本申請要求2013年5月2日提交的美國臨時申請第61/818,621號的權(quán)益，該申請的內(nèi)容通過引用全文納入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及診斷和/或預(yù)測疾病和醫(yī)療病癥，且具體涉及使用脂質(zhì)組學(xué)生物標志物進行這類診斷和/或預(yù)測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一個實施方式是一種評估丙型肝炎感染或者所述感染所致或相關(guān)病癥的方法。該方法包括：(a)從有此需要的對象獲得生物樣品；(b)測定所述生物樣品中至少一種丙型肝炎脂質(zhì)組學(xué)生物標志物的水平；以及(c)比較(b)的所述水平與所述丙型肝炎脂質(zhì)組學(xué)生物標志物的對照水平以評估對象中的丙型肝炎感染或者所述感染所致或相關(guān)病癥。

另一個實施方式是一種評估對治療應(yīng)答的方法，包括：(a)向有此需要的對象給予試劑；(b)隨后從該對象中獲得生物樣品；(c)測定該生物樣品中葡糖神經(jīng)酰胺、乳糖神經(jīng)酰胺和鞘磷脂中至少一種的去飽和指數(shù)；以及(d)比較該去飽和指數(shù)值與對照去飽和指數(shù)值以評估對所述試劑的應(yīng)答，與對照值相比，較高的測定的去飽和指數(shù)值表示對象對該試劑產(chǎn)生應(yīng)答和/或該試劑提供了治療益處。

另一個實施方式是一種鑒定丙型肝炎患者的方法，該患者不太可能對包括干擾素和利巴韋林中至少一種的丙型肝炎治療產(chǎn)生應(yīng)答。該方法包括：(a)從患有丙型肝炎感染的對象中獲得生物樣品；(b)定該生物樣品的脂蛋白中葡糖神經(jīng)酰胺、乳糖神經(jīng)酰胺和鞘磷脂中至少一種的去飽和指數(shù)值；以及(c)比較該測定值與對照去飽和指數(shù)值，如果測定值高于對照去飽和值，則該對象可能不對包括干擾素和利巴韋林中至少一種的丙型肝炎治療產(chǎn)生應(yīng)答和/或可能不接受治療益處。

附圖簡要說明

圖1示意性顯示用于所選實驗的所選亞胺糖：a)N-丁基-脫氧野尻霉素(NB-DNJ；UV-1或美格魯特)；b)N-(9-甲氧基壬基)-脫氧野尻霉素(N9-DNJ或UV-4)；c)N-(5-金剛烷-1-基-甲氧基-戊基)-脫氧野尻霉素(金剛烷-戊基-dNM；AMP-DNM或AMP-DNJ)；d)N-(N-丁基)脫氧野尻霉素(NB-DGJ)；e)N-(7-氧雜-壬基)-1,5,6-三脫氧-1,5-亞氨基-D-半乳糖醇(N-7-氧雜-壬基MeDGJ)(UT231-B)；f)N-(N-{4’-疊氮基-2’-硝基苯基}-6-氨基己基)脫氧野尻霉素(NAP-DNJ或UV-5)。這些化合物的共有特征是具有橋環(huán)氮原子代替相應(yīng)糖分子的氧。UV-1/NB-DNJ/美格魯特是的活性藥物成分(API)元件，其是用于治療戈謝病的葡糖神經(jīng)酰胺的抑制劑。雖然具有半乳糖型頭部基團，但NB-DGJ是葡糖神經(jīng)酰胺合成酶的特異性抑制劑，其對ERα葡糖苷酶沒有抑制活性(不同于其差向異構(gòu)類似物NB-DNJ，NB-DNJ還抑制葡糖苷酶)。

圖2提供了感染和未感染狀態(tài)的肝癌細胞中測得的總脂肪酸含量。顯示了細胞脂質(zhì)的水解后各測試組的脂肪酸甲酯總量。

圖3a-b提供了來自圖1的多種化合物的處理下和丙型肝炎病毒(HCV)感染的影響下肝癌細胞的總細胞脂肪酸組成的分析結(jié)果。顯示的數(shù)字是脂肪酸甲酯分析測得的各脂肪酸的組成百分比。數(shù)據(jù)欄使用Microsoft Excel 2007的默認設(shè)置并“垂直”編碼以使用紅色高亮顯示每個分子種類的變化(a)且藍色高亮顯示總組成的變化(a)。(先前的編碼強調(diào)不顯眼的少數(shù)種類的變化)。

圖4a-f比較了不同類型的細胞之間總細胞脂肪酸組成中特定脂肪酸的百分比。a)米德酸(mead acid)；b)二十二碳六烯酸(DHA)；c)油酸；d)亞油酸；e)棕櫚油酸w9；f)棕櫚油酸w7。圖4a-f顯示亞胺糖影響未感染狀態(tài)中的脂肪酸組成。來自脂肪酸甲酯分析的特定脂肪酸顯示為組成百分比，即作為感染或亞胺糖處理結(jié)果而變化的那些。感染的樣品在各圖左側(cè)(最左邊的七條)。

圖5a-b提供了感染和亞胺糖化合物影響下的全局性去飽和指數(shù)和全局性延伸指數(shù)。來自脂肪酸甲酯分析的全局性脂肪酸分析的結(jié)果(圖3)表示為所示非必需脂肪酸的去飽和和延伸指數(shù)。未感染的細胞＝淺色條，感染的細胞＝深色條。

圖6顯示測得的未感染的細胞(左柱)和感染的細胞(右柱)的膽固醇酯的細胞脂肪酸組成。測量了最豐富的膽固醇酯種類，如材料和方法中所述，并表示為組成豐度百分比。淺色條＝未感染的，深色條＝感染的。

圖7提供了表格，其中顯示感染和亞胺糖化合物的影響下的細胞甘油三酯組成。檢測的多種甘油三酯物質(zhì)的組成豐度百分比列為“垂直”數(shù)據(jù)條，描述了各分子種類的總豐度的變化。

圖8顯示感染狀態(tài)中甘油三酯組成的變化。甘油三酯分子組成的變化顯示為與未感染狀態(tài)相比的‘倍數(shù)變化’，其中著重顯示了豐度顯著變化的稀有種類。暗色(藍色)柱＝受感染降低，淺色(紅色)柱＝受感染升高。

圖9提供了表格，其中顯示感染和亞胺糖影響下磷脂酰膽堿(酯形式)的分子組成。列舉了PC分子種類的豐度變化——箭頭顯示感染狀態(tài)中的升高和降低。

圖10顯示感染和亞胺糖影響下磷脂酰膽堿(酯形式)脂肪酸的組成。描述了PC的酯形式(縮醛磷脂形式)的組成豐度。

圖11a-g顯示感染和亞胺糖影響下溶血磷脂酰膽堿的脂肪酸組成。顯示了各溶血PC種類的組成豐度(百分比)。淺色條＝未感染的，深色條＝感染的。

圖12提供了表格，顯示感染和亞胺糖影響下的磷脂酰乙醇胺(PE)分子組成。列舉了PE種類的百分比豐度(數(shù)據(jù)欄垂直編碼)以強調(diào)感染和未感染狀態(tài)之間的變化。箭頭顯示受感染影響升高或降低的種類。

圖13提供了表格，顯示感染影響下的磷脂酰絲氨酸(PS)分子種類。在PS的情況中，在亞胺糖的影響下感染和未感染狀態(tài)中不存在顯著變化。以比例顯示PS分子種類的豐度百分比以及未感染和感染狀態(tài)之間的變化。

圖14提供了表格，顯示感染和亞胺糖影響下的磷脂酰肌醇(PI)分子種類。PI僅具有四種分子種類。使用數(shù)據(jù)欄垂直編碼其豐度以顯示感染后單個分子種類的豐度變化。

圖15a-f顯示感染和亞胺糖影響下鞘脂的細胞豐度。在多種處理下，鞘脂‘神經(jīng)酰胺’(Cer)、糖基神經(jīng)酰胺(GlcCer)和乳糖神經(jīng)酰胺(LacCer)的細胞豐度顯示為納摩爾/mg蛋白質(zhì)。

圖16提供了葡糖神經(jīng)酰胺的主要組分和判別分析的結(jié)果。將主要組分分析(左)和判別分析應(yīng)用于處理對比未處理的整個數(shù)據(jù)集以及亞胺糖處理對比未處理的細胞。經(jīng)PCA鑒定，GlcCer 24:1和GlcCer 24:0之間的差異可以解釋數(shù)據(jù)集中的大多數(shù)變化。在該分析中未區(qū)分來自感染或未感染培養(yǎng)物的未處理的樣品，然而，所有亞胺糖處理(在未感染或感染狀態(tài)中)都可與未處理的樣品區(qū)分(橢圓代表95％置信區(qū)間)。

圖17提供了感染和亞胺糖影響下磷脂酰膽堿分子種類的主要組分(PCA)和判別分析。PCA和判別分析清楚地區(qū)分了PC分子種類，形成兩個主要的組‘感染’(方框的左半邊)和未感染(方框的右半邊)，在F1維度上彼此區(qū)分(占數(shù)據(jù)集中變化的91.3％)，其在該情況中代表單飽和種類(如PC32:1)的減少，而飽和的PC32:0和34:0和富PUFA的PC(PC34:4和PC38:5)受感染而富集(還參見圖9箭頭所指的各欄)。不同于GlcCer的PCA和判別分析所觀察到的結(jié)果，在PC的情況中，感染的亞胺糖處理的細胞無法與未處理的感染的細胞區(qū)分(這類差別僅占F2(垂直)維度的一部分，其僅包含數(shù)據(jù)集中6.79％的變化)。使用PE獲得了類似的結(jié)果，即未清楚地區(qū)分亞胺糖處理的感染的細胞與未處理的感染的細胞——與亞胺糖處理的作用相比，感染的作用占主導(dǎo)地位。

圖18a-d顯示感染和亞胺糖化合物的影響下細胞中GlcCer的去飽和指數(shù)(24:1/24:0)。在圖16所述的PCA和判別分析后(其鑒定了24:1和24:0種類之間的變化(Δ-9處)作為數(shù)據(jù)集中的主要變化)，使用相應(yīng)的GlcCer去飽和指數(shù)對各細胞樣品和處理作圖(a，b)。應(yīng)注意，雖然是‘Δ-9’，但GlcCer的去飽和指數(shù)在感染和未感染的狀態(tài)之間沒有變化(反映PCA和判別分析的發(fā)現(xiàn))。還對LacCer(其由GlcCer產(chǎn)生)的去飽和指數(shù)進行了作圖(c，d)。

發(fā)明詳述

除非另有說明，“一”或“一個”表示一個或多個。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，可通過測定獲自對象的生物學(xué)樣品中一種或多種脂質(zhì)組學(xué)生物標志物(其可以是脂質(zhì)代謝物)的水平并比較測定的水平與對照水平來評估丙型肝炎感染和/或相關(guān)病癥，如肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌。

