本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及NRF2激活子。

背景技術(shù)：

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，NRF2)通路是癌癥化學(xué)預(yù)防的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。在癌癥發(fā)展的過(guò)程中，NRF2通路通過(guò)致癌物質(zhì)、具有化學(xué)預(yù)防作用的化合物等的誘導(dǎo)而被激活，從而誘導(dǎo)NQO1、γ-GCS、GSTs、HO-1等II相解毒酶的合成，起到抗氧化、抗炎、解毒等作用，繼而保護(hù)細(xì)胞。大量研究表明，NRF2的激活對(duì)多種疾病的預(yù)防有重要作用，如癌癥、神經(jīng)組織退化性疾病、心血管疾病、缺血、糖尿病、肺纖維化、以及炎癥等。

就癌癥而言，II相代謝酶可以催化結(jié)合或減少I(mǎi)相代謝反應(yīng)產(chǎn)生的代謝物，從而減少致癌物質(zhì)的產(chǎn)生。II相酶的基因表達(dá)是通過(guò)其DNA上順式反應(yīng)元件(ARE)進(jìn)行調(diào)控的?；瘜W(xué)致癌物的致癌性可以通過(guò)一些親電子的化合物的親電作用而被抑制，通常這些親電化合物就被叫作“化學(xué)預(yù)防劑”。這些親電化合物可以誘導(dǎo)II相解毒酶，使細(xì)胞能夠解毒并除去這些化學(xué)致癌物從而保護(hù)細(xì)胞。而通過(guò)ARE來(lái)調(diào)控這些基因正是轉(zhuǎn)錄因子NRF2的職責(zé)。正常情況下，NRF2存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并通過(guò)泛素-26S蛋白酶體通路迅速被降解，處于抑制狀態(tài)，Keap1在此過(guò)程中作為Cul3依賴的E3泛素連接酶的底物適配器，以NRF2上賴氨酸殘基的Neh2結(jié)構(gòu)域作為靶點(diǎn)，從而完成與泛素的結(jié)合。當(dāng)受到活性氧、親電子物質(zhì)或者上游信號(hào)通路——促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的刺激后，NRF2會(huì)脫離Keap1并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，繼而與肌腱纖維瘤蛋白肌腱纖維瘤蛋白(muscle aponeurotic fibrosarcoma protein,Maf)以異二聚體的形式結(jié)合，此二聚體再與下游基因的ARE結(jié)合，從而使II相解毒酶、氧化還原酶類(lèi)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等NRF2的下游基因增多，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。因此，作為NRF2激活子的化合物，可以通過(guò)調(diào)控NRF2通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)，起到對(duì)癌癥的治療和預(yù)防作用。

另一方面，NRF2的激活還可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減少自由基或化學(xué)致癌原對(duì)細(xì)胞的損傷。從而NRF2激活子可預(yù)防或延緩氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

現(xiàn)有技術(shù)中已知有若干可調(diào)節(jié)NRF2通路的化合物，在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中至少存在如下問(wèn)題：

1、美國(guó)雅培公司研發(fā)的bardoxolone被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑及解毒酶的重要調(diào)節(jié)子，并能抑制主要的炎癥基因調(diào)節(jié)器NFkB，旨在激活NRF2通路，被開(kāi)發(fā)用于 慢性腎病及糖尿病治療，但由于特異性過(guò)低并且能與多種蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生了過(guò)量的嚴(yán)重不良事件及死亡，最終止步于Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

2、現(xiàn)在許多研究也發(fā)現(xiàn)了一些NRF2化學(xué)誘導(dǎo)子，如brusatol,ascorbic acid(抗壞血酸),luteolin(木犀草素),ochratoxin A(赭曲霉素A),trigonellin(胡蘆巴堿),all-trans retinoic acid(全反式維甲酸)、Sulforaphane(蘿卜硫素)等，但是它們的有效性仍不令人滿意甚至產(chǎn)生毒性，并且它們的作用機(jī)理也并不完全清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種有效的、低毒的、作用機(jī)理清楚的可調(diào)節(jié)NRF2通路的誘導(dǎo)劑或藥物。

發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期的探索和嘗試，以及多次的實(shí)驗(yàn)和努力，不斷的改革創(chuàng)新，為解決以上技術(shù)問(wèn)題，提供更有效的NRF2誘導(dǎo)劑，從而可制備用于治療和預(yù)防與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病的藥物或食品，包括保健品。

