本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人參酶解物及其制備工藝和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，目前腫瘤的常規(guī)治療方法為手術(shù)切除、放療和化療，盡管取得了一些進(jìn)展，但腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是困擾臨床腫瘤治療的具有普遍意義的難題。究其原因，在于現(xiàn)有治療的目標(biāo)仍然集中在腫瘤細(xì)胞本身，而忽略了其微環(huán)境的重要性。
在體外活性藥物能夠識別腫瘤抗原并殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，要消除機(jī)體內(nèi)形成的腫瘤僅靠識別腫瘤抗原是不夠的。一個成型的腫瘤是一個復(fù)雜的組織，它不僅由腫瘤細(xì)胞組成，還包括基質(zhì)細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，脈管系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，所有這些總和定義為腫瘤微環(huán)境(TME)。腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系。它不僅包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，而且亦與腫瘤細(xì)胞自身的(核和胞質(zhì))內(nèi)在環(huán)境有關(guān)。
腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間就像土壤與種子的關(guān)系，腫瘤細(xì)胞可以通過自分泌和旁分泌，改變和維持自身生存和發(fā)展的條件，促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。全身和局部組織亦可通過代謝、分泌、免疫、結(jié)構(gòu)和功能的改變，限制和影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤與環(huán)境，兩者既是相互依存，相互促進(jìn)，又是相互拮抗，相互斗爭的。腫瘤惡變過程，就是腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境共進(jìn)化的過程，其結(jié)果就是休眠腫瘤細(xì)胞的蘇醒，進(jìn)入快速增殖，并發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，改善腫瘤微環(huán)境，維持腫瘤細(xì)胞的休眠狀態(tài)，是目前研究的熱點和重點。微環(huán)境是腫瘤研究前沿。
免疫負(fù)調(diào)控研究為腫瘤治療提供了新策略。腫瘤微環(huán)境中，存在著大量的負(fù)調(diào)控細(xì)胞，它們相互作用，相互影響，伴隨著腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境的共進(jìn)化。由于腫瘤細(xì)胞的免疫原性改變和非正常生長，刺激成纖維細(xì)胞釋放炎癥因子，抗原提呈細(xì)胞傳遞腫瘤抗原信號，共同招募免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤局部，而且腫瘤細(xì)胞的異常增殖引起對鄰近細(xì)胞的壓迫，導(dǎo)致缺血壞死等組織損傷，產(chǎn)生大量的炎性因子，因此腫瘤局部處于非可控性炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致微環(huán)境免疫負(fù)調(diào)控的形成，誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞(MDSC)的形成。其結(jié)果是抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、自然殺傷細(xì)胞(NK)的活性，維持腫瘤局部的免疫耐受狀態(tài)。
MDSC在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了免疫抑制效應(yīng)，抑制了殺傷性T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的清除作用，因此目前MDSC成為腫瘤治療的重要細(xì)胞靶點之一。MSC2細(xì)胞為MDSC細(xì)胞系中一種亞細(xì)胞，穩(wěn)定，常用于誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞(MDSC)系列實施中，闡述相關(guān)機(jī)理。