術(shù)語“脂質(zhì)組學(xué)標志物”或“脂質(zhì)組學(xué)生物標志物”可指來自具有疾病或病癥(如丙型肝炎和/或相關(guān)病癥)的對象的生物樣品與對照生物樣品之間脂質(zhì)組成的特定差異，所述對照生物樣品可以是一個或多個健康個體的樣品或一個或多個不具有該疾病或病癥的個體的樣品。在一些實施方式中，術(shù)語“脂質(zhì)組學(xué)標志物”或“脂質(zhì)組學(xué)生物標志物”可指來自具有疾病或病癥(如丙型肝炎和/或相關(guān)病癥)的對象的生物樣品與對照生物樣品之間一種或多種脂質(zhì)組分或其代謝物的絕對豐度的特定差異。而在一些實施方式中，術(shù)語“脂質(zhì)組學(xué)標志物”或“脂質(zhì)組學(xué)生物標志物”可指來自具有疾病或病癥(如丙型肝炎和/或相關(guān)病癥)的對象的生物樣品與對照生物樣品之間脂質(zhì)組分或其代謝物的相對豐度的特定差異。

“生物樣品”包括從可用于診斷或監(jiān)測實驗的生物體獲得的多種樣品類型。該術(shù)語包括生物來源的血液和其它液體樣品，固體組織樣品如活檢樣品或組織培養(yǎng)物或由其衍生的細胞，以及它們的后代。此外，該術(shù)語可包括循環(huán)的腫瘤或其他細胞。該術(shù)語具體包括臨床樣品，也包括細胞培養(yǎng)物中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、尿液、羊水、生物流體和組織樣品。該術(shù)語還包含獲得后經(jīng)任何方式處理的樣品，如試劑處理、溶解或?qū)δ承┙M分的富集。

該生物樣品可以是對象的體液或身體組織的樣品。例如，該生物樣品可以是來自對象的血液、血漿、血清、唾液、膽汁、尿液、糞便或腦脊液的樣品或來源于對象的細胞、組織或器官(如肝)的樣品。在許多實施方式中，可優(yōu)選使用血液、血漿或血清作為生物樣品。可使用多種技術(shù)來獲得生物樣品。

“個體”、“對象”、“宿主”和“患者”在本文中互換使用，指任何需要診斷、處理或治療的動物對象，如哺乳動物對象。在一個優(yōu)選的實施方式中，該個體、對象、宿主或患者是人。其他對象可包括但不限于：牛、馬、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、靈長類動物、土撥鼠、鴨和小鼠。

在一些實施方式中，可在測定脂質(zhì)組學(xué)生物標志物的水平前對生物樣品進行預(yù)處理。這類預(yù)處理可例如涉及分離生物樣品的至少一個部分并測定該分離的部分中的脂質(zhì)組學(xué)標志物水平。這類分離部分可以是，例如，脂蛋白部分(如極低密度脂蛋白部分或低密度蛋白部分)、甘油酯部分(如甘油三酯部分)，或磷脂部分。在一些實施方式中，該分離部分可以是高密度脂蛋白部分或外來體部分，參見例如Keller,Sanderson等(參見下文參考文獻)。對于特定組分的分離，可使用合適的分離技術(shù)，例如離心、萃取、分級、超濾、蛋白質(zhì)沉淀或色譜分離。

而在一些實施方式中，可對未預(yù)處理或未分級的樣品測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平。

在一些實施方式中，優(yōu)選測定獲自禁食狀態(tài)的對象的未預(yù)處理或未分級樣品的脂質(zhì)組學(xué)標志物水平，其可以指最后一餐前至少1小時或至少1.5小時或至少2小時或至少2.5小時或至少3小時，例如早晨早餐前。

而在一些實施方式中，測定獲自餐后狀態(tài)的對象的未預(yù)處理或未分級樣品的脂質(zhì)組學(xué)標志物水平。

測定脂質(zhì)組學(xué)生物標志物的水平可以是定量或半定量的。在一些實施方式中，定量測定可涉及測定一種或多種脂質(zhì)代謝物的絕對含量或濃度。而在一些實施方式中，定量測定可涉及相對于一種或多種其他代謝物測定一種或多種脂質(zhì)代謝物的相對含量或濃度。例如，在一些實施方式中，可測定至少一種代謝物A的含量或濃度與至少一種代謝物B的含量或濃度的比例。

可使用多種技術(shù)來測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平。在一些實施方式中，測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平可涉及使用色譜技術(shù)，例如液相色譜(LC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層色譜、尺寸排阻或親和色譜。在一些實施方式中，測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平可涉及使用質(zhì)譜技術(shù)，例如氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)、直接輸注質(zhì)譜或傅立葉變換離子-回旋加速器-共振質(zhì)譜(FT-ICR-MS)、毛細管電泳質(zhì)譜(CE-MS)、高效液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS)、四極質(zhì)譜、任何連續(xù)偶聯(lián)質(zhì)譜(如MS-MS或MS-MS-MS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)、熱解質(zhì)譜(Py-MS)、離子遷移率質(zhì)譜或電離飛行時間質(zhì)譜(TOF)。合適的技術(shù)公開于，例如，Nissen,Journal of Chromatography A,703,1995:37-57、美國專利號4,540,884或美國專利號5,397,894。

在一些實施方式中，測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平可涉及使用以下技術(shù)之一：核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅立葉變換紅外分析(FT-IR)、紫外(UV)光譜、折射率(RI)、熒光檢測、放射化學(xué)檢測、電化學(xué)檢測、光散射(LS)、分散性拉曼光譜或火焰電離檢測(FID)。在一些實施方式中，可使用脂肪酰酯分析來測定例如特定脂蛋白部分(如特定血液脂蛋白部分)的脂肪酰組成。在一些實施方式中，可使用LC-MS來測定單個脂質(zhì)物質(zhì)，如磷脂或鞘脂。

在一些實施方式中，測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平可涉及使用具有在線質(zhì)譜的氣相色譜(GCMS)和/或LCMS2(具有在線二維質(zhì)譜的高效液相色譜)，其中使用合適的內(nèi)部標準品并使用軟件工具(如脂質(zhì)質(zhì)譜分析軟件(LIMSA)，參見例如Haimi等Methods Mol.Biol.2009,580,285-94)用于數(shù)據(jù)處理。

在一些實施方式中，測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平可涉及特定的化學(xué)或生物試驗。該試驗可利用一種或多種試劑，其特異性識別脂質(zhì)代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或能夠基于其與其他化合物相互作用的能力或在生物讀取系統(tǒng)中引發(fā)應(yīng)答的能力特異性鑒定脂質(zhì)代謝物。例如，在一些實施方式中，可使用免疫試驗，其中特異性針對待測分析物的試劑(如抗體)用于測量靶物質(zhì)的豐度。

在一些實施方式中，測定脂質(zhì)組學(xué)標志物的水平可涉及使用兩種或更多種上文所述技術(shù)。

在一些實施方式中，丙型肝炎脂質(zhì)組學(xué)標志物可以是生物樣品中米德酸的豐度(即含量或濃度)。與對照豐度值相比，較高的米德酸豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，米德酸的豐度可用作肝細胞癌的生物標志物。在這類情況中，與對照豐度值相比，較高的米德酸豐度值表示對象具有肝細胞癌。

用于測定米德酸豐度的樣品可以是生物流體樣品，如血漿、血液或血清。在一些實施方式中，可對未處理或未分級的樣品測定米德酸豐度。而在一些實施方式中，可對樣品的具體部分(例如極低密度脂蛋白部分)測定米德酸豐度。

在一些實施方式中，可在對象處于禁食狀態(tài)時獲得用于測定米德酸豐度的生物樣品，其可以指最后一餐前至少1小時或至少1.5小時或至少2小時或至少2.5小時或至少3小時。在一些實施方式中，禁食時間優(yōu)選不超過24小時。而在一些實施方式中，可在對象處于餐后狀態(tài)時獲得用于測定米德酸豐度的生物樣品。

在一些實施方式中，脂質(zhì)新生(de novo lipogenesis)的至少一種非必需脂肪酸副產(chǎn)物(如棕櫚油酸(C16:1ω9和ω7)和油酸(C18:1ω9))的豐度(即含量或濃度)可用作丙型肝炎或這類感染所致或相關(guān)病癥的生物標志物。在這類情況中，與對照豐度值相比，較低的測得豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，非必需脂肪酸的去飽和指數(shù)(其可以是例如血液脂蛋白部分(如VLDL部分)的脂質(zhì)中存在的非必需脂肪酸的去飽和指數(shù))可用作丙型肝炎或這類感染所致或相關(guān)病癥的生物標志物。在這類情況中，與對照去飽和指數(shù)相比，較低的去飽和指數(shù)可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。與一些其他生物標志物(如病毒血癥)相比，這類生物標志物可以更好地測量肝損傷。該去飽和指數(shù)可以是例如((16:1ω-7+16:1ω-9)/16:0)比例，即16:1ω-7和16:1ω-9脂肪酸的合并豐度與16:0脂肪酸豐度的比例。

在一些實施方式中，生物樣品中非必需脂肪酸的延伸度可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的生物標志物。在這類情況中，與對照延伸值相比，生物樣品測得的較高的延伸值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。與一些其他生物標志物(如病毒血癥)相比，這類生物標志物是肝損傷的較好的指示物。該延伸度可使用例如(18:1ω-7/16:1ω-7)比例來測定，即18:1ω-7脂肪酸和16:1ω-7脂肪酸的豐度的比例。

在一些實施方式中，丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)生物標志物可以是至少一種多不飽和ω-6和ω-3脂肪酸(如花生四烯酸和二十二碳六烯酸)的豐度。在這類情況中，與對照豐度值相比(其可以是未感染HCV的一個或多個健康個體的豐度值)，較高的生物樣品中測定的這類豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。與一些其他生物標志物(如病毒血癥)相比，這類生物標志物是肝損傷進展的較好的指示物。

在一些實施方式中，生物樣品的膽固醇酯概況中的一種或多種脂肪酸的豐度(即濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)生物標志物。為測量膽固醇酯概況，可使用分離技術(shù)(如色譜純化)從生物樣品中純化膽固醇酯。在某些情況中，這類脂肪酸可以是至少一種多不飽和必需ω-3或ω-6脂肪酸，如20:4脂肪酸、20:5脂肪酸、22:6脂肪酸和22:5脂肪酸。在這類情況中，與對照豐度值相比，一種或多種這類多不飽和脂肪酸中測得的較高的豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。與一些其他生物標志物(如病毒血癥)相比，這類生物標志物是肝損傷進展的較好的指示物。在某些情況中，膽固醇酯概況中某些脂肪酸的缺乏可表示在受感染個體中的肝細胞上HCV的存在或HCV的作用。在這類情況中，該脂肪酸可以是至少一種單不飽和脂肪酸，其可以是例如16:1脂肪酸和18:1脂肪酸。在這類情況中，與對照豐度值相比，一種或多種這類單不飽和脂肪酸中測得的較低的豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，生物樣品中的一種或多種甘油三酯的豐度(即濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)生物標志物。這類甘油三酯可以是，例如，C54:5-C18:0甘油三酯；C54:6-C18:1甘油三酯；C56:5-C20:4甘油三酯或C56:7-C22:6甘油三酯。在這類情況中，與對照豐度值相比，較高的甘油三酯豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，可對未處理或未分級的生物樣品(如血漿、血液或血清樣品)測定甘油三酯生物標志物的豐度。而在一些實施方式中，可在生物樣品的一部分(如極低密度脂蛋白部分和甘油三酯部分)中測定甘油三酯生物標志物的豐度。在一些實施方式中，可在從禁食狀態(tài)的對象獲得的生物樣品中測定甘油三酯生物標志物的豐度，即最后一餐前至少1小時或至少1.5小時或至少2小時或至少2.5小時或至少3小時。而在一些實施方式中，可在從餐后狀態(tài)的對象獲得的生物樣品中測定甘油三酯生物標志物的豐度。為測定C54:5-C18:0甘油三酯；C56:5-C20:4甘油三酯或C56:7-C22:6甘油三酯的豐度，優(yōu)選使用獲自禁食狀態(tài)中對象的未分級的生物樣品，如血漿、血液或血清樣品?；蛘撸瑢τ谶@些生物標志物，可使用生物樣品的一部分，如極低密度脂蛋白部分和甘油三酯部分。可在獲自禁食或餐后狀態(tài)的對象的未分級生物樣品(如血漿、血液或血清樣品)中測定C54:6-C18:1甘油三酯的豐度。

