專利名稱：改良疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的保護(hù)性和治療性疫苗，還涉及改良的、用于預(yù)防性和/或治療性誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
DNA疫苗是一種新興領(lǐng)域，它通過(guò)在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而提供了預(yù)防和治療失調(diào)、疾病、病癥和感染的手段，其中所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答針對(duì)與這些失調(diào)、疾病、病癥和感染相關(guān)的抗原。本質(zhì)上，將含有抗原編碼序列的質(zhì)粒DNA(其中該編碼序列可操作地連于基因表達(dá)所需的調(diào)控元件)施用于個(gè)體。個(gè)體細(xì)胞攝入該質(zhì)粒DNA并表達(dá)該編碼序列。這樣產(chǎn)生的抗原就成為免疫應(yīng)答所針對(duì)的靶目標(biāo)。針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答可提供個(gè)體抗任何變應(yīng)原、病原體、癌癥細(xì)胞或自身免疫細(xì)胞的預(yù)防或治療好處，只要它們含有能被針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答所識(shí)別的表位。
DNA疫苗包括裸疫苗和易化疫苗(facilitated vaccine)。此外，它們可以用各種不同技術(shù)進(jìn)行施用，其中包括幾種將物質(zhì)輸送給組織的不同裝置。出版的文獻(xiàn)包括數(shù)篇綜述文章，它們描述了DNA疫苗技術(shù)的各個(gè)方面，并且引用了有關(guān)用該技術(shù)獲得的許多結(jié)果的報(bào)道中的一部分。下列綜述文章中的每一篇都在此引用作為參考，在每篇綜述文章中所引用的每篇參考文獻(xiàn)也在此引用作為參考，它們描述了DNA疫苗技術(shù)McDonnel W.M.和F.K.Askari 1996，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New.Engl.J.Med.)334(1)42-45；Robinson，A.1995，癌癥醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志(Can.Med.Assoc.J.)152(10)1629-1632；Fynan，E.F.等人，1995，國(guó)際免疫藥物學(xué)雜志(Int.J.Immunopharmac.)17(2)79-83；Pardoll，D.M.和A.M.Beckerleg 1995，免疫(Immunity)3165-169；和Spooner等人，1995，基因治療(Gene Therapy)2173-180。
雖然這些疫苗對(duì)于預(yù)防性或治療性免疫個(gè)體以抵抗病原體感染或人疾病通常是有效的，但仍然需要有更好的疫苗。需要一種產(chǎn)生增強(qiáng)免疫應(yīng)答的組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒，它包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列，該序列與在真核細(xì)胞中表達(dá)所必需的調(diào)控元件操作性連接，其中編碼免疫原性抗原的核苷酸序列包括編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，該信號(hào)肽引導(dǎo)該免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一種病原體抗原、與癌癥相關(guān)的抗原或與自身免疫疾病相關(guān)的細(xì)胞相連的抗原。在某些實(shí)施方案中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，會(huì)編碼這樣的信號(hào)肽，該信號(hào)肽指導(dǎo)免疫原性靶抗原被分泌，或定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體。在某些例子中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，是非天然的信號(hào)序列。
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)個(gè)體針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，它包括步驟給個(gè)體施用質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列，該序列與在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的調(diào)控元件操作性連接，其中編碼免疫原性抗原的核苷酸序列包括編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，該信號(hào)肽引導(dǎo)該免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一種病原體抗原、與癌癥相關(guān)的抗原或與自身免疫疾病相關(guān)的細(xì)胞相連的抗原。在某些實(shí)施方案中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，會(huì)編碼這樣的信號(hào)肽，該信號(hào)肽指導(dǎo)免疫原性靶抗原被分泌，或定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體。在某些例子中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，是非天然的信號(hào)序列。
本發(fā)明涉及一種改良的DNA疫苗，該疫苗包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列，該序列與在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的調(diào)控元件操作性連接，其中，編碼免疫原性抗原的核苷酸序列包括編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，該信號(hào)肽引導(dǎo)該免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一種病原體抗原、與癌癥相關(guān)的抗原或與自身免疫疾病相關(guān)的細(xì)胞相連的抗原。在某些實(shí)施方案中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，會(huì)編碼這樣的信號(hào)肽，該信號(hào)肽指導(dǎo)免疫原性靶抗原被分泌，或定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體。在某些例子中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，是非天然的信號(hào)序列。
本發(fā)明涉及一種免疫個(gè)體對(duì)抗病原體、癌癥或自身免疫疾病的的方法，它包括步驟給個(gè)體施用DNA疫苗，該DNA疫苗包含編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列，該序列與在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的調(diào)控元件操作性連接，其中，編碼免疫原性抗原的核苷酸序列包括編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，該信號(hào)肽引導(dǎo)該免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的免疫原性靶抗原是一種病原體抗原、與癌癥相關(guān)的抗原或與自身免疫疾病相關(guān)的細(xì)胞相連的抗原。在某些實(shí)施方案中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，會(huì)編碼這樣的信號(hào)肽，該信號(hào)肽指導(dǎo)免疫原性靶抗原被分泌，或定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體。在某些例子中，編碼引導(dǎo)免疫原性靶抗原的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)肽的核苷酸序列，是非天然的信號(hào)序列。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A、1B和1C顯示了對(duì)H221結(jié)合進(jìn)行FACS分析的結(jié)果。
圖2A是遺傳免疫載體的圖，在該載體中克隆入了VH或Fv區(qū)。
圖2B是插入片段的構(gòu)建圖，該插入片段編碼V區(qū)，用于將V區(qū)導(dǎo)向(定位)細(xì)胞中的不同位置。
圖3顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)設(shè)計(jì)成在細(xì)胞中可定位于不同位置的不同構(gòu)建物，比較了它們誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的情況和增殖反應(yīng)情況。
圖4A、4B和4C顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些實(shí)驗(yàn)評(píng)估了各種不同的胞內(nèi)定向DNA疫苗所引發(fā)的CTL應(yīng)答情況。
圖5A、5B和5C顯示了腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中使用產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，而該抗體的可變區(qū)由DNA疫苗所編碼。
圖6A和6B顯示了本發(fā)明的含有特異引導(dǎo)序列的遺傳構(gòu)建物。
圖7A和7B顯示了用于保留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的幾種C末端序列。
圖8顯示了DNA疫苗的結(jié)構(gòu)。使用的DNA疫苗骨架是pBBkan骨架。它使用了CMV啟動(dòng)子和RSV增強(qiáng)子來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。插入片段示于表4，在前導(dǎo)肽(或者是來(lái)自鼠IgG的疏水性前導(dǎo)肽(Ig前導(dǎo)肽)，或者是用于胞質(zhì)定位的親水性前導(dǎo)肽(Cyto前導(dǎo)肽))后為VHFv(VL連于VH)區(qū)，以及添加的具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)的跨膜和胞質(zhì)尾部(CD4 TM & E19 Cyto)。
