專利名稱：富羥脯氨酸蛋白及含有這種蛋白的藥用和化妝用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富羥脯氨酸糖蛋白，這種蛋白可以從植物材料中獲得，還涉及它的藥用和化妝用用途。
更確切地講，本發(fā)明涉及富羥脯氨酸糖蛋白，可以通過酸性醇萃取法從紅豆杉(Taxus spp.)、銀杏(Gingko biloba)、番茄(Lycopersicum esculentum)和胡蘿卜(Daucus carota)細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得這種蛋白，其具有以下特征-平均分子量20,000Da，波動(dòng)范圍為12,000-38,000，通過凝膠滲透和電泳測(cè)得；-可溶于酸性水溶液。
已知源于動(dòng)物的某些糖蛋白，如膠原和蛋白聚糖在原樣或摻入合適的組合物中后進(jìn)行表面涂敷時(shí)能產(chǎn)生有益作用。
膠原是一種富脯氨酸和羥脯氨酸的糖蛋白，可將其直接用于或與其它多肽基質(zhì)混合后用于治療與不良的皮膚水化和彈性相關(guān)的皺紋和其它有損容貌的缺陷。不過，源于動(dòng)物的膠原的應(yīng)用是受限制的，因?yàn)槠渲写嬖诒徊《竞投舅匚廴镜奈ｋU(xiǎn)。盡管源于植物的化合物不存在這種風(fēng)險(xiǎn)，但迄今為止其在化妝品中的應(yīng)用卻十分有限例如，已知化妝用組合物含有諸如蘆薈之類的植物的粗提物或諸如鱷梨之類的切碎的完整植物。
已了解到，被稱為伸展蛋白的植物糖蛋白是由處于增殖期的植物細(xì)胞所產(chǎn)生的，而且具有類似于動(dòng)物膠原的結(jié)構(gòu)。EP-A-05334078中披露了平均分子量在100,000Da以上的伸展蛋白在化妝品中的應(yīng)用。然而，迄今所公開的用于提取伸展蛋白的方法都包括用鹽水溶液萃取各種來源的植物材料，接著用諸如三氯乙酸之類的強(qiáng)酸純化，這些方法不能獲得用于化妝品的合適產(chǎn)物，由于存在可溶性、穩(wěn)定性、再現(xiàn)性及其化學(xué)-物理特征一致性的問題。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過下述方法可以獲得結(jié)構(gòu)上類似于上述伸展蛋白、但分子量較低、在酸性水溶液中可溶性較高的富羥脯氨酸糖蛋白，該方法包括體外培養(yǎng)選擇的植物的細(xì)胞，并用酸性醇溶液萃取上述生長(zhǎng)于合適培養(yǎng)基中的細(xì)胞。
通過本發(fā)明方法所獲得的糖蛋白，其水化、成膜、調(diào)色和結(jié)瘢特性優(yōu)于膠原的相應(yīng)特性。因此，本發(fā)明的糖蛋白可用于化妝用組合物或皮膚病用組合物中，用于治療干皮病、牛皮癬、鱗癬、皮屑、角化病、皺紋、痤瘡、濕疹、炎性皮膚病、皮膚老化以及所有其它曾建議采用動(dòng)物膠原的用途中。
本發(fā)明糖蛋白的水溶液保持穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生能導(dǎo)致不可溶的產(chǎn)物形成的任何糖蛋白聚合作用。另外，這種溶液的粘度特別高，而且不取決于其濃度；令人吃驚的是，其0.1％的濃度即具有與1％膠原或5％植物白蛋白溶液相同的成膜和水化力。
待萃取的植物材料獲自紅豆杉、銀杏、番茄和胡蘿卜細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)物。優(yōu)選采用獲自紅豆杉、銀杏和番茄的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是常見的，包括用來自諸如葉、皮、根、莖或種子之類的植物各部分的愈傷培養(yǎng)物進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，該方法如Dobbs和Roberts所述(Experiments inPlant Tissne Culture，2nd ed.，Cambridge University Press，New York，1985)。