在一些實施方式中，生物樣品的磷脂中的一種或多種脂肪酸的豐度(即濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)標志物。在一些實施方式中，生物樣品的酯鍵連接的磷脂中的一種或多種脂肪酸的豐度(即濃度或含量)可用作這類脂質(zhì)組學(xué)標志物。例如，在一些實施方式中，生物樣品的二酯形式的磷脂酰膽堿中至少一種脂肪酸的豐度可以是脂質(zhì)組學(xué)標志物。這類脂肪酸可例如選自PC 32:1種類、PC 32:0種類、PC 34:0種類、PC 34:4種類和PC 34:5種類。在這類情況中，與各自的對照值相比，PC 32:0種類、PC 34:0種類、PC 34:4種類和PC 34:5種類中至少一種的較高豐度值表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。與相應(yīng)對照值相比，32:1種類的較低豐度值也表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，生物樣品的二酯形式的磷脂酰乙醇胺中至少一種脂肪酸的豐度(如濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)標志物。這類脂肪酸可選自，例如，a)米德酸；b)至少一種棕櫚油酸，如16:1ω-7和ω-9酸；或c)至少一種必需ω-3或ω-6脂肪酸，如20:3ω-3、20:4ω-6、20:5ω-3、22:6ω-3、22:5ω-3和22:4ω-6。在這類情況中，與各自對照豐度值相比，測得的米德酸或至少一種必需ω-3或ω-6的較高豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。與各自對照值相比，至少一種棕櫚油酸的較低豐度值也表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，生物樣品的二酯形式的磷脂酰絲氨酸中至少一種脂肪酸的豐度(即濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)標志物。這類脂肪酸可以是例如38:3種類或40:6種類。在這類情況中，與各自對照值相比，38:3種類和40:6種類中至少一種的較高的豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，生物樣品的二酯形式的磷脂酰肌醇中至少一種脂肪酸的豐度(即濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)標志物。這類脂肪酸可以是，例如，PI 38:3種類、PI 36:4種類、PI 38:4種類或PI38:5種類。在這類情況中，與各自對照豐度值相比PI 38:3種類測得的較高的豐度值或與各自對照豐度值相比PI 36:4種類、PI 38:4種類和PI 38:5種類中至少一種測得的較低的豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，生物樣品的至少一種溶血磷脂酰膽堿中至少一種脂肪酸的豐度(即濃度或含量)可用作丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的脂質(zhì)組學(xué)標志物。這類脂肪酸可以是16:1種類、16:0種類、20:4種類或22:6種類。在這類情況中，與各自對照值相比16:0種類、20:4種類和22:6種類中至少一種測得的較高的豐度值或與各自對照值相比16:1種類測得的較低的豐度值可表示對象具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。

在一些實施方式中，為測定酯鍵連接的磷脂酰膽堿和酯鍵連接的磷脂酰乙醇胺中脂肪酸的豐度，優(yōu)選使用生物樣品的一部分，如生物樣品的極低密度脂蛋白部分。

本發(fā)明的生物標志物可用于診斷丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。在這類情況中，對照水平或?qū)φ罩悼芍附】祩€體中測得的生物標志物的水平或值，所述個體不具有丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥。該對照水平或值也可以是健康個體群體上平均的水平或值。

本發(fā)明的生物標志物可用于評估丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的進展或消退。在這類情況中，該對照水平或該對照值可指較早時間同一對象中測定的生物標志物的水平或值。

本發(fā)明的生物標志物可用于評估某一試劑對丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的作用。在這類情況中，該對照水平或該對照值可指例如向?qū)ο蠼o予試劑前測定的生物標志物的水平或值。

本發(fā)明的生物標志物還可用于評估對丙型肝炎感染或這類感染所致或相關(guān)病癥的治療的應(yīng)答。在這類情況中，該對照水平或該對照值可指例如向?qū)ο蠼o予治療前測定的生物標志物的水平或值。

本發(fā)明的發(fā)明人還公開了對治療的應(yīng)答，其可涉及向?qū)ο蠼o予治療劑，其中使用脂質(zhì)組學(xué)生物標志物，其可以是獲自對象的生物樣品的葡糖神經(jīng)酰胺、乳糖神經(jīng)酰胺和鞘磷脂中至少一種的去飽和指數(shù)。與對照值(即給予試劑前獲得的對象的樣品中測定的值)相比，較高的測定的去飽和指數(shù)值可表示該對象對該試劑產(chǎn)生應(yīng)答。這類去飽和指數(shù)可以是24:1/24:0比率。

在一些實施方式中，可在生物樣品的極低密度脂蛋白部分中測定去飽和指數(shù)。

在一些實施方式中，可測定葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺之一中的去飽和指數(shù)。而在一些實施方式中，可測定葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺中的去飽和指數(shù)。

在一些實施方式中，除去飽和指數(shù)標志物外，還可使用生物樣品的葡糖神經(jīng)酰胺的豐度(即濃度或量)評估對治療的應(yīng)答。在這類情況中，與對照值(即給予試劑前的值)相比，降低的葡糖神經(jīng)酰胺豐度(特別是VLDL血液部分中的豐度)可表示該對象對該治療產(chǎn)生應(yīng)答。

在一些實施方式中，該對象可以是患有丙型肝炎感染或相關(guān)病癥(如肝纖維化或肝細胞癌)的對象。給予這類對象的試劑可以是亞胺糖，其可以是對丙型肝炎有效的。這類亞胺糖可以是例如以下物質(zhì)之一：N-取代的脫氧野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽、N-取代的脫氧半乳糖野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽，以及N-取代的Me-脫氧半乳糖野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽。示例性亞胺糖可包括但不限于：N-丁基-脫氧野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽和N-(7-氧雜-壬基)-1,5,6-三脫氧-1,5-亞氨基-D-半乳糖醇及其藥學(xué)上可接受的鹽。在例如美國專利號7,612,093和6,465,487中公開了有效針對丙型肝炎的亞胺糖。

在一些實施方式中，該對象可以是患有溶酶體貯積癥(如戈謝病或C型尼曼-皮克病)的對象。給予這類對象的試劑可以是亞胺糖，其可以是對溶酶體貯積癥有效的。這類亞胺糖可以是例如以下物質(zhì)之一：N-取代的脫氧野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽、N-取代的脫氧半乳糖野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽，以及N-取代的Me-脫氧半乳糖野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽。示例性亞胺糖可包括但不限于：N-丁基脫氧野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽；N-壬基脫氧野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽以及N-丁基脫氧半乳糖野尻霉素及其藥學(xué)上可接受的鹽。有效針對丙型肝炎的亞胺糖公開于例如美國專利號5,472,969；5,525,616；5,580,884；5,656,641；5,786,369；5,798,366；5,801,185；6,291,657；6,465,488；6,495,570；6,610,703；6,660,749；6,696,059；7,348,000。

在一些實施方式中，該對象可以是患有糖尿病(例如患有II型糖尿病)的對象。給予這類對象的試劑可以是胰島素敏化劑，其可以是例如亞胺糖、雙胍或噻唑烷二酮。胰島素敏化亞胺糖的一個示例可以是N-(5-金剛烷-1-基-甲氧基戊基)-DNJ及其藥學(xué)上可接受的鹽。噻唑烷二酮胰島素敏化劑的示例包括但不限于吡格列酮和羅格列酮。雙胍胰島素敏化劑的一個非限制性示例是二甲雙胍。通常，雙胍和胰島素敏化劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

本發(fā)明還假設(shè)可通過測定獲自丙型肝炎患者的生物樣品的脂蛋白中葡糖神經(jīng)酰胺、乳糖神經(jīng)酰胺和鞘磷脂中至少一種的去飽和指數(shù)值來鑒定這類患者，所述患者不太可能對包括給予至少一種干擾素(如peg化的干擾素α)和利巴韋林的丙型肝炎治療產(chǎn)生應(yīng)答(非應(yīng)答者患者)。如果測定的去飽和指數(shù)值顯示高于對照去飽和指數(shù)值，該患者可能不會對包括至少一種干擾素和利巴韋林的丙型肝炎治療產(chǎn)生應(yīng)答。在這類情況中，除了干擾素和/或利巴韋林治療外或者用于代替干擾素和/或利巴韋林治療，還可向經(jīng)鑒定的非應(yīng)答者患者給予替代性治療。這類替代性治療可涉及給予亞胺糖，其可有效地針對丙型肝炎，例如公開于美國專利號7,612,093和6,465,487中的那些。該去飽和指數(shù)可以是24:1/24:0比率。在一些實施方式中，該替代性治療可包括給予直接作用的抗病毒劑，其可以是，例如，HCV蛋白酶的抑制劑(如特拉匹韋或伯克匹韋)或聚合酶抑制劑。

在一些實施方式中，可在生物樣品的極低密度脂蛋白部分中測定去飽和指數(shù)。

在一些實施方式中，可測定葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺之一中的去飽和指數(shù)。而在一些實施方式中，可測定葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺中的去飽和指數(shù)。

本發(fā)明還提供了試劑盒，其可包含(a)用于測量一種或多種脂質(zhì)組學(xué)生物標志物水平的一種或多種試劑以及(b)用法說明。這類試劑盒可提供用于測量1、2、3、4、5、10或更多種脂質(zhì)組學(xué)生物標志物水平的1、2、3、4、5、10、15、20或更多種試劑。在一些實施方式中，該試劑盒可包含一種或多種用于免疫試驗的試劑。在一些實施方式中，該試劑盒可包含一種或多種用于MS試驗的試劑。在一些實施方式中，該試劑可以是針對脂質(zhì)代謝物(如脂肪酸)的抗體。制備抗體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。

在一些方面中，該試劑盒可包含(a)針對脂質(zhì)代謝物(如脂肪酸)的抗體以及(b)用法說明。在一些方面中，該試劑盒還可包含：(c)針對第二脂質(zhì)代謝物(如脂肪酸)的第二抗體。在一些方面中，該試劑盒還包含(d)針對第三脂質(zhì)代謝物(如脂肪酸)的第三抗體。

