專利名稱：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子反義寡聚脫氧核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)反義寡聚脫氧核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，antisense ODN)及其應(yīng)用。
目前治療腫瘤的各種藥物主要是針對腫瘤細(xì)胞本身進(jìn)行的，但惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管，這主要表現(xiàn)在(1)腫瘤組織如無血管侵入，其體積不會超過2∽3mm3；(2)快速生長的腫瘤常因血管生長滯后，局部營養(yǎng)減弱而發(fā)生缺血壞死；(3)腫瘤增殖程度與腫瘤新生血管形成呈正相關(guān)。故抑制腫瘤新生血管形成和生長可阻止腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，開辟腫瘤治療的第二戰(zhàn)場。很多疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病、化學(xué)損傷引起的失眩等也與VEGF異常表達(dá)、新生血管形成生長有關(guān)。抑制VEGF的異常表達(dá)和新生血管的形成生長，可為這類疾病的治療提供新的方法。
已發(fā)現(xiàn)的血管生長抑制劑已有數(shù)十種之多，但由于治療時劑量毒副作用太大而不能用于臨床，如TNP和煙酰胺等。此外，雖然發(fā)現(xiàn)至少有十四種生長因子具有刺激新生血管形成的作用，但只有VEGF專一作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF是一類新發(fā)現(xiàn)的于1979年首次從腫瘤分泌物中分出的生長因子(DvorakHF，et al．J．Immunol．1979，122166-174)。它高效，特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)烈的促有絲分裂作用和趨化作用，在體內(nèi)可刺激血管的發(fā)生與生長，并可提高血管壁的通透性。它在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)很小，在惡性實(shí)體瘤則高表達(dá)，表達(dá)量與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。而且現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多生長因子，如TGF-β，刺激新生血管形成的作用是全部或部分通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的(Harold F，et al．American J．Pathology．1995，1461029-39)。
已有研究用VEGF的單克隆或多克隆抗體有效抑制新生血管形成和腫瘤的生長。(Asano M，et al．Cancer Res．1995，555296-301；Warren RS，et al．J．Clin．Invest．1995，95∶1789-97；Borgstrom P，et al．Cancer Res．1996，564032-9)。該藥是一種蛋白質(zhì)類藥物。
反義寡聚脫氧核苷酸技術(shù)(Agraival，Trends in Biotech，1992，10152)的作用機(jī)理已經(jīng)清楚。它可通過堿基互補(bǔ)配對與雙鏈DNA形成三鏈，或與RNA形成雜交雙鏈，從而阻斷基因的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯。它也可以激發(fā)RNaseH活力，降解RNA、DNA雜交雙鏈中的RNA鏈或以其它的方式最終阻斷基因的表達(dá)。采用反義寡聚脫氧核苷酸技術(shù)，設(shè)計合成VEGF的反義寡聚脫氧核苷酸。由于反義ODN只能與反向互補(bǔ)的靶序列結(jié)合，因此具有比上述單抗、多抗更高的專一性，更低的毒副作用。
海布里頓公司的發(fā)明專利申請公開說明書(公開號CN1131437A，1996年)，題目為反義寡核苷酸對血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的抑制作用。報道了八種反義寡聚脫氧核苷酸。作用于人和小鼠VEGF mRNA的-16-3，8-24，72-88，688-708四個位點(diǎn)，他們僅做了RNA酶H消化試驗，對鼠VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)抑制試驗。他們并未進(jìn)行反義寡聚脫氧核苷酸在整體生物體內(nèi)抑制新生血管的生長試驗和反義寡聚脫氧核苷酸在整體生物體內(nèi)抑制腫瘤生長的試驗。因此，合成新的反義寡聚脫氧核苷酸，深入地進(jìn)行上述兩個試驗工作，以更清楚地證明反義寡聚脫氧核苷酸可抑制新生血管的生長和抑制腫瘤的生長，是一個很有意義的研究課題。