上述植物愈傷組織在滅菌并選擇性地添加抗細(xì)菌劑后，通常被用作合適的液體培養(yǎng)基的接種物，如在上述Dobbs和Roberts的手冊(cè)中所述。特別適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基是Murashige and Skoog培養(yǎng)基。添加諸如脯氨酸、還原劑、乙烯或諸如Ethephon或L-氨基環(huán)丙烷羧酸之類的能釋放乙烯的化合物之類的添加劑適合于提高目的糖蛋白的產(chǎn)量。
優(yōu)選以萘乙酸作為植物生長(zhǎng)素，以6-(γ，γ-二甲氨基)嘌呤為細(xì)胞激動(dòng)素，以維生素和3％的糖為碳源?？筛鶕?jù)所選擇的材料添加適量維生素C，以防止最終的產(chǎn)物褐變。
發(fā)酵時(shí)間在3-12天之間，優(yōu)選在5-6天之間。一旦發(fā)現(xiàn)結(jié)束就對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行離心，并在存在稀釋的無機(jī)酸、優(yōu)選為氫氯酸或硫酸的條件下，用醇，優(yōu)選為乙醇萃取細(xì)胞材料。該方法能使某些可能破壞本發(fā)明糖蛋白穩(wěn)定性的酶失活，特別是使多酚氧化酶和酪氨酸氧化酶失活，這些酶能使糖蛋白聚合，從而形成不可溶的產(chǎn)物。
在有無機(jī)酸的條件下進(jìn)行醇萃取，可以徹底提取出堿性糖蛋白，而且已證實(shí)其對(duì)這種用途具有高度選擇性。除乙醇之外，還可采用諸如甲醇或異丙醇之類的可水溶混的醇。對(duì)所得到的水醇提取物進(jìn)行中和，然后濃縮并加熱至70-100℃溫度，優(yōu)選為80℃左右，接近完全沉淀變性蛋白。通過濃縮澄清懸浮液，并對(duì)該液體進(jìn)行分級(jí)超濾，以除去高和低分子量物質(zhì)。超濾是用截?cái)喾肿恿繛?0,000-40,000 Da的聚磺酸膜，如CentriconR或RomiconR進(jìn)行，其纖維可以是空心的或是卷曲的。對(duì)所得到的過濾產(chǎn)物進(jìn)行電透析，以除去不需要的物質(zhì)，如鹽和低分子量糖。經(jīng)過濾和透析后得到的溶液，可直接用于化妝品或藥品中，或?qū)⑵錆饪s至較小體積，然后凍干或霧化。
通過高壓液相層析(HPLC)進(jìn)行凝膠滲透，對(duì)本發(fā)明的產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，所述HPLC由一個(gè)Waters泵裝置組成，并具有一個(gè)Ultrahydrogel Linear WatersR柱組30cm×0.5cm和Waters UV吸收檢測(cè)器，484型。將含有0.067M磷酸二氫鉀、0.1M NaCl和6×10-4MNaN3的水溶液用作洗脫劑。將待分析的糖蛋白樣品溶于同一洗脫溶液(3mg/10ml)中，測(cè)定目的物和被選作分子量在細(xì)胞色素C(12，400Da)和葡聚糖藍(lán)(2,000,000 Da)之間的參照物的標(biāo)的量；可通過在12.5％聚丙烯酰胺凝膠和4％積層凝膠上電泳分別或同時(shí)測(cè)定所述產(chǎn)物或其中間產(chǎn)物。將待分析的樣品溶于含有SDS和0.1％巰基乙醇的緩沖液中，使沉淀量為100～300mg。在20mA的穩(wěn)定電流下進(jìn)行遷移4小時(shí)。用5種標(biāo)準(zhǔn)分子量(7kD、14kD、24kD、54kD和66kD)繪制計(jì)量曲線。由該計(jì)量曲線計(jì)算出兩條主帶的分子量為22.5kD和25kD，而兩條較弱帶的分子量為31kD和34kD。用本文所披露的方法可從來源于不同植物的各種細(xì)胞外植體中獲得分子量相當(dāng)和氨基酸組成相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物混合物。下面以舉例方式給出自銀杏細(xì)胞中提取的糖蛋白的氨基酸分析結(jié)果。氨基酸 峰面積 ％Asp 4.399Glu 4.328Hyp 17.505Ser 7.065Gly 6.056Hys 1.782Arg 2.471Thr 4.739Pro 10.036Ala 8.2Tyr 2.388Val 6.162Met 1.154Ile 2.479Leu 5.525Phe 1.862Lys 14.254上述數(shù)據(jù)相當(dāng)于糖蛋白混合物中氨基酸總量的百分比。該混合物中的糖為阿拉伯糖和半乳糖。各種產(chǎn)物中氨基酸與糖之比的平均值為2∶1。
