本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，蜜環(huán)菌提取物在治療動(dòng)物糖尿病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的多發(fā)病，根據(jù)病因的不同，糖尿病可分為1型糖尿病(胰島素依賴型)、2型糖尿病(非胰島素依賴型)和妊娠糖尿病。隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，尤其是2型糖尿病。目前治療糖尿病的藥物，如胰島素、羅格列酮、阿卡波糖等，均具有不同程度的副作用，并且長(zhǎng)期注射這些藥物給患者帶來巨大的痛苦，因此研發(fā)一種口服降血糖藥物或者保健品迫在眉睫。蜜環(huán)菌(ArmillariamelleaP.Kumm)又名榛蘑，屬于擔(dān)子菌門，擔(dān)子菌綱，傘菌目，白蘑科，是一種在夏、秋季發(fā)生，能兼性寄生于多種木本和草本植物的食用菌。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何治療糖尿病。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了蜜環(huán)菌提取物在制備治療動(dòng)物糖尿病產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蜜環(huán)菌提取物在制備治療動(dòng)物糖尿病產(chǎn)品中的應(yīng)用中，所述蜜環(huán)菌提取物為蜜環(huán)菌水洗脫物、蜜環(huán)菌水提物、蜜環(huán)菌NaCl洗脫物或蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物；所述蜜環(huán)菌水提物按照包括如下D1)的方法制備：D1)用水提取蜜環(huán)菌，收集提取液，得到所述蜜環(huán)菌水提物；所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物按照包括如下D2)的方法制備：D2)利用木瓜蛋白酶和纖維素酶處理所述蜜環(huán)菌水提物，得到所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物；所述蜜環(huán)菌水洗脫物按照包括如下D3)的方法制備：D3)將所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物進(jìn)行DEAE-纖維素離子交換柱層析得到所述蜜環(huán)菌水洗脫物；所述DEAE-纖維素離子交換柱層析包括：用水洗脫，收集洗脫液，得到所述蜜環(huán)菌水洗脫物；所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物按照包括如下D4)的方法制備：D4)將所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物進(jìn)行DEAE-纖維素離子交換柱層析得到所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物；所述DEAE-纖維素離子交換柱層析包括：用水洗脫，然后用NaCl水溶液洗脫，收集洗脫液，除去所述洗脫液中的鹽得到所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物。上述應(yīng)用中，所述用水提取蜜環(huán)菌可在70-100℃下進(jìn)行。所述用水提取蜜環(huán)菌的提取時(shí)間可根據(jù)具體情況確定，具體可為2-8小時(shí)，如4小時(shí)。為充分提取所述蜜環(huán)菌，可先用水浸泡所述蜜環(huán)菌。所述浸泡的時(shí)間可根據(jù)具體情況確定，具體可為6-18小時(shí)，如12小時(shí)。上述應(yīng)用中，所述D1)可包括：D11)用水提取所述蜜環(huán)菌，收集提取液，得到蜜環(huán)菌水提物1；D12)利用乙醇水溶液提取所述蜜環(huán)菌水提物1，得到所述蜜環(huán)菌水提物。上述應(yīng)用中，步驟D12)具體可包括：向所述蜜環(huán)菌水提取物1中加入所述乙醇水溶液進(jìn)行提取，得到乙醇提取液；將所述乙醇提取液進(jìn)行離心，收集沉淀，得到所述蜜環(huán)菌水提物。上述應(yīng)用中，所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分比可為95％。所述D1)中所述乙醇水溶液與所述蜜環(huán)菌水提物1的體積比可為4:1。上述應(yīng)用中，所述木瓜蛋白酶、所述纖維素酶和所述蜜環(huán)菌水提物的配比可為0.4U:0.12U:100mg。其中，所述蜜環(huán)菌水提物的量可為將所述蜜環(huán)菌水提物干燥后的質(zhì)量。所述干燥可通過濃縮凍干進(jìn)行。上述應(yīng)用中，所述NaCl水溶液中NaCl的濃度可為0.4M。上述應(yīng)用中，所述蜜環(huán)菌可為蜜環(huán)菌子實(shí)體。