本發(fā)明涉及輔酶Q10微膠囊的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：：輔酶Q10(CoenzymeQ10，CoQ10)是一種生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物，化學(xué)名稱為2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基-1,4-苯醌，這種脂溶性抗氧化劑存在于細(xì)胞的線粒體中，是生物體內(nèi)最重要的抗氧化劑之一,輔酶Q10是人體內(nèi)產(chǎn)生能量的要素，存在于各臟器細(xì)胞膜中，能夠改進(jìn)心肌代謝、加強(qiáng)心臟功能；而且它的強(qiáng)抗氧化功能能保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基的破壞，提高機(jī)體的免疫力。隨著輔酶Q10在生物學(xué)方面的重要功能和保健作用的不斷被揭示，再加上其無(wú)毒性、無(wú)致畸作用和無(wú)明顯副作用的特點(diǎn)，近幾年在國(guó)際范圍內(nèi)，已被廣泛用于各類心臟病，糖尿病、帕金森癥等疾病的治療，并可預(yù)防動(dòng)脈硬化、中風(fēng)和高血壓，對(duì)心臟、肝臟和腎均有良好的保健作用，輔酶Q10的實(shí)際應(yīng)用范圍被不斷擴(kuò)大。輔酶Q10在歐美國(guó)家被廣泛地用于食品、化妝品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑等，我國(guó)現(xiàn)今市場(chǎng)上也有著各種相關(guān)的軟膠囊產(chǎn)品。輔酶Q10作為脂溶性的類維生素物質(zhì)，具備良好的生理功效，然而它的水不溶性卻使其在人體的消化吸收方面存在困難。另外，輔酶Q10結(jié)構(gòu)中存在醌基，對(duì)光和氧相當(dāng)敏感，暴露于光下容易分解。因此，如何提高輔酶Q10在水相介質(zhì)中的溶解性、貯藏穩(wěn)定性和生物利用度，成為其在生產(chǎn)和消費(fèi)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。將輔酶Q10制成微膠囊，可解決其水不溶性問(wèn)題，并改善其不穩(wěn)定性。在現(xiàn)今的眾多關(guān)于輔酶Q10的微膠囊化現(xiàn)有技術(shù)中，大部分都采用單一的乳化噴霧干燥法、噴霧凍結(jié)法等造粒方法，并且都或多或少的存在一些缺陷。中國(guó)專利CN200410040078.2《輔酶Q10微囊及其制備方法》中提到輔酶Q10微膠囊的制備方式，其中的溶劑或非溶劑法、噴霧凍結(jié)法、空氣懸浮法、界面縮聚法、輻射化學(xué)法等都會(huì)涉及到一些溶劑、非溶劑的殘留或者是造粒方法對(duì)人體造成安全隱患，而該專利申請(qǐng)的實(shí)施例1、實(shí)施例2制備工藝用到甲醛，實(shí)施例3制備工藝用到丁酮、異丙醚，實(shí)施例4制備工藝用到氯仿、環(huán)己烷、乙醇，實(shí)施例6制備工藝用到乙醚、乙醇，實(shí)施例7為溶劑噴霧干燥法制備工藝用到異丙醇等，制備工藝中用到的溶劑易帶來(lái)生產(chǎn)安全隱患和溶劑殘留。中國(guó)專利申請(qǐng)CN200710068191.5《輔酶Q10水分散體及其制備方法》中提到輔酶Q10微膠囊的制備方式，采用單一的乳化噴霧干燥法但是或多或少的存在一些缺陷，添加或使用在片劑壓片中，存在著流動(dòng)性差異造成松片或者壓片后易冒油等情況。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的輔酶Q10產(chǎn)品的水溶性差、生物利用度低、不穩(wěn)定等技術(shù)問(wèn)題，提供一種水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊及其制備方法與應(yīng)用。一種水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊，按重量百分比計(jì)，包括：1～20％輔酶Q10、0.1～1％胡椒堿、0.05～5％抗氧化劑、30～60％載體油、0.05～5％油相表面活性劑、0.05～5％水相表面活性劑、20～50％水相壁材。所述水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊，按重量百分比計(jì)，優(yōu)選包括：2～12％輔酶Q10、0.2～0.8％胡椒堿、0.5～2.5％抗氧化劑、35～50％載體油、2～4％油相表面活性劑、0.5～3.5％水相表面活性劑、30～45％水相壁材。所述水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊，按重量百分比計(jì)，更優(yōu)選包括：6～12％輔酶Q10、0.2～0.5％胡椒堿、2.0～2.5％抗氧化劑、40～45％載體油、2.5～4％油相表面活性劑、2.5～3.5％水相表面活性劑、40～45％水相壁材。所述的抗氧化劑為天然VE、迷迭香提取物或2,6-二叔丁基對(duì)甲酚等中的至少一種，優(yōu)選天然VE。所述的油相表面活性劑為蔗糖酯(HLB值5～7)、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、吐溫類、甘油酯類、卵磷脂中的至少一種，優(yōu)選卵磷脂。