人參及其相關(guān)提取物、酶解物等具有抑制腫瘤細(xì)胞本身的活性，但是目前的現(xiàn)有技術(shù)中尚未有相關(guān)的產(chǎn)品可以作用于MDSC，并具有明顯的抑制活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種人參酶解物的制備工藝，使得所述制備工藝制備的人參酶解物對MDSC具有很好的抑制作用，進(jìn)而有效改善腫瘤微環(huán)境。
本發(fā)明的另外一個目的在于提供一種人參酶解物的制備工藝，使得所述制備工藝制備的人參酶解物對結(jié)腸癌具有明顯的抑制作用，同時與化療藥物聯(lián)用對抑制結(jié)腸癌具有協(xié)同作用。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種人參酶解物的制備工藝，提取人參，獲得人參提取液，濃縮后調(diào)節(jié)pH值為酸性，獲得人參濃縮液；向人參濃縮液中加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，酶解后干燥獲得人參酶解物；
其中，所述復(fù)合酶為纖維素酶和選自果膠酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶中任意一種或兩種以上的酶。
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中缺乏能夠抑制髓源抑制性細(xì)胞(MDSC)的人參提取物的問題，通過特殊的酶解工藝對人參提取液進(jìn)行酶解，獲得了對MDSC具有較好抑制作用的人參酶解物，解決了技術(shù)問題。
作為優(yōu)選，所述提取人參為通過水煎法提取人參。在具體實施方式中，所述提取人參的方法可參照如下：
取人參藥材，加入人參藥材重量10-30倍水，提取1-3次、每次1.5-3小時，過濾，合并濾液，得人參提取液；或者取人參藥材，粉碎，過60-120目篩，加入藥材重量15-30倍水，煎煮1.5-3小時，得人參提取液。
作為優(yōu)選，所述調(diào)節(jié)pH值為酸性為調(diào)節(jié)pH值為4.0-6.5，可采用蘋果酸、醋酸、檸檬酸中的一種調(diào)節(jié)，pH值可具體調(diào)節(jié)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。
作為優(yōu)選，所述人參濃縮液與人參的液料比為5-15ml：1g。在本發(fā)明具體實施方式中，所述人參濃縮液與人參的液料比為5ml:1g、8ml:1g、9ml:1g、10ml:1g、11ml:1g、12ml:1g或15ml:1g。
作為優(yōu)選，所述復(fù)合酶和人參的質(zhì)量比為0.01-0.14:1。在本發(fā)明具體實施方式中，所述復(fù)合酶和人參的質(zhì)量比為0.01:1、0.04:1、0.05:1、0.07:1、0.08:1、0.12:1或0.14:1。作為優(yōu)選，所述復(fù)合酶中各酶的質(zhì)量相同，所采用的纖維素酶酶活為300-3000u/ml，果膠酶酶活為300-3000u/ml，半纖維素酶活為300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶酶活為3000-30000u/ml。
作為優(yōu)選，所述酶解為在40-70℃下酶解1-6天，更優(yōu)選為酶解4-5天。在具體實施方式中，所述酶解為在55℃下酶解5天、在70℃下酶解6天、在40℃下酶解1天、在60℃下酶解5天、在55℃下酶解4天、在50℃下酶解3天或在45℃下酶解2天。
本發(fā)明所述復(fù)合酶可一次性全部加入，但分次加入所獲得的人參酶解物活性更佳，故作為優(yōu)選，所述加入復(fù)合酶為將復(fù)合酶按重量份分成6等份，每隔4-24h加入一等份；在具體實施方式中，加入的間隔時間可以具體選擇為4h、12h、16h、20h或24h。
此外，在對酶解后的酶解物干燥前，本發(fā)明制備工藝還可包括加入輔料后再干燥；優(yōu)選的所述輔料選自麥芽糊精、微晶纖維素、二氧化硅和淀粉中的一種或幾種。
經(jīng)過本發(fā)明制備的人參酶解物，含水量低于8％，含有0.69-3.7wt％的人參總皂苷，所述人參總苷中含有5.2-11.4wt％的稀有皂苷；具體地，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 1.7-3.2份、人參皂苷F1 0-1.9份、人參皂苷CK 0.8-1.8份和人參皂苷Rh2 0-2.9份；進(jìn)一步地，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 2.1-2.9份、人參皂苷F1 1.2-1.9份、人參皂苷CK 0.8-1.0份和人參皂苷Rh2 1.0-2.5份。
同時，本發(fā)明制備的人參酶解物對MDSC具有很好的抑制作用，進(jìn)而可有效改善腫瘤微環(huán)境，維持腫瘤細(xì)胞的休眠狀態(tài)從而起到抗腫瘤作用。本發(fā)明人參酶解物對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞具有很好的抑制作用，同時與化療藥物聯(lián)用對結(jié)腸癌CT26腫瘤水鼠的腫瘤抑制效果優(yōu)于單一用藥選擇，具備協(xié)同作用。