本發(fā)明可通過以下實施例更詳細地說明，但應(yīng)理解本發(fā)明不受其限制。

實施例

在使用復(fù)制型丙型肝炎病毒(HCVcc)感染的影響下和使用多種抗病毒亞胺糖化合物(其是ER葡糖苷酶和/或葡糖神經(jīng)酰胺合成酶的抑制劑)處理的影響下研究肝癌細胞的脂質(zhì)組成。在不存在感染的情況下，未處理的肝癌細胞在細胞的全局性脂肪酸概況中顯示顯著升高的不飽和非必需脂肪酸水平，表明必需脂肪酸缺乏的組成型狀態(tài)。具體而言，米德酸(二十碳三烯酸，20:3ω-9)高度升高。感染顯著抑制脂肪酸的從頭合成(證據(jù)是米德酸和單飽和脂肪酸的含量降低)且導(dǎo)致高度多不飽和必需ω-3和ω-6脂肪酸的富集。感染提高了細胞的脂肪酸含量且顯著改變了磷脂、三甘油酯和膽固醇酯的脂肪?；M成，提高內(nèi)源合成的非必需脂肪酰基鏈的長度和飽和度，并提高了膜和儲存性脂形式中必需高度多不飽和脂肪酸的摻入。亞胺糖化合物降低葡糖神經(jīng)酰胺的豐度，但也令人吃驚地提高其飽和度。對亞胺糖響應(yīng)的葡糖神經(jīng)酰胺豐度和飽和度的這些變化可存在于感染和未感染的狀態(tài)中。與HCV的作用相反，這些亞胺糖刺激從頭脂質(zhì)合成和米德酸產(chǎn)生，但僅限于未感染狀態(tài)。這些新觀察到的細胞脂質(zhì)組成方面的改變(指示致癌轉(zhuǎn)化、HCV感染和對亞胺糖處理的應(yīng)答)可用作丙型肝炎疾病活性的診斷性和/或預(yù)后性標志物和用于肝細胞癌的診斷。

丙型肝炎和相關(guān)病癥

約3％的世界人口感染丙型肝炎病毒(Marcellin 1999，引用參見下文參考文獻部分)，其是慢性肝病(包括肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌)的主要原因。此外，丙型肝炎病毒感染是美國和歐洲肝移植的最常見跡象(Chen和Morgan 2006)。該感染是在約50％的病例中是“可治愈的”(即存在持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答)，具體治療方法為PEG化干擾素α與利巴韋林聯(lián)用的組合治療(干擾素+利巴韋林)，但需要最多一年治療的這類療法的副作用是顯著的(例如干擾素的流感樣癥狀)(Awad,Thorlun等2010；Pawlotsky 2011)。隨著使用最近批準的新型‘直接作用’抗病毒劑(例如蛋白酶抑制劑特拉匹韋或伯克匹韋)和開發(fā)中的藥物如吉利德公司(Gilead)的GS-7977(曾用名PI-7977，一種核苷酸類似物聚合酶抑制劑)，治愈率提高。這些新藥具有可觀的前景，但其面對病毒的高突變能力的長期成功程度，以及其與其他藥物聯(lián)用以預(yù)防感染復(fù)發(fā)同時避免使用干擾素及其伴隨的副作用的成功程度仍有待觀察(Pawlotsky 2011)。此外，新批準的藥物是昂貴的，且保險和醫(yī)療預(yù)算有限，從而出于藥物經(jīng)濟學(xué)的原因，重要的是了解哪些患者可能需要昂貴的新療法和哪些患者對于歷史上形成的醫(yī)療標準(干擾素+利巴韋林)具有適當(dāng)應(yīng)答。同樣地，重要的是能夠預(yù)測哪些患者將經(jīng)歷疾病的快速進展且可能比其他人更需要更具攻擊性的治療或肝移植。

可預(yù)期血流中丙型肝炎病毒的量可以是感染的患者中肝疾病嚴重程度的良好的測量物。然而，這尚未被證明：即，被認為最可能指示肝病理學(xué)(但使患者疼痛并處于顯著風(fēng)險中)的肝活檢樣品與病毒血癥(血液中的病毒量，通過相對非侵入性血液取樣方法評估)之間沒有清楚的關(guān)系(Hollingsworth RC 1996)。迄今為止，非侵入性預(yù)后研究已用于通過測量血液中的蛋白質(zhì)生物標志物來檢測纖維化(后續(xù)硬化的指示物)的開始和進展。為此，已開發(fā)了一組蛋白質(zhì)生物標志物(例如，F(xiàn)ibroTest，在美國稱作FibroSure)(Castéra,Vergniol等2005)(Gangadharan,Bapat等2012)。這些蛋白質(zhì)生物標志物測試能夠在臨產(chǎn)前階段檢測指示硬化開始的纖維化(FibroTest)，且其他蛋白質(zhì)生物標志物(如我們發(fā)現(xiàn)的新型標志物)具有作為有用的疾病活性指示物的潛力。但是，越來越需要使用非侵入性或最低侵入性方法獲得病毒對肝病理學(xué)影響的早期指示。此外，感興趣的還有鑒定預(yù)測對特定治療應(yīng)答的生物標志物或生物標志物組，從而確保使用患者最可能產(chǎn)生應(yīng)答的適當(dāng)藥物或藥物組合治療患者，即所謂‘個性化’或‘分層’醫(yī)療?；诠逃杏邢薜尼t(yī)療預(yù)算，這類努力平衡了患者的最大利益和社會的最大利益(包括具有類似醫(yī)療需要程度的患有不同疾病的其他患者)。

迄今為止建立得最好的預(yù)測丙型肝炎病毒感染中治療應(yīng)答的生物標志物示例是IL28B基因的多態(tài)性，其預(yù)測對PEG-干擾素-α與利巴韋林組合(其直至目前仍是治療丙型肝炎患者的‘標準護理’)的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答。然而，IL28多態(tài)性的預(yù)測值本身不強，不足以用于決定患者是否將對任何特定治療方案產(chǎn)生應(yīng)答的臨床判斷。然而，似乎IL28多態(tài)性可能與其他遺傳多態(tài)性具有疊加或協(xié)同值或可同樣地與其他生物標志物策略(如基于生物標志物的蛋白質(zhì))聯(lián)用以幫助作出關(guān)于治療的決定，作出決定的新型治療環(huán)境中因為新批準的藥物和開發(fā)中的新藥而具有較多的藥物選擇。然而，迄今為止，丙型肝炎感染的生物標志物策略聚焦于蛋白質(zhì)和遺傳標志物，且尚未研究或鑒定使用脂質(zhì)組學(xué)生物標志物的可能性。

丙型肝炎病毒明顯依賴肝細胞的細胞脂質(zhì)代謝(具體而言是膽固醇代謝)以進行其復(fù)制循環(huán)(Barba,Harper等1997；Sagan,Rouleau等2006；Aizaki,Morikawa等2008；Amemiya,Maekawa等2008；Burlone和Budkowska 2009；Lyn,Kennedy等2009；McLauchlan 2009；Ogawa,Hishiki等2009；Diamond,Syder等2010；Herker,Harris等2010；Syed,Amako等2010；Merz,Long等2011；Miyoshi,Moriya等2011；Clark,Thompson等2012；Moriishi和Matsuura 2012；Rodgers,Villareal等2012)。在體內(nèi)，丙型肝炎病毒后代以包膜病毒顆粒的形式(即脂質(zhì)膜包膜病毒顆粒)出現(xiàn)于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其與‘脂病毒顆粒’形式的極低密度脂蛋白(VLDL)相關(guān)。為感染新細胞，該顆粒必須結(jié)合細胞表面受體(包括四旋蛋白(tetraspanin)、清除劑受體-B1和LDL-受體)，SRB1和LDL-R是脂蛋白受體。這些受體與‘脂閥’相關(guān)(富含膽固醇和飽和鞘糖脂的膜微結(jié)構(gòu)域)。一旦加入細胞的內(nèi)體，病毒還必須與膽固醇受體‘C型尼曼-皮克病樣蛋白1’(NPCL1)相互作用以逃逸至胞質(zhì)中(Sainz,Barretto等2012)。一旦加入細胞胞質(zhì)，該病毒推翻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)代謝以建立其自身細胞群‘膜性網(wǎng)’以支持其自身復(fù)制設(shè)備的功能。病毒顆粒的組裝發(fā)生在脂質(zhì)液滴上(ER中VLDL的中間前體)，通過核心蛋白質(zhì)與液滴表面的結(jié)合起始。完整的病毒顆粒隨后出現(xiàn)作為與VLDL相關(guān)的脂病毒顆粒并重復(fù)整個循環(huán)。

發(fā)明人假設(shè)，由于HCV操縱并利用肝細胞脂質(zhì)代謝的許多方面以用于其自身復(fù)制，其必然對細胞的脂質(zhì)組成具有特異性和可測量的影響，并還意識到這些變化將以肝分泌的血液脂蛋白的改變的脂質(zhì)組成形式體現(xiàn)于血液中(具體而言是VLDL的組分)，以及能夠隨著肝生物活檢試樣的變化來進行分析。此外，發(fā)明人意識到，感染的細胞上HCV的“脂質(zhì)組學(xué)印跡”是測量病毒對其宿主細胞影響的測量值，即對于肝脂質(zhì)代謝的影響，其可以是比病毒血癥更好的疾病活性標志物，因為其更直接地反映病毒對于肝功能和病理學(xué)的不良作用，且因為其代表復(fù)雜的針對病毒感染的細胞代謝應(yīng)答的總和，其可能受多個基因多態(tài)性的影響——其各自具有微弱貢獻，且單獨具有受限制的預(yù)測值。此外，發(fā)明人認識到，丙型肝炎感染的患者的血漿和活檢樣品中脂質(zhì)組學(xué)特征的預(yù)后值代表目前未使用的生物標志物來源，其可與遺傳多態(tài)性和蛋白質(zhì)組學(xué)生物標志物聯(lián)用以實現(xiàn)對特定治療方案的應(yīng)答以及纖維化、硬化和肝細胞癌的發(fā)展速率和風(fēng)險的增強的預(yù)測準確性。發(fā)明人還認識到，來源于在脂質(zhì)代謝中非常活躍的肝細胞的肝細胞癌本身具有其自身的特征性脂質(zhì)組學(xué)特征－反映肝細胞的轉(zhuǎn)化狀態(tài)中脂質(zhì)代謝特性中的變化，且血液脂蛋白脂質(zhì)組成形式的肝細胞癌的特征可用于肝癌的早期檢測，目前使用現(xiàn)有生物標志物(如α-胎蛋白，其不是由HCC全局性表達(表達于約80％的病例中(Huo,Hsia等2007)))檢測肝癌是不可靠的。因此，發(fā)明人研究了復(fù)制型HCVcc感染對于肝細胞癌細胞(Huh7.5)的脂質(zhì)組學(xué)的影響，以及未感染和感染的細胞對亞胺糖藥物的脂質(zhì)組學(xué)應(yīng)答和脂質(zhì)組學(xué)組成，所述亞胺糖藥物是ERα-葡糖苷酶和葡糖神經(jīng)酰胺合成酶的抑制劑，且已知影響蛋白質(zhì)折疊(通過葡糖苷酶抑制)(Branza-Nichita,Durantel等2001；Chapel,Garcia等2006；Chapel,Garcia等2007)和/或通過抑制葡糖神經(jīng)酰胺合成酶影響脂質(zhì)代謝(Platt,Reinkensmeier等1997；Butters,Dwek等2003；Butters,Dwek等2005)，且通過抑制β-葡糖苷酶-2(GBA2)–一種中性外溶酶體葡糖神經(jīng)酰胺酶(Boot,Verhoek等2007)。