所述的載體油不僅可以選自安全穩(wěn)定的天然植物油，如大豆油、花生油、橄欖油、蓖麻油、紅花油等一種或多種；還可選自對(duì)藥物溶解能力強(qiáng)的、經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造、水解后的植物油或脂肪酸酯，如肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、油酸乙酯、中鏈脂肪酸甘油酯(MCT)、油酸聚乙二醇甘油酯、單亞油酸甘油酯和聚丙二醇辛酸酯等中的一種或多種；所述的水相壁材選自改性阿拉伯膠、麥芽糊精、明膠、改性淀粉、改性大豆分離蛋白中的一種或多種；所述改性淀粉是辛烯基琥珀酸淀粉鈉或十二烯基琥珀酸淀粉鈉；所述的水相表面活性劑選自蔗糖酯(HLB值13～16)、泊洛沙姆188、殼聚糖及其衍生物中的一種或多種；所述的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊，其口服給藥后在體內(nèi)通過(guò)胃腸道的蠕動(dòng)自發(fā)形成油滴為納米級(jí)的微乳液。所述的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊的制備方法，包括以下步驟：1)將輔酶Q10、載體油、胡椒堿、抗氧化劑、油相表面活性劑等一起在研磨機(jī)中0～25℃進(jìn)行研磨至結(jié)晶顆粒粒徑為5微米以下，得到輔酶Q10分散液；2)將水相壁材、水相表面活性劑溶于水中，配成水相溶液，加熱至35～45℃并保溫；3)將輔酶Q10分散液升溫至35～50℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至30～40℃，加入水相溶液中混合、高速剪切，乳化至油滴粒徑≤2微米后，進(jìn)入設(shè)定壓力為60～80MPa的高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)至油滴粒徑小于100納米的乳液；4)將所得的輔酶Q10納米乳液在30～40℃中保溫并在噴霧干燥器中噴霧流化雙包被即制備所需的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊。所述水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊在制備增強(qiáng)免疫力藥物、保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：1)本發(fā)明通過(guò)引入雙相乳化劑，乳液經(jīng)研磨、高壓均質(zhì)、流化雙包被，形成水溶性納米緩釋功能性微膠囊，在胃腸道中能自發(fā)形成10-100納米的乳滴，有利于增加芯材對(duì)組織的附著力，提高輔酶Q10的生物利用度。2)本發(fā)明通過(guò)添加處方量的胡椒堿促進(jìn)腸胃吸收作用以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)輔酶Q10的有效吸收，進(jìn)一步促進(jìn)提高輔酶Q10的生物利用度。3)通過(guò)雙包被微膠囊技術(shù)，使微膠囊的穩(wěn)定性和溶解性得到進(jìn)一步的提高，雙包被微膠囊具有更好的緩釋性，且釋放更為徹底。雙包被技術(shù)也能進(jìn)一步改善微膠囊的水溶性進(jìn)而進(jìn)一步提高輔酶Q10的生物利用度。4)本發(fā)明的納米微膠囊的穩(wěn)定性好，可防止組分的破壞，且便于加工。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的輔酶Q10微膠囊的體外釋放曲線圖；圖2為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的輔酶Q10微膠囊在不同溫度下的溶解性試驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式：以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步補(bǔ)充，對(duì)本發(fā)明予以詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行，所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。以下實(shí)施例中輔酶Q10的含量根據(jù)《中國(guó)藥典》(2010年版)二部中所記載的HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例1將240Kg輔酶Q10結(jié)晶與16Kg胡椒堿、40Kg卵磷脂、40Kg天然VE、654Kg大豆油一起在納米研磨機(jī)中溫度25℃下研磨至結(jié)晶粒徑為5μm以下，得到輔酶Q10分散液。將1000Kg改性淀粉(T809)、10Kg蔗糖酯(HLB值13～16)溶于3000Kg的水中，配成改性淀粉水溶液，保溫至40℃?zhèn)溆?。將輔酶Q10分散液升溫至50℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至40℃，保溫備用。將上述的輔酶Q10分散液加入到改性淀粉水溶液中在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切30分鐘，并且在60MPa下均質(zhì)3次，在出口得到納米分散的輔酶Q10乳液。將上述納米分散的輔酶Q10乳液進(jìn)行噴霧流化雙包干燥，以玉米淀粉為包裹壁材進(jìn)行雙包被，噴霧塔進(jìn)風(fēng)口溫度控制在180℃，出風(fēng)口溫度控制在90℃，霧化器轉(zhuǎn)速1400r/min，噴霧干燥得水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊。經(jīng)檢測(cè)，該雙包被的玉米淀粉上粉率為15％，微膠囊中輔酶Q10的含量為10.26％，油滴粒徑分布表明產(chǎn)品中輔酶Q10的D90為90nm。實(shí)施例2將20Kg輔酶Q10結(jié)晶與2Kg胡椒堿、30Kg卵磷脂、4Kg天然VE、10Kg單甘酯、1Kg迷迭香提取物(含10％鼠尾草酸)、498Kg橄欖油一起在納米研磨機(jī)中溫度20℃下研磨至結(jié)晶粒徑為5μm以下，得到輔酶Q10分散液。將400Kg改性淀粉(T809)、35Kg蔗糖酯(HLB值13～16)溶于1500Kg的水中，配成改性淀粉水溶液，保溫至45℃?zhèn)溆?。將輔酶Q10分散液升溫至35℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至30℃，保溫備用。將上述的輔酶Q10分散液加入到改性淀粉水溶液中在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切30分鐘，并且在80MPa下均質(zhì)3次，在出口得到納米分散的輔酶Q10乳液。將上述納米分散的輔酶Q10乳液進(jìn)行噴霧流化雙包干燥，以玉米淀粉為包裹壁材進(jìn)行雙包被，噴霧塔進(jìn)風(fēng)口溫度控制在180℃，出風(fēng)口溫度控制在90℃，霧化器轉(zhuǎn)速1400r/min，噴霧干燥得水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊。經(jīng)檢測(cè)，該雙包被的玉米淀粉上粉率為17％，微膠囊中輔酶Q10的含量為1.69％，油滴粒徑分布表明產(chǎn)品中輔酶Q10的D90為95nm。實(shí)施例3將400Kg輔酶Q10結(jié)晶與20Kg胡椒堿、40Kg卵磷脂、80Kg天然VE、20Kg2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、60Kg乙酸異丁酸蔗糖酯、880Kg肉豆蔻酸異丙酯一起在納米研磨機(jī)中溫度15℃下研磨至結(jié)晶粒徑為5μm以下，得到輔酶Q10分散液。將400Kg改性阿拉伯膠(A-2010)、100Kg泊洛沙姆188溶于2000Kg的水中，配成改性阿拉伯膠水溶液，保溫至35℃?zhèn)溆?。將輔酶Q10分散液升溫至45℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至35℃，保溫備用。將上述的輔酶Q10分散液加入到改性阿拉伯膠水溶液中在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切30分鐘，并且在65MPa下均質(zhì)3次，在出口得到納米分散的輔酶Q10乳液。將上述納米分散的輔酶Q10乳液進(jìn)行噴霧流化雙包干燥，以玉米淀粉為包裹壁材進(jìn)行雙包被，噴霧塔進(jìn)風(fēng)口溫度控制在180℃，出風(fēng)口溫度控制在90℃，霧化器轉(zhuǎn)速1400r/min，噴霧干燥得水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊。經(jīng)檢測(cè)，該雙包被的玉米淀粉上粉率為14％，微膠囊中輔酶Q10的含量為17.36％，油滴粒徑分布表明產(chǎn)品中輔酶Q10的D90為85nm。實(shí)施例4將60Kg輔酶Q10結(jié)晶與1Kg胡椒堿、0.4Kg卵磷脂、0.4Kg天然VE、0.1Kg2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、0.1Kg吐溫-80、487.5KgMCT一起在納米研磨機(jī)中溫度10℃下研磨至結(jié)晶粒徑為5μm以下，得到輔酶Q10分散液。將450Kg魚(yú)明膠、0.5Kg殼聚糖溶于2000Kg的水中，配成魚(yú)明膠水溶液，保溫至40℃?zhèn)溆?。將輔酶Q10分散液升溫至40℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至30℃，保溫備用。將上述的輔酶Q10分散液加入到魚(yú)明膠水溶液中在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切30分鐘，并且在80MPa下均質(zhì)3次，在出口得到納米分散的輔酶Q10乳液。將上述納米分散的輔酶Q10乳液進(jìn)行噴霧流化雙包干燥，以玉米淀粉為包裹壁材進(jìn)行雙包被，噴霧塔進(jìn)風(fēng)口溫度控制在180℃，出風(fēng)口溫度控制在90℃，霧化器轉(zhuǎn)速1400r/min，噴霧干燥得水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊。經(jīng)檢測(cè)，該雙包被的玉米淀粉上粉率為18％，微膠囊中輔酶Q10的含量為5.02％，油滴粒徑分布表明產(chǎn)品中輔酶Q10的D90為89nm。實(shí)施例5將10Kg輔酶Q10結(jié)晶與5Kg胡椒堿、15Kg卵磷脂、20Kg天然VE、5Kg2,6-二叔丁基對(duì)甲酚、10KgTPGS、600Kg油酸聚乙二醇甘油酯一起在納米研磨機(jī)中溫度0℃下研磨至結(jié)晶粒徑為5μm以下，得到輔酶Q10分散液。將310Kg改性大豆分離蛋白、25Kg殼聚糖溶于1000Kg的水中，配成改性大豆分離蛋白水溶液，保溫至45℃?zhèn)溆?。將輔酶Q10分散液升溫至50℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至40℃，保溫備用。