具體的說(shuō)，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，首先提供一種NRF2激活子化合物，該化合物為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。

本發(fā)明中所述的化合物結(jié)構(gòu)式如下：

中文名稱：白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，

英文名稱：2-Atractylenolide，

分子式：C₁₅H₂0O₂，

分子量：232.32，

CAS號(hào)：73069-14-4。

本發(fā)明還提供了一種藥物，該藥物是治療和預(yù)防與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病的藥物，包括組分白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。

根據(jù)本發(fā)明所述藥物的一個(gè)實(shí)施方式，所述與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病為神經(jīng)組織退化 性疾病、心血管疾病、缺血、糖尿病、肺纖維化、炎癥、癌癥中的任一種。

根據(jù)本發(fā)明所述藥物的一個(gè)實(shí)施方式，所述與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病為乳腺癌。

根據(jù)本發(fā)明所述藥物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥物為口服溶液，所述口服溶液包括白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和用于溶解白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的溶劑。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，能夠?qū)⒈景l(fā)明所述白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ還可以配制成其他適合的藥物制劑的形式，藥學(xué)上可被接受的載體和/或賦形劑均可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行合理選擇。

根據(jù)本發(fā)明所述藥物的一個(gè)實(shí)施方式，所述乳劑各組分及其質(zhì)量百分比分別為：15％-25％聚氧乙烯蓖麻油、5％-15％乙醇、5％-15％吐溫80、50％-70％水。

本發(fā)明還提供了一種白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的新用途，用于制備治療或防治與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病的藥物或食品。

根據(jù)本發(fā)明所述白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的新用途的一個(gè)實(shí)施方式，所述與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病為癌癥。

根據(jù)本發(fā)明所述白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的新用途的一個(gè)實(shí)施方式，所述與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病為乳腺癌。

根據(jù)本發(fā)明所述白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的新用途的一個(gè)實(shí)施方式，所述與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病是與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：

a)經(jīng)過(guò)發(fā)明人大量探索研究，試驗(yàn)和篩選了多種化合物，意外地發(fā)現(xiàn)：白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ可作為有效的NRF2誘導(dǎo)劑。

b)實(shí)驗(yàn)證明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能夠用于治療和預(yù)防與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病的藥物中。特別是通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)θ橄侔┘?xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

c)與NFR2通路調(diào)控相關(guān)的疾病有：神經(jīng)組織退化性疾病、心血管疾病、缺血、糖尿病、肺纖維化、以及炎癥、癌癥，更具體的，所述癌癥為乳腺癌。

d)正常情況下，Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并通過(guò)泛素-26S蛋白酶體通路迅速被降解，處于抑制狀態(tài)。Keap1在此過(guò)程中作為Cul3依賴的E3泛素連接酶的底物適配器，以Nrf2上賴氨酸殘基的Neh2結(jié)構(gòu)域作為靶點(diǎn)，從而完成與泛素的結(jié)合。當(dāng)受到活性氧、親電子物質(zhì)或者上游信號(hào)通路——促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的刺激后，Nrf2會(huì)脫離Keap1并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，繼而與肌腱纖維瘤蛋白(muscle aponemuscle fibrosarcoma protein,Maf)以異二聚體的形式結(jié)合，此二聚體再與下游基因的ARE結(jié)合，從 而使II相解毒酶、氧化還原酶類(lèi)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等Nrf2的下游基因增多，這些酶的增加能夠減少對(duì)細(xì)胞有害的活性氧、毒素以及致癌劑等，從而起到保護(hù)作用。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施方式的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施方式中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1是白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)CF 10A乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用趨勢(shì)分析圖。。

圖2-1-1是不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)和陽(yáng)性對(duì)照藥物(姜黃素，CUR)作用于MCF 10A細(xì)胞48h后，對(duì)MCF 10A細(xì)胞中KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1的mRNA水平影響的電泳圖。

圖2-1-2是不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)和陽(yáng)性對(duì)照藥物(姜黃素，CUR)作用于MCF 10A細(xì)胞48h后，對(duì)MCF 10A細(xì)胞中KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1的mRNA水平影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。

圖2-2-1是50μM白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)和20μM陽(yáng)性對(duì)照藥物(姜黃素，CUR)處理24h、48h和72h后，對(duì)MCF-10A細(xì)胞Keap1、NRF2、HO-1和NQO1mRNA水平影響的電泳圖。