感染和未感染細胞的脂肪酸含量

測量了未感染和感染狀態(tài)中肝癌細胞的總脂肪酸含量(游離的以及脂質(zhì)的脂肪酰鏈)(圖2)。感染的細胞的脂肪含量高得多(3-5倍)，但未立即觀察到該升高的原因。例如，這些細胞可輸入脂肪(通過脂蛋白受體)；同樣地其可輸出脂肪(作為脂蛋白)且還可通過從頭脂質(zhì)合成再度利用。下文列舉了理由以表明感染的細胞的脂肪含量增加涉及輸入這些人細胞無法制備的必需脂肪酸(可能作為脂蛋白的脂質(zhì)組分)，且此外不可能通過感染狀態(tài)中受高度抑制的從頭脂質(zhì)合成來產(chǎn)生高脂肪含量。降低的脂蛋白輸出(肝細胞中HCV感染的已知特征)是這些觀察的另一種可能解釋。

未感染細胞的全局性細胞脂肪酸組成

為獲得感染和亞胺糖對宿主細胞脂質(zhì)組學(xué)影響的總體印象，首先檢查總脂質(zhì)提取物的酸性轉(zhuǎn)甲基化后未感染細胞的總脂肪酸組成(以脂肪酸甲基酯的形式)。該分析包括非酯化和酯化脂肪酸(后者包括部分膽固醇酯、甘油三酯和多種磷脂以及鞘脂)圖3。令人吃驚地在未處理、未感染的宿主細胞中發(fā)現(xiàn)了非常高含量的‘米德酸’(20:3ω-9，占總脂肪酸的13％)。米德酸通過鏈延長和去飽和的反應(yīng)由棕櫚酸(C16:0)(從頭脂質(zhì)生成的中間產(chǎn)物)生成。原代肝細胞表達比培養(yǎng)的Huh7.5肝癌細胞低得多的米德酸水平(以其脂肪酸概況的百分比計)(Claude Wolf，個人通訊)。

米德酸在人和動物體內(nèi)必需脂肪酸消耗的病癥中總體增加(Siguel,Chee等1987；Duffin,Obukowicz等2000)。米德酸的增加因此表示未感染的宿主細胞有效地消耗必需脂肪酸，即亞油酸(18:2ω-6)和α-亞油酸(18:3ω-3)，其是主要膳食必需脂肪酸(是高度多不飽和脂肪酸的合成所需的，包括ω-6花生四烯酸和ω-3二十二碳六烯酸)。

該觀察可表明HCC患者中的肝癌細胞，不同于健康肝細胞，可分泌米德酸作為脂蛋白(如VLDL)的脂質(zhì)元素的脂肪?；?，且此外這類VLDL組成中的變化可在必需脂肪酸的飲食波動的表面中維持。不同于α-胎蛋白(其是臨床上有用的肝細胞癌的蛋白質(zhì)生物標志物)，發(fā)明人假設(shè)VLDL組成中的這些變化在HCC患者中體現(xiàn)得更廣泛，這獨立于其是否對血清α-胎蛋白(經(jīng)典的HCC生物標志物)呈陽性。同樣地，發(fā)明人假設(shè)VLDL中基于增加的米德酸的診斷測試可以是比α-胎蛋白(其在約80％的患者子集中增加)更靈敏和可靠的潛在肝細胞癌指示物，且這類測試可與HCC診斷中的至少一種其他測試互補，以診斷精確性和可靠性的形式提供協(xié)同或疊加的數(shù)值。

HCVcc感染的細胞的全局性脂肪酸組成

使用HCV感染顯著降低米德酸的細胞含量(超過20倍，圖4)。其還降低了從頭脂質(zhì)生成中其他非必需脂肪酸副產(chǎn)物(即棕櫚油酸(C16:1w9和w7)和油酸(C18:1w9))的豐度(與未感染的狀態(tài)相比)。然而，另一種來自從頭脂質(zhì)生成的非必需脂肪酸異油酸(C18:1ω-7)未變化。HCV降低米德酸和從頭脂質(zhì)合成的其他副產(chǎn)物豐度的機制或該作用(可能是細胞代謝的自我保護反應(yīng))的原因并不確切清楚，但從頭脂質(zhì)合成的中間產(chǎn)物棕櫚酸酯(16:0)的可用性似乎不是限制性因素，因為該脂肪酸的組成豐度未因感染而變化。這可能表明，具體而言，HCV可抑制合成米德酸所需的進一步去飽和以及鏈延長。(米德酸在人細胞中由棕櫚酸(16:0)產(chǎn)生，其產(chǎn)生的連續(xù)去飽和和延長步驟涉及Δ-9去飽和酶、Δ-6和Δ-5去飽和酶，以及延長酶ELOVL6和ELOVL5)。應(yīng)注意，大鼠中的飲食膽固醇已被觀察到抑制肝中Δ-6和Δ-5去飽和酶的活性(這兩者都是米德酸合成所需的)(Muriana,Vazquez等1992；Bernasconi,Garda等2000)。雖然本發(fā)明不受其作用理論的限制，但米德酸合成的抑制可因此是HCV感染所致細胞膽固醇增加的結(jié)果：例如HCV已知增加細胞膽固醇(Sagan,Rouleau等2006；Kapadia,Barth等2007；Waris,Felmlee等2007；Ye 2007))。感染的狀態(tài)中觀察到的非必需(內(nèi)源性合成)脂肪酸去飽和的降低還可來源于高度多不飽和必需脂肪酸(如花生四烯酸和二十二碳六烯酸)的作用，其因感染而(令人吃驚地)增加(參見后文)且已知其抑制肝中所有三種相關(guān)去飽和酶(Δ-9、Δ-6和Δ-5)的表達(Cho,Nakamura等1999；Cho,Nakamura等1999；Ntambi 1999)。觀察到感染的細胞中Δ-9去飽和指數(shù)降低(圖5)，這符合感染的狀態(tài)中升高的PUFA或膽固醇。

感染的狀態(tài)中非必需脂肪酸的降低的去飽和增加的延長

原則上，感染的狀態(tài)中米德酸的減少可以是上文所述去飽和酶活性降低或延長減少的結(jié)果，因為其合成需要這兩種類型的酶。然而，脂肪酸延長不因感染而降低，而是相反(在全局性脂肪酸概況中)在感染的狀態(tài)中脂肪酸延長增加，如同(18:1ω-7/16:1ω-7)的比率所評估的那樣(圖5)，這是ELOVL-1和ELOVL-6的合并活性的功能。相反地，在感染的狀態(tài)中去飽和酶活性降低。因此，Δ-9去飽和酶(也稱作硬脂酰-CoA去飽和酶-1，SCD1)對棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)進行去飽和。16:1/16:0比率因感染而降低，表明Δ-9去飽和酶活性的降低：即Δ-9去飽和酶活性評估為棕櫚酸豐度與棕櫚酸種類的比率((16:1ω-7+16.1ω-9)/16:0)，其被發(fā)現(xiàn)在感染的狀態(tài)中降低。該分析可表明感染的狀態(tài)中Δ-9去飽和酶活性的降低，以及增加的延長。這些發(fā)現(xiàn)(涉及Δ-9去飽和酶)符合降低的米德酸水平，指示去飽和酶-6和5的活性降低，使得降低的去飽和酶活性(Δ-9、Δ-6和Δ-5)是感染狀態(tài)中非必需不飽和脂肪酸(包括米德酸)水平降低的可能原因。

亞胺糖對于全局性脂肪酸組成的影響

在未感染的狀態(tài)中，通常發(fā)現(xiàn)亞胺糖在抗病毒濃度下提高全局性脂肪酸組成的已經(jīng)較高的米德酸組分(圖4)。在亞胺糖化合物之一(AMP-DNJ)的情況下，米德酸含量幾乎翻倍。亞胺糖的這些作用是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

亞胺糖對米德酸生產(chǎn)的刺激似乎是去飽和酶Δ-6和Δ-5的活性進一步增加的結(jié)果，即高于和大于這些培養(yǎng)的細胞中組成型高水平，其證據(jù)是其已經(jīng)較高的米德酸含量。亞胺糖的這一影響與HCV感染恰恰相反，但矛盾的是未在感染的狀態(tài)中檢測到，其很大程度受病毒影響的支配。未感染的狀態(tài)中亞胺糖的這一作用可顯示對細胞進行亞胺糖處理后胰島素敏感度的提高。因此，這些化合物之一(AMP-DNJ，也稱作AMP-DNM)在肥胖小鼠中改進肝胰島素敏感度、降低脂肪酸合成酶活性并消除肝脂質(zhì)沉著癥(Bijl,Sokolovic等2009)。此外，胰島素刺激Δ-6去飽和酶表達和活性(其是米德酸合成的速率限制因素(Wang,Botolin等2006))，其可支持亞胺糖提高胰島素靈敏度的假設(shè)。發(fā)明人假設(shè)，II型糖尿病是HCV感染對象中(對干擾素+利巴韋林)治療應(yīng)答的陰性預(yù)后指示物，且從HCV感染中治愈的患者也治愈了胰島素耐受(Clement,Pascarella等2009；Eslam,Khattab等2011)可表明亞胺糖的胰島素敏化作用在亞胺糖的抗病毒治療中可以是有利的，這是通過其對抗支持病毒復(fù)制的肝細胞中潛在的代謝缺陷。

HCV感染對于全局性脂肪酸組成的必需多不飽和脂肪酸組分的影響

必需脂肪酸亞油酸和α亞油酸無法由哺乳動物細胞合成。此外，發(fā)現(xiàn)(在上文中)細胞非常缺乏這些必需脂肪酸。因此，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)感染狀態(tài)中高度多不飽和ω-6和ω-3脂肪酸(如花生四烯酸和二十二碳六烯酸)的豐度顯著增加。雖然本發(fā)明不受其作用理論的限制，感染狀態(tài)中這些高度多不飽和種類相對豐度的增加可簡單地反映以下事實：其不再被來自從頭脂質(zhì)生成的內(nèi)源性合成的脂肪酸稀釋，其受病毒抑制。

由于在復(fù)制子和感染性病毒系統(tǒng)中游離狀態(tài)的多不飽和脂肪酸(PUFA)(如二十二碳六烯酸)都對HCV具有抗病毒性(Leu,Lin等2004；Kapadia和Chisari 2005；Miyoshi,Moriya等2011)，感染的細胞中高含量的這類PUFA也都是較令人吃驚的。雖然本發(fā)明不限于其作用理論，但可能感染狀態(tài)中膽固醇酯和甘油三酯的高ω-3和ω-6PUFA含量(見下文)可反映病毒支持將這些脂肪酸隔離至脂質(zhì)液滴中的趨勢，其中其抑制病毒復(fù)制的能力是受限的。

感染狀態(tài)中觀察到的細胞ω-3和ω-6高度多不飽和脂肪酸的令人吃驚的增加可表明，這些脂肪酸血漿水平的增加可定量表示HCV感染的程度，或HCV感染對于肝功能的代謝影響，然而，這些必需脂肪酸(EFA)是常見的膳食組分(肉中富含(ω-6)和魚中富含(ω-3))，使得基于全局性血漿脂肪酸概況中這些脂肪酸標志物豐度的生物標志物測量可容易地被飲食中的改變混淆?？赡苄枰鼜?fù)雜的分析豐富，其注意飲食對于總脂質(zhì)脂肪酸概況的潛在混淆作用。