將上述的輔酶Q10分散液加入到改性大豆分離蛋白水溶液中在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切30分鐘，并且在70MPa下均質(zhì)3次，在出口得到納米分散的輔酶Q10乳液。將上述納米分散的輔酶Q10乳液進(jìn)行噴霧流化雙包干燥，以玉米淀粉為包裹壁材進(jìn)行雙包被，噴霧塔進(jìn)風(fēng)口溫度控制在180℃，出風(fēng)口溫度控制在90℃，霧化器轉(zhuǎn)速1400r/min，噴霧干燥得水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊。經(jīng)檢測(cè)，該雙包被的玉米淀粉上粉率為15％，微膠囊中輔酶Q10的含量為0.85％，油滴粒徑分布表明產(chǎn)品中輔酶Q10的D90為93nm。實(shí)施例6：穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：1、光照的影響取實(shí)施例1制備得到的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊和輔酶Q10原料(輔酶Q10的質(zhì)量含量：99％)分別裝入密封無(wú)色透明的小瓶中置于4500Lx光照強(qiáng)度照射、無(wú)氧灌裝(25℃恒溫)條件下，1份作為對(duì)照，一份放置10天，一份放置20天，一份放置30天，用HPLC法測(cè)定輔酶Q10含量，考察光照對(duì)輔酶Q10含量(％)和外觀的影響。結(jié)果如表1所示：表1光照對(duì)水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊穩(wěn)定性的影響表1結(jié)果顯示，本發(fā)明所制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊粉體經(jīng)光照后，輔酶Q10未出現(xiàn)明顯破壞，表明其在上述環(huán)境下較穩(wěn)定，說(shuō)明水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊可大大的提高輔酶Q10的光穩(wěn)定性。2、溫度的影響取實(shí)施例1制備得到的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊和輔酶Q10原料(輔酶Q10質(zhì)量含量：99％)分別裝入密封無(wú)色透明的小瓶中置于60℃(恒溫箱)條件下，1份作為對(duì)照，一份放置10天，一份放置20天，一份放置30天，用HPLC法測(cè)定輔酶Q10含量，考察溫度條件對(duì)輔酶Q10含量(％)和外觀的影響。結(jié)果如表2所示：表2溫度對(duì)水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊穩(wěn)定性的影響表2結(jié)果顯示，本發(fā)明所制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊粉體在高溫環(huán)境下，輔酶Q10未出現(xiàn)明顯破壞，表明其在上述環(huán)境下較穩(wěn)定，說(shuō)明水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊可大大的提高輔酶Q10的高溫穩(wěn)定性。3、氧氣的影響取實(shí)施例1制備得到的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊和輔酶Q10原料(輔酶Q10質(zhì)量含量：99％)分別裝入棕色的小瓶中充氧灌裝(25℃恒溫))避光放置，1份作為對(duì)照，一份放置10天，一份放置20天，一份放置30天，用HPLC法測(cè)定輔酶Q10含量，考察充氧條件對(duì)輔酶Q10含量(％)和外觀的影響。結(jié)果如表3所示：表3氧氣對(duì)水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊穩(wěn)定性的影響表3結(jié)果顯示，本發(fā)明所制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊粉體在充氧環(huán)境下，輔酶Q10未出現(xiàn)明顯破壞，表明其在上述環(huán)境下較穩(wěn)定，說(shuō)明水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊可大大的提高輔酶Q10的充氧穩(wěn)定性。由上述影響因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊在光照、充氧、高溫破壞條件下，外觀性狀和含量均沒(méi)有明顯變化。在光照、充氧、高溫破壞條件下外觀性狀一致，水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊為淡黃色粉末，顏色上沒(méi)有明顯改變。光照、充氧、高溫破壞條件下輔酶Q10的HPLC分析色譜圖未出現(xiàn)降解產(chǎn)物峰，表明其在上述環(huán)境下穩(wěn)定。以上說(shuō)明本發(fā)明的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊具有較好的穩(wěn)定性，降低了光照、氧氣、溫度對(duì)其輔酶Q10性質(zhì)的影響。