由此，本發(fā)明提出了由所述制備工藝制備的人參酶解物，以及所述酶解物在制備髓源抑制性細(xì)胞(MDSC)抑制劑和/或制備治療結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。其中，所述治療結(jié)腸癌藥物包括所述人參酶解物和化療藥物。所述化療藥物選自廣譜抗腫瘤藥物。在實施例中，廣譜抗腫瘤藥物優(yōu)選5-氟尿嘧啶，劑量為5毫克/公斤/天，皮下注射。
本發(fā)明抗腫瘤人參酶解物可以添加醫(yī)學(xué)或食品可接受的載體、賦形劑、賦形劑和/或填充劑，制成任何一種臨床上或藥學(xué)上可接受的劑型的藥物可口服制劑。如可將其制成口服制劑，如常規(guī)的固體制劑如片劑、膠囊、軟膠囊等；液體制劑如口服液，合劑、糖漿劑等；還可制成如注射劑等其他劑型。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過適宜的酶組合以及酶解方式，對人參提取液進(jìn)行了酶解處理，獲得了特定皂苷成分組成的人參酶解物，對MDSC和結(jié)腸癌具有很好的抑制作用，同時與化療藥物聯(lián)用對抑制結(jié)腸癌具備協(xié)同作用。
具體實施方式
本發(fā)明公開了一種人參酶解物及其制備工藝和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述人參酶解物及其制備方法和應(yīng)用已經(jīng)通過實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品、方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
以下就本發(fā)明所提供的一種人參酶解物及其制備工藝和應(yīng)用做進(jìn)一步說明。
實施例1：制備本發(fā)明所述人參酶解物
a.人參提取液的制備：先取人參藥材飲片，加入藥材重量20倍水，提取2次、每次2小時，過濾，合并濾液，得人參提取液；
b.取步驟a中所述人參提取液經(jīng)減壓濃縮后得濃縮液，濃縮液與人參藥材的液料比為9ml：1g，最后向所述濃縮液中加醋酸，調(diào)節(jié)PH值至4.5，得人參濃縮液，備用；
c.酶解反應(yīng)：取步驟b中所述人參濃縮液，保持所述人參濃縮液溫度為45℃，先往所述人參濃縮液中添加酶解物，然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)，所述酶解反應(yīng)時間為2天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。
其中，所述酶解物選自纖維素酶和半纖維素酶，其中纖維素酶和半纖維素酶的質(zhì)量比為1：1；按質(zhì)量比，所述酶解物與人參藥材的質(zhì)量比為0.05：1。添加酶解物的方法為：一次性加入。
此外，在將人參酶解中間產(chǎn)物干燥前，可向所述人參酶解中間產(chǎn)物中添加淀粉輔料，然后干燥，制得人參酶解物。
運(yùn)用高效液相法測定經(jīng)上述方法制備的人參酶解物，所述人參酶解物中含有3.4wt％的人參總皂苷，所述人參總苷中含有6.1wt％的稀有皂苷。進(jìn)一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 1.7份、人參皂苷CK1.6份和人參皂苷Rh2 0.7份。
實施例2：制備本發(fā)明所述人參酶解物
a.人參提取液的制備：先取人參藥材，加入藥材重量15倍水，提取2次、每次2.5小時，過濾，合并濾液，得人參提取液；
b.取步驟a中所述人參提取液經(jīng)減壓濃縮后得濃縮液，濃縮液與人參藥材的液料比為10ml：1g，最后向所述濃縮液中加蘋果酸，調(diào)節(jié)PH值至5.0，得人參濃縮液，備用；
c.酶解反應(yīng)：取步驟b中所述人參濃縮液，保持所述人參濃縮液溫度為50℃，先往所述人參濃縮液中添加酶解物，然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)，所述酶解反應(yīng)時間為3天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于5％。
其中，所述酶解物選自果膠酶和纖維素酶，其中果膠酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1：1；按質(zhì)量比，所述酶解物與人參藥材的質(zhì)量比為0.08：1。添加酶解物的方法為：先將所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔12h加入一等份，并攪拌均勻。
此外，在將人參酶解中間產(chǎn)物干燥前，可向所述人參酶解中間產(chǎn)物中添加麥芽糊精和微晶纖維素輔料，然后干燥，制得人參酶解物。其中，麥芽糊精和微晶纖維素的質(zhì)量比為1：1。
運(yùn)用高效液相法測定經(jīng)上述方法制備的人參酶解物，所述人參酶解物中含有2.8wt％的人參總皂苷，所述人參總苷中含有6.3wt％的稀有皂苷。進(jìn)一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 2.0份、人參皂苷CK1.2份和人參皂苷Rh2 1.2份。