如上所述，本發(fā)明的產(chǎn)品既可應(yīng)用于藥品領(lǐng)域又可應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。對(duì)于藥品領(lǐng)域來說，可將該產(chǎn)品摻入凝膠或軟膏中，或用在醫(yī)用紗布上用于燒傷或傷口的特殊治療。在這種場(chǎng)合通常要對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行滅菌或滅菌過濾和凍干。
可以用傳統(tǒng)方法制備本發(fā)明的化妝用和皮膚病用制劑。使用形式的例子包括水成噴霧劑、洗液、溶液、乳液、凝膠、藥膏和乳油。
本發(fā)明的化妝用和皮膚病用制劑可以含有重量百分比為約0.01～約50％的富羥脯氨酸糖蛋白，優(yōu)選為0.05～5％，還含有常用的賦形劑。由于本發(fā)明糖蛋白的高穩(wěn)定性，可以獲得含有50％以上可溶性富羥脯氨酸糖蛋白的藥用和化妝用制劑。
可將本發(fā)明的糖蛋白直接加入藥用和化妝用制劑中或進(jìn)行微膠囊化，以產(chǎn)生長(zhǎng)效水化作用。這種微膠囊可以是親水的或親脂的。本發(fā)明的制劑可以含有對(duì)于預(yù)想目標(biāo)有互補(bǔ)或有用活性的其它活性成分。
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
例1制備用于糖蛋白生產(chǎn)的銀杏愈傷組織和液體培養(yǎng)物在0.1％Tween 80(R)溶液中洗滌銀杏嫩葉，制備這種嫩葉的外植體。將葉片切成約0.5cm大小，并用75％乙醇預(yù)滅菌1分鐘。然后用2％次氯酸鈉溶液滅菌，并在無菌水中洗滌3次。將所得外植體轉(zhuǎn)移到裝在培養(yǎng)皿里的Murashige & Skoog培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有3％蔗糖并添加了Lynsmeyer & Skoog維生素和諸如2，4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸之類的激素。將上述產(chǎn)物在黑暗中、在23℃下培養(yǎng)20天。在這一時(shí)期結(jié)束時(shí)，得到易碎的愈傷組織，它易于生長(zhǎng)并可以在同一條件下繼代培養(yǎng)的方式連續(xù)傳代，因?yàn)榭蓪⑵溆糜谥苽湟后w培養(yǎng)基。將該愈傷組織用于接種盛有200ml Murashige & Skoog培養(yǎng)基的Erlenmeyer燒瓶，該培養(yǎng)基中添加了萘乙酸和6(γ，γ-二甲氨基)嘌呤，Lynsmeyer&Skoog維生維和3％蔗糖作為碳源。在攪拌和連續(xù)光照條件下將所述燒瓶培養(yǎng)4天。然后收獲細(xì)胞的生物材料用于提取糖蛋白。
例2由銀杏細(xì)胞制備糖蛋白對(duì)按例1方法得到的培養(yǎng)物進(jìn)行低速離心，并用1升含有1％硫酸的70％乙醇對(duì)收獲的細(xì)胞(鮮重1.5kg)進(jìn)行萃取。重復(fù)萃取2次，從而定量回收堿性糖蛋白。中和以后對(duì)提取物進(jìn)行過濾，以除去混濁物，在真空中于50℃下濃縮，直到所有的乙醇都被完全除去。將該含水濃縮物在85℃下加熱30分鐘，并再次離心，以除去沉淀，將沉淀?xiàng)壋?。用具?0,000Da截?cái)鄻O限的CentriconR對(duì)所獲得的澄清溶液進(jìn)行超濾，以排除較高分子量。