實(shí)施例7：增強(qiáng)免疫力功能的試驗(yàn)本發(fā)明水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊經(jīng)動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可以增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果如下：1.1樣品：樣品1：實(shí)施例1制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊；參比樣：實(shí)施例1配方中的胡椒堿替換成同等質(zhì)量的大豆油，其余組分及制備方法與實(shí)施例1一致，制備得到輔酶Q10微膠囊參比樣。原料樣：輔酶Q10原料(輔酶Q10的質(zhì)量含量為99％)。總共3個(gè)樣品進(jìn)行動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：由長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(湘)2010-0010)提供的SPF級(jí)昆明種雄性小鼠，鼠齡3個(gè)月，體重18～22g。按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作，以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的痛苦。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將小鼠隨機(jī)每40只分為一組，共六組。免疫Ⅰ組，進(jìn)行ConA誘導(dǎo)鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；免疫Ⅱ組，進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；免疫Ⅲ組，進(jìn)行體比值測(cè)定，血清溶血素測(cè)定和抗體生成細(xì)胞數(shù)測(cè)定；免疫Ⅳ-Ⅵ組，分別進(jìn)行碳實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測(cè)定。1.3主要儀器與試劑：二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津有限公司；酶標(biāo)儀：美國(guó)寶特；等。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、Hank's液(pH7.2-7.4)、RPMI1640培養(yǎng)液、小牛血清、ConA、吩嗦二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I等。1.4受試物給予方式：根據(jù)人口服推薦用量，設(shè)樣品1、參比樣、原料樣組(分別相當(dāng)于人體推薦用量)，設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組，每組10只動(dòng)物。分別稱取樣品，混勻、配成溶液劑后，給予相應(yīng)劑量組動(dòng)物灌胃，陰性對(duì)照組予以等體積的空白溶液劑，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30d。1.5實(shí)驗(yàn)方法：1.5.1臟器/體重比值測(cè)定稱重后處死小鼠，取出胸腺和脾臟，在電子分析天平上稱重，計(jì)算臟/體比值。1.5.2其他免疫指標(biāo)的測(cè)定根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》-2003免疫功能檢測(cè)的程序，分別測(cè)定下列各項(xiàng)免疫指標(biāo)：ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法)、二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠DTH實(shí)驗(yàn)(耳腫脹法)、抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(Jerne改良玻片法)、血清溶血素的測(cè)定(血凝法)、小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測(cè)定(乳酸脫氫酶測(cè)定法)。1.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析統(tǒng)計(jì)處理。1.7結(jié)果判定根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》增強(qiáng)免疫力功效的判定標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用。