圖2-2-2是50μM白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)和20μM陽(yáng)性對(duì)照藥物(姜黃素，CUR)處理24h、48h和72h后，對(duì)MCF-10A細(xì)胞Keap1、NRF2、HO-1和NQO1mRNA水平影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。

圖3-1-1是不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)和陽(yáng)性對(duì)照20μM CUR(姜黃素，CUR)作用于MCF 10A細(xì)胞48h后，對(duì)MCF 10A細(xì)胞中KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)的電泳圖。

圖3-1-2是不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)和陽(yáng)性對(duì)照20μM CUR(姜黃素，CUR)作用于MCF 10A細(xì)胞48h后，對(duì)MCF 10A細(xì)胞中KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。

圖3-2-1是50μM白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)在不同處理時(shí)間對(duì)MCF 10A細(xì)胞中KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)影響的電泳圖。

圖3-2-2是50μM白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(At-Ⅱ)在不同處理時(shí)間對(duì)MCF 10A細(xì)胞中KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean± S.D.)表示，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。

圖3-3-1是不同濃度白術(shù)內(nèi)酯II(At-II)處理不同時(shí)間后在MCF-7細(xì)胞中對(duì)NRF2和NQO1蛋白表達(dá)影響的電泳圖。

圖3-3-2是不同濃度白術(shù)內(nèi)酯II(At-II)處理不同時(shí)間后在MCF-7細(xì)胞中對(duì)NRF2和NQO1蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，n＝3。

圖3-4-1是不同濃度白術(shù)內(nèi)酯II(At-II)處理不同時(shí)間在MDA-MB-231細(xì)胞中對(duì)NRF2和NQO1蛋白表達(dá)影響的電泳圖。

圖3-4-2是不同濃度白術(shù)內(nèi)酯II(At-II)處理不同時(shí)間在MDA-MB-231細(xì)胞中對(duì)NRF2和NQO1蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，n＝3。

圖3-5是不同濃度白術(shù)內(nèi)酯II(A)處理不同時(shí)間后在MCF-7細(xì)胞內(nèi)對(duì)NQO1活性影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，n＝3。

圖3-6是不同濃度白術(shù)內(nèi)酯II(A)處理不同時(shí)間后在MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)對(duì)NQO1活性影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)表示，*P<0.05，n＝3。

圖4-1-1是NC-shRNA轉(zhuǎn)染的MCF MCF-10A細(xì)胞在At-II和陽(yáng)性對(duì)照CUR預(yù)處理或不預(yù)處理的情況下，于含雌二醇的空白軟瓊脂或含藥物和雌二醇的軟瓊脂中生長(zhǎng)21天對(duì)MCF-10A細(xì)胞E2-誘導(dǎo)惡變影響的照片。

圖4-1-2是NC-shRNA轉(zhuǎn)染的MCF MCF-10A細(xì)胞在At-II和陽(yáng)性對(duì)照CUR預(yù)處理或不預(yù)處理的情況下，于含雌二醇的空白軟瓊脂或含藥物和雌二醇的軟瓊脂中生長(zhǎng)21天對(duì)MCF-10A細(xì)胞E2-誘導(dǎo)惡變影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。±SD，n＝3；##，與對(duì)照組相比P<0.01；*，與E2-處理組相比P<0.05；**，與E2-處理組相比P<0.01。

圖4-2-1是NRF2-shRNA轉(zhuǎn)染的MCF 10A細(xì)胞在At-II和陽(yáng)性對(duì)照CUR預(yù)處理或不預(yù)處理的情況下，于含雌二醇的空白軟瓊脂或含藥物和雌二醇的軟瓊脂中生長(zhǎng)21天對(duì)MCF-10A細(xì)胞E2-誘導(dǎo)惡變影響的照片。

圖4-2-2是NRF2-shRNA轉(zhuǎn)染的MCF 10A細(xì)胞在At-II和陽(yáng)性對(duì)照CUR預(yù)處理或不預(yù)處理的情況下，于含雌二醇的空白軟瓊脂或含藥物和雌二醇的軟瓊脂中生長(zhǎng)21天對(duì)MCF-10A細(xì)胞E2-誘導(dǎo)惡變影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖?！繱D，n＝3；##，與對(duì)照組相比P<0.01；*，與E2-處理組相比P<0.05；**，與E2-處理組相比P<0.01。