圖9顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)評(píng)估了在單次DNA接種之后脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)情況。
圖10A、10B和10C顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)評(píng)估了在單次DNA接種之后細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答情況。圖10A顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自于這樣的實(shí)驗(yàn)，其中疫苗將H221 VH或Fv區(qū)導(dǎo)向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以便分泌。圖10B顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自于這樣的實(shí)驗(yàn)，其中疫苗將H221 VH或Fv區(qū)導(dǎo)向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以便保留。圖10C顯示的數(shù)據(jù)來(lái)自于這樣的實(shí)驗(yàn)，其中疫苗將H221 VH或Fv區(qū)導(dǎo)向于胞質(zhì)。
圖11A和11B顯示了在DNA接種和攻擊后存活和腫瘤負(fù)荷的情況。
圖12顯示了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，該實(shí)驗(yàn)評(píng)估了腫瘤攻擊存活細(xì)胞的增殖反應(yīng)情況。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及改良的DNA疫苗。下列文獻(xiàn)描述了DNA疫苗美國(guó)專利No.5,589,466和5,973,972，PCT出版的申請(qǐng)PCT/US90/01515，PCT/US93/02338，PCT/US93/048131和PCT/US94/00899，以及它們所引用的優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)，這些文獻(xiàn)的每一篇都在本文中引用作為參考。除了這些專利申請(qǐng)中所述的給藥方案之外，輸送DNA的其他方法可參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,945,050和5,036,006，它們都在此引用作為參考。此外，上述的綜述文章描述了DNA疫苗技術(shù)并列舉了DNA疫苗的例子。在每種情況下，質(zhì)粒DNA被輸送至個(gè)體的細(xì)胞，細(xì)胞攝入該質(zhì)粒然后表達(dá)質(zhì)粒所編碼的免疫原性靶蛋白。所產(chǎn)生的針對(duì)免疫原性靶蛋白的免疫應(yīng)答，為接種疫苗的個(gè)體提供了預(yù)防或治療上的好處。
根據(jù)本發(fā)明，在質(zhì)粒上的編碼免疫靶蛋白的編碼序列是與編碼一氨基酸序列的編碼序列一起提供的，因該氨基酸序列存在于蛋白質(zhì)上而導(dǎo)致表達(dá)的蛋白有特定的細(xì)胞內(nèi)定位。編碼引導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?、并被包含在免疫原性蛋白質(zhì)的編碼序列(該編碼序列被包含在用作DNA疫苗組合物的質(zhì)粒構(gòu)建物中)中的核苷酸序列，可引導(dǎo)在細(xì)胞中定位于特定區(qū)域，這導(dǎo)致特異性免疫應(yīng)答被增強(qiáng)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“遺傳構(gòu)建物”指含有編碼序列的質(zhì)粒，該編碼序列編碼免疫原性靶蛋白和指導(dǎo)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄?，該編碼序列可操作地連于在真核細(xì)胞中表達(dá)該編碼序列所需的調(diào)控元件。用于DNA表達(dá)的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。此外，其他元件如Kozak區(qū)也可被包含在遺傳構(gòu)建物中。起始信號(hào)和終止信號(hào)是必需的調(diào)控元件，它們常常被認(rèn)為是編碼序列的一部分。本發(fā)明遺傳構(gòu)建物的編碼序列包括功能性的起始信號(hào)和終止信號(hào)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“免疫原性靶蛋白”指這樣的抗原，它是針對(duì)與病癥、感染、疾病或失調(diào)相關(guān)的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答所針對(duì)的靶目標(biāo)，如病原體、病原體抗原、與癌癥細(xì)胞或自身免疫疾病相關(guān)細(xì)胞有關(guān)的抗原。免疫原性靶抗原由DNA疫苗中所用的遺傳構(gòu)建物的編碼序列所編碼。將DNA疫苗施用于接種疫苗的個(gè)體，遺傳構(gòu)建物被個(gè)體細(xì)胞所攝入，編碼序列被表達(dá)，然后產(chǎn)生免疫原性靶蛋白。免疫原性靶蛋白在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)免疫原性靶蛋白的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答針對(duì)與病癥、感染、疾病或失調(diào)相關(guān)的蛋白質(zhì)，如病原體、病原體抗原、與癌癥細(xì)胞或自身免疫疾病相關(guān)細(xì)胞有關(guān)的抗原。因此，接種的個(gè)體可以預(yù)防性或治療性地被免疫，以防止或治療該病癥、感染、疾病或失調(diào)。免疫原性靶蛋白指由本發(fā)明基因構(gòu)建物所編碼的肽和蛋白質(zhì)，它們作為免疫應(yīng)答的靶蛋白。術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答靶蛋白”指這樣的蛋白質(zhì)，針對(duì)該蛋白質(zhì)可引發(fā)免疫應(yīng)答。免疫原性靶蛋白與來(lái)自需要免疫來(lái)對(duì)抗的變應(yīng)原、病原體、不利蛋白或細(xì)胞類型(如癌癥細(xì)胞或自身免疫疾病中所涉及的細(xì)胞)的蛋白，共享至少一個(gè)表位(抗原決定蔟)。針對(duì)免疫原性靶蛋白的免疫應(yīng)答會(huì)保護(hù)個(gè)體以對(duì)抗特定的感染或疾病，以及治療個(gè)體的特定感染或疾病，而其中來(lái)自變應(yīng)原、病原體、不利蛋白或細(xì)胞類型的蛋白與該感染或疾病是相關(guān)的。免疫原性靶蛋白并不要求與需要免疫應(yīng)答來(lái)針對(duì)的蛋白質(zhì)完全一樣。相反，免疫原性靶蛋白必須能夠引發(fā)免疫應(yīng)答，而該免疫應(yīng)答能夠與需要免疫應(yīng)答來(lái)針對(duì)的蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非天然信號(hào)序列”指，相對(duì)編碼指導(dǎo)免疫原性靶抗原胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)序列的核苷酸序列而言，是異源的信號(hào)序列。非天然信號(hào)序列在自然界中并不與免疫原性靶蛋白相連；相反，它是通過(guò)制備基因構(gòu)建物而產(chǎn)生的，其中在該基因構(gòu)建物中編碼信號(hào)序列的核苷酸序列與編碼免疫原性靶抗原的核苷酸序列相連。在某些例子中，可以從編碼免疫原性靶蛋白的編碼序列中去除天然信號(hào)序列，然后用非天然信號(hào)序列加以替換來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位，從而將其引導(dǎo)至與天然序列引導(dǎo)蛋白所到達(dá)的部位不同的部位，或者更有效地引導(dǎo)至與天然序列引導(dǎo)蛋白所到達(dá)的部位相同的部位。
根據(jù)本發(fā)明，免疫原性靶蛋白包含指導(dǎo)在細(xì)胞內(nèi)定位的序列。通過(guò)提供信號(hào)序列、設(shè)計(jì)嵌合蛋白或?qū)⑿蛄幸浦?graft)入免疫原性蛋白質(zhì)序列中，可以將指導(dǎo)蛋白定位的天然存在序列摻入到DNA疫苗的免疫原性靶蛋白中。DNA疫苗是質(zhì)粒，因而可用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法對(duì)免疫原性靶蛋白的編碼序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生編碼序列，該編碼序列編碼含有指導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)序列的免疫原性靶蛋白，或者編碼含有指導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)膮^(qū)域的嵌合免疫原性靶蛋白。此外，可用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)改變免疫原性靶蛋白的氨基酸序列，從而使它在其序列中就含有指導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位的序列。在某些例子中，編碼指導(dǎo)免疫原性靶抗原胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)男盘?hào)序列的核苷酸序列，是非天然的信號(hào)序列。通過(guò)使用眾所周知的技術(shù)，可以鑒定、分離編碼一種蛋白質(zhì)的信號(hào)序列的核苷酸序列，并將其連接于編碼不同蛋白質(zhì)的編碼序列。
免疫原性靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)被引導(dǎo)到達(dá)的位置，會(huì)影響個(gè)體產(chǎn)生的針對(duì)免疫原性靶蛋白的免疫應(yīng)答。已發(fā)現(xiàn)，由DNA疫苗遺傳構(gòu)建物所編碼的免疫原性靶蛋白的胞內(nèi)定位，可導(dǎo)致對(duì)免疫原性靶抗原的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。通過(guò)將胞內(nèi)定位信號(hào)的編碼序列作為免疫原性靶蛋白編碼序列的一部分，可以使免疫原性靶蛋白定位于細(xì)胞的該部位。已發(fā)現(xiàn)，某些定位與更強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答是相關(guān)的。例如，已發(fā)現(xiàn)，與使用不含引導(dǎo)特異性胞內(nèi)定位的序列的疫苗時(shí)的觀察結(jié)果相比，將引導(dǎo)蛋白質(zhì)停留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或再循環(huán)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(尤其是糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，可在接種動(dòng)物中引發(fā)更強(qiáng)的CTL應(yīng)答。