單個脂質(zhì)類型的脂肪酸組成

膽固醇酯在未感染和感染的狀態(tài)中測量膽固醇酯的最常見的脂肪酸種類。感染導(dǎo)致膽固醇酯的脂肪酸組成的顯著變化(圖6)，其中必需ω-3和ω-6脂肪酸(20:4、20:5、22:6和22:5)顯著增加5-14倍，且不轉(zhuǎn)化為EFA形式的單飽和種類(16:1、18:1)減少：即，膽固醇酯反映與感染對全局性脂肪酸概況類似的改變，且因此可對培養(yǎng)的肝癌細胞的全局性概況產(chǎn)生重大影響。不同于全局性概況，在亞胺糖的影響下，感染或未感染狀態(tài)中膽固醇酯的脂肪酸概況都沒有明顯差異，但在膽固醇酯脂肪酸概況分析中沒有檢測到米德酸(正常情況下不是膽固醇酯中的主要組分)。由于膽固醇酯是脂質(zhì)液滴的主要組分，其是極低密度脂蛋白(VLDL)的中間前體，且由于VLDL是HCV脂病毒顆粒的脂蛋白組分，因此可從中明顯地看到，富含EFA種類的膽固醇酯的增加可以是丙型肝炎病毒感染的有用的生物標志物，或用于評估受感染的患者中HCV感染對于肝細胞的代謝影響。

甘油三酯甘油三酯形成脂質(zhì)液滴的主要組分，其(與膽固醇酯一起)形成分泌的VLDL和脂病毒顆粒的核心?；谖覀儽疚闹邪l(fā)展的理論，即血液VLDL/脂病毒脂質(zhì)組分可能是HCV感染對于肝細胞代謝作用的靈敏的指示物，因此甘油三酯是特別感興趣的。不同于其中每個分子僅存在一條脂肪?；湹哪懝檀减?，對于甘油三酯而言存在三條，且對于傾向存在于各位置中脂肪酰基鏈，這三個位置不是等價的，表明合成酶的底物偏好性以及細胞中游離脂肪酸前體的可用性(Berry2009)。甘油三酯生物合成的這些特征對較大多樣性的脂肪?；之悩?gòu)組合物提供比其他脂質(zhì)類別多的自由度。圖7顯示所發(fā)現(xiàn)的不同甘油三酯種類的組成百分比以及感染和亞胺糖對于該組成的影響。

應(yīng)注意，最豐富的甘油三酯種類‘C52:2-C16:1’(其含有棕櫚油酸(16:1)，代表所要甘油三酯種類的四分之一至三分之一)的組成豐度實際未被感染改變。然而，在一些較次要的甘油三酯種類中存在非常顯著的變化。因此，9種甘油三酯種類的豐度降低大于2倍，而6種甘油三酯種類的豐度增加大于2倍.最大的變化存在于以下甘油三酯種類，其在感染后增加大于15倍：

C54:5-C1 C54:6-C1 C56:5-C2 C56:7-C2

8:0 8:1 0:4 2:6

應(yīng)注意，C54:6-C18:1因感染增加96倍，但其仍僅蛋白感染狀態(tài)中1.7％的甘油三酯組成。諸如這些的變化在常規(guī)臨床診斷測試中使用的傳統(tǒng)血液甘油三酯分析中不顯著，因為這些測試測量總甘油三酯且不根據(jù)脂肪酸組成或分子種類來分解甘油三酯種類。還應(yīng)注意，含有非常多雙價且明確含有必須脂肪酸的種類C56:5-C20:4(含有花生四烯酸20:4)和C56:7-C22:6(含有二十二碳六烯酸)在感染狀態(tài)中大幅增加(大于16倍)，但仍僅包含總細胞甘油三酯池的次要組分(圖8)。

完全飽和種類C44:0-C16:0在感染狀態(tài)中下降五倍，使得血液甘油三酯或VLDL中該甘油三酯種類豐度的降低可用于測定丙型肝炎病毒對于肝脂質(zhì)代謝的作用。亞胺糖化合物對于甘油三酯脂肪酸組成沒有系統(tǒng)性影響，例外之處是傾向于提高未感染狀態(tài)中該飽和種類豐度并矛盾地降低感染狀態(tài)中該種類的豐度。亞胺糖對于該特定甘油三酯種類的微弱影響預(yù)期不會具有特定的診斷或預(yù)后重要性。

磷脂酰膽堿不同于PC的醚鍵合形式(見下文)，酯鍵合磷脂PC、PE、PS和PI的脂肪酸組成因感染而廣泛常見，如同PC的溶血形式那樣。對于PC二酯形式，單飽和PC32:1種類的水平因感染降低而包含的PC32:0和34:0和富PUFA的PC(PC34:4和PC38:5)因感染升高(圖9)。因為整個分子種類的同分異構(gòu)模糊性，在該研究中無法明確區(qū)分米德酸或其他單個多不飽和脂肪酸。然而，感染狀態(tài)中觀察到的多不飽和脂肪酰基形式的PC的增加確認了并與對于全局性脂肪酸概況和膽固醇酯概況的上文分析的令人吃驚的結(jié)果一致，即隨著將這些不飽和形式摻入膜磷脂中，感染狀態(tài)中必需多不飽和脂肪?；N類的豐度增加。

醚磷脂形式的PC(即過氧化物酶體中合成的‘縮醛磷脂’形式)的脂肪酸組成實際上未因感染而變化(圖10)。ER中進行的酯鍵合磷脂的選擇性重建顯示HCV在磷脂重建方面具有隔室特異性作用，影響ER而非過氧化物酶體，符合其緊密依賴于ER以生成‘膜性網(wǎng)’(如前所述)磷脂液滴上其核心蛋白組裝(與ER緊密相關(guān))以及其從ER出芽為脂蛋白顆粒。

溶血-PC的分析(圖11)提供了解析上文所述同分異構(gòu)模糊性的機會。對于溶血-PC(其來源于二酯PC但僅具有一條脂肪?；?，感染狀態(tài)中不飽和棕櫚酸減少(16:1)且16:0相反地增加，這與上文關(guān)于Δ-9去飽和指數(shù)的觀察一致且表明全局性概況中這些普遍的變化也反映于膜以及儲存脂質(zhì)中。同樣地，對于溶血-PC，在20:4(花生四烯酸)和22:6中存在明確增加，表明這些在感染狀態(tài)中更豐富的必需脂肪酸也找到了其通往膜脂質(zhì)的道路。

磷脂酰乙醇胺 在PE的二酯形式的分析中(圖12)，明確鑒定到了米德酸(C20:3ω-9)。根據(jù)全局性脂肪酸概況，感染導(dǎo)致米德酸減少約大于20倍，而(僅在未感染狀態(tài)中)亞胺糖處理導(dǎo)致米德酸水平升高–最高兩倍，這取決于亞胺糖化合物。同樣地，感染導(dǎo)致棕櫚油酸(16:1ω-7和ω-9)的顯著減少和必需ω-3和ω-6脂肪酸(20:3ω-3；20:4ω-6；20:5ω-3；22:6ω-3；22:5ω-3；和22:4ω-6)的顯著增加。這些PE的脂肪?；M成的發(fā)現(xiàn)有利地確認了脂肪酸全局性概況、膽固醇酯概況和二酯-PC概況的發(fā)現(xiàn)。然而，不同于二酯PC概況，對于PE，(與單飽和形式相比)飽和形式的豐度沒有平衡性增加，其可表明，對于PE，感染可對其膜融合和分裂性質(zhì)產(chǎn)生重大影響(例如，細胞分裂、從ER中病毒出芽等所需的性質(zhì))。

磷脂酰絲氨酸，對于PS的二酯形式，感染導(dǎo)致38:3種類減少約大于2倍，預(yù)計包括18:0和米德酸(20:3ω-9)，表明與其他脂質(zhì)類別相比較低的全局性脂肪酸概況變化的可塑性(plasticity)(圖13)。較少的可塑性可反映較低的PS轉(zhuǎn)換率。此外，感染可減少40:6種類。然而，不清楚在分解的水平下該PS種類是否代表含有與C18:0配對的單個22:6或一對C20:3的種類。

磷脂酰肌醇 僅具有四種分子種類的PI的二酯形式顯示感染后脂肪酸組成的顯著變化(圖14)。感染與各情況中PI38:3水平降低6倍且剩余富PUFA的PI種類(PI36:4、38:4和38:5)的比例提高2倍相關(guān)。感染導(dǎo)致了PI組成的最大轉(zhuǎn)變(不同于亞胺糖處理)，其導(dǎo)致38:4大量替代38:3種類。由于PI38:3的假定結(jié)構(gòu)是18:0/20:3，感染后的變化符合感染狀態(tài)中米德酸(20:3ω-9)的可用性降低，其被感染狀態(tài)中最豐富的脂肪酸花生四烯酸(20:4ω-6)代替：即從18:0/20:3(硬脂/米德)轉(zhuǎn)變?yōu)?8:0/20:4(硬脂/花生四烯)。僅在未感染的狀態(tài)中，在亞胺糖化合物存在的情況下有PI38:3種類水平增加的趨勢，微弱地反映全局性脂肪酸概況中發(fā)現(xiàn)的亞胺糖對米德酸的強增加。PI主要涉及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基質(zhì)，且PI脂肪酸組成的變化(由感染或亞胺糖處理導(dǎo)致)可預(yù)期影響PI介導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如影響胰島素敏感度)。應(yīng)注意，花生四烯酸(ω-6)阻斷了胰島素對PI3激酶的激活，阻止其通過P38MAP激酶誘導(dǎo)葡萄糖6-磷酸脫氫酶(Talukdar,Szeszel-Fedorowicz等2005)。此外，感染導(dǎo)致的PI脂肪酸組成的變化可將PI的底物行為朝向PI3激酶改變。此外，還因其他原因(不同于胰島素耐受性)認為這一由感染導(dǎo)致的PI組成變化可以在丙型肝炎病毒感染中具有病理學(xué)重要性。因此，PI是用于類二十烷酸合成的花生四烯酸的主要來源，且感染狀態(tài)中PI花生四烯酸的3倍增加可通過提高這些生物活性產(chǎn)物的生物合成來增強對該病毒的宿主炎癥應(yīng)答。

生物標志物鑒定的磷脂脂肪酸概況的重要性

肝分泌HCV病毒顆粒作為脂病毒顆粒的一部分(上文所述)，其包含與VLDL顆粒相關(guān)的HCV病毒顆粒。雖然不分明不受其作用理論的限制，但發(fā)明人假設(shè)由于VLDL顆粒的脂質(zhì)表面主要包含PC和PE，病毒對于PC和PE的細胞脂肪酸概況的任何作用都將反映為感染的患者血液中VLDL的脂肪酸概況的變化。對于PC，僅觀察到感染后二酯形式的脂肪酸概況的變化。隨后，VLDL中二酯形式的PC的變化可能在鑒定生物標志物方面最令人感興趣，且醚形式的組成可以是有用的對照。首先，在這一方面，應(yīng)注意PC32:1種類因感染降低而包含的PC32:0和34:0和富PUFA的PC(PC34:4和PC38:5)因感染升高。因此，二酯PC的32:1種類的降低以及(32:0；34:0；34:4和38:5)種類的升高將顯示HCV對于肝細胞磷脂代謝的活性。