為充分得到所述蜜環(huán)菌提取物，也可先將所述蜜環(huán)菌粉碎，然后按照上述方法提取所述蜜環(huán)菌。上述應(yīng)用中，所述木瓜蛋白酶和所述纖維素酶處理所述蜜環(huán)菌水提物的溫度可為45℃。所述木瓜蛋白酶和所述纖維素酶處理所述蜜環(huán)菌水提物的時(shí)間可為2小時(shí)。上述應(yīng)用中，步驟D4)中，除去所述洗脫液中的鹽可通過透析進(jìn)行。所述透析所用透析袋可為3500Da透析袋。所述透析所用透析液可為蒸餾水。上述應(yīng)用中，所述蜜環(huán)菌水洗脫物、所述蜜環(huán)菌水提物、所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物或所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物均可為液體、半固體或干燥后得到的固體。所述干燥可通過濃縮凍干進(jìn)行。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)面還提供了所述蜜環(huán)菌提取物在治療動(dòng)物糖尿病中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蜜環(huán)菌提取物的制備方法。本發(fā)明所提供的所述蜜環(huán)菌提取物的制備方法為下述M1)-M4)中的任一種：M1)所述蜜環(huán)菌提取物為所述蜜環(huán)菌水提物，所述蜜環(huán)菌水提物的制備方法所述D1)；M2)所述蜜環(huán)菌提取物為所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物，所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物的制備方法包括所述D2)；M3)所述蜜環(huán)菌提取物為所述蜜環(huán)菌水洗脫物，所述蜜環(huán)菌水洗脫物的制備方法包括所述D3)；M4)所述蜜環(huán)菌提取物為所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物，所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物的制備方法包括所述D4)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了由所述蜜環(huán)菌提取物的制備方法制備的蜜環(huán)菌提取物。所述蜜環(huán)菌提取物可為所述蜜環(huán)菌水洗脫物、所述蜜環(huán)菌水提物、所述蜜環(huán)菌NaCl洗脫物、所述蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物或所述蜜環(huán)菌水提物1。本發(fā)明中，所述動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物具體可為小鼠，如B6.BKS(D)-Leprdb/JNju小鼠。本發(fā)明中，所述糖尿病可為2型糖尿病。本發(fā)明中，所述產(chǎn)品可為藥物或保健食品。本發(fā)明中，治療糖尿病的效果可通過血糖水平來體現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的蜜環(huán)菌提取物可以治療糖尿?。菏┯昧嗣郗h(huán)菌水洗脫物的動(dòng)物血糖水平顯著低于未施用蜜環(huán)菌水洗脫物的動(dòng)物，施用了蜜環(huán)菌醇提物與蜜環(huán)菌NaCl洗脫物的動(dòng)物的血糖水平也出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明，可用本發(fā)明的蜜環(huán)菌提取物治療糖尿病。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的木瓜蛋白酶為biosharp產(chǎn)品，酶活為0.5U/mg；纖維素酶為sigma產(chǎn)品，酶活為0.3U/mg。下述實(shí)施例中的B6.BKS(D)-Leprdb/JNju小鼠為南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所產(chǎn)品，C57BL/6J小鼠為北京華阜康生物科技股份有限公司產(chǎn)品。