本發(fā)明屬于藥物技術領域，具體涉及一種依托泊苷立方液晶及其制備方法和應用。

背景技術：

依托泊苷(etoposide)又名足葉乙苷，鬼臼乙叉苷，化學名稱為9-(4,6-o-亞乙基-β-d-吡喃葡糖苷)-4′-去甲基表鬼臼毒素,簡稱vp-16，是由植物成分鬼臼脂素經多步化學合成衍生而得。依托泊苷為白色或類白色結晶粉末，無臭，有引濕性；難溶于水、乙醚，可溶于乙醇、易溶于甲醇、氯仿。在水中的溶解度58.7ug/ml，pka值為9.5，ph值在4-5時水溶液最穩(wěn)定。

依托泊苷對肺癌、白血病、睪丸癌、尤因氏瘤、妊娠胚芽細胞瘤、卡波濟氏瘤、何杰金氏病、神經母細胞瘤和兒童橫紋肌療效明顯，還可與其他藥物，如順鉑聯(lián)用治療卵巢癌、胃癌、肝癌等。它特異性地作用于細胞周期晚s期或g2期,干擾哺乳類動物dna拓撲異構酶ii，為拓撲異構酶的嵌入型抑制劑，使單鏈或雙鏈dna斷裂。這些細胞毒性機制決定了依托泊苷具有較高的社會和經濟價值。該藥為國際上公認的新型抗腫瘤藥物,也是迄今為止最成功的鬼臼毒素類抗腫瘤藥物。

依托泊苷為水難溶性藥物，一般為靜脈注射給藥，口服給藥可提高療效，但生物利用度非常低，只有50％,且個體差異較大。常見不良反應主要為血液學和消化道毒性，有脫發(fā)、食欲減退、惡心、嘔吐、心悸、頭暈，還有低血壓，靜脈炎及骨髓抑制等。靜脈與口服制劑相比較，嘔吐發(fā)生率較低，但有可能引發(fā)嚴重的過敏反應。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服藥物臨床應用時會出現(xiàn)不同程度的胃腸道反應、過敏反應、神經毒性等不良反應，提高藥物生物利用度、改善藥物在體內的穩(wěn)定性、降低毒副作用、實現(xiàn)靶向給藥。

本發(fā)明的目的之一在于提供一種依托泊苷立方液晶。

本發(fā)明的目的之二是提供了所述依托泊苷立方液晶的制備方法。

本發(fā)明的目的之三是提供了所述依托泊苷立方液晶的應用。

本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

一種依托泊苷立方液晶，所述依托泊苷立方液晶的平均粒徑大小為100～220nm，所述依托泊苷立方液晶的包封率為60～90％。

其中，所述依托泊苷立方液晶包含固液比為4～6:1(mg/ml)的固體原料和溶劑；

固體原料包括按照質量百分比計算的：

脂質材料75～90％

穩(wěn)定劑10～20％

依托泊苷3～8％

溶劑包括按照體積百分比計算的：

丙酮3～8％

去離子水92～97％。

較佳地，所述固體原料包括按照質量百分比計算的：

脂質材料75～85％

穩(wěn)定劑15～20％

依托泊苷3～6％。

其中，所述脂質材料，為植烷三醇、單油酸甘油酯、甘油單硬脂酸酯、甘油單月桂醇酯、十二/十四醇油酸酯中的一種或幾種組合物。

本發(fā)明選用脂質材料/h2o立方液晶在二元液晶體系相圖中占較大范圍，具有在室溫下能與水穩(wěn)定共存的性質，因此具備作為藥物載體的潛力；穩(wěn)定劑它有利于支撐體系的框架網絡結構。單油酸甘油酯(gmo)是一種難溶于水的兩親性物質，分子量為356.5399，hlb值為3.3，用作表面活性劑，潤滑劑等；優(yōu)選南通展億化工有限公司生產。本發(fā)明中優(yōu)選75～85％的用量，該用量為穩(wěn)定，實驗證明其溶液乳白色乳劑，不分層，無沉淀；如果單油酸甘油酯(gmo)的用量增加，平均粒徑先增加后減少，且液面出現(xiàn)油滴，可能gmo的用量已經達到飽和。