實施例3：制備本發(fā)明所述人參酶解物
a.人參提取液的制備：先取人參藥材，加入藥材重量20倍水，提取2次、每次2小時，過濾，合并濾液，得人參提取液；
b.取步驟a中所述人參提取液經(jīng)減壓濃縮后得濃縮液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，最后向所述濃縮液中加檸檬酸，調(diào)節(jié)PH值至6.0，得人參濃縮液，備用；
c.酶解反應(yīng)：取步驟b中所述人參濃縮液，保持所述人參濃縮液溫度為60℃，先往所述人參濃縮液中添加酶解物，然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)，所述酶解反應(yīng)時間為5天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于5％。
其中，所述酶解物選自果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶，其中果膠酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的質(zhì)量比為1：1：1；按質(zhì)量比，所述酶解物與人參藥材的質(zhì)量比為0.12：1。添加酶解物的方法為：先將所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔20h加入一等份，并攪拌均勻。
此外，在將人參酶解中間產(chǎn)物干燥前，可向所述人參酶解中間產(chǎn)物中添加麥芽糊精輔料，然后干燥，制得人參酶解物。
運(yùn)用高效液相法測定經(jīng)上述方法制備的人參酶解物，所述人參酶解物中含有2.6wt％的人參總皂苷，所述人參總苷中含有11.4wt％的稀有皂苷。進(jìn)一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 2.9份、人參皂苷F1 1.9份、人參皂苷CK 1.0份和人參皂苷Rh2 2.5份。
實施例4：制備本發(fā)明所述人參酶解物
a.人參提取液的制備：先取人參藥材，粉碎，過60目篩，加入藥材重量15倍水，煎煮3小時，得人參提取液；
b.取步驟a中所述人參提取液經(jīng)減壓濃縮后得濃縮液，濃縮液與人參藥材的液料比為8ml：1g，最后向所述濃縮液中加檸檬酸，調(diào)節(jié)PH值至4.0，得人參濃縮液，備用；
c.酶解反應(yīng)：取步驟b中所述人參濃縮液，保持所述人參濃縮液溫度為40℃，先往所述人參濃縮液中添加酶解物，按質(zhì)量比，所述酶解物與人參藥材的質(zhì)量比為0.04：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)，所述酶解反應(yīng)時間為1天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。
其中，所述酶解物選自果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶，三者的質(zhì)量比為1：1：1。添加酶解物的方法為：先將所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔4h加入一等份，并攪拌均勻。其中所述酸選自檸檬酸。
此外，在將人參酶解中間產(chǎn)物干燥前，可向所述人參酶解中間產(chǎn)物中添加麥芽糊精和微晶纖維素輔料，然后干燥，制得人參酶解物。其中麥芽糊精和微晶纖維素的質(zhì)量比為1：1。
運(yùn)用高效液相法測定經(jīng)上述方法制備的人參酶解物，所述人參酶解物中含有0.67wt％的人參總皂苷，所述人參總苷中含有5.3wt％的稀有皂苷。進(jìn)一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 3.1份、人參皂苷F1 1.8份。
實施例5：制備本發(fā)明所述人參酶解物
a.人參提取液的制備：先取人參藥材，粉碎，過100目篩，加入藥材重量30倍水，煎煮3小時，得人參提取液；
b.取步驟a中所述人參提取液經(jīng)減壓濃縮后得濃縮液，濃縮液與人參藥材的液料比為15ml：1g，最后向所述濃縮液中加檸檬酸，調(diào)節(jié)PH值至6.5，得人參濃縮液，備用；
c.酶解反應(yīng)：取步驟b中所述人參濃縮液，保持所述人參濃縮液溫度為70℃，先往所述人參濃縮液中添加酶解物，按質(zhì)量比，所述酶解物與人參藥材的質(zhì)量比為0.08：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)，所述酶解反應(yīng)時間為6天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于8％。
其中，所述酶解物選自果膠酶和纖維素酶，二者的比為1：1。添加酶解物的方法為：先將所述酶解物按重量份比分成6等份，每隔24h加入一等份，并攪拌均勻。