為此，本發(fā)明的目的是提供一類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子反義寡聚脫氧核苷酸，它們是可與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子mRNA反向互補(bǔ)的五種反義寡聚脫氧核苷酸，可有效地抑制細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，抑制整體動物體內(nèi)和人體內(nèi)新生血管的形成與生長，抑制腫瘤的生長。
根據(jù)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子cDNA順序，進(jìn)行計算機(jī)模擬，選擇mRNA中高級結(jié)構(gòu)松散部位的53-73位和138-156位作為靶位點(diǎn)。五種反義ODN的序列見表1。
表1反義寡聚脫氧核苷酸的序列，修飾和作用部位
據(jù)此設(shè)計作用于VEGF mRNA 53-73位和138-156位的五種反義寡聚脫氧核苷酸。No．158(5′*TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′)作用于53-73位，它的5′末端帶不能與mRNA反向互補(bǔ)的TCCA序列，該四核苷酸可與3′末端的TGGA反向互補(bǔ)，形成大環(huán)。No．176(5′GCA GTA GCT GCGCTG ATA G 3′)作用于138-156位，為線性結(jié)構(gòu)，不含任何修飾。No．182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3’)作用于138-156位，在No．176的核酸序列上加了3′三核苷酸，形成大環(huán)修飾，并且其5′及3′各三個磷酸根上有一個氧原子被硫取代(phosphorothiate)。No．157(5’GCA GTA GCTGCG CTG ATA GTGC 3′)作用于138-156位，與No．182的序列完全相同，5′末端形成大環(huán)。No．177(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA GCGC 3′)作用于138-156位，為No．176的3′端加了CGC三核苷酸，可與片段中的GCG形成小環(huán)。所有修飾均可起到保護(hù)反義寡聚脫氧核苷酸的作用，使其不易被體內(nèi)核酸酶降解。
另外作為藥效試驗的對照，設(shè)計了正義片段，即與mRNA序列相同的片段(No．102，5′CTA TCA GCG CAG CTA CTG C3′)和組成與No．176完全相同而序列不同的錯義片段(No．101，5′CCT CGT CAT GAG ACA CGT C3′)。
上述各種反義寡聚脫氧核苷酸，用ABI 392型DNA合成儀合成(按照ABI392型DNA合成儀說明書進(jìn)行)，用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化，或用快速高效液相色譜(FPLC)純化。
在牛臍血管內(nèi)皮細(xì)胞測VEGF活力系統(tǒng)中，測定上述各種反義寡聚脫氧核苷酸抑制S180腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的情況。結(jié)果表明，正義寡聚脫氧核苷酸(No．102)和錯義寡聚脫氧核苷酸(No．101)對S180細(xì)胞VEGF表達(dá)無抑制作用，而本發(fā)明的五種反義寡聚脫氧核苷酸(No．158，No．176，No．182，No．157，No．177)或No．157與No．158及No．182與No．158的混合物均可抑制S180細(xì)胞VEGF的表達(dá)。在小鼠角膜S180肉瘤模型上，測定各種反義寡聚脫氧核苷酸對新生血管生長和對腫瘤生長的影響，結(jié)果表明正義寡聚脫氧核苷酸(No．102)和錯義寡聚脫氧核苷酸(No．101)對新生血管的生長、腫瘤的生長均無抑制作用，而本發(fā)明五種反義寡聚脫氧核苷酸(No．158，No．176，No．182，No．157，No．177)及No．182與No．158的混合物均有抑制作用。結(jié)果表明本發(fā)明的所有反義寡聚脫氧核苷酸均可有效地抑制VEGF的表達(dá)，新生血管的生長和腫瘤的生長。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明根據(jù)VEGF cDNA序列設(shè)計合成的5種VEGF反義寡聚脫氧核苷酸，與海布里頓公司的VEGF反義寡聚脫氧核苷酸相比，作用位點(diǎn)不同，化合物種類不同，可有效地抑制細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，抑制整體動物內(nèi)新生血管的形成和生長，抑制整體動物體內(nèi)腫瘤的生長。它比VEGF單克隆抗體或多克隆抗體有更高的底物專一性和更低的毒副作用。并經(jīng)整體動物試驗表明本發(fā)明可應(yīng)用于配制成治療腫瘤與新生血管形成的有關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1．五種反義寡聚脫氧核苷酸及兩種混合物對VEGF表達(dá)的抑制曲線圖。