本發(fā)明的改進(jìn)是包含指導(dǎo)胞內(nèi)定位的遺傳物質(zhì)，以指導(dǎo)在施用了DNA疫苗的個(gè)體細(xì)胞中產(chǎn)生免疫原性靶蛋白的胞內(nèi)定位。
本發(fā)明涉及將遺傳物質(zhì)引入個(gè)體細(xì)胞的方法，以誘導(dǎo)針對(duì)遺傳物質(zhì)所編碼的蛋白質(zhì)或肽的免疫應(yīng)答。所述方法包括步驟給該個(gè)體的組織施用DNA，該DNA含有編碼序列，該編碼序列可操作地連于表達(dá)所需的調(diào)控序列。該編碼序列包括連于或含有胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)編碼序列的免疫原性靶蛋白編碼序列。
胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)是眾所周知的。
在某些例子中，蛋白質(zhì)需要被分泌。這類蛋白質(zhì)包含N端疏水序列。當(dāng)RNA被翻譯時(shí)，N端的疏水序列導(dǎo)致蛋白質(zhì)被粘于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。隨后，疏水序列被蛋白酶切除，然后蛋白質(zhì)被分泌。在本發(fā)明的某些例子中，免疫原性靶蛋白可含有N端疏水前導(dǎo)序列，當(dāng)免疫原性靶蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該前導(dǎo)序列會(huì)指導(dǎo)免疫原性靶蛋白的分泌。
在某些例子中，蛋白質(zhì)需要被結(jié)合于膜上。這類蛋白質(zhì)包含N端疏水序列和內(nèi)部疏水區(qū)域。與分泌形式相同，當(dāng)RNA被翻譯時(shí)，疏水序列導(dǎo)致蛋白質(zhì)被粘于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。隨后，疏水序列被蛋白酶切除。蛋白質(zhì)依照相同的分泌途徑，但是內(nèi)部疏水序列防止了分泌，蛋白質(zhì)就結(jié)合于膜上。在本發(fā)明的某些例子中，免疫原性靶蛋白可含有N端疏水前導(dǎo)序列和內(nèi)部疏水序列，當(dāng)免疫原性靶蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，這些序列導(dǎo)致免疫原性靶蛋白成為膜結(jié)合蛋白。
在某些例子中，蛋白質(zhì)需要被定位于胞質(zhì)。這類蛋白質(zhì)不包含N端疏水序列。當(dāng)RNA被翻譯時(shí)，蛋白質(zhì)不粘于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因而蛋白質(zhì)成為胞質(zhì)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的某些例子中，免疫原性靶蛋白不含有N端疏水前導(dǎo)序列，因此當(dāng)免疫原性靶蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，就成為胞質(zhì)蛋白質(zhì)。
在某些例子中，蛋白質(zhì)需要被定位于溶酶體。這類蛋白質(zhì)可包含序列DKQTLL(SEQ ID NO1)，該序列會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)定位于溶酶體。在本發(fā)明的某些例子中，免疫原性靶蛋白含有序列DKQTLL(SEQ ID NO1)，因此當(dāng)免疫原性靶蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，就被引導(dǎo)至溶酶體。
在某些例子中，蛋白質(zhì)需要從高爾基體被定位回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這類蛋白質(zhì)可包含位于C末端的序列KDEL(SEQ ID NO2)，該序列會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)被再循環(huán)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在本發(fā)明的某些例子中，免疫原性靶蛋白在C末端含有序列KDEL(SEQ ID NO2)，因此免疫原性靶蛋白被引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
據(jù)報(bào)道，這種“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)再循環(huán)信號(hào)”的另一例子是腺病毒E19蛋白的C末端序列。該蛋白質(zhì)被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，該E19蛋白結(jié)合于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，并且有效地防止它們荷載(loading)蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)是由MHC在表面所呈遞的(在表面上，它們與T細(xì)胞受體復(fù)合從而作為免疫應(yīng)答誘導(dǎo)過(guò)程的一部分)。E19蛋白是一種六肽DEKKMP(SEQ ID NO3)。在某些例子中，需要通過(guò)在C末端含有DEKKMP(SEQ ID NO3)序列而使蛋白質(zhì)被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在本發(fā)明的某些例子中，免疫原性靶蛋白在C末端含有序列DEKKMP(SEQ IDNO3)，因此免疫原性靶蛋白被引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
取決于需要增強(qiáng)的免疫應(yīng)答類型，需要不同的胞內(nèi)定位。在I類免疫應(yīng)答情況下，在細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)被降解并運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中它們被荷載在MHC上，然后MHC移至細(xì)胞表面并與CD8+T細(xì)胞的T細(xì)胞受體復(fù)合。該反應(yīng)導(dǎo)致了CTL應(yīng)答。在II類免疫應(yīng)答情況下，蛋白質(zhì)與抗原呈遞細(xì)胞(APC)復(fù)合，而APC與CD4+T細(xì)胞相互作用，并使輔助性T細(xì)胞(包括與抗體應(yīng)答相關(guān)的輔助性T細(xì)胞)參與。
為了增強(qiáng)I類免疫應(yīng)答，使蛋白質(zhì)定位于胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可使這些蛋白質(zhì)更易進(jìn)入I類途徑。
為了增強(qiáng)II類免疫應(yīng)答，使蛋白質(zhì)定位于跨膜或溶酶體或使蛋白質(zhì)分泌，將使這些蛋白質(zhì)更易進(jìn)入II類途徑。
本發(fā)明提供了可用作DNA疫苗的遺傳構(gòu)建物，它含有免疫原性靶蛋白的編碼序列，而該免疫原性靶蛋白含有胞內(nèi)定位所需的序列。
在某些例子中，遺傳構(gòu)建物含有Biocca，S.等人(1990，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)9101-108)所述的定位引導(dǎo)序列。遺傳構(gòu)建物可含有處于與圖6A所示相同方向的這些引導(dǎo)序列。具體地，前導(dǎo)序列位于蛋白質(zhì)的N末端，正好位于啟動(dòng)子和感興趣蛋白質(zhì)的編碼序列之間。在某些例子中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物含有本申請(qǐng)圖6A中所示的前導(dǎo)序列之一。在某些例子中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建物含有本申請(qǐng)圖6B中所示的前導(dǎo)序列之一。
在某些例子中，遺傳構(gòu)建物含有腺病毒E19蛋白的末端六肽，以便被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。當(dāng)DNA疫苗的免疫原性靶蛋白C末端為DEKKMP(SEQ ID NO3)時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
在某些例子中，遺傳構(gòu)建物含有C末端的四肽，以便被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。當(dāng)DNA疫苗的免疫原性靶蛋白C末端為KDEL(SEQ ID NO2)時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
圖7A和7B顯示了數(shù)種用于留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的C末端序列。Jackson，M.R.，等人(1990，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)，93153-3162)報(bào)道，當(dāng)圖7A中的C末端序列被連于那些通常不保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)的C末端時(shí)，會(huì)導(dǎo)致嵌合蛋白質(zhì)留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
在某些例子中，遺傳構(gòu)建物含有位于免疫原性靶蛋白C末端尾部處的溶酶體定位雙聯(lián)體。C末端尾部是最后的20-30個(gè)氨基酸。通過(guò)包含雙聯(lián)體LL和/或YQ和/或QY，可使蛋白質(zhì)被引導(dǎo)至溶酶體。在某些例子中，含有一個(gè)或多個(gè)溶酶體定位雙聯(lián)體的C末端尾部是跨膜蛋白的細(xì)胞質(zhì)尾部。在某些例子中，雙聯(lián)體被包含在免疫原性蛋白的序列的最后30個(gè)氨基酸中。