較佳地，所述穩(wěn)定劑為卵磷脂、乳化劑op、cremophorel、cremophorrh40、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、吐溫-80、油酸乙酯或西黃耆膠。優(yōu)選泊洛沙姆407(f127)。該穩(wěn)定劑不會出現(xiàn)油水分離，溶液均勻。其用量的改變對立方液晶的平均粒徑大小影響不大，但隨著穩(wěn)定劑用量的增加，立方液晶的穩(wěn)定性先增加后又降低，說明f127在一定范圍內可以參與脂質立方液晶結構的組裝，并能支撐整個骨架，但是當用量超過一定限度，其又可能會導致結構的破壞或者晶型結構的轉變。

所述依托泊苷立方液晶的制備方法，具體步驟為：

(1)稱取所述量的脂質材料，置于錐形瓶中，再加入所述量的依托泊苷和丙酮進行溶解，并用超聲清洗器超聲處理10～20min，作為a相；

(2)精密稱取所述量的穩(wěn)定劑，加入水，水浴加熱使其充分溶解、攪拌，制備成穩(wěn)定劑溶液，作為b相；

(3)將所述a相緩慢的滴加至所述b相中，室溫攪拌0.5～1.5h；不同的攪拌溫度對立方液晶的粒徑和穩(wěn)定性具有一定的影響。隨著溫度的增加，粒徑隨之增加，且穩(wěn)定性降低。為了盡可能選擇粒徑較小且穩(wěn)定的立方液晶，本發(fā)明最終選擇室溫下攪拌。不同的攪拌時間對立方液晶的平均粒徑具有一定的影響，而對穩(wěn)定性影響不明顯。在1-3h時間段，隨著攪拌時間的增加，平均粒徑隨之增加，而在0.5h時，粒徑反而比1h的還大，可能受丙酮揮發(fā)不完全的影響。為了盡可能選擇粒徑較小且穩(wěn)定的立方液晶，本發(fā)明最優(yōu)選擇攪拌1h。

(4)最后用細胞粉碎儀超聲處理，得所述依托泊苷立方液晶溶液。

較佳地，步驟(4)中，細胞粉碎儀超聲以250～350w處理3～8min，每5秒處理1次，每次之間間隔5秒。本發(fā)明在100w-250w間，隨著超聲功率的增加，平均粒徑隨之增加，而在100w-200w，立方液晶穩(wěn)定性低。為了盡可能選擇粒徑較小且穩(wěn)定的立方液晶，本發(fā)明最終選擇超聲功率250～350w。

隨著超聲次數(shù)的增加，平均粒徑先增加后降低至平穩(wěn)，對立方液晶穩(wěn)定性影響小。為了盡可能選擇粒徑較小的立方液晶，并減少超聲次數(shù)，本發(fā)明最終選擇每5秒處理1次，每次之間間隔5秒。

其中，a相(也叫藥物用量)和b相(也叫分散相)用量也很重要。

隨著b相(分散相)的增加，使平均粒徑先減小后增加，而穩(wěn)定性則提高了。分散相用量較少時，立方液晶納米粒濃度較高，樣品易于聚集，穩(wěn)定性下降。

隨著a相(藥物用量)藥物用量的增加，平均粒徑先增加后減小。但當投藥量達到15％，立方液晶穩(wěn)定性降低，說明藥物用量過高會對脂質立方液晶的脂質雙分子層造成影響，同時也可能使得納米粒的晶型結構發(fā)生改變。

本發(fā)明的制備過程簡單，而且對于熔點較高的藥物，采用乙醇(丙酮)溶解先制備成前體溶液，再分散至含穩(wěn)定劑的水溶液中進行制備。同時制備過程時間短，包封率易測定。

依托泊苷立方液晶的應用，將依托泊苷立方液晶制成中空栓劑；其制備具體為：

(1)取半合成脂肪酸甘油酯適量于水浴中融化，加入4％的吐溫-80，充分攪拌混勻，放冷至呈稍黏稠狀態(tài)，

(2)將步驟(1)中所得黏稠脂肪酸甘油酯中速灌裝到涂抹有水溶性潤滑劑的子彈型栓模中，常溫冷卻5min后，將栓模翻轉180度，使中心未凝的基質流出，形成空腔，放冷；