表4輔酶Q10增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)對(duì)小鼠(免疫Ⅰ組)體重的影響(x±S)作用藥物動(dòng)物數(shù)初始體重/g中期體重/g末期體重/g增重/g樣品11019.9±1.230.7±1.042.9±1.523.0±2.3參比樣1020.1±1.330.1±1.140.7±1.620.6±2.5原料樣1020.2±1.332.1±1.042.1±1.821.9±2.1陰性對(duì)照組1019.7±1.231.9±1.141.5±1.921.8±2.0表5輔酶Q10增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)對(duì)小鼠(免疫Ⅱ組)體重的影響(x±S)作用藥物動(dòng)物數(shù)初始體重/g中期體重/g末期體重/g增重/g樣品11020.0±1.231.7±1.341.1±1.621.1±1.9參比樣1019.7±1.331.1±1.241.7±1.722.0±2.1原料樣1020.3±1.132.0±1.143.1±1.822.8±2.0陰性對(duì)照組1020.3±1.232.1±1.242.4±1.922.1±1.7表6輔酶Q10增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)小鼠的免疫器官臟器/體重比值(x±S)作用藥物動(dòng)物數(shù)胸腺/體重/％P值脾臟/體重/％P值樣品1100.218±0.0170.3500.388±0.0460.894參比樣100.218±0.0190.8900.392±0.0260.897原料樣100.219±0.0160.9120.408±0.0510.899陰性對(duì)照組100.222±0.015----0.405±0.038----由表4、5、6所示，不同免疫組實(shí)驗(yàn)期間小鼠的體重增長(zhǎng)與陰性對(duì)照組間的比較，差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)，表明該樣品對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，小鼠的胸腺/體重及脾臟/體重比值與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)，表明該樣品對(duì)小鼠的免疫器官重量無(wú)明顯影響。表7輔酶Q10對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(x±S)由表7所示，經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力均高于陰性對(duì)照組，其中的樣品1組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(P＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的淋巴細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)化能力的作用。表8輔酶Q10對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(x±S)由表8所示，經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠左右耳片重量差值均高于陰性對(duì)照組，其中的樣品1組與陰性對(duì)照組的差異具有非常顯著性(P＜0.01)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用。表9輔酶Q10對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞檢測(cè)測(cè)定結(jié)果的影響(x±S)由表9所示，經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)均高于陰性對(duì)照組，其中的樣品1組、參比樣組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(分別P＜0.01和P＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的抗體生成細(xì)胞增殖的作用。表10輔酶Q10對(duì)小鼠溶血素測(cè)定結(jié)果的影響(x±S)作用藥物動(dòng)物數(shù)抗體積數(shù)P值樣品110202.8±13.70.030參比樣10193.2±21.90.316原料樣10192.1±31.50.357陰性對(duì)照組10179.2±23.6----由表10所示，經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠的抗體積數(shù)均高于陰性對(duì)照組，其中的樣品1組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(P＜0.05)，表明該樣品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。表11輔酶Q10對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清測(cè)定結(jié)果的影響(x±S)作用藥物動(dòng)物數(shù)吞噬指數(shù)P值樣品1108.37±1.250.021參比樣107.14±1.370.876原料樣107.09±1.280.929陰性對(duì)照組106.76±0.95----由表11所示，經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠的吞噬指數(shù)均高于陰性對(duì)照組，其中的參比樣組與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(P＜0.05)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的單核巨噬細(xì)胞碳廓清功能的作用。