圖5是白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)裸鼠的MDA-MB-231異位移植瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。n＝3。

圖6是對(duì)照組和白術(shù)內(nèi)酯II組裸鼠皮下接種MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞后的體重情況的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖。n＝3。

圖7-1是灌胃白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)裸鼠MDA-MB-231移植物的腫瘤大小對(duì)比照片。

圖7-2是灌胃白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)裸鼠MDA-MB-231移植物的腫瘤腫瘤數(shù)據(jù)處理結(jié)果圖。

圖8是經(jīng)蘇木紅-伊紅(H&E)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的形態(tài)學(xué)變化及NRF2和NQO1蛋白量變化結(jié)果對(duì)比照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。

為使本發(fā)明實(shí)施方式的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施方式中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施方式是本發(fā)明一部分實(shí)施方式，而不是全部的實(shí)施方式?；诒景l(fā)明中的實(shí)施方式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施方式，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。因此，以下對(duì)在附圖中提供的本發(fā)明的實(shí)施方式的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施方式。

制備實(shí)施例

化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(來(lái)自市售，純度>98％)。用乳劑(配方：20％聚氧乙烯蓖麻油、10％乙醇、10％吐溫80、60％水)溶解制成口服溶液。

生物活性實(shí)施例

化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)RF2通路的調(diào)控作用

發(fā)明人將pARE-TI-熒光素酶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)染后的HepG2-ARE-C8細(xì)胞，建立起穩(wěn)定的細(xì)胞系，用以進(jìn)行ARE(antioxidant responsive element,抗氧化反應(yīng)元件)熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能夠明顯激活熒光素酶基因的表達(dá)。當(dāng)具有誘導(dǎo)NRF2功能的藥物刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的NRF2將與Keap1解偶聯(lián)，之后進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識(shí)別并結(jié)合上述下游基因的ARE繼而啟動(dòng)ARE調(diào)控的下游基因，提高Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。所以，ARE熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法能快速簡(jiǎn)便的確定被測(cè)物質(zhì)是否具有調(diào)控Keap1-NRF2-ARE通路的活性。因此本發(fā)明中的化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能夠明顯激活熒光素酶基因的表達(dá)，這一結(jié)果說(shuō)明此化合物是NRF2的激活子。

具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

將pARE-TI-熒光素酶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心ATCC)，得到轉(zhuǎn)染后的HepG2-ARE-C8細(xì)胞用以進(jìn)行ARE熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)。將HepG2-C8細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于不同細(xì)胞培養(yǎng)皿，按照常規(guī)條件培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)處理后，利用熒光素酶實(shí)驗(yàn) 試劑盒(Promega，Madison)測(cè)定HepG2-C8細(xì)胞中的ARE熒光素酶活性，并以BCA試劑盒測(cè)定的蛋白濃度對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行校準(zhǔn)。經(jīng)48h處理后，100μM白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ使HepG2-C8細(xì)胞中的ARE熒光素酶活性升至空白對(duì)照組的3倍?？梢?jiàn)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能夠明顯誘導(dǎo)HepG2-C8細(xì)胞中的ARE熒光素酶的活性。因此，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ具有調(diào)控NRF2通路的作用，是有效的NRF2通路激活劑，從而有希望作為癌癥的治療劑和化學(xué)預(yù)防劑。

(1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

發(fā)明人從細(xì)胞水平上證明了此化合物是NRF2的激活子，以人乳腺癌MCF-10A細(xì)胞為例，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)ι鲜霭┘?xì)胞具有明顯生長(zhǎng)抑制作用。并進(jìn)一步證明了該化合物可升高M(jìn)CF-10A細(xì)胞中的NRF2mRNA水平、可誘導(dǎo)細(xì)胞中的NRF2與NQO1蛋白水平。發(fā)明人還通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)考察化合物對(duì)17β-雌二醇(E2)對(duì)MCF-10A細(xì)胞致癌作用的影響。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)(Soft agar assay)是利用細(xì)菌瓊脂粉將細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w的“果凍”狀態(tài)用以培養(yǎng)細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中，正常細(xì)胞仍停留在接種時(shí)的狀態(tài)，幾乎不進(jìn)行增殖，但已轉(zhuǎn)化(癌變)的細(xì)胞則以半浮游狀態(tài)增殖，而形成菌落。在長(zhǎng)時(shí)間的致癌劑E2誘導(dǎo)后，癌變的MCF-10A細(xì)胞可以在軟瓊脂中具有形成集落的能力，而正常的MCF-10A細(xì)胞則不具備此能力。通過(guò)癌癥化學(xué)預(yù)防藥物的處理，癌變的MCF-10A的集落形成能力會(huì)下降，相應(yīng)的集落個(gè)數(shù)也會(huì)下降。因此，MCF-10A的軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)是考察藥物化學(xué)預(yù)防能力的經(jīng)典理想體外模型。結(jié)果顯示化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ能明顯抑制E2誘導(dǎo)的MCF-10A細(xì)胞成簇能力，表明該化合物對(duì)E2誘導(dǎo)的MCF-10A細(xì)胞癌變具有明顯抑制作用。