實(shí)施例1 VEGF反義寡聚脫氧核苷酸片段的設(shè)計和合成根據(jù)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子cDNA順序，進(jìn)行計算機(jī)模擬，選擇VEGFmRNA中高級結(jié)構(gòu)松散的53-73位和138-156位作為靶位點(diǎn)。據(jù)此設(shè)計作用于VEGF mRNA 53-73位和138-156位的五種反義寡聚脫氧核苷酸。1．No．158(5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′)作用于53-73位，它的5′末端帶不能與mRNA反向互補(bǔ)的TCCA序列，該四核苷酸可與3′末端的TGGA反向互補(bǔ)，形成大環(huán)。2．No．176(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3′)作用于138-156位，不含任何修飾，3．No．182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTGATA G*T*G*C 3′)作用于138-156位，與No．157的核酸序列完全相同，但5′及3′各三個磷酸根被硫取代(phosphorothiate)，4．No．157(5′GCAGTAGCTGCGCTGA TAGTGC 3′)作用于138-156位，在No．176的3′端加了TGC三核苷酸，使其可與5′末端形成大環(huán)。5．No．177(5′GCAGTAGCT GCGCTGAT AGCGC 3′)作用于138-156位，為No．176的3′端加了CGC三核苷酸，可與片段中的GCG形成小環(huán)。所有修飾(No．158，No．182，No．157，No．177．)均可起到保護(hù)寡聚脫氧核苷酸的作用，使其不易被體內(nèi)核酸酶降解。另外作為藥效試驗的對照，設(shè)計了正義片段，即與VEGF mRNA138-156位序列相同的片段(No．102，5′CTA TCA GCG CAG CTA CTG C3′)和組成與No．176完全相同而序列不同的錯義片段(No．101，5′CCT CGT CAT GAG ACA CGT C3′)。用ABI 392型DNA合成儀合成(按照ABI 392型DNA合成儀說明書進(jìn)行)，10％PAGE純化，或FPLC純化。
實(shí)施例2反義寡聚脫氧核苷酸抑制小鼠S180細(xì)胞表達(dá)VEGF1．S180腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗S180腫瘤細(xì)胞在含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)繁殖到一定數(shù)目，離心收集，PBS洗三次，改換無血清培養(yǎng)基，種至96孔板上，每孔為200μl體積，含有10×104個細(xì)胞。分別加入不同劑量的不同反義寡聚脫氧核苷酸(體積均為5μl)，每12小時加一次，相同條件下培養(yǎng)，第三天收集培養(yǎng)液，4℃離心收集上清。組別共9個大組，每大組包括對照共5個濃度組。No．157(5′GCAGTA GCTGCGCTGA TAGTGC 3′)，濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．158(5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′)，濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．177(5′CAGTAGCT GCGCT GAT AGCGC 3′)，濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．176(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3′)，濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3′)，濃度分別為0，0．50，5．0010．00，20．00μmol／LNo．157+No．158，兩片段等比例混合，總濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．182+No．158，兩片段等比例混合，總濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．101(5′CT CGT CAT GAG ACA CGT C3′)，濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／LNo．102(5′TA TCA GCG CAG CTA CTG C3′)，濃度分別為0，0．50，5．00 10．00，20．00μmol／L2．VEGF的測活實(shí)驗將該上清加入96孔板牛血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，每孔50μl，72小時后收集牛血管內(nèi)皮細(xì)胞，MTT染色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，以下式計算生長抑制率。抑制率=(N-Nn)／(Nn-NO)×100％，其中N為未處理細(xì)胞數(shù)(僅加S180條件培養(yǎng)基)，Nn為處理后細(xì)胞數(shù)(加ODN)，NO為初始細(xì)胞數(shù)。