表12輔酶Q10對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞測(cè)定結(jié)果的影響(x±S)作用藥物動(dòng)物數(shù)吞噬率//％吞噬率轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)P值吞噬指數(shù)P值樣品11024.1±3.40.511±0.0410.0430.47±0.080.001參比樣1020.8±3.50.467±0.0480.8760.40±0.070.086原料樣1021.7±5.290.484±0.0360.4430.39±0.080.211陰性對(duì)照組1020.1±2.20.462±0.025----0.36±0.05----由表12所示，口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)均高于陰性對(duì)照組，其中的樣品1的吞噬率和吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組的差異具有顯著性(分別P＜0.05和P＜0.01)，表明該樣品具有促進(jìn)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能的作用。表13輔酶Q10對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果的影響(x±S)由表13所示，經(jīng)口給予小鼠不同樣品組的輔酶Q10溶液劑30d，各樣品組的小鼠的NK細(xì)胞活性均高于陰性對(duì)照組，但各劑量組與陰性對(duì)照組的差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)，表明該樣品對(duì)小鼠的NK細(xì)胞活性無(wú)明顯的提高作用。以樣品1、參比樣、原料樣的輔酶Q10溶液劑給小鼠連續(xù)灌胃30d，能促進(jìn)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化作用，促進(jìn)小鼠的抗體生成細(xì)胞增殖，提高小鼠的血清溶血素水平，促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及其單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能，對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值及其NK細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。從顯著性差異的統(tǒng)計(jì)分析判斷添加胡椒堿的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊增強(qiáng)免疫力功能優(yōu)于未添加胡椒堿的輔酶Q10微膠囊。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，可判定本發(fā)明輔酶Q10、胡椒堿的組合具有良好的增強(qiáng)免疫力的性能。實(shí)施例8：輔酶Q10體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)本發(fā)明水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊經(jīng)動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可以明顯提高輔酶Q10的吸收性能，其實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果如下：1.1樣品：樣品樣：實(shí)施例1制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊；參比樣：采用與實(shí)施例7相同的參比樣；原料樣：輔酶Q10原料(輔酶Q10的質(zhì)量含量為99％)。總共3個(gè)樣品進(jìn)行動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：由長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(湘)2010-0010)提供的SPF級(jí)昆明種雄性小鼠，鼠齡3個(gè)月，體重18～22g。按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作，以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的痛苦。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將大鼠隨機(jī)每10只分為一組，共三組。1.3實(shí)驗(yàn)條件：為屏蔽環(huán)境，實(shí)驗(yàn)期間環(huán)境溫度23℃～24℃，濕度50％～56％，每日自由攝取去離子水和標(biāo)準(zhǔn)飼料。1.4口服給藥及樣品采集取禁食12h的小鼠隨機(jī)10只分為一組，共三組。分別將實(shí)施例樣品樣，參比樣，原料樣，按30mg/kg劑量給予小鼠灌胃處理，使每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠，于給藥5、15、30min及1、2、4、6、12h分別取血于肝素抗凝管中，離心分離處理后進(jìn)行測(cè)樣。