對于PE，在未感染狀態(tài)中米德酸升高，其可反映為肝細胞癌來源的血液VLDL顆粒中升高的米德酸，使得血液VLDL米德酸含量可用作肝細胞癌的有用的標志物。此外，感染導(dǎo)致棕櫚油酸(16:1ω-7和ω-9)的顯著減少和必需ω-3和ω-6脂肪酸(20:3ω-3；20:4ω-6；20:5ω-3；22:6ω-3；22:5ω-3；和22:4ω-6)的顯著增加。感染狀態(tài)的血漿VLDL特征中的后一群變化可指示HCV感染對于肝細胞的影響，且可用于生物標志物目的。

PI和PS僅是VLDL的次要磷脂組分，其作為HCV感染的生物標志物的用處不大。然而，VLDL中PI中米德酸或PI的38:3種類的水平的降低可以是HCV感染影響的有用的指示物。同樣VLDL中PI和PS水平(通常限于血漿膜和ER的胞內(nèi)小葉(intracellular leaflet))的升高可表明HCV感染。因此，HCV感染期間發(fā)生的肝細胞凋亡可導(dǎo)致膜對稱性增加以及后續(xù)的脂質(zhì)(如PI和PS)富集(其通常很大程度上被排除在VLDL之外)目前在VLDL的表面磷脂單層中出現(xiàn)較高的豐度。

感染對比未感染以及處理對比未處理的細胞中鞘糖脂的豐度和脂肪酸組成

以抗病毒濃度使用亞胺糖處理感染或未感染的細胞通過抑制葡糖神經(jīng)酰胺合成酶顯著降低了‘糖基神經(jīng)酰胺’的細胞濃度(本發(fā)明的制品分析無法區(qū)分葡糖和半乳糖形式)(圖15)。在乳糖神經(jīng)酰胺的情況中這些作用甚至更明顯，所述乳糖基神經(jīng)酰胺是葡糖神經(jīng)酰胺的明確產(chǎn)物(與‘糖基神經(jīng)酰胺’相反，其相對于葡萄糖或半乳糖在該制品分析中是模糊的)。這些結(jié)果可以預(yù)期，因為先前已知大多數(shù)測試的化合物是葡糖神經(jīng)酰胺合成酶的抑制劑。

然而，出乎意料的是，還發(fā)現(xiàn)亞胺糖處理改變了葡糖神經(jīng)酰胺的脂肪酸組成，但令人吃驚的是(基于上述觀察到的感染對主要和次要細胞脂質(zhì)的廣泛重建和Δ-9全局性去飽和指數(shù)的變化)感染未改變GlcCer的脂肪酸組成。相反地，亞胺糖導(dǎo)致GlcCer的鏈延長和去飽和(后一作用在這兩種作用中較強)。這些現(xiàn)象(去飽和和鏈延長)存在于類似的感染和未感染的狀態(tài)中。圖16描述葡糖神經(jīng)酰胺去飽和的這些藥物應(yīng)答，且圖17顯示這些變化對鞘脂(GlcCer和LacCer)是特異性的，即不顯示于PC和PE中。

GlcCer脂肪酸組成的變化(類似的感染和未感染的狀態(tài)中對亞胺糖應(yīng)答產(chǎn)生的增加的去飽和)在一定程度上可與感染狀態(tài)中降低的去飽和酶活性的觀察和推斷(較早作出)相悖，但根據(jù)上述觀察，亞胺糖誘導(dǎo)的GlcCer去飽和的程度在感染的狀態(tài)中較低。這些變化可用GlcCer的‘去飽和指數(shù)’(即C24:1/C24:0的豐度比率，即神經(jīng)酸/二十四烷酸脂肪?；湹哪柋?方便地表示(圖18)。發(fā)現(xiàn)亞胺糖提高了GlcCer和LacCer的去飽和指數(shù)(后者的程度較低)。相反地，該指數(shù)在相關(guān)鞘脂神經(jīng)酰胺(GlcCer的中間前體)中未變化(未顯示)?？梢虼吮砻鳎珿lcCer合成酶的亞胺糖抑制劑存在的情況下不飽和GlcCer的累積可代表LacCer合成酶(半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-I)或更復(fù)雜的鞘糖脂的生物合成通路中較后的酶對于飽和形式的偏好，而非由這些化合物對于Δ-9去飽和酶活性的作用所介導(dǎo)，其在受感染的狀態(tài)中被明顯抑制(證據(jù)為上文中細胞的全局性脂肪酸概況)?；蛘?，這些變化可預(yù)期導(dǎo)致合成摻入較大比例不飽和鏈的神經(jīng)節(jié)苷脂，即此時LacCer合成酶的GlcCer前體池是極度主要不飽和的；或?qū)е乱訪acCer合成的競爭性抑制劑形式作用的不飽和形式GlcCer的干擾，如下文所述。

由于GlcCer和LacCer是神經(jīng)節(jié)苷脂的主要前體(Butter,Dwek等2005；Fuller2010)，且因為神經(jīng)節(jié)苷脂是脂閥的重要組分(與鞘磷脂和膽固醇一起)(Quinn2010)，發(fā)明人假設(shè)GlcCer細胞豐度的降低可預(yù)期降低細胞膜閥的豐度和/或尺寸，或改變其功能特性。此外，由于HCV在其復(fù)制循環(huán)的若干階段期間高度依賴于脂閥(Aizaki,Lee等2004；Matto,Rice等2004；Aizaki,Morikawa等2008；Weng,Hirata等2010)，可能的情況是，亞胺糖導(dǎo)致的脂閥豐度降低或功能變化可解釋其針對HCV的抗病毒作用。此外，觀察到除降低GlcCer的豐度外，葡糖神經(jīng)酰胺的亞胺糖抑制劑還令人吃驚地提高GlcCer的去飽和，其還可預(yù)期為影響脂閥的量和性質(zhì)：即在脂閥(其是特征性‘飽和’微結(jié)構(gòu)域)中摻入不飽和神經(jīng)節(jié)苷脂可改變其結(jié)構(gòu)和功能。由于神經(jīng)節(jié)苷脂的病理性累積使膽固醇陷入細胞膜中(如同神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病(如戈謝病)中那樣)，可能的情況是，亞胺糖可影響膽固醇劃分或運輸。例如，消耗脂閥的神經(jīng)節(jié)苷脂組分可從閥中釋放膽固醇，提高其在膜中的‘游離’濃度。因此，除其直接作用于脂閥外，亞胺糖還可通過從膜閥中釋放膽固醇來介導(dǎo)其抗病毒作用，其結(jié)果是GlcCer的豐度或脂肪酸組成的變化。

從脂閥中釋放膽固醇可假性表示對細胞‘膽固醇過載’的狀態(tài)，導(dǎo)致釋放的膽固醇對膽固醇合成的反饋抑制，消耗病毒復(fù)制所需的膽固醇。

用于生物標志物目的的鞘糖脂豐度和去飽和的重要性

如上文所述，血液脂蛋白中葡糖神經(jīng)酰胺的豐度以及葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺的去飽和指數(shù)可用作治療性使用亞胺糖時抗病毒療法對比HCV有效性的指示物。同樣地，這些指數(shù)可用作遺傳性溶酶體貯積癥(如戈謝(Gaucher)和C型尼曼-皮克(Niemann-Pick)病)中對葡糖神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑治療應(yīng)答的測量值。雖然葡糖神經(jīng)酰胺的神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)物的豐度已在實驗上用作戈謝病中治療應(yīng)答的生物標志物，但沒有教導(dǎo)使用葡糖神經(jīng)酰胺的去飽和指數(shù)作為這類疾病中對葡糖神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑的治療應(yīng)答的生物標志物。同樣地，雖然鞘脂(即神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和腦苷脂)和全局性血漿脂肪酸概況概況中神經(jīng)酸(24:1)的豐度在I型糖尿病的大鼠和鼠模型中降低(Fox,Bewley等2011)，但迄今為止未教導(dǎo)葡糖神經(jīng)酰胺的去飽和指數(shù)可用作II型糖尿病中疾病活性或?qū)σ葝u素敏化劑應(yīng)答的標志物。本發(fā)明中，發(fā)明人表明，代謝綜合征和II型糖尿病的特征可以是VLDL中葡糖神經(jīng)酰胺的去飽和指數(shù)升高(由于高胰島素血癥)，且使用胰島素敏化劑(如選自亞胺糖、雙胍和噻唑烷二酮)進行治療可通過改善胰島素靈敏度(特別是相對于由胰島素刺激的組織的葡萄糖攝取應(yīng)答，以及肝產(chǎn)生的葡萄糖的減少)和校準高胰島素血癥將該指數(shù)降低至正常值。

考慮到代謝綜合征和II型糖尿病是使用干擾素+利巴韋林治療HCV的應(yīng)答的不良預(yù)后指示物(Clement,Pascarella等2009；Eslam,Khattab等2011)，這也表明血液VLDL GlcCer和/或LacCer的去飽和指數(shù)可用于鑒定不太可能對干擾素+利巴韋林產(chǎn)生應(yīng)答的HCV感染的對象。例如，具有異常高的GlcCer或LacCer去飽和指數(shù)(表示為24:1/24:0的比例)的HCV感染的患者(例如具有由未診斷的代謝綜合征導(dǎo)致的高胰島素血癥)較不可能對干擾素+利巴韋林產(chǎn)生應(yīng)答，且可能需要使用新批準的藥物進行更劇烈的治療(單獨或與彼此聯(lián)用或與干擾素+利巴韋林聯(lián)用)。類似地，這類患者比其他HCV感染的患者更可能對使用葡糖神經(jīng)酰胺合成酶的亞胺糖抑制劑的療法產(chǎn)生應(yīng)答，其通過改善組織(包括肝)中的胰島素靈敏度來減少高胰島素血癥。通過確保丙型肝炎患者接受其更可能產(chǎn)生應(yīng)答的藥物，患者可因此受益并降低治療成本。

雖然血液VLDL甘油三酯中棕櫚油酸16:1/16:0的去飽和指數(shù)已被提出用作代謝疾病的標志物(Peter,Cegan等2009)，即在代謝綜合征中升高，該標志物策略無法預(yù)測本發(fā)明鑒定的葡糖神經(jīng)酰胺去飽和指數(shù)的具體值，其憑借堅定(adamantly)化合物AMP-DNJ/AMP-DNM反映的亞胺糖的胰島素致敏作用而與胰島素敏感性特別相關(guān)，其表明葡糖神經(jīng)酰胺涉及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。此外，這些結(jié)果可顯示，16:1/16:0比例(不同于葡糖神經(jīng)酰胺的去飽和指數(shù))傾向于在受感染的細胞中降低，其中HCV感染降低該比例(至少在受感染細胞的全局性脂肪酸概況的情況中)，限制其在HCV感染的情況下用作代謝疾病的標志物。