此外，在將人參酶解中間產(chǎn)物干燥前，可向所述人參酶解中間產(chǎn)物中添加微晶纖維素輔料，然后干燥，制得人參酶解物。
運(yùn)用高效液相法測定經(jīng)上述方法制備的人參酶解物，所述人參酶解物中含有1.6wt％的人參總皂苷，所述人參總苷中含有8.8wt％的稀有皂苷。進(jìn)一步的，所述稀有皂苷由以下重量份比的物質(zhì)組成：人參皂苷Rg3 2.4份、人參皂苷CK1.0份和人參皂苷Rh2 3.0份。
實施例6：本發(fā)明人參酶解物對髓源抑制性細(xì)胞的抑制研究
實驗樣品制備：取人參藥材，按實施例1-5酶解工藝制備的抗腫瘤人參酶解物，將1-5實施例抗腫瘤人參酶解物干燥至含水量低于6％后，分別用MSC2細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度均為2mg生藥材/ml的溶液，得實施例1-5樣品溶液，樣品標(biāo)記為實施例1-5。
對照樣品制備：
對照樣品1：取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮后干燥至含水量低于6％，用MSC2細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品1。
對照樣品2：先取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，調(diào)節(jié)PH值至5.5，得人參濃縮液。然后往人參濃縮液中添加纖維素酶，纖維素酶的酶活為300-3000u/ml，同本發(fā)明，按質(zhì)量比，所述纖維素酶與人參藥材的比為0.08：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)4天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。最后用MSC2細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品2。
對照樣品3：先取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，調(diào)節(jié)PH值至5.8，得人參濃縮液。然后往人參濃縮液中添加果膠酶和β-葡聚糖酶(1:1質(zhì)量比，酶活同本發(fā)明，果膠酶酶活為300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶活為3000-30000u/ml)，按質(zhì)量比，所述復(fù)合酶與人參藥材的比為0.07：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)4天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。最后用MSC2細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品3。
空白組：以相同體積的培養(yǎng)體系代替樣品。
實驗方法：按常規(guī)實驗方法培養(yǎng)MDSC細(xì)胞系MSC2細(xì)胞，并將MSC2細(xì)胞接種于96孔板中，接種的MSC2細(xì)胞密度為1×104個/孔。分別取實施例1-5樣品、對照樣品，分別加入接種成功的MSC2的96孔板中，并留有空白組，接種48h后，采用MTT(噻唑藍(lán))法，利用酶標(biāo)儀于570nm測定測定細(xì)胞吸光度，吸光度值越低代表對細(xì)胞抑制作用越好，并記錄吸光度值。
實驗結(jié)果：MTT測定細(xì)胞增殖結(jié)果運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析軟件為SPSS16.0，分析計量數(shù)據(jù)多組間比較采用方差分析，顯著性水平為α＝0.05，p<0.05。結(jié)果進(jìn)行方差分析結(jié)果如表1所示。
表1 MSC2細(xì)胞的抑制效應(yīng)
注：*表示樣品與空白對照組比較，P＜0.01。
由以上結(jié)果可以看出，實施例1-5對MSC2細(xì)胞具有抑制效應(yīng)，與空白組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，且抑制效果均優(yōu)于對照樣品1-3。相對于對照樣品(人參提取液，未經(jīng)酶解或雖經(jīng)酶解但是所用酶解制劑不同)而言，對髓樣抑制性細(xì)胞(MDSC)抑制率顯著提高，有更強(qiáng)的抗腫瘤價值，進(jìn)一步說明對髓樣抑制性細(xì)胞(MDSC)的形成具有抑制作用，有助于維持腫瘤細(xì)胞處于休眠狀態(tài)或者逆轉(zhuǎn)激活狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞重新回到休眠狀態(tài)，有助于提升改善腫瘤微環(huán)境的效應(yīng)，從而加強(qiáng)其抗腫瘤活性。
實施例7：抗腫瘤人參酶解物對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的抑制研究