1.5藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)口服(30mg/kg)給予實(shí)施例樣品樣、參比樣、原料樣后，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的血漿樣品處理后進(jìn)樣HPLC分析測(cè)定。根據(jù)血藥濃度結(jié)果進(jìn)行擬合分析，計(jì)算血藥濃度數(shù)據(jù)。表14小鼠經(jīng)口服給藥樣品藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)是評(píng)定生物利用度的最可靠的指標(biāo)。由表14，可知樣品樣的AUC比參比樣和原料樣的比值大。藥物制劑的生物利用度測(cè)定，一般是用非血管途徑給藥(如口服，op)的藥-時(shí)曲線下的面積(AUC)與該藥參比制劑如靜注(iv)或相同途徑給藥(po)后的比值，以吸收百分率表示。樣品樣的F值為146.0％，即本發(fā)明的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊的生物利用度是原料藥的1.46倍，參比樣的F值為122.3％，即參比輔酶Q10微膠囊的相對(duì)生物利用度是原料藥的1.223倍。生物利用度是用來(lái)評(píng)價(jià)制劑吸收程度的指標(biāo)，說(shuō)明本發(fā)明的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊在體內(nèi)吸收過(guò)程得到改善，胡椒堿的添加，可進(jìn)一步提高輔酶Q10的生物利用度。實(shí)施例9：輔酶Q10微膠囊的體外釋放實(shí)驗(yàn)樣品樣：實(shí)施例1制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊；參比樣：采用與實(shí)施例1相同的配方，噴霧干燥方式有所不同，制備方法如下：將240Kg輔酶Q10結(jié)晶與16Kg胡椒堿、40Kg卵磷脂、40Kg天然VE、654Kg大豆油一起在納米研磨機(jī)中溫度25℃下研磨至結(jié)晶粒徑為5μm以下，得到輔酶Q10分散液。將1000Kg改性淀粉(T809)、10Kg蔗糖酯(HLB值13～16)溶于3000Kg的水中，配成改性淀粉水溶液，保溫至40℃?zhèn)溆?。將輔酶Q10分散液升溫至50℃，待輔酶Q10分散液溶解完全后，冷卻至40℃，保溫備用。將上述的輔酶Q10分散液加入到改性淀粉水溶液中在10000rpm轉(zhuǎn)速下剪切30分鐘，并且在60MPa下均質(zhì)3次，在出口得到納米分散的輔酶Q10乳液。將上述納米分散的輔酶Q10乳液進(jìn)行噴霧干燥，噴霧塔進(jìn)風(fēng)口溫度控制在180℃，出風(fēng)口溫度控制在90℃，霧化器轉(zhuǎn)速1400r/min，噴霧干燥即得。稱取適量的樣品樣和參比樣(相當(dāng)于輔酶Q1030mg)，分別撒布于釋放儀中，在(37±1)℃1000ml擴(kuò)散介質(zhì)中，以槳法轉(zhuǎn)速為50r·min-1攪拌，分別在5min、10min、15min、20min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、8h取樣10ml，同時(shí)補(bǔ)加同溫同量的擴(kuò)散介質(zhì)；在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣，微孔濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液在505nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算累積釋放百分率，繪制釋放曲線，見(jiàn)附圖1。由附圖1釋放曲線可得到，由于本發(fā)明的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊粉末雙包埋壁材更厚實(shí)，緩釋效果更好，體外釋放時(shí)間有所延長(zhǎng)。實(shí)施例10：輔酶Q10微膠囊在不同溫度下的溶解性實(shí)驗(yàn)樣品樣：實(shí)施例1制備的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊；參比樣1：采用與實(shí)施例9相同的參比樣；以下參比樣2、3、4為隨機(jī)從市場(chǎng)上購(gòu)買的10％水溶性輔酶Q10微膠囊：參比樣2：購(gòu)自西安某醫(yī)藥有限公司的10％水溶性輔酶Q10微膠囊；參比樣3：購(gòu)自河南某食品添加劑有限公司的10％水溶性輔酶Q10微膠囊；參比樣4：購(gòu)自西安某生物技術(shù)有限公司的10％水溶性輔酶Q10微膠囊。分別稱取0.1g樣品樣和參比樣，加入燒杯中，置于恒溫水浴鍋中，再分別加入10ml與水浴同溫的蒸餾水，分別測(cè)定在25℃、35℃、45℃、55℃、60℃條件下完全溶解所需要的時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖2。由附圖2可見(jiàn)，同一溫度下，本發(fā)明水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊的水溶性能明顯優(yōu)于市售的其它輔酶Q10水溶性微膠囊，也明顯優(yōu)于參比樣1的單層包被微膠囊，說(shuō)明本發(fā)明的水溶性納米緩釋功能性輔酶Q10微膠囊的水溶性能優(yōu)越，雙包被技術(shù)可改善微膠囊的水溶性，有利于進(jìn)一步提高輔酶Q10的生物利用度。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3