(3)精密量取依托泊苷立方液晶40ul填入中空栓殼內,用熔化的基質封口、放冷，刮平、脫模即得依托泊苷立方液晶栓劑。

較佳地，步驟(2)中所述中速灌裝到涂抹有水溶性潤滑劑的子彈型栓模中時，不填滿。

將依托泊苷立方液晶制成中空栓劑，其外層為基質制成的殼,空心可填充固態(tài)、液態(tài)和混懸態(tài)等各種狀態(tài)的藥物,與普通栓劑(cts)相比,中空栓劑(hts)具有釋藥速度快、生物利用度高、制劑穩(wěn)定性好和應用范圍廣等優(yōu)點,擴大了藥物的給藥途徑。cts具有許多其他劑型無可代替的優(yōu)點，經直腸給藥后，50％-75％減少肝藥酶對藥物的破壞，另一方面也減少藥物對肝臟的毒副作用和對胃腸黏膜的刺激，且直腸給藥避免了進食種類和進食時間的干擾，能使藥物規(guī)律穩(wěn)定地發(fā)揮藥效，可明顯提高藥物的生物利用度。hts作為一種改進的栓劑新劑型，比cts性質更穩(wěn)定、溶出更迅速、生物利用度更高。栓劑制備過程中，不需要特殊的儀器設備，工藝簡單易行，包裝、貯存和運輸?shù)确奖憧旖?，適于臨床大批生產。本發(fā)明將依托泊苷立方液晶制備成hts，通過直腸給藥，可以有效避免肝臟的首過消除，從而提高藥物的生物利用度。

本發(fā)明包括首先選擇脂質材料/水(gmo/h2o)體系，穩(wěn)定劑制備依托泊苷立方液晶，所得依托泊苷立方液晶的平均粒徑大小為100～220nm，所述依托泊苷立方液晶的包封率為60～90％；最后采用特殊藥用輔料組合將其制成中空栓劑。脂質立方液晶是兩親性脂質和表面活性劑在水中自發(fā)形成的液晶納米分散體系，即脂質和表面活性劑結合水形成液晶相，再以類似固體納米粒的形式分散在過量的水中形成的分散體系三維空間無限循環(huán)堆疊形成晶胞，晶胞繼續(xù)堆疊形成曲面度極小的緊密結構，即類似“蜂窩狀”的結構。在其網絡狀的立方晶格中有微小的水道結構(完全溶脹狀態(tài)下大小為5nm)，兩條水通道互不相通，一條與外水道相連，而另一條是封閉的，具有巨大的表面積。立方相能夠包結各種不同極性的藥物，水溶性藥物可以包結在立方液晶的水道中；油溶性的藥物能包結在立方液晶的雙分子層膜中；雙親性藥物包結于界面處。立方液晶的獨特結構使其在醫(yī)藥領域的應用具有很多優(yōu)點，比如能夠增溶、分散、保護藥物分子、熱力學穩(wěn)定、可降解、生物親和性和粘附性好等。

因此，采用脂質立方液晶作為藥物載體包封依托泊苷，一方面可以提高其在體外的穩(wěn)定性和溶解性，另一方面可以明顯提高其體內生物利用度，并且具有緩釋和靶向作用，增強了依托泊苷在體內治療的療效目前國內外上市的依托泊苷制劑主要是口服膠囊和靜脈注射劑，但是依托泊苷口服制劑生物利用度低，而靜脈注射劑為非水溶劑注射劑，臨用前用生理鹽水稀釋時容易形成細微沉淀，引起較強的局部刺激；且依托泊苷水溶液的化學穩(wěn)定性較差。因此，采用脂質立方液晶作為藥物載體包封依托泊苷，一方面可以提高其在體外的穩(wěn)定性和溶解性，另一方面可以明顯提高其體內生物利用度，并且具有緩釋和靶向作用，增強了依托泊苷在體內治療的療效。