具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

①對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用：

采用SRB(Sulforhodamine B)比色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，SRB是一種粉紅色陰離子染料，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合，在560nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細(xì)胞量成線性正相關(guān)，故可用作細(xì)胞數(shù)的定量檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)MCF 10A乳腺癌細(xì)胞具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，且該抑制作用具有時(shí)間、濃度依賴性，通過(guò)計(jì)算可得其處理24h、48h和72h的IC50值分別為903μM、512μM和437μM。

②對(duì)乳腺癌細(xì)胞中NRF2相關(guān)基因mRNA的表達(dá)的作用：

采用RT-PCR法進(jìn)行mRNA的表達(dá)的定量，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，可將提得的RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的DNA，再以此為模板放大擴(kuò)增DNA，進(jìn)行生物體外的特殊DNA復(fù)制，從而利用瓊脂糖凝膠起到半定量的作用。最后使用ImageJ軟件對(duì)得到的DNA條帶進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2-1-1和2-1-2所示，50μM、100μM白術(shù)內(nèi)酯 Ⅱ和陽(yáng)性對(duì)照藥物20μM CUR(姜黃素)均能顯著上調(diào)NRF2、HO-1、NQO1的mRNA水平(P<0.05)；并且如圖2-2-1和圖2-2-2所示，50μM白術(shù)內(nèi)酯II(At-II)處理48h和72h均能顯著上調(diào)NRF2、HO-1、NQO1的mRNA水平(P<0.05)，其中At-II處理72h對(duì)NRF2的mRNA水平的上調(diào)作用大于48h。

③對(duì)乳腺癌細(xì)胞中KEAP1-NRF2-ARE信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響：

利用Western Blot方法研究五種化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞中NRF2與NQO1蛋白水平的影響。NQO1是NRF2眾多下游基因中的一種，NRF2可通過(guò)與其啟動(dòng)子上ARE序列的結(jié)合從而調(diào)控其表達(dá)。NQO1的調(diào)控是通過(guò)ARE介導(dǎo)的，能夠結(jié)合ARE序列的物質(zhì)便能夠調(diào)控NQO1的表達(dá)，而比起其他的ARE調(diào)控劑(例如Nrf1、Maf等)hNQO1的ARE序列更加接近NRF2。因此，NQO1是NRF2非常重要的一種下游基因，藥物對(duì)其蛋白水平的影響可以提示藥物對(duì)NQO1還原酶的激活能力，并從側(cè)面顯示出藥物對(duì)NRF2結(jié)合下游靶基因的ARE的功能的影響。Western Blot即蛋白免疫印跡法，是分子生物學(xué)中常用的實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞樣品進(jìn)行著色，再分析著色的位置和著色深度，來(lái)定性、定量的獲得蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)情況。NQO1酶活性實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞質(zhì)中DCPIP的雙香豆素抑制基團(tuán)的減少來(lái)表示NQO1的活性。結(jié)果如圖3-1-1和3-1-2所示，與空白組相比，50μM、100μM At-II和陽(yáng)性對(duì)照20μM CUR均能顯著上調(diào)MCF-10A乳腺癌細(xì)胞中NRF2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)(P<0.05)，其中50μM At-II對(duì)NRF2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用大于100μM At-II。結(jié)果如圖3-2-1和3-2-2所示，50μM At-II處理24h、48h和72h均能顯著上調(diào)MCF-10A乳腺癌細(xì)胞中NRF2、HO-1的蛋白表達(dá)(P<0.05)，處理48h和72h能顯著上調(diào)NQO1的蛋白表達(dá)(P<0.05)，其中At-II處理48h和72h對(duì)NRF2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用大于24h，48h和72h的作用相當(dāng)。并且如圖3-3-1、3-3-2和圖3-4-1、3-4-2所示，適宜的濃度及處理時(shí)間均能顯著上調(diào)MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中NRF2、NQO1的蛋白表達(dá)(P<0.05)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適宜的濃度及處理時(shí)間均能顯著增加MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中NQO1的活性(P<0.05)，結(jié)果如圖3-5和圖3-6所示。