實(shí)驗結(jié)果共獲得九條ODN抑制VEGF表達(dá)的劑量-生長抑制率曲線(見圖1)。圖1所示經(jīng)反義ODN處理的S180腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基對牛血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用明顯減小，反義ODN的劑量與抑制效應(yīng)呈線性關(guān)系，抑制作用最強(qiáng)的三個組為No．177、No．157+No．158，No．182+No．158組，在低濃度時即能有效抑制VEGF的表達(dá)，統(tǒng)計顯示它們?nèi)咧g的作用無明顯差別，但與對照組相比P＜0．01。No．176、No．182、No．157、No．158組抑制效果相近，與對照組相比亦有明顯差異(P＜0．05)。正義(No．101)和錯義(No．102)ODN處理的條件培養(yǎng)基基本上沒有抑制作用。
實(shí)施例3反義寡聚脫氧核苷酸抑制新生血管的生長
BALB／c小鼠S180肉瘤細(xì)胞腹水傳代，抽取腫瘤腹水腋下皮下接種，4周后取實(shí)體S180肉瘤，切成小塊，在帶標(biāo)尺的手術(shù)顯微鏡下將腫瘤種植于BALB／c小鼠眼睛角膜內(nèi)，每只動物只用一眼，共用164鼠，成功117眼(反義寡聚脫氧核苷酸用生理鹽水配制成下述不同濃度的藥物)。術(shù)后1天開始給藥，每天3次，每次每眼5μl，記錄角膜邊緣血管距腫瘤的距離變化情況。
實(shí)驗組別共17組，每組5-7眼。對照不用任何藥物No．157(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA GTGC 3)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．158(5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．177(5′CA GTA GCT GCG CTG AT A GCGC 3′)，濃度分別為5．00，10．00，20．00μmol／LNo．176(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3′)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG A G*T*G*C 3′)，濃度分別為5．00 10．00，20．00μmol／LNo．182+No．158，兩片段等比例混合，總濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．101(5′CT CGT CAT GAG ACA CGT C3′)，濃度為20．00μmol／LNo．102(5′TA TCA GCG CAG CTA CTG C3′)，濃度為20．00μmol／L所有測量均在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行，測量精度為0．01mm。按下公式計算ODN對新生血管形成的影響血管生長率=(D1-D2)／D1×100％。其中D1為腫瘤距結(jié)膜血管緣的距離，D2為新生血管距腫瘤的距離。
表2 ODNs對新生血管生長的影響
所有數(shù)據(jù)為各組平均值，表明新生血管長度占腫瘤距結(jié)膜血管緣長度的百分?jǐn)?shù)。182+158為兩種ODN等量混合組，濃度為兩者的總濃度。
實(shí)驗結(jié)果ODN抑制新生血管形成的結(jié)果見表2。所有反義寡聚脫氧核苷酸藥物對新生血管的生長均有明顯的抑制。所有小鼠均治療8周，顯效者經(jīng)治療后腫瘤未能誘導(dǎo)新生血管形成和長入，部分有效者在8周治療過程中腫瘤仍然發(fā)展，有新生血管形成或長入，正義組(5眼)、錯義組(5眼)均未見治療效果，其病情發(fā)展與未經(jīng)治療的對照組(5眼)相同。無效者角膜新生血管形成并長入瘤體。證明反義寡聚脫氧核苷酸藥物確實(shí)可抑制新生血管的形成與生長。它有望用于與新生血管生長有關(guān)的疾病治療。
實(shí)施例4反義寡聚脫氧核苷酸抑制腫瘤生長BALB／c小鼠S180肉瘤細(xì)胞腹水傳代，抽取腫瘤腹水腋下皮下接種，4周后取實(shí)體S180肉瘤，切成小塊，在帶標(biāo)尺的手術(shù)顯微鏡下將腫瘤種植于BALB／c小鼠眼睛角膜內(nèi)，每只動物只用一眼，共用164鼠，成功117眼(反義寡聚脫氧核苷酸用生理鹽水配制成下述不同濃度的藥物)。術(shù)后1天開始給藥，每天3次，每次每眼5μl，記錄種植腫瘤的長徑、短徑的變化情況。