總之，本發(fā)明不僅提高了藥物生物利用度、改善了藥物的穩(wěn)定性、降低了毒副作用、實現(xiàn)了靶向給藥；而且制備過程簡單、儀器易得，制備時間短。

附圖說明

圖1為依托泊苷立方液晶粒徑分布圖

圖2為依托泊苷立方液晶洗脫后色譜圖

圖3為依托泊苷立方液晶洗脫前色譜圖

圖4依托泊苷標準曲線

圖5依托泊苷對照片色譜圖

圖6依托泊苷立方液晶色譜圖

圖7空白立方液晶色譜圖。

具體的實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以助于本領域技術人員理解本發(fā)明。

實施例1

一種依托泊苷立方液晶，所述依托泊苷立方液晶的平均粒徑大小為208nm，所述依托泊苷立方液晶的包封率為65％。

制備方法：稱取gmo0.1g，于50ml錐形瓶中，加入5mg依托泊苷和1ml丙酮進行溶解，并用超聲清洗器超聲處理15min，作為a相；精密稱取f1270.02g，加入20ml水，水浴加熱使充分溶解，攪拌，制備成濃度為0.1％f127的溶液，使成b相。將a相緩慢的滴加至b相中，室溫攪拌1h。再于細胞粉碎儀超聲以300w處理5min，5秒1次(間隔5秒)，得依托泊苷立方液晶溶液。

依托泊苷立方液晶的應用，將其制成中空栓劑；其制備具體為：

(1)取半合成脂肪酸甘油酯適量于水浴中融化，加入4％的吐溫-80，充分攪拌混勻，放冷至呈稍黏稠狀態(tài)，

(2)將步驟(1)中所得黏稠脂肪酸甘油酯中速灌裝到涂抹有水溶性潤滑劑的子彈型栓模中(不填滿)，常溫冷卻5min后，將栓模翻轉180度，使中心未凝的基質流出，形成空腔，放冷；

(3)精密量取依托泊苷立方液晶40ul填入中空栓殼內,用熔化的基質封口、放冷，刮平、脫模即得依托泊苷立方液晶栓劑。

實施例2

一種依托泊苷立方液晶，所述依托泊苷立方液晶的平均粒徑大小為180nm，所述依托泊苷立方液晶的包封率為75％。

制備方法：稱取植烷三醇0.08g，于50ml錐形瓶中，加入6mg依托泊苷和0.8ml丙酮進行溶解，并用超聲清洗器超聲處理13min，作為a相；精密稱取卵磷脂0.018g，加入22ml水，水浴加熱使充分溶解，攪拌，制備成濃度為0.08％卵磷脂的溶液，使成b相。將a相緩慢的滴加至b相中，室溫攪拌1.2h。再于細胞粉碎儀超聲以280w處理4min，5秒1次(間隔5秒)，得依托泊苷立方液晶溶液。

依托泊苷立方液晶的應用，將其制成中空栓劑；其制備具體同實施例1。

實施例3

一種依托泊苷立方液晶，所述依托泊苷立方液晶的平均粒徑大小為100nm，所述依托泊苷立方液晶的包封率為90％。

制備方法：稱取甘油單月桂醇酯0.12g，于50ml錐形瓶中，加入4mg依托泊苷和1.2ml丙酮進行溶解，并用超聲清洗器超聲處理17min，作為a相；精密稱取cremophorrh400.022g，加入22ml水，水浴加熱使充分溶解，攪拌，制備成濃度為0.1％cremophorrh40的溶液，使成b相。將a相緩慢的滴加至b相中，室溫攪拌0.8h。再于細胞粉碎儀超聲以320w處理5min，5秒1次(間隔5秒)，得依托泊苷立方液晶溶液。

依托泊苷立方液晶的應用，將其制成中空栓劑；其制備具體同實施例1。

實施例4

一種依托泊苷立方液晶，所述依托泊苷立方液晶的平均粒徑大小為220nm，所述依托泊苷立方液晶的包封率為60％。

制備方法：稱取十二醇油酸酯0.05g和十四醇油酸酯0.05g，于50ml錐形瓶中，加入5mg依托泊苷和1ml丙酮進行溶解，并用超聲清洗器超聲處理15min，作為a相；精密稱取油酸乙酯0.02g，加入20ml水，水浴加熱使充分溶解，攪拌，制備成濃度為0.1％油酸乙酯的溶液，使成b相。將a相緩慢的滴加至b相中，室溫攪拌1h。再于細胞粉碎儀超聲以300w處理5min，5秒1次(間隔5秒)，得依托泊苷立方液晶溶液。