根據(jù)本發(fā)明，所提供的是預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的組合物和方法，以抵抗變應(yīng)原、病原體或異常的與疾病相關(guān)的細(xì)胞或蛋白質(zhì)。遺傳物質(zhì)編碼靶蛋白(即這樣的肽或蛋白質(zhì)，它與待針對(duì)的變應(yīng)原、病原體或抗原或細(xì)胞共有至少一個(gè)表位)，而且遺傳物質(zhì)還編碼胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)。遺傳物質(zhì)由個(gè)體的細(xì)胞表達(dá)，并作為免疫原性靶目標(biāo)，以引發(fā)針對(duì)它的免疫應(yīng)答。胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)的存在，會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞中的某個(gè)部位，而在該部位可更有效地誘導(dǎo)所需的免疫應(yīng)答。與用缺少胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)的類似遺傳構(gòu)建物所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比，這樣所導(dǎo)致的與變應(yīng)原、病原體、或抗原或細(xì)胞反應(yīng)的免疫應(yīng)答得到了增強(qiáng)。
本發(fā)明可用于引發(fā)免疫應(yīng)答，以針對(duì)與變應(yīng)原、病原體或個(gè)體自身“異?！奔?xì)胞特異性相關(guān)的蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用于免疫個(gè)體以抵抗變應(yīng)原或病原性物質(zhì)和生物體，由此，針對(duì)某病原體蛋白的免疫應(yīng)答可提供抵抗該病原體的保護(hù)性免疫力。本發(fā)明可用于抵抗超增殖性疾病和紊亂(例如癌癥)，即通過(guò)引發(fā)針對(duì)與超增殖細(xì)胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用于抵抗自身免疫疾病和紊亂，即通過(guò)引發(fā)針對(duì)與涉及自身免疫病的細(xì)胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明，DNA編碼免疫原性靶蛋白，該蛋白或者連于胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)序列，或者該蛋白是包含胞內(nèi)運(yùn)輸序列的肽序列。作為細(xì)胞正常蛋白質(zhì)加工的一部分，信號(hào)序列會(huì)被切除。此外，編碼免疫原性靶蛋白的DNA可在蛋白質(zhì)的編碼序列中包含胞內(nèi)運(yùn)輸序列。DNA表達(dá)所需的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。此外，遺傳構(gòu)建物中還可包含諸如Kozak區(qū)之類的其它元件。
如本文所用，“可表達(dá)形式”表示這樣的基因構(gòu)建物，它包含與編碼免疫原性靶蛋白的編碼序列操作性連接的必需調(diào)控元件，從而當(dāng)位于個(gè)體細(xì)胞內(nèi)時(shí)，能夠表達(dá)編碼序列。
如本文所用，“共(享)有一個(gè)表位”表示某蛋白質(zhì)含有至少一個(gè)與另一蛋白的表位完全相同或基本相似的表位。
如本文所用，“基本相似的表位”表示所述表位所具有的結(jié)構(gòu)與某蛋白表位不完全相同，但是能夠引發(fā)與該蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答。
遺傳構(gòu)建物包含一段核苷酸序列，它編碼靶蛋白和/或免疫調(diào)節(jié)蛋白，它包含與基因表達(dá)所需的調(diào)控元件操作性連接的胞內(nèi)運(yùn)輸序列。
當(dāng)遺傳構(gòu)建物被細(xì)胞攝入時(shí)，它們留在細(xì)胞內(nèi)作為功能性的染色體外分子，和/或整合到細(xì)胞的染色體DNA中?？梢詫NA引入細(xì)胞，使其在細(xì)胞中仍為質(zhì)粒形式的獨(dú)立遺傳物質(zhì)。或者，可將能與染色體整合的線性DNA引入細(xì)胞。在將DNA引入細(xì)胞時(shí)，可以添加促進(jìn)DNA整合到染色體中的試劑。也可以在DNA分子內(nèi)包含促進(jìn)整合的DNA序列。或者，可以將RNA施用于細(xì)胞。也可以考慮提供線性小染色體形式的遺傳構(gòu)建物，它具有著絲粒、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)?；驑?gòu)建物可以作為活在細(xì)胞內(nèi)的減毒活疫苗或重組微生物載體中遺傳物質(zhì)的一部分?；驑?gòu)建物可以是重組病毒疫苗基因組的一部分，其中遺傳物質(zhì)或者整合到細(xì)胞染色體內(nèi)，或者仍留在染色體外。
遺傳構(gòu)建物包括核酸分子進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)所必需的調(diào)控元件。這些元件包括啟動(dòng)子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號(hào)。此外，為了編碼免疫原性靶蛋白的序列的基因表達(dá)，常需要增強(qiáng)子。這些元件必須與編碼所需蛋白的序列操作性連接(可操作地連接)，而且這些調(diào)控元件在作為給予對(duì)象的個(gè)體內(nèi)有效(可操作)。
起始密碼子和終止密碼子一般被認(rèn)為是編碼免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分。但是，這些元件在給予基因構(gòu)建物的個(gè)體內(nèi)必須是可發(fā)揮功能的。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列處于相同讀碼框。
所用的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)在個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)必須是有功能的。
可用于實(shí)施本發(fā)明，尤其是用于生產(chǎn)人用遺傳疫苗的啟動(dòng)子實(shí)例，包括但不限于猴病毒40(SV40)啟動(dòng)子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒(HIV)的啟動(dòng)子例如HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子(LTR)、莫洛尼氏(Moloney)病毒啟動(dòng)子、ALV啟動(dòng)子、巨噬細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子例如CMV立即早期啟動(dòng)子、EB病毒啟動(dòng)子、羅絲肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和來(lái)自人基因的啟動(dòng)子，如來(lái)自人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和人金屬硫蛋白等人基因的啟動(dòng)子。
可用于實(shí)施本發(fā)明，尤其是用于生產(chǎn)人用遺傳疫苗的聚腺苷酸化信號(hào)的實(shí)例，包括但不限于SV40聚腺苷酸化信號(hào)和LTR聚腺苷酸化信號(hào)。具體地，使用的是位于pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen，San Diego，CA)內(nèi)的SV40聚腺苷酸化信號(hào)，文中稱為SV40聚腺苷酸化信號(hào)。
除了DNA表達(dá)所需的調(diào)控元件外，DNA分子內(nèi)還可以包含其它元件。這些其它元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以選自但不限于人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸，以及諸如來(lái)自CMV、RSV和EBV等的病毒增強(qiáng)子。
為了使構(gòu)建物保留在染色體外并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多拷貝的構(gòu)建物，可以使遺傳構(gòu)建物具有哺乳動(dòng)物復(fù)制起始位點(diǎn)。Invitrogen(San Diego CA)的質(zhì)粒pCEP4和pREP4，含有EB病毒復(fù)制起始位點(diǎn)和核抗原EBNA-1的編碼區(qū)域，它們不發(fā)生整合，而是產(chǎn)生高拷貝游離型復(fù)制產(chǎn)物。
在有關(guān)免疫應(yīng)用的較好實(shí)施方案中，被輸送的核酸分子包括編碼靶蛋白、IL-2蛋白和其他額外蛋白質(zhì)基因(該額外蛋白質(zhì)基因進(jìn)一步加強(qiáng)針對(duì)該靶蛋白免疫應(yīng)答)的核苷酸序列。這類基因來(lái)自例如編碼細(xì)胞因子和淋巴因子的基因，所述的因子有例如α干擾素、γ干擾素、血細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2。在有些實(shí)施方案中，在用于免疫組合物的遺傳構(gòu)建物中宜包含GM-CSF基因。
如果出于某種理由需要消滅接受了遺傳構(gòu)建物的細(xì)胞，可以加入其他元件以作為摧毀細(xì)胞的靶目標(biāo)?？梢栽谶z傳構(gòu)建物中包含處于可表達(dá)形式的皰疹腺苷激酶(tk)基因?？梢越o個(gè)體施用藥物9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(gangcyclovir，簡(jiǎn)稱GCV)，該藥將選擇性地殺滅所有產(chǎn)生tk的細(xì)胞，由此提供了選擇性摧毀具有遺傳構(gòu)建物的細(xì)胞的手段。
為了盡可能擴(kuò)大蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，可以選擇調(diào)控序列使得它們非常適合在施用了構(gòu)建物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因。而且，可以選用在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄效率最高的密碼子。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠制造在細(xì)胞內(nèi)具有功能的DNA構(gòu)建物。
本發(fā)明方法包括步驟將核酸分子施用于個(gè)體的組織。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子的給藥途徑是肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥，或通過(guò)灌洗而用于選自下組的粘膜組織陰道、直腸、尿道、口腔和舌下。