再用截?cái)喾肿恿繛?0,000Da的空心纖維膜對(duì)上述過濾產(chǎn)物進(jìn)行超濾，以除去非糖蛋白低分子量物質(zhì)。接著對(duì)濾液進(jìn)行透析，并濃縮成1％的固體殘余物。得到1.5升略為粘稠的產(chǎn)物，可將這種產(chǎn)物直接用于化妝用組合物。在電泳分析時(shí)，該產(chǎn)物含有6條帶，其中4條的分子量為16,000、22,000、33,000和36,000Da。
例3由蕃茄制備糖蛋白按照例1的方法用滅菌的蕃茄芽在盛有10升Murashige & Skoog培養(yǎng)基的14升發(fā)酵罐中制備細(xì)胞材料，所述培養(yǎng)基中加入萘乙酸和6(γ，γ-二甲氨基)-嘌呤，Lynsmeyer & Skoog維生素和3％蔗糖作為碳源。發(fā)酵在23℃下進(jìn)行5天，同時(shí)以150rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，發(fā)酵是在有0.05％的酵母提取物和大約70％溶解氧的條件下進(jìn)行。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)收集發(fā)酵液，并通過0.2μm的陶瓷膜進(jìn)行微量過濾以濃縮細(xì)胞。將一定量的含0.5％氫氯酸的異丙醇加入所獲得的細(xì)胞糊狀物中，并用例2的方法進(jìn)行提取。獲得含有0.5％干殘余物的3.5升溶液。對(duì)凍干的溶液進(jìn)行分析，分別得出10％的脯氨酸含量和31％羥脯氨酸含量。
例4化妝用組合物100g O/W乳液中含有例2或3的溶液 10.0g乙?；蛎糚EG-10 2.0g鯨蠟基-十八烷醇 1.5g鯨蠟醇十六酸酯 2.0g硬脂酸 7.0g辛酸辛酯 7.5g鯨蠟基磷酸鉀 0.5g防腐劑 適量香料 適量純化水 適量，加至100g的總重量例5化妝用組合物100g的O/W乳液中含有例2或3的溶液 10.0g鯨蠟基十八烷基葡糖苷 5.0g西蒙得油(Jojoba oil) 10.0g二甲聚硅氧烷 0.5g十四烷酸異丙酯 8.0g抗氧化劑 適量防腐劑 適量香料 適量純化水 適量，加至總重量為100g
權(quán)利要求
1.富羥脯氨酸糖蛋白，可以用酸性醇萃取法從紅豆杉、銀杏、蕃茄和胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得，其具有以下特征-平均分子量為20,000Da，波動(dòng)范圍為12,000～38,000，通過凝膠滲透和電泳測(cè)得；-高的水溶性。
2.一種用于制備權(quán)利要求1的糖蛋白的方法，該方法包括a)在一種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)紅豆杉、銀杏、蕃茄和胡蘿卜細(xì)胞3-12天；b)在有稀無機(jī)酸的條件下用水可溶混的醇提取細(xì)胞材料；c)中和、濃縮并在70～100℃的溫度下加熱所述提取物；d)離心、分級(jí)超濾并透析。
3.含有權(quán)利要求1的糖蛋白作為活性成分的化妝用和藥用制劑，具有水化、成膜、調(diào)色和結(jié)瘢特性。
4.如權(quán)利要求3的制劑，其為水成噴霧劑、洗液、溶液、乳液、凝膠、軟膏、乳油和醫(yī)用紗布形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及富羥脯氨酸糖蛋白,可以通過酸性醇萃取法從紅豆杉、銀杏、蕃茄和胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得這種糖蛋白,其具有以下特征:平均分子量為20,000Da,波動(dòng)范圍為12,000～38,000,是通過凝膠滲透和電脈測(cè)得;高的水溶性。
文檔編號(hào)A61K8/96GK1171822SQ95197140
公開日1998年1月28日 申請(qǐng)日期1995年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月28日
發(fā)明者E·伯姆巴德里, C·普佐恩 申請(qǐng)人:因迪納有限公司