株保存于液氮之中，在使用之前，從 液氮中取出，并且將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：將水浴鍋溫度調(diào)至37°C，將有血清 的培養(yǎng)液（即完全培養(yǎng)液）置于其中預(yù)熱。并且在記錄本中查到所要復(fù)蘇的細(xì)胞存于液氮 罐中的位置；準(zhǔn)備好超凈臺內(nèi)的所需的一些儀器。從液氮罐中取出所要的細(xì)胞，立即置于 37°C水浴鍋中，使其快速解凍；將凍存管及培養(yǎng)液瓶外表面用75%酒精擦拭后放入超凈工 作臺；將細(xì)胞懸液移到IOml離心管中，并加入2-3ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，用封口 膜密封；IOOOrpm離心3min ;吸去上清，加入2-3ml培養(yǎng)液，吹打均勻，使細(xì)胞懸??；將細(xì)胞 懸液移到25cm2培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加少量培養(yǎng)液；擰松培養(yǎng)瓶蓋，置于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0051] (2)、細(xì)胞的傳代：培養(yǎng)的細(xì)胞生長到一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)逐漸消耗、 代謝物逐步積累（可見到培養(yǎng)液變黃），并且細(xì)胞的生長空間也受到限制，就會影響到細(xì)胞 的繼續(xù)生存，這時(shí)就需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，進(jìn)行傳代。將消化液和培養(yǎng)液 從冰箱中取出，37°C解凍和預(yù)熱；吸出培養(yǎng)液，緩緩加入約I. 5ml的消化液；置于37°C消化 2-5min，期間在顯微鏡下觀察，消化至細(xì)胞收縮變圓、部分脫落即可加入約4ml消化液終止 消化，防止消化過度；用吸管輕輕吹洗培養(yǎng)瓶有細(xì)胞的一面，以使細(xì)胞脫落干凈，將細(xì)胞懸 液轉(zhuǎn)移至IOml離心管內(nèi)，密封；IOOOrpm離心3min，期間用培養(yǎng)液再清洗一下培養(yǎng)瓶；吸去 上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。
[0052] (3)、細(xì)胞的凍存：當(dāng)細(xì)胞生長到一定程度的時(shí)候，可以將一部分凍存起來，長期保 存，以備下次需要用的時(shí)候可以使用。將凍存液、消化液和培養(yǎng)液從冰箱中取出，37°C解凍 和預(yù)熱；細(xì)胞經(jīng)過消化、離心收集；大約IO 6個(gè)細(xì)胞加入Iml凍存液，用吸管吹打，使細(xì)胞分 散成單細(xì)胞懸液；加入到凍存管中，通常I. 8ml的凍存管不加超過I. 5ml的細(xì)胞懸液；在凍 存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱和凍存日期，用紗布包裹后，置于4°C 0. 5h，然后置于-20°C 2h，再置 于-80°C過夜；第二天將細(xì)胞置于液氮中；記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄。
[0053] 2、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
[0054] (1)鋪板：傳代三到四次后達(dá)到細(xì)胞良好的狀態(tài)的時(shí)候，可以按照約IXlO5個(gè)細(xì) 胞/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板中。將消化液和培養(yǎng)液從冰箱中取出，37°C解凍和預(yù)熱； 吸出培養(yǎng)液，緩緩加入約I. 5ml的消化液；置于37°C消化2-5min，期間在顯微鏡下觀察，消 化至細(xì)胞收縮變圓、部分脫落即可加入兩吸管消化液終止消化，防止消化過度；用吸管輕 輕吹洗培養(yǎng)瓶有細(xì)胞的一面，以使細(xì)胞脫落干凈，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至IOml離心管內(nèi)，密封； IOOOrpm離心3min，期間用培養(yǎng)液再清洗一下培養(yǎng)瓶；吸去上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打均 勻，吸取10 μ 1到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并且計(jì)算細(xì)胞的密度；預(yù)先在孔中放入 一塊IcmX Icm的蓋玻片；用完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，在24孔板的每個(gè)孔加入0. 5ml。
[0055] (2)轉(zhuǎn)染：鋪板過后大約24h，細(xì)胞完全貼壁，且密度達(dá)到大約70%的時(shí)候，即可以 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的時(shí)候，在50 μ 1稀釋液中加入0. 8-1 μ g的質(zhì)粒；在50 μ 1稀釋液中加入 2 μ 1的Lipofectamine2000,輕輕地吹打均勾，在室溫下放置5min ;將質(zhì)粒稀釋液和脂質(zhì)體 稀釋液混合，輕柔吹打均勻，室溫下放置20min ;吸去24孔板每個(gè)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液，沿孔 壁加入0. 5ml的無血清培養(yǎng)液；將混合液加入到每個(gè)加了無血清培養(yǎng)液的孔中，每個(gè)孔約 加100 μ 1，輕柔晃動，使之混合；放在25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h后將無血清培養(yǎng)液更換成 完全培養(yǎng)液。
[0056] 3、篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系
[0057] 利用引物pcDNA-TCTP-S和pcDNA-TCTP-R構(gòu)建了 Ec-TCTP基因的真核重組表達(dá)質(zhì) 粒pcDNA3. 1-Ec-TCTP。采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒微量提取試劑盒（Omega，USA)提取真核表達(dá)重組 質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)，然后使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen)將所提 取的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在24孔板中的GB細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按1:3的比例稀 釋后傳代，并在培養(yǎng)液中加入終濃度為800 μ g/mL G418 (Amresco)進(jìn)行篩選培養(yǎng)。每隔3 天更換培養(yǎng)液一次，按上述濃度加入G418繼續(xù)篩選。經(jīng)過約4周的篩選培養(yǎng)后，用PCR方 法進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的檢測，引物采用載體pcDNA3. 1的通用引物T7和BGH，結(jié)果如圖4所 示。篩選得到的穩(wěn)定細(xì)胞系分別命名為pcDNA3. I-Ec-TCTP和pcDNA3. 1，結(jié)果如圖5所示。
[0058] T7 ：TAATACGACTCACTATAGGG
[0059] BGH ：TAGAAGGCACAGTCGAGGC
[0060] 石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP對病毒復(fù)制的影響實(shí)驗(yàn)
[0061] 將穩(wěn)定細(xì)胞系pcDNA3. I-Ec-TCTP和pcDNA3. 1傳至24孔板，每孔接種約I X IO5個(gè) 細(xì)胞。16-24h后，細(xì)胞長滿單層。棄去培養(yǎng)液，每孔接入0. 5MOI的NNV，置于25°C下吸附 lh，期間每隔15min輕輕搖動細(xì)胞板一次。吸附完畢后，棄去孔中病毒，然后用新鮮培養(yǎng)基 500 μ 1漂洗一次，接著加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后12和24h，分別收取感染后的細(xì)胞 培養(yǎng)物，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組分別收取三個(gè)重復(fù)孔，然后置于_20°C凍存。將收取的 樣品凍融三次，然后采用TCID50方法對其滴度進(jìn)行測定（如圖6所示）。同時(shí)，收取平行實(shí) 驗(yàn)樣品用于后續(xù)總RNA提?。ㄈ鐖D7所示），檢測病毒核心基因轉(zhuǎn)錄情況（如圖8所示）。
【權(quán)利要求】
1. 石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP在抗魚類神經(jīng)壞死病毒方面的應(yīng)用。
2. 石斑魚翻譯控制腫瘤蛋白TCTP的編碼基因 Ec-TCTP在抗魚類神經(jīng)壞死病毒方面的 應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/14GK104497120SQ201410783832
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】魏京廣, 秦啟偉, 周勝, 許濛 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所