在有些實(shí)施方案中，將核酸分子與促進(jìn)劑(facilitating agent)一起施用于細(xì)胞。促進(jìn)劑又稱多核苷酸功能增強(qiáng)子或遺傳疫苗促進(jìn)劑。有關(guān)促進(jìn)劑的描述，可參見(jiàn)1993年1月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/008,342、1993年3月11日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/029,336、1993年9月21日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)08/125,012和1994年1月26日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US94/00899，這些申請(qǐng)均被本文引用作為參考。此外，促進(jìn)劑還被描述于1995年3月30日提交的PCT/US95/04071，該申請(qǐng)被本文引用作為參考。與核酸分子聯(lián)用的促進(jìn)劑，可以以與核酸分子形成的混合物形式來(lái)施用，也可以在施用核酸分子的同時(shí)、之前或之后單獨(dú)施用。此外，具有轉(zhuǎn)染劑(transfecting agent)和/或復(fù)制劑和/或促炎劑(inflammatory agent)作用的，以及可以在有或沒(méi)有促進(jìn)劑時(shí)同時(shí)給藥的其它物質(zhì)包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和淋巴因子，例如α干擾素、γ干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2，以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、諸如免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS)之類表面活性劑、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酸脂A(monophosphoryl Lipid A，MPL))/胞壁酰肽、醌類似物和諸如角鯊烯和角鯊烯之類的泡囊(vesicle)。透明質(zhì)酸也可以與遺傳構(gòu)建物聯(lián)用。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明遺傳構(gòu)建物可與選自下組的促進(jìn)劑配制在一起或聯(lián)用苯甲酸酯、酰替苯胺、脒、氨基甲酸乙酯以及它們的鹽酸鹽，例如局部麻醉劑家族的那些種類。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中的促進(jìn)劑可以是具有以下結(jié)構(gòu)之一的化合物Ar-R1-O-R2-R3或 Ar-N-R1-R2-R3或 R4-N-R5-R6或 R4-O-R1-N-R7式中，Ar是苯、對(duì)氨基苯、間氨基苯、鄰氨基苯、取代的苯、取代的對(duì)氨基苯、取代的間氨基苯、取代的鄰氨基苯，其中在氨基苯化合物中的氨基可以是氨基、C1-C5烷基胺、C1-C5，C1-C5二烷基胺，而取代化合物中的取代基是鹵素、C1-C5烷基和C1-C5烷氧基；R1是C＝O；
R2是C1-C10烷基，包括支鏈烷基；R3是氫原子、胺、C1-C5烷基胺、C1-C5，C1-C5二烷基胺；R2+R3可形成環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán))；R4是Ar、R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基，環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán))；R5是C＝NH；R6是Ar、R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán))；R7是Ar、R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán))。
酯的實(shí)例包括苯甲酸酯，例如哌羅卡因、美普卡因和異布卡因；對(duì)氨基苯甲酸酯，例如普魯卡因、丁卡因、丁胺卡因、丙氧卡因和氯普魯卡因；間氨基苯甲酸酯，例如美布他明和primacaine；和對(duì)乙氧基苯甲酸酯，例如對(duì)乙氧卡因。酰替苯胺的實(shí)例包括利多卡因、依替卡因、甲哌卡因、布比卡因、吡咯卡因和丙胺卡因。此類化合物的其它實(shí)例包括辛可卡因、苯佐卡因、達(dá)克羅寧、普莫卡因、丙美卡因、布它卡因、奧布卡因、卡波卡因、甲基布比卡因、苦味酸butasin、非那卡因、diothan、luccaine、intracaine、nupercaine、美布卡因、匹多卡因、珍尼柳酯和源自植物的二環(huán)化合物，例如可卡因、肉桂酰可卡因、吐昔林和cocaethlene，以及所有以上物質(zhì)與鹽酸形成的化合物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，促進(jìn)劑是布比卡因。布比卡因與甲哌卡因的區(qū)別在于布比卡因用N-丁基代替了甲哌卡因中的N-甲基?；衔镌谠揘位上可以有C1-C10?；衔锟梢员畸u素取代，例如普魯卡因和氯普魯卡因。較好的是酰替苯胺(anilide)。
促進(jìn)劑在遺傳構(gòu)建物之前、同時(shí)或之后給予?？梢詫⒋龠M(jìn)劑與遺傳構(gòu)建物配制在同一組合物中。
布比卡因-鹽酸的化學(xué)名稱是2-哌啶甲酰胺(2-piperidinecarboxamide)，1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-一鹽酸，一水合物，其市場(chǎng)來(lái)源廣泛，可從包括AstraPharmaceutical Product Inc.(Westboro，MA)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York，NY)，Eastman Kodak(Rochester，NY)等渠道購(gòu)得以用于藥物用途。市售的布比卡因有時(shí)與羥苯甲酸甲酯和腎上腺素配制在一起，有時(shí)則不。以上所述的制劑均可使用。購(gòu)來(lái)用于藥用的濃度為0.25％，0.5％和0.75％，這些可用于本發(fā)明。如果需要，可以配制引發(fā)所需效果的其它濃度，尤其是0.05％至1.0％之間的濃度。根據(jù)本發(fā)明，可給予約250μg至10mg布比卡因。在有些實(shí)施方案中，可給予約250μg至7.5mg。在有些實(shí)施方案中，可給予約0.05mg至5.0mg。在有些實(shí)施方案中，可給予約0.5mg至3.0mg。在有些實(shí)施方案中，可給予約5至50μg。例如，在有些實(shí)施方案中，在給予疫苗之前、同時(shí)或之后，在施用疫苗的同一部位施用約50μl至2ml，較好的是約50μl至1500μl，更好的是約1ml配制在等滲藥用載體內(nèi)的0.25-0.50％鹽酸布比卡因和0.1％羥苯甲酸甲酯溶液。類似地，在有些實(shí)施方案中，在給予疫苗之前、同時(shí)或之后，在施用疫苗的同一部位施用約50μl至2ml，較好地約50μl至1500μl，更好地約1ml配制在等滲藥用載體內(nèi)的0.25-0.50％鹽酸布比卡因溶液。布比卡因和任何其它作用類似的化合物，尤其是相關(guān)的局部麻醉劑家族中的那些化合物，可以在能夠有助于細(xì)胞攝入遺傳構(gòu)建物的濃度下進(jìn)行施用。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，在給予遺傳構(gòu)建物之前，先給個(gè)體注射促進(jìn)劑。即，在給予遺傳構(gòu)建物之前約1周至10天之內(nèi)，先給個(gè)體注射促進(jìn)劑。在有些實(shí)施方案中，在給予遺傳構(gòu)建物之前或之后的約1至5天，有時(shí)是24小時(shí)給個(gè)體注射促進(jìn)劑?；蛘撸灰皇褂?，促進(jìn)劑可以在給予遺傳構(gòu)建物的同時(shí)、或之前或之后的幾分鐘內(nèi)進(jìn)行施用。所以，可將促進(jìn)劑與遺傳構(gòu)建物合并在同一藥物組合物中。
在有些實(shí)施方案中，可給予遺傳構(gòu)建物而不給予促進(jìn)劑。即，使用不含促進(jìn)劑的制劑，并且使用不將遺傳構(gòu)建物與促進(jìn)劑聯(lián)用的給藥方案。
本發(fā)明中輸送給細(xì)胞的核酸分子可以作為蛋白質(zhì)的遺傳模板，而所述蛋白的功能就是預(yù)防性和/或治療性免疫劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子包含在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼序列所必需的調(diào)控序列。
本發(fā)明可用于免疫個(gè)體以抵抗病原體，例如病毒、原核生物和病原性真核生物如單細(xì)胞病原體和多細(xì)胞寄生蟲。本發(fā)明特別適用于免疫個(gè)體以抵抗感染細(xì)胞的病原體和無(wú)包被(not encapculated)的病原，例如病毒和諸如淋病、李斯特氏菌屬(listeria)和志賀氏菌屬(shigella)之類的原核生物。此外，本發(fā)明還可用于免疫個(gè)體以抵抗原生動(dòng)物病原體，這些病原體在其生命周期內(nèi)有一階段是胞內(nèi)病原體?！鞍麅?nèi)病原體”在此表示這樣的病毒或病原體，在其繁殖或生命周期中至少部分時(shí)期是在宿主細(xì)胞內(nèi)的，并在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生或?qū)е庐a(chǎn)生病原蛋白。表1列出了可根據(jù)本發(fā)明制備針對(duì)性疫苗的部分病毒的科和屬。在疫苗中可使用這樣的DNA構(gòu)建物，它們所含的DNA序列編碼多肽，該多肽具有至少一個(gè)表位與病原抗原(例如表中所列出的那些抗原)上的表位完全相同或基本相似。而且，本發(fā)明還可用于免疫個(gè)體以抵抗其它病原體，其中包括原核和真核的原生動(dòng)物病原體以及多細(xì)胞寄生蟲，例如表2所列的那些。
為了生產(chǎn)提供免受病原體感染保護(hù)作用的遺傳疫苗，必須在遺傳構(gòu)建物中包含編碼免疫原性蛋白的遺傳物質(zhì)以作為靶蛋白編碼序列，所述的免疫原性蛋白能夠引起針對(duì)它的保護(hù)性免疫應(yīng)答。不論病原體是胞內(nèi)感染(對(duì)于胞內(nèi)感染，本發(fā)明尤其適用)，還是胞外感染，不可能所有的病原體抗原都引發(fā)保護(hù)性應(yīng)答。因?yàn)镈NA和RNA都較小，而且較容易生產(chǎn)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于可以用多種病原體抗原進(jìn)行免疫接種。用于遺傳疫苗的遺傳構(gòu)建物可以包括編碼多種病原體抗原的遺傳物質(zhì)。例如，可將數(shù)個(gè)病毒基因包括在同一構(gòu)建物中，由此提供多個(gè)靶目標(biāo)。