實(shí)施例1、蜜環(huán)菌提取物可以降低小鼠血糖水平1、蜜環(huán)菌提取物的制備將500g蜜環(huán)菌(ArmillariamelleaP.Kumm)子實(shí)體利用12L蒸餾水浸泡過夜(12小時(shí))，得到混合物；將混合物于100℃孵育4h，利用300目紗布過濾，分別收集濾液(將該濾液稱為提取液1)和濾渣；向?yàn)V渣中加入10L蒸餾水，然后于100℃孵育3h，利用300目紗布過濾，收集濾液(將該濾液稱為提取液2)；合并提取液1和提取液2，得到混合提取液，將該混合提取液濃縮至2.5L得到蜜環(huán)菌水提物濃縮液，將該濃縮液稱為蜜環(huán)菌水提物1；向蜜環(huán)菌水提物1中加入是濃縮液4倍體積的95％(體積百分比)乙醇，靜置過夜，然后于4000rpm(3200RCF)離心15min，收集沉淀，干燥即得到蜜環(huán)菌水提物，將該蜜環(huán)菌水提物稱為蜜環(huán)菌水提物2；將8g蜜環(huán)菌水提物2溶于160ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)體系pH至6.5，得到溶液1；向溶液1中加入總質(zhì)量為64mg的木瓜蛋白酶和32mg纖維素酶，其中加入的木瓜蛋白酶和纖維素酶質(zhì)量比為2：1，使木瓜蛋白酶、纖維素酶和蜜環(huán)菌醇提物的配比為0.4U:0.12U:100mg)，于45℃孵育2h后，100℃加熱煮沸15min使酶失活，得到溶液2；將溶液2于4500rpm(4000RCF)下離心15min，收集上清液，將該上清液濃縮凍干即得到蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物；將蜜環(huán)菌酶解產(chǎn)物用水溶解，得到蜜環(huán)菌酶解液，將蜜環(huán)菌酶解液利用DEAE-纖維素離子交換柱進(jìn)行分級(jí)，所用DEAE-纖維素為上海恒試化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，該離子交換柱的柱體積為1000ml，具體操作方法如下：首先將DEAE-纖維素用蒸餾水浸泡3-7天至充分溶脹，擠壓除去水分，分別用0.5MNaOH水溶液和0.5MHCl水溶液處理1小時(shí)，用蒸餾水洗至pH值為7。將預(yù)處理過的DEAE-纖維素裝入體積為1000ml(9.8cm×30cm(直徑×高度))的玻璃層析柱中，得到DEAE-纖維素離子交換柱。將DEAE-纖維素離子交換柱分別利用蒸餾水、2MNaCl水溶液、蒸餾水以13ml/min的流速平衡2倍柱體積后，利用AgNO3水溶液(10mg/ml)定性測(cè)定層析柱流出液中是否含有NaCl以確定層析柱是否平衡好，以流出液中不含有NaCl為準(zhǔn)。將蜜環(huán)菌酶解液以13ml/min的流速勻速上樣，待樣品上完后，以相同流速13ml/min進(jìn)行洗脫：先用三倍柱體積的蒸餾水洗脫，收集洗脫液，將該洗脫液濃縮凍干即得到蜜環(huán)菌水洗脫物；再用兩倍柱體積的0.4MNaCl水溶液洗脫，收集洗脫液，將該洗脫液經(jīng)3500Da透析袋透析除鹽，透析液為蒸餾水，于室溫下透析24h,用AgNO3溶液(10mg/ml)定性檢測(cè)至無白色沉淀產(chǎn)生即不含NaCl為準(zhǔn)，即得到透析產(chǎn)物，將透析后產(chǎn)物濃縮凍干即得到蜜環(huán)菌NaCl洗脫物。2、蜜環(huán)菌提取物可以降低小鼠血糖水平將步驟1的蜜環(huán)菌水提物2溶于生理鹽水中，得到濃度為5mg/ml的蜜環(huán)菌水提物溶液；將蜜環(huán)菌水洗脫物溶于生理鹽水中，得到濃度為5mg/ml的蜜環(huán)菌水洗脫物溶液；將蜜環(huán)菌NaCl洗脫物溶于生理鹽水中，得到濃度為5mg/ml的蜜環(huán)菌NaCl洗脫物溶液。選取20只6周齡雄性B6.BKS(D)-Leprdb/JNju小鼠(25g)，將其隨機(jī)分為4組，即第A1組、第A2組、第A3組和第A4組，每組5只；選取20只6周齡雄性C57BL/6J小鼠(20g)，將其隨機(jī)分為4組，即第B1組、第B2組、第B3組和第B4組，每組5只，用作陰性對(duì)照；將這8組小鼠進(jìn)行以下處理：第A1組和第B1組：用蜜環(huán)菌水提物溶液以50mg/kg/d為劑量連續(xù)灌胃14天；第A2組和第B2組：用蜜環(huán)菌水洗脫物溶液以50mg/kg/d為劑量連續(xù)灌胃14天；第A3組和第B3組：用蜜環(huán)菌NaCl洗脫物溶液以50mg/kg/d為劑量連續(xù)灌胃14天；第A4組和第B4組：用生理鹽水以等體積連續(xù)灌胃14天。每天上午9點(diǎn)用血糖儀(強(qiáng)生，OneTouchUltraEasy)檢測(cè)各組小鼠的血糖(表1)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行ANOVA-oneway統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示蜜環(huán)菌水洗脫物可以顯著降低小鼠血糖水平。表1、蜜環(huán)菌提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響組別血糖(mg/dl)組別血糖(mg/dl)A1231.6±38.9B1147.6±18.0A2205.2±34.2*B2156.3±25.8A3288.0±20.1B3167.4±32.6A4425.4±45.2B4148.5±18.8表1中結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*表示與第A4組小鼠血糖相比差異達(dá)到顯著水平，p<0.05。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3