實驗樣品制備：取人參藥材，按實施例1-5酶解工藝制備的抗腫瘤人參酶解物，將1-5實施例抗腫瘤人參酶解物干燥至含水量低于6％后，分別用細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度均為2mg生藥材/ml的溶液，得實施例1-5樣品溶液，樣品標(biāo)記為實施例1-5。
對照樣品制備：
對照樣品1：取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮至含水量低于6％，用細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品。
對照樣品2：先取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，調(diào)節(jié)PH值至5.5，得人參濃縮液。然后往人參濃縮液中添加纖維素酶，纖維素酶的酶活為300-3000u/ml，同本發(fā)明，按質(zhì)量比，所述纖維素酶與人參藥材的比為0.08：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)4天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。最后用細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品2。
對照樣品3：先取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，調(diào)節(jié)PH值至5.8，得人參濃縮液。然后往人參濃縮液中添加果膠酶和β-葡聚糖酶(1:1質(zhì)量比，酶活同本發(fā)明，果膠酶酶活為300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶活為3000-30000u/ml)，按質(zhì)量比，所述復(fù)合酶與人參藥材的比為0.07：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)4天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。最后用細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品3。
空白組：以相同體積的培養(yǎng)體系代替樣品。
實驗方法：
制備荷瘤(結(jié)腸癌CT26)小鼠脾臟細(xì)胞單細(xì)胞懸液：取小鼠脾臟在PBS緩沖液中進(jìn)行研磨，經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾后離心(1500r/min)3min，去上清。加入紅細(xì)胞裂解液(RLB)裂解1min，加入5mlPBS重懸，過濾后離心(1500r/min)3min，去上清。加入1640+/+培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞板計數(shù)得到細(xì)胞液濃度，加入1640+/+培養(yǎng)基調(diào)至所需終濃度，得到脾臟單細(xì)胞懸液。接種于96孔板，2×106/孔，48h后，進(jìn)行流式檢測MDSC比例：CT26荷瘤小鼠脾細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為5×104/孔，取實施例1-5樣品、對照樣品和陽性對照，分別加入接種成功的結(jié)腸癌CT26的96孔板中，并留有空白組。陰性對照每孔加入等體積的1640+/+培養(yǎng)基至終體積200μl/孔。37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。適當(dāng)力度吹打細(xì)胞后吸出液體，分別注入1.5ml離心管，離心(4000r/min，4℃)5min。去上清，加入含2％NCS的PBS 50μL，依比例加入流式染料，冰上放置，抗體染色30min(7AAD最后染5min)后，離心(4000r/min，4℃)5min，沉淀用200ml含2％NCS的PBS重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，上機(jī)檢測，流式細(xì)胞儀為FACScan flow cytometer(BD Calibur)，采用Flowjo 7.6進(jìn)行結(jié)果分析。實驗結(jié)果數(shù)值越低代表相應(yīng)樣品對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞抑制作用越好，并記錄。
實驗結(jié)果：檢測結(jié)果運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析軟件為SPSS16.0，分析計量數(shù)據(jù)多組間比較采用方差分析，顯著性水平為α＝0.05，p<0.05。結(jié)果進(jìn)行方差分析結(jié)果如表2所示。
表2結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的抑制效應(yīng)