表1和表2列出了部分病原性物質(zhì)或生物體，可以制備針對(duì)它們的疫苗以保護(hù)個(gè)體免受它們的感染。在部分優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫個(gè)體以抵抗病原體的方法可針對(duì)HIV、HTLV或HBV。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種給予基礎(chǔ)廣泛的保護(hù)性免疫應(yīng)答以抵抗超增殖性細(xì)胞(這些細(xì)胞是超增殖性疾病的特征)的方法，還涉及治療超增殖性疾病患者的方法。如本文所用，“超增殖性疾病”指以細(xì)胞超增殖為特征的疾病或紊亂。超增殖性疾病的例子包括各種形式的癌癥和牛皮癬。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將包含編碼免疫原性“超增殖細(xì)胞”相關(guān)蛋白的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建物引入個(gè)體細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致在個(gè)體的接種細(xì)胞內(nèi)生成這些蛋白。如本文所用，“超增殖性相關(guān)蛋白”表示與超增殖性疾病相關(guān)的蛋白。為了免疫以抵抗超增殖性疾病，可給個(gè)體施用包含編碼超增殖性疾病相關(guān)蛋白的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建物。
為了使超增殖相關(guān)蛋白成為有效的免疫原性靶目標(biāo)，該蛋白必需只在超增殖細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，或在超增殖細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的水平高于正常細(xì)胞。靶抗原包括這樣的蛋白、其片段和肽，它們包含所述蛋白上的至少一個(gè)表位。有時(shí)，超增殖相關(guān)蛋白是編碼某蛋白的基團(tuán)發(fā)生突變的產(chǎn)物。突變基因編碼的蛋白與正常蛋白幾乎完全相同，僅有細(xì)微的氨基酸序列差異并產(chǎn)生了正常蛋白上所沒(méi)有的不同表位。這樣的靶蛋白包括由諸如myb，myc，fyn之類的癌基因和轉(zhuǎn)位基因bcr/abl，ras，src，P53，neu，trk和EGRF等所編碼的蛋白。除了作為靶抗原的癌基因產(chǎn)物之外，用于抗癌治療和保護(hù)性治療的靶蛋白還包括用B細(xì)胞淋巴瘤制備的抗體的可變區(qū)和T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體的可變區(qū)(它們有時(shí)還用于引導(dǎo)自身免疫病的抗原)。還可以使用其它腫瘤相關(guān)蛋白作為靶蛋白，例如在腫瘤細(xì)胞內(nèi)含量很高的蛋白，其中包括被單克隆抗體17-1A識(shí)別的蛋白和葉酸結(jié)合蛋白。
雖然本發(fā)明可用于免疫個(gè)體以抵抗一種或多種形式的癌癥，本發(fā)明尤其適用于對(duì)個(gè)體進(jìn)行預(yù)防性免疫，所述個(gè)體具有患某種癌癥的傾向性或曾經(jīng)患有癌癥因而懷疑會(huì)復(fù)發(fā)。遺傳學(xué)和技術(shù)以及流行病學(xué)的發(fā)展，已能夠確定個(gè)體患癌癥的可能性和進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。利用遺傳篩選和/或家族健康史，可以預(yù)測(cè)某個(gè)體患上數(shù)種癌癥中任何一種的可能性。
同樣，那些已經(jīng)患上了癌癥的個(gè)體，以及接受治療已去除癌癥或處于緩和期的個(gè)體，尤其容易復(fù)發(fā)。作為治療方案的組成部分，為了避免復(fù)發(fā)，可以針對(duì)已確診的癌癥對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫。這樣，一旦得知個(gè)體曾患有某種癌癥并有可能復(fù)發(fā)，就可以對(duì)他們進(jìn)行免疫，從而使得他們的免疫系統(tǒng)作好準(zhǔn)備以抵抗任何將發(fā)生的癌癥。
本發(fā)明提供了一種治療患超增殖性疾病個(gè)體的方法。在這種方法中，引入遺傳構(gòu)建物起著免疫治療的作用，即引導(dǎo)和促進(jìn)個(gè)體的免疫系統(tǒng)以抵抗產(chǎn)生靶蛋白的超增殖細(xì)胞。
本發(fā)明提供了治療患自身免疫疾病和失調(diào)的個(gè)體的方法，即提供基礎(chǔ)廣泛的保護(hù)性免疫應(yīng)答，以抵抗與自身免疫相關(guān)的靶目標(biāo)，其中包括細(xì)胞受體和產(chǎn)生導(dǎo)向于“自身”的(self-directed)抗體的細(xì)胞。
T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、Sjogren氏綜合征、肉狀瘤病、胰島素依賴性糖尿病(ID DM)、自身免疫甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、僵硬性脊椎炎、硬皮病、多肌炎、皮膚肌炎、牛皮癬、脈管炎、韋格納氏肉芽腫病、Crohn氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。上述疾病的特征均在于T細(xì)胞受體結(jié)合內(nèi)源性抗原，由此引發(fā)與自身免疫病有關(guān)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。針對(duì)T細(xì)胞可變區(qū)的免疫接種，可引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答，以消滅這些T細(xì)胞。
在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，已經(jīng)定性了數(shù)種參與該疾病的T細(xì)胞受體(TCR)的特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-3、Vβ-14、Vβ-17和Vα-17。這樣，用編碼以上蛋白中至少一種蛋白的DNA構(gòu)建物來(lái)免疫接種，將引發(fā)針對(duì)參與RA的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。參見(jiàn)Howell，M.D.等，1991美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8810921-10925；Paliard，X.等人，1991，科學(xué)(Science)253325-329；Williams，W.V.，等人，1992，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)90326-333；以上文獻(xiàn)均被本文引用作為參考。
在多發(fā)性硬化癥(MS)中，已經(jīng)確定了數(shù)種參與該疾病TCR的特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-7和Vα-10。這樣，用編碼以上蛋白中至少一種蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建物來(lái)免疫接種，將引發(fā)針對(duì)參與MS的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。參見(jiàn)Wucherpfennig，K.W.等人，1990科學(xué)(Science)2481016-1019；Oksenberg，J.R.等人，1990，自然(Nature)345344-346；以上文獻(xiàn)均被本文引用作為參考。
在硬皮病中，已經(jīng)確定了數(shù)種參與該疾病的TCR的特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14和Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。這樣，用編碼以上蛋白中至少一種蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建物來(lái)接種免疫，將引發(fā)針對(duì)參與硬皮病的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
為了治療患T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病(尤其是TCR可變區(qū)還是未知的疾病)的患者，可以進(jìn)行滑液活檢?？梢垣@取存在的T細(xì)胞的樣品，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定TCR的可變區(qū)。利用以上信息就可以制備遺傳疫苗。
B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病包括狼瘡(SLE)，格雷夫斯氏病，重癥肌無(wú)力，自身免疫溶血性貧血，自身免疫性血小板減少、哮喘、冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽硬化和惡性貧血。上述疾病的特征均在于抗體結(jié)合于內(nèi)源抗原，由此引發(fā)與自身免疫病相關(guān)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。用針對(duì)這些抗體的可變區(qū)的免疫接種，將引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答，從而消滅這些產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。
為了治療患B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的患者，必需鑒定出參與自身免疫活性的那些抗體的可變區(qū)。可以進(jìn)行活檢，獲取位于炎性反應(yīng)部位的抗體樣品。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定這些抗體的可變區(qū)。利用這一信息就可以制備出遺傳疫苗。
以SLE為例，一種抗原被認(rèn)為是DNA。這樣，對(duì)于待接受抗SLE免疫的患者，可對(duì)其血清進(jìn)行抗DNA抗體的篩選，然后就能夠制備出疫苗，該疫苗包含編碼血清中發(fā)現(xiàn)的抗-DNA抗體的可變區(qū)的DNA構(gòu)建物。
TCR和抗體兩者可變區(qū)的一般結(jié)構(gòu)特征是眾所周知的。一般，可以利用公知技術(shù)來(lái)找到編碼特定TCR或抗體的DNA序列，所述技術(shù)可參見(jiàn)Kabat等人，1987，免疫學(xué)上感興趣蛋白質(zhì)的序列(Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest)U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda MD，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。此外，克隆抗體的功能性可變區(qū)的通用方法可參見(jiàn)Chaudhary，V.K.等人，1990，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)871066，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1腎源性(nephritogenic)自身抗體抗-DNA IL/IM該單克隆抗體是從衍生自MRL-lpr/lpr小鼠的雜交瘤大板(panel)(Vlahakos等人，1992，Kidney Int.41，1690-1700)上鑒別出的，因?yàn)樗c從患腎炎的MRL-lpr/lpr小鼠腎臟洗脫出的Ig共享抗原結(jié)合特性?？?DNA IL/IM是J558 VH基因家族的一種IgG2a抗體，其pI為5.1?？?DNA IL/IM抗體特異性地結(jié)合于ssDNA、dsDNA、SmRNP和腎小球抽提物。在施用于正常的組織相容性小鼠后，抗-DNAIL/IM會(huì)在腎臟形成腎小球膜的、內(nèi)皮下層的、和管腔內(nèi)的免疫沉淀物。