以上結(jié)果從蛋白水平上得到更加直觀的NRF2通路誘導(dǎo)結(jié)果，更加進(jìn)一步確證了ARE熒光素酶與RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

④對(duì)E2誘導(dǎo)的MCF-10A細(xì)胞癌變的抑制作用

通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)考察白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)MCF-10A細(xì)胞的3D生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖4-1-1、4-1-2和圖4-2-1、4-2-2所示，At-II的預(yù)處理或長(zhǎng)期給藥能抑制MCF 10A細(xì)胞的癌變，并且其抑制作用是NRF2依賴性的。

此實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證了此化合物對(duì)癌癥的發(fā)生具有化學(xué)預(yù)防作用。

(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

發(fā)明人在動(dòng)物水平上，再次證明了化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ可激活NRF2依賴的抗氧化防衛(wèi)通路，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

發(fā)明人將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于裸鼠，并同時(shí)灌胃給予化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，從體內(nèi)考察它們的化學(xué)預(yù)防作用，結(jié)果顯示化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)DA-MB-231異種移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。

具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：

化合物白術(shù)內(nèi)酯II對(duì)接種于BALB/c裸鼠的MDA-MB-231異位移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。發(fā)明人將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞接種于裸鼠，并同時(shí)灌胃給予白術(shù)內(nèi)酯II，從體內(nèi)考察白術(shù)內(nèi)酯II的化學(xué)預(yù)防作用。腫瘤大小由游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，按照公式V＝L×W 2/2計(jì)算腫瘤體積，電子天平稱量腫瘤重量，經(jīng)蘇木紅-伊紅(H&E)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果如圖5、圖6、圖7-1、圖7-2和圖8所示，4mg/g白術(shù)內(nèi)酯II明顯抑制了MDA-MB-231異位移植瘤的生長(zhǎng)。接種于裸鼠的MDA-MB-231細(xì)胞有非常高的NRF2蛋白表達(dá)，其N(xiāo)QO1蛋白的量也較高。在近一個(gè)月的灌胃給予白術(shù)內(nèi)酯II后，乳腺組織中的NRF2與NQO1的蛋白量無(wú)明顯的變化。由此再次證實(shí)組合物在裸鼠上對(duì)此類(lèi)腫瘤具有化學(xué)預(yù)防作用。

總之，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，白術(shù)內(nèi)酯II在細(xì)胞水平上能明顯激活NRF2通路，有效地保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害，并且能預(yù)防E2誘導(dǎo)的MCF-10A細(xì)胞癌變，具有顯著的癌癥預(yù)防作用。在動(dòng)物身上，白術(shù)內(nèi)酯II能抑制裸鼠的MDA-MB-231異位移植瘤的生長(zhǎng)；作為NRF2誘導(dǎo)子，白術(shù)內(nèi)酯II也能預(yù)防和抑制與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)儆谝阎衔?，但發(fā)現(xiàn)其對(duì)NRF2通路的激活作用具有重大意義。白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ可以作為組分用于制備治療和預(yù)防與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病的藥物，或者保健品。特別是用于制備治療和預(yù)防癌癥的藥物中，例如乳腺癌。

本實(shí)施例中，治療和預(yù)防與NRF2通路調(diào)控有關(guān)的疾病的藥物制劑為口服溶液，所述口服溶液包括白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和用于溶解白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的溶劑。溶劑各組分及其質(zhì)量百分比分別為：15％-25％聚氧乙烯蓖麻油、5％-15％乙醇、5％-15％吐溫80、50％-70％水。優(yōu)選地，溶劑各組分及其質(zhì)量百分比分別為20％聚氧乙烯蓖麻油、10％乙醇、10％吐溫80、60％水。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，能夠?qū)⒈景l(fā)明所述白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ還可以配制成其他適合的藥物制劑的形式，藥學(xué)上可被接受的載體和/或賦形劑均可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行合理選擇。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。