依托泊苷立方液晶的應用，將其制成中空栓劑；其制備具體同實施例1。

上述實施例，只是本發(fā)明的較佳實施例，并非用來限制本發(fā)明實施范圍，故凡以本發(fā)明權利要求所述的特征及原理所做的等效變化或修飾，均應包括在本發(fā)明權利要求范圍之內。

1.包封率測定

選擇微柱離心法，取一定量葡聚糖凝膠g-50用去離子水充分溶脹24h，裝入5ml注射器中，高度大概占注射器高度的5/6，放入離心機中，以2000r/min離心3min，充分除去柱中水分。

用微量取樣器吸取最優(yōu)處方依托泊苷立方液晶樣品1ml，加于脫水后的g-50凝膠柱頂部，在離心機中以500r/min轉速離心5min。在凝膠柱頂端加入1ml去離子水進行洗脫，在離心機中以2000r/min離心5min，重復6次。收集洗脫液用甲醇進行破乳，破乳后，加于10ml容量瓶中用甲醇進行定容，搖勻。0.45μm微孔濾膜過濾后，進樣，記錄峰面積(見圖2)，算出濃度c。

用微量取樣器吸取最優(yōu)處方依托泊苷立方液晶樣品1ml，用甲醇進行破乳，破乳后，加于10ml容量瓶中用甲醇進行定容，搖勻。0.45μm微孔濾膜過濾后，進樣，記錄峰面積(見圖3)，算出濃度c0以及包封率。(見表1)

表1最優(yōu)處方依托泊苷立方液晶包封率結果

2.依托泊苷立方液晶粒徑分布

取依托泊苷立方液晶混懸液適量，加入一定量的蒸餾水進行稀釋，用bh-9300ht激光粒度分布儀測定其粒徑分布(見圖1)。

3.含量測定

3.1樣品溶液的制備

(1)對照品溶液的制備

取依托泊苷對照品適量，精密稱定，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為51ug/ml的對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備

取依托泊苷立方液晶混懸液1ml至10ml量瓶中，加入甲醇超聲處理，并定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

(3)空白溶液的制備

取空白立方液晶混懸液1ml至10ml量瓶中，加入甲醇超聲處理，并定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2色譜條件

按照2015年版《中國藥典》二部依托泊苷含量測定項下確定色譜條件如下:

色譜柱：hypersilodsc18柱(250mm×4.6mm,5μm)；

流動相：乙腈-醋酸鹽緩沖液(ph4.0)(30：70)；

流速：1.0ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：254nm；

進樣量：20ul；

理論塔板數(shù)：按依托泊苷計算不得低于3000

3.3方法學考察

(1)標準曲線的建立

在本色譜條件下，分別吸取依托泊苷對照品溶液1ml、2.5ml、5ml、10ml、25ml，于25ml容量瓶中用甲醇定容制得5個對照品溶液，過濾后取續(xù)濾液20μl，進高效液相色譜儀測定含量，以峰面積對濃度進行線性回歸，得回歸方程。(見表2，圖4)

表2依托泊苷標準曲線測定結果

(2)專屬性試驗

在本色譜條件下，分別吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液20μl注入高效液相色譜儀，測定，查看色譜圖，比較。(見圖5、6、7)結果表明，空白立方液晶對依托泊苷脂質立方液晶依托泊苷的含量測定沒有干擾。

(3)精密度試驗

精密量取依托泊苷立方液晶溶液5份，按照供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取供試品溶液20μl注入高效液相色譜儀，依法測定，計算藥物濃度的rsd。(見表3)

表3精密度試驗結果

(4)重復性試驗

精密量取依托泊苷立方液晶溶液5份，按照供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取供試品溶液20μl注入高效液相色譜儀，依法測定，計算藥物濃度的rsd。(見表4)

表4重復性試驗結果