當(dāng)產(chǎn)生抗-DNA IL/IM的雜交瘤細(xì)胞被施用于組織相容性小鼠的腹腔內(nèi)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的膜內(nèi)的和管腔內(nèi)的沉淀物，這與毛細(xì)管壁增厚、腎小球膜間位(interposition)和膨脹、動(dòng)脈瘤膨脹和腎小球毛細(xì)袢的管腔內(nèi)閉合、以及嚴(yán)重的蛋白尿等有關(guān)。盡管腎小球免疫沉淀物的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象讓人想起與冷球蛋白血癥相關(guān)的現(xiàn)象，但是在攜帶抗-DNA IL/IM雜交瘤且具有高血清抗-DNA抗體活性的小鼠中，并沒(méi)有檢測(cè)到冷球蛋白或類風(fēng)濕因子。腎小球免疫沉淀物的形成與毛細(xì)管壁增厚、腎小球膜間位(interposition)和膨脹、動(dòng)脈瘤膨脹和腎小球毛細(xì)袢的管腔內(nèi)閉合、以及嚴(yán)重的蛋白尿等有關(guān)。
在給出了其交叉反應(yīng)特性和特征性的腎源性特征之后，考慮分析抗-DNAIL/IM是否通過(guò)與腎小球抗原的直接作用而形成免疫沉淀物。為了闡明這一可能性，對(duì)單克隆抗-DNA IgG2a抗體，抗-DNA IL/IM結(jié)合于腎小球細(xì)胞表面抗原的能力加以評(píng)估。在體內(nèi)施用于正常小鼠后，抗-DNA IL/IM產(chǎn)生腎小球膜的、內(nèi)皮下層的、和管腔內(nèi)的免疫沉淀物。通過(guò)FACS，抗-DNA IL/IM(用雜交瘤編號(hào)H221來(lái)稱呼)結(jié)合于腎小球膜的、管上皮的和主動(dòng)脈上皮的細(xì)胞表面，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同種型匹配的抗-DNA抗體(該抗體不產(chǎn)生腎小球免疫沉淀物)與表面的結(jié)合。結(jié)果示于圖1A、1B和1C(鼠內(nèi)皮細(xì)胞是Dr.Fuad Ziyadeh(Renal Division，Universityof Pennsylvania)的惠贈(zèng))。
用抗DNA抗體對(duì)腎小球細(xì)胞的總細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western印跡分析，結(jié)果表明抗-DNA IL/IM可與多個(gè)條帶反應(yīng)，而不形成免疫沉淀物的抗-DNA抗體則不反應(yīng)。在對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行生物素標(biāo)記和用抗-DNA IL/IM進(jìn)行免疫沉淀之后，在腎小球膜細(xì)胞裂解液中鑒別出一個(gè)100kD條帶，該條帶不能被同種型匹配的對(duì)照單克隆抗-DNA抗體所識(shí)別。
因此，這表明抗-DNA IL/IM單克隆抗體可結(jié)合于鼠腎臟的腎小球膜血小板和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，因而鑒別出了一種候選的表面蛋白質(zhì)靶目標(biāo)。這顯示了該單克隆抗體的多特異性抗原結(jié)合特性(這是病原性SLE抗體的共同特征)，因而在形成腎小球免疫沉淀的起始過(guò)程中可能負(fù)責(zé)與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合。
對(duì)抗-DNA IL/IM(H221)進(jìn)行了序列分析。在此給出了完整的VL-JL序列(SEQID NO4)和幾乎完整的VH-DH-JH序列(SEQ ID NO6)。
H221VL-JL 序列 (SEQ ID NO4)GAC ATT GTG ATA TCA CAG TCT CCA TCC ACC CTG GCT GTG TCA GCA GGA GAG AAG GTC ACT ATG AACasp ile val ile ser gln ser pro ser thr leu ala val ser ala gly glu lys val thr met asnCDR ITGC AAA TCC AGT CAG AGT CTG TTC AAC AGT AGA ACC CGA AAG AAC TAC TTG GCT TGG TTC CAG CAGcyslys ser ser gln ser leu phe asn ser arg thr arg lys asn tyr leu alatrp phe gln glnCDR IIAAA CCA GGG CAG TCT CCT AAA CTG CTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC CCT GATlys pro gly gln ser pro lys leu leu ile tyrtrp ala ser thr arg glu sergly val pro aspCGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GACarg phe thr gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile ser ser val gln ala glu aspCDR IIICTG GCA GTT TAT TAC TGC AAG CAA TCT TAT TAT CTT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AGG CTG GAAleu ala val tyr tyr cyslys gln ser tyr tyr leu arg thrphe gly gly gly thr arg leu gluH221 VH-DH-JH 序列 (SEQ ID NO6)GAG GTC CAG CTG CAG CAG CCT GGT GCT GAA CTT GTG AAG TCT GGG GCC TCA GTG AAG CTGglu val gln leu gln gln pro gly ala glu leu val lys ser gly ala ser val lys leuCDR ITCC TGC AAG GCT TCT GAC TTC ACT TTC ACC AGC TAC TGG ATA AAC TGG GTG AAA CAG AGGser cys lys ala ser asp phe thr phe thrser tyr trp ile asntrp val lys gln argCDR IICCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA AAA TTT TAT CCT GGT AGT GGT ACT ATT AAC TACpro gly gln gly leu glu trp ile glylys phe tyr pro gly ser gly thr ile asn tyrAGT GAA AAT TTT AAG AAA AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGT ACA TCC TACser glu asn phe lys lyslys ala thr leu thr val asp thr ser ser ser thr ser tyrATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAC GAC TCT GCG GTC TAT TAT TGT GCA AGA GAA CGTmet gln leu ser ser leu thr ser asp asp ser ala val tyr tyr cys ala argglu argCDR IIICTC CTG GGG TTT GTT TAT TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT ACA GCC AAA ACAleu leu gly phe val tyrtrp gly gln gly thr leu val thr val ser thr ala lys thrACA GCC CCA TCG GTC TAT CGG GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GGC ACTthr ala pro ser val tyr arg gly ser ser arg val asp leu gln ala cys lys leu gly thr結(jié)果證實(shí)，抗-DNA IL/IM(H221)是J558 VH家族的一個(gè)成員，并且它提供了進(jìn)行“研究設(shè)計(jì)和方法”章節(jié)中所述試驗(yàn)的材料。額外的序列分析正在進(jìn)行以完成重鏈的序列。
進(jìn)行針對(duì)抗-DNA IL/IM的遺傳免疫接種進(jìn)行了初步試驗(yàn)，即用編碼抗-DNA IL/IM VH或Fv區(qū)的DNA構(gòu)建物來(lái)免疫AKR×DBA/2小鼠，然后用致死劑量的親代雜交瘤細(xì)胞來(lái)攻擊它們。簡(jiǎn)而言之，如圖2A所示，將VH或Fv區(qū)克隆入遺傳免疫載體中并將V區(qū)置于CMV啟動(dòng)子的控制之下。如圖2B所示，V區(qū)被定向于細(xì)胞膜、或被分泌、或留在胞質(zhì)中、或用腺病毒E19蛋白ER保留信號(hào)而留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。還開(kāi)發(fā)了定向于溶酶體的構(gòu)建物。
Biocca，S.等人，1990，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)9101-108描述了定位于細(xì)胞膜、被分泌、胞質(zhì)定位，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。Nilsson等人，1989，細(xì)胞(Cell)58707-718，Jackson等人，1993，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)121(2)317-333和Jackson等人，1990，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)93153-3162描述了用腺病毒E19蛋白ER保留信號(hào)，將蛋白質(zhì)留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Letourneur，F(xiàn).和R.D.Klausner 1992，細(xì)胞(Cell)691143-1157描述了將蛋白質(zhì)導(dǎo)向溶酶體。