注：*表示樣品與空白對照組比較，P＜0.01
由以上結(jié)果可以看出，實施例1-5對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞具有抑制效應(yīng)，與空白組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，且抑制效果均優(yōu)于對照樣品。相對于對照樣品(人參提取液，未經(jīng)酶解或雖經(jīng)酶解但是所用酶解制劑不同)而言，對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的抑制效果顯著，具有更強(qiáng)的抗腫瘤價值。
實施例8：抗腫瘤人參酶解物與化療藥聯(lián)用協(xié)同抗腫瘤研究
實驗樣品制備：取人參藥材，按實施例1-5酶解工藝制備的抗腫瘤人參酶解物，將1-5實施例抗腫瘤人參酶解物干燥至含水量低于6％，樣品標(biāo)記為實施例1-5。
對照樣品制備：
對照樣品1：取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮至含水量低于6％，樣品標(biāo)記為對照樣品1。
對照樣品2：先取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，調(diào)節(jié)PH值至5.5，得人參濃縮液。然后往人參濃縮液中添加纖維素酶，纖維素酶的酶活為300-3000u/ml，同本發(fā)明，按質(zhì)量比，所述纖維素酶與人參藥材的比為0.08：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)4天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。最后用細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品2。
對照樣品3：先取同一批人參藥材，粉碎后過80目篩，加入藥材重量20倍水，提取2次，每次2小時，過濾，合并提取液，濃縮液與人參藥材的液料比為12ml：1g，調(diào)節(jié)PH值至5.8，得人參濃縮液。然后往人參濃縮液中添加果膠酶和β-葡聚糖酶(1:1質(zhì)量比，酶活同本發(fā)明，果膠酶酶活為300-3000u/ml，β-葡聚糖酶酶活為3000-30000u/ml)，按質(zhì)量比，所述復(fù)合酶與人參藥材的比為0.07：1。然后置于酶解罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)4天，得人參酶解中間產(chǎn)物；將所述中間產(chǎn)物進(jìn)行干燥后得人參酶解物。所述人參酶解物含水量低于6％。最后用細(xì)胞培養(yǎng)體系液制成濃度為2mg生藥材/ml的溶液，樣品標(biāo)記為對照樣品3。
陽性對照：5-氟尿嘧啶(5Fu)注射液，皮下注射，劑量為5毫克/公斤/天。
空白對照：以相同體積的生理鹽水為空白對照。
實驗方法：取結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26，于皮下接種于Balb/c小鼠，接種劑量為1×106/只。12天后，實施例1-5組取實施例1-5樣品用蒸餾水溶解后給鼠灌胃，每只小鼠灌胃劑量以人參藥材計、1.5克/公斤/天，每天灌胃1次。對照樣品1-3組取對照組1-3樣品用蒸餾水溶解后給鼠灌胃，每只小鼠灌胃劑量以人參藥材計、1.5克/公斤/天，每天灌胃1次。實施例1-5組和對照樣品1-3組，每天還給予皮下注射廣譜抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(5Fu)，劑量為5毫克/公斤/天。陽性對照組，每天單皮下注射廣譜抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(5Fu)，劑量為5毫克/公斤/天?？瞻讓φ战M采用相同體積的蒸餾水灌胃。
實施例1-3組、對照樣品1-3組、陽性對照組和空白組其他喂養(yǎng)相同。每組樣本例數(shù)為8只。連續(xù)進(jìn)行實驗20天時，記錄腫瘤大小(長和寬)，計算腫瘤體積，公式為1/2×長×寬2。腫瘤體積數(shù)值越低代表對該樣品對腫瘤的抑制作用越好。
實驗結(jié)果：檢測結(jié)果運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析軟件為SPSS16.0，分析計量數(shù)據(jù)多組間比較采用方差分析，顯著性水平為α＝0.05，p<0.05。實驗結(jié)果如表3所示。
表3協(xié)同抗腫瘤結(jié)果(單位：mm3)
注：*表示樣品與空白對照組比較，P＜0.01
結(jié)果顯示，第20天時，實施例1-5與化療藥聯(lián)用組，結(jié)腸癌腫瘤體積小于單純化療組(陽性對照)，且優(yōu)于對照樣品1-3組。本結(jié)果說明實施例1-5人參酶解物可以增強(qiáng)化療藥的抗腫瘤效果，可用于腫瘤化療的治療或輔助治療。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。