診斷測試的實施

血液含有若干不同的脂蛋白形式，其中一些在攝入食物后隨時間動態(tài)變化。例如，脂肪以乳糜微粒的形式被吸收，其在餐后最高且在進食后相當(dāng)迅速地小時(六小時內(nèi))。這些乳糜微粒主要含有膳食脂肪且包含甘油三酯、甘油二酯、膽固醇酯、游離膽固醇、磷脂和游離脂肪酸。相反地，VLDL是肝的產(chǎn)物且含有重建和重新包裝的甘油三酯和膽固醇酯以及表面磷脂，根據(jù)發(fā)明人的假說，這些物質(zhì)都會受到HCV感染對細胞脂質(zhì)代謝的代謝作用的影響。雖然對于一些經(jīng)鑒定適用于評估HCV對肝細胞代謝影響的多種脂質(zhì)生物標志物而言，其血漿中的測量易于被乳糜微粒形式的膳食脂質(zhì)的不同背景混淆，但在禁食或餐后狀態(tài)的未分級的血漿中測量時一些經(jīng)鑒定的標志物(如C54:6-C18:1甘油三酯(感染后升高96倍))仍是有用的。此外，人血漿的全局性脂肪酸概況的最新研究顯示多種脂肪酸種類的豐度被控制在狹窄的限制內(nèi)(Lamaziere,Wolf等2012)，表明背景膳食波動對于本文所述丙型肝炎的脂質(zhì)分子概況生物標志物的作用不會嚴重到使其無法用作HCV感染的代謝影響的生物標志物，但應(yīng)理解對于生物標志物目的而言，血漿的直接全局性脂肪酸概況的可用性有限(Flowers 2009)。然而，對于膳食血漿脂質(zhì)中動態(tài)變化的混淆作用，存在至少兩種解決方案。

在禁食環(huán)境下，VLDL是血液中甘油三酯的主要脂蛋白儲庫(Flowers 2009；Peter,Cegan等2009)。因此，在禁食環(huán)境下，血漿甘油三酯組成可與VLDL甘油三酯組成相當(dāng)。因此，至少相對于本文中特征為指示HCV感染對肝代謝作用的甘油三酯分子種類概況而言，可預(yù)期在禁食狀態(tài)中未分級血漿的分析可適用于本發(fā)明所述的生物標志物目的。

背景膳食脂質(zhì)的混淆問題的第二解決方案是通過合適的分離技術(shù)從血液中分離VLDL，例如密度梯度超速離心或通過色譜方法。同樣地(在甘油三酯的情況下)從血漿中純化甘油三酯可通過薄層色譜或HPLC實現(xiàn)。用于從人血漿中分離VLDL和甘油三酯部分的合適方法參見例如Peter等2009。

對于測量葡糖神經(jīng)酰胺的去飽和指數(shù)(24:1/24:0)，應(yīng)理解對于上文所述其他標志物(例如特別是甘油三酯種類)而言，VLDL(其來源于肝)也是適當(dāng)?shù)拇治鲅褐鞍?。然而，?yīng)理解，在循環(huán)的鞘脂中鞘磷脂的豐度比葡糖神經(jīng)酰胺高得多(Hammad,Pierce等2010)。除測量VLDL中葡糖神經(jīng)酰胺的去飽和以外，還可容易或更敏感地測量鞘磷脂的24:1/24:0去飽和指數(shù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該指數(shù)受到亞胺糖的影響，影響方式類似于葡糖神經(jīng)酰胺與去飽和指數(shù)。

材料和方法

Huh7.5和Jc1 HCV細胞培養(yǎng)：人肝癌細胞中可復(fù)制型HCV的細胞培養(yǎng)方法基本如先前所述(Pollock,Nichita等2010)。Huh7.5細胞(阿帕斯公司(Apath,LLC))生長于附加有100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、1x MEM和10％FBS的DMEM中。所有孵育都在37℃/5％CO₂下進行。對未感染和HCVcc感染的細胞測定亞胺糖處理對于細胞脂質(zhì)概況的作用。為使用HCV毒株Jc1(基因型2a)感染細胞，使用已知效價的病毒儲液以感染復(fù)數(shù)(MOI)＝0.02在病毒存在的情況下將Huh7.5細胞孵育1小時。將細胞傳代約2周以允許感染達到接近100％細胞(通過HCV核心蛋白質(zhì)免疫熒光測定)，從而避免部分感染的培養(yǎng)物中未感染的細胞稀釋‘感染的’脂質(zhì)組學(xué)特征。隨后在亞胺糖存在或不存在的情況下將HCV感染和未感染的細胞孵育4天，此時使用胰蛋白酶/EDTA收獲，在冰冷的PBS中清洗3次，使用臺盼藍染色計數(shù)，并在脂質(zhì)概況分析前將最終的細胞沉淀重懸于甲醇:丙酮(體積1:1)中。使用Bradford蛋白質(zhì)測定試驗(伯樂公司(Bio-Rad))將小體積的各樣品用于總蛋白質(zhì)估計。

脂質(zhì)組學(xué)方法

“總脂質(zhì)”脂肪酸概況：先前已描述了通過GCMS進行“總脂質(zhì)”FA測量的方法(Wolf 2008；Quinn,Rainteau等2009)。簡言之，使用Bligh和Dyer的方法(Bligh和Dyer 1959)用氯仿萃取經(jīng)培養(yǎng)肝癌Huh7.5細胞的沉淀。簡言之，向沉淀的經(jīng)培養(yǎng)肝癌Huh7.5細胞的氯仿脂質(zhì)提取物中添加十七烷酸作為內(nèi)部標準品。將溶劑提取物真空干燥并使用甲醇/H₂SO₄(18N,2％v/v)對干脂質(zhì)膜在70℃下轉(zhuǎn)甲基化1小時。惰性氮氣/氬氣氣氛，并添加丁基化羥基甲苯(BHT)作為抗氧化劑。特氟隆密封的一次性玻璃管用于最小化多不飽和脂肪酸的過氧化。冷卻后，加入水(1/2:v/v)并將FA甲基酯(FAME)萃取至己烷。在氮氣流下濃縮己烷提取物并轉(zhuǎn)移至配備200μl玻璃插件的自動進樣器中(Agilent 5975；91940雷祖里，法國)。在GCMS儀器的無分流模式中注射1μl的等分試樣(Agilent 5975；91940雷祖里，法國)。在極性結(jié)合的聚乙二醇毛細管柱(Omegawax；西格瑪-奧德里奇公司，L'Isle d'Abeau Chesnes 38297圣屈昂坦法拉維耶，法國(Saint-Quentin Fallavier,France))上分離不飽和的FAME異構(gòu)體(ω雙鍵位置位于n3、n6、n7、n9)。使用氨作為試劑氣體在化學(xué)離子化模式中測試加合物(FAME+NH⁺₄)(約10^-4托，源溫度約100℃)。相對于內(nèi)部標準品(十七烷酸)進行標準化并使用Ponderal校準混合物(Mix-37，色譜科(Supelco)-西格瑪-奧德里奇公司，L'Isle d'Abeau Chesnes 38297圣屈昂坦法拉維耶，法國)校準應(yīng)答常數(shù)后通過峰面積積分來進行定量。

總膽固醇(GCMS)：將總(酯化和非酯化)膽固醇和固醇代謝物衍生化為三甲基甲硅烷醚并通過GCMS進行概況分析(參見Chevy,Illien等2002；Chevy,Humbert等2005)。簡言之，向脂質(zhì)氯仿提取物中添加d7-氯仿(阿凡提極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids)，脂質(zhì)MS標準品，阿拉巴斯特，阿拉巴馬州35007)和表糞甾醇(epicoprostanol)(西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))作為內(nèi)部標準品。在進行上文所述脂肪酸轉(zhuǎn)甲基化以進行FAME制備后，在氮氣流下干燥己烷提取物。使用0.5ml BSTFA(N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺)和TMCS 1％(三甲基氯硅烷)(Supelco，西格瑪-奧德里奇公司，38297圣屈昂坦法拉維耶)對固醇在60℃下甲硅烷基化60分鐘。蒸發(fā)過量的試劑并將甲硅烷基化固醇溶解在己烷中用于GC注射。在中等極性連接的二苯基-二甲基-聚硅氧烷毛細管柱(RTX50；RF公司(Restek France)，利塞法國9109)上在200-250℃下分離膽固醇和代謝物。通過正模式中特征性離子片段的峰積分來實現(xiàn)相對于Ponderal校準混合物的檢測和定量(電子沖擊能量70eV)。

LCMS2脂質(zhì)組學(xué)測量：先前已在方法綜述中詳細描述了LCMS2方法(Ivanova,Milne等2007；Myers,Ivanova等2011)。簡言之，從沉淀的Huh7.5細胞中制備磷脂氯仿提取物。向提取物中加入內(nèi)部脂質(zhì)標準品的混合物(阿凡提極性脂質(zhì)公司，脂質(zhì)MAPS MS標準品，阿拉巴斯特，阿拉巴馬州35007)。在聚乙烯醇官能化的二氧化硅柱(PVASil，YMC，ID 4mm，長度250mm，英特奇姆公司(Interchim)，蒙特呂松03100，法國)上通過HPLC(Agilent 1200系列)分離各脂質(zhì)類別。較少的極性脂質(zhì)(甘油三酯、甘油二酯、膽固醇酯、神經(jīng)酰胺、葡糖神經(jīng)酰胺和乳糖神經(jīng)酰胺)在5-15分鐘之間通過溶劑系統(tǒng)己烷/異丙醇/水乙酸銨10mM(40/58/2v/v)洗脫。隨后通過溶劑己烷/異丙醇/水乙酸銨10mM(40/50/10v/v)洗脫磷脂，其以以下順序在15-60分鐘時以極性遞增的函數(shù)形式洗脫：磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿、鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿。洗脫的脂質(zhì)傳輸至波譜儀的電噴射界面(圖波離子公司(TurboIon)，弗雷明漢，馬薩諸塞州01701，美國)。以正模式進行脂質(zhì)離子化以檢測M+NH₄⁺和M+H⁺。將源與以“碰撞誘導(dǎo)解離”模式(或“前體”模式)運行的三重四極質(zhì)譜儀(API3000，ABSciex公司，加拿大多倫多)偶聯(lián)以監(jiān)測連續(xù)洗脫的脂質(zhì)類別的特征性片段離子。使用軟件LIMSA在制備用于培養(yǎng)的肝癌細胞的文庫中鑒定特征性片段離子的前體分子種類(Haimi,Chaithanya等2009)。在鑒定脂質(zhì)的分子種類時，制備離子對(前體/產(chǎn)物離子)的列表以通過多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)來定量。相應(yīng)的MEM峰經(jīng)時間積分。相對于適當(dāng)脂質(zhì)類型標準品計算脂質(zhì)含量，假定該類別中所有分子種類的應(yīng)答常數(shù)相等。

統(tǒng)計方法：使用軟件(2011.2版；插件軟件公司(Addinsoft)，法國)進行比較脂質(zhì)和脂肪酸概況的統(tǒng)計方法。如詳述的那樣進行參數(shù)測試、多變量分析、關(guān)聯(lián)測試和回歸分析(Golmard 2012)。

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雖然前文描述了具體優(yōu)選的實施方式，應(yīng)理解本發(fā)明不限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對公開的實施方式進行多種修改且這類修改旨在包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

說明書中引用的所有出版物、專利申請和專利都通過全文引用納入本文。