實(shí)驗組別共16組，每組5-7眼。對照不用任何藥物No．157(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA GTGC 3′)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．158(5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．177(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA GCGC 3′)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．176(5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3′)，濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．182(5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3′)，濃度分別為5．00，10．00，20．00μmol／LNo．182+No．158，兩片段等比例混合，總濃度分別為10．00，20．00μmol／LNo．101(5′CT CGT CAT GAG ACA CGT C3′)，濃度為20．00μmol／LNo．102(5′TA TCA GCG CAG CTA CTG C3′)，濃度為20．00μmol／L所有測量均在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行，測量精度為0．01mm。按下公式計算ODN對腫瘤生長的影響腫瘤生長率=(V1-V2)／V2×100％。其中V1為腫瘤生長體積，V2為腫瘤植入體積。
表3 ODNs抑制腫瘤的生長
所有數(shù)據(jù)為各組平均值。負(fù)值表明腫瘤縮小體積占原植入體積的百分?jǐn)?shù)，正值表示腫瘤生長體積占原植入體積的百分?jǐn)?shù)。182+158為兩種ODN等量混合組，濃度為兩者的總濃度。
實(shí)驗結(jié)果反義ODN抑制腫瘤生長的結(jié)果見表3。所有小鼠均治療8周。所有反義寡聚脫氧核苷酸藥物治療組，腫瘤生長均受到明顯抑制。顯效者經(jīng)治療后腫瘤未能誘導(dǎo)新生血管形成和長入，腫瘤因缺乏營養(yǎng)供應(yīng)而逐漸消退吸收，顯微鏡下觀察可見治療過程中腫瘤邊界模糊，瘤體縮小成片狀。在治療晚期(6周以上)植入腫瘤隨表層角膜壞死脫落，角膜修復(fù)如初。有些小鼠在8周治療過程中腫瘤仍然發(fā)展，有新生血管形成或長入，但瘤體與未經(jīng)治療者相比仍有明顯減小。正義組(5眼)、錯義組(5眼)均未見治療效果，其病情發(fā)展與未經(jīng)治療的對照組(5眼)相同。無效者角膜新生血管形成并長入瘤體，腫瘤一旦穿破角膜突入前房則迅速生長，眼睛失明，腫瘤最終占據(jù)整個眼眶，表面壞死變黑，呈菜花狀。實(shí)驗結(jié)果證明，本發(fā)明的反義寡聚脫氧核苷酸確實(shí)對腫瘤有抑制作用。它們確實(shí)可配制成抗腫瘤的藥物。
權(quán)利要求
1．一類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)反義寡聚脫氧核苷酸，它與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子mRNA反向互補(bǔ)，其特征在于它包括五種反義寡聚脫氧核苷酸，它們的序列及作用部位如下a．5′TCCA GGG ACC ACT TGG CAT GGT GGA 3′，25核苷酸。作用于人VEGF mRNA 53-73位，大環(huán)修飾；b．5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G 3′，19核苷酸，作用于人VEGFmRNA 138-156位，成線性；c．5′G*C*A*GTA GCT GCG CTG ATA G*T*G*C 3′(*表示硫代)，22核苷酸，作用于人VEGF mRNA 138-156位，硫代，大環(huán)修飾；d．5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G TGC 3′，22核苷酸，作用于人VEGFmRNA 138-156位，大環(huán)修飾；e．5′GCA GTA GCT GCG CTG ATA G CGC 3′，22核苷酸，作用于人VEGFmRNA 138-156位，小環(huán)修飾。
2．根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一類反義寡聚脫氧核苷酸，其特征在于它們可應(yīng)用于配制治療腫瘤與新生血管形成的有關(guān)疾病的藥物。
全文摘要
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在各種與新生血管形成有關(guān)的疾病中起著重要的作用,本發(fā)明提供了用于抑制這種異常血管生成的五種反義寡聚脫氧核苷酸,及它們作用的靶位點(diǎn)。在細(xì)胞和整體實(shí)驗中證明了這些化合物可抑制VEGF的表達(dá),抑制新生血管的形成、生長和抑制腫瘤的生長。它們可應(yīng)用于配制治療腫瘤與新生血管形成的有關(guān)疾病的藥物。
文檔編號A61K31/70GK1206714SQ9710653
公開日1999年2月3日 申請日期1997年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月24日
發(fā)明者金由辛, 董凡 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所