在初步試驗(yàn)中，在用布比卡因預(yù)處理后，將純化的質(zhì)粒DNA接種于小鼠。在數(shù)次加強(qiáng)免疫之后，評(píng)估小鼠的抗體應(yīng)答。對(duì)照包括殺死的雜交瘤細(xì)胞和純化的抗體Fv區(qū)。這些免疫原中沒(méi)有一種能夠引發(fā)針對(duì)抗-DNA IL/IM Fab片段的血清應(yīng)答(用標(biāo)記的葡萄球菌G蛋白進(jìn)行檢測(cè))。在初步研究中，用數(shù)種構(gòu)建物來(lái)引發(fā)增殖性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。選擇出最佳的構(gòu)建物，在更大的小鼠組中進(jìn)行評(píng)估。用100微克質(zhì)粒DNA和布比卡因同時(shí)來(lái)免疫各組一次，每組有4只AKR×DBA/2小鼠。一周后，殺死小鼠，評(píng)估細(xì)胞毒性T細(xì)胞和增殖反應(yīng)。增殖是這樣評(píng)估的用純化的H221單克隆抗體(25或5＝B5g/孔)或用20,000或100,000殺滅的抗-DNA IL/IM雜交瘤細(xì)胞刺激免疫脾細(xì)胞72小時(shí)，然后用含氚的胸苷脈沖過(guò)夜。結(jié)果示于圖3。
最佳的增殖反應(yīng)是由殺滅的雜交瘤細(xì)胞所引發(fā)的。對(duì)于大多數(shù)構(gòu)建物都觀察到了可觀的反應(yīng)(僅與載體比較)，但是在程度上僅僅是適度而已。對(duì)于用殺滅細(xì)胞或用導(dǎo)向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的疫苗所免疫的小鼠，針對(duì)純化單克隆抗體的增殖反應(yīng)是顯著的(與主軸(backbone)對(duì)照相比，超過(guò)2倍標(biāo)準(zhǔn)差)。對(duì)于用導(dǎo)向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的疫苗和用VH-可溶型且VH-胞質(zhì)型疫苗兩者，針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的增殖反應(yīng)是顯著的(與主軸(backbone)對(duì)照相比，超過(guò)2倍標(biāo)準(zhǔn)差)。與之相反，引導(dǎo)的CTL應(yīng)答是驚人的。這些結(jié)果示于圖4A、4B和4C。
在殺滅的抗-DNA IL/IM刺激物(脾細(xì)胞與刺激物之比為20∶1)存在下，培養(yǎng)免疫脾細(xì)胞7天，其中在前2天存在伴刀豆球蛋白A，然后僅與刺激物一起培養(yǎng)。用51Cr標(biāo)記抗-DNA IL/IM雜交瘤細(xì)胞，在圓底微量滴定板中測(cè)定裂解情況。對(duì)于各種不同的效應(yīng)子∶靶目標(biāo)之比，顯示出了平均值＝B1標(biāo)準(zhǔn)差％特異性裂解(如上對(duì)CD4所示的那樣)。有趣的是，與作為測(cè)試中陽(yáng)性對(duì)照的殺滅細(xì)胞相比，除了一種構(gòu)建物(可溶的重鏈V區(qū)或VHsol)之外，所有的構(gòu)建物都同等地或更佳地引發(fā)CTL活性。具體地，對(duì)于胞質(zhì)和ER導(dǎo)向型構(gòu)建物，觀察到了異常出色的應(yīng)答。這表明，導(dǎo)向于這些區(qū)室(compartment)可以加強(qiáng)觀察到的CTL應(yīng)答。
這些結(jié)果表明，大多數(shù)評(píng)估的DNA疫苗可引導(dǎo)從良好至優(yōu)秀的CTL應(yīng)答。該試驗(yàn)可作為該策略的一個(gè)例子，該策略可用于選擇具體疫苗以進(jìn)行研究并排除其他疫苗。因此，定向于胞質(zhì)的Fv構(gòu)建物所引發(fā)的CTL應(yīng)答明顯高于其他構(gòu)建物(＞2倍標(biāo)準(zhǔn)差)。根據(jù)這一分析，該疫苗值得進(jìn)一步評(píng)估。類似地，VH可溶性疫苗并不引發(fā)良好的CTL應(yīng)答。因此，該疫苗可以被剔除而不必進(jìn)一步評(píng)估，因?yàn)楦鶕?jù)在CD4系統(tǒng)中所建立的假設(shè)，預(yù)計(jì)它不會(huì)引發(fā)保護(hù)性的應(yīng)答。
對(duì)于該疫苗額外試驗(yàn)揭示，情況的確如此。在該試驗(yàn)中，用100＝B5g的DNA疫苗免疫各組3次，每組有5或6只小鼠。然后用抗-DNA IL/IM雜交瘤細(xì)胞對(duì)它們進(jìn)行腹腔內(nèi)攻擊。4周后，當(dāng)腫瘤在對(duì)照動(dòng)物中出現(xiàn)時(shí)，所有的小鼠都被殺死，并評(píng)估腫瘤負(fù)荷和腹水?dāng)?shù)量。還定量分析了患腫瘤的小鼠的比例。這些結(jié)果示于圖5A、5B和5C。
圖5A顯示患腫瘤的小鼠比例。圖5B顯示了在各組的平均腫瘤質(zhì)量和每只小鼠的具體值。類似地，圖5C顯示了獲得的惡性腹水的體積。注意，在該具體試驗(yàn)中，用殺滅的細(xì)胞所免疫的小鼠(我們的陽(yáng)性對(duì)照)與僅用載體免疫的小鼠(我們的陰性對(duì)照)相比，在各方面都沒(méi)有很大差異。盡管如此，數(shù)種DNA疫苗顯示出明顯的保護(hù)力，尤其是Fv胞質(zhì)定向型疫苗以及Fv和VH兩者的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)定向型疫苗。這與這些疫苗引發(fā)CTL應(yīng)答的能力具有很好的吻合性。VH可溶性疫苗不表現(xiàn)出保護(hù)力，這與它不顯示CTL活性是相一致的。
實(shí)施例2有數(shù)種人類疾病與B細(xì)胞和T細(xì)胞的病理性增殖有關(guān)。這包括惡性或超增殖性疾病例如淋巴瘤和白血病，以及自身免疫疾病如全身性紅斑狼瘡(SLE)(其中致病的自身抗體導(dǎo)致組織受損)。這些疾病的目前治療手段是不夠的，治療常伴有發(fā)生率高的副作用。一種更合邏輯的治療這些疾病的方法是特異性地消除致病細(xì)胞。這可以通過(guò)主動(dòng)性的、針對(duì)其可變區(qū)的免疫治療而實(shí)現(xiàn)。針對(duì)V區(qū)的主動(dòng)免疫有消除致病細(xì)胞的潛在可能。此外，通過(guò)引發(fā)保護(hù)性免疫，可以消除致病克隆的再次出現(xiàn)。然而，由免疫所引發(fā)免疫應(yīng)答，也有可能會(huì)產(chǎn)生不利的后果。例如，針對(duì)產(chǎn)生B細(xì)胞V區(qū)的自身抗體的理想化免疫，應(yīng)引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答以消除致病的B細(xì)胞，從而限制自身抗體的產(chǎn)生。但是，如果引發(fā)了輔助性T細(xì)胞(即TH2型應(yīng)答)，那么自身抗體的產(chǎn)生事實(shí)上會(huì)增加，從而有害于病人。因此，針對(duì)致病的B細(xì)胞或T細(xì)胞V區(qū)的主動(dòng)免疫應(yīng)當(dāng)被設(shè)計(jì)成引發(fā)所需的免疫應(yīng)答(如CTL應(yīng)答)，同時(shí)又限制潛在不利的應(yīng)答(如TH2應(yīng)答)。
針對(duì)自身抗體V區(qū)的DNA免疫接種，如下進(jìn)行評(píng)估。產(chǎn)生自身抗體的雜交瘤抗-DNA IL/IM(也稱為H221)是從衍生自MRL-lpr/lpr小鼠的雜交瘤大板(panel)上選出的；當(dāng)產(chǎn)生抗-DNA IL/IM的雜交瘤細(xì)胞被施用于組織相容性小鼠的腹腔內(nèi)時(shí)，導(dǎo)致了腎小球性腎炎，其特征是大量膜內(nèi)的和管腔內(nèi)的沉淀物，這與毛細(xì)管壁增厚、腎小球膜間位(interposition)和膨脹、動(dòng)脈瘤膨脹和腎小球毛細(xì)袢的管腔內(nèi)閉合、以及嚴(yán)重的蛋白尿等有關(guān)。這就提供一種體內(nèi)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中可以評(píng)估獨(dú)特型DNA免疫接種在引發(fā)保護(hù)性免疫方面的效力。為了調(diào)查增強(qiáng)這些DNA疫苗免疫原性的可能性，將基因表達(dá)導(dǎo)向于特定的胞內(nèi)或胞外區(qū)室(導(dǎo)向胞質(zhì)、導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)以便分泌和導(dǎo)向ER以便保留)。采用了針對(duì)單個(gè)V區(qū)(VH區(qū))和針對(duì)整個(gè)Fv(VH與VL相連)片段的免疫接種。結(jié)果表明，針對(duì)H221 VH和Fv區(qū)的DNA接種會(huì)引發(fā)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是強(qiáng)效的CTL應(yīng)答，并且通過(guò)將待表達(dá)的V區(qū)引導(dǎo)至胞質(zhì)或保留在ER中，使CTL活性得以增強(qiáng)。此外，獨(dú)特型DNA免疫接種引發(fā)了針對(duì)H221細(xì)胞的保護(hù)性免疫，尤其是當(dāng)基因產(chǎn)物被引導(dǎo)至保留在ER中時(shí)。
材料和方法DNA構(gòu)建物pBBkan是一種真核表達(dá)載體，它用CMV啟動(dòng)子和RSV增強(qiáng)子來(lái)指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄(圖8)。它最初是這樣進(jìn)行修飾將來(lái)自小鼠IgG的分泌前導(dǎo)序列或細(xì)胞質(zhì)前導(dǎo)序列亞克隆入多克隆位點(diǎn)的NotI和XbaI位點(diǎn)之間。具有分泌前導(dǎo)序列的載體是分泌型和ER保留型疫苗的親代載體。同樣，具有細(xì)胞質(zhì)前導(dǎo)序列的載體是胞質(zhì)表達(dá)型疫苗的親代載體。H221的VH和VL區(qū)通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，并使用重組PCR來(lái)產(chǎn)生Fv編碼序列(Srikatan等人，1994，AIDS 81525-32，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。將XbaI限制性位點(diǎn)引入單個(gè)重鏈產(chǎn)物的5′端和κ-輕鏈產(chǎn)物(Fv)的5′端。PCR產(chǎn)物被限制性消化，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿抽提法從2％低熔點(diǎn)瓊脂糖純化出，再凝膠純化，然后或者直接連入載體(與前導(dǎo)序列一起連入)，或者連于其他片段并用作模板進(jìn)行進(jìn)一步PCR反應(yīng)，從而按所示的拼接于3′導(dǎo)向序列(CD4 TM拼接于E19，F(xiàn)v或VH拼接于CD4-E19)。E19信號(hào)序列是從CD8-E19上擴(kuò)增出的(Nilsson等人，1989，細(xì)胞(Cell)58707-718，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。使用的引物列于表3。在表4中列出了下列物質(zhì)的氨基酸序列免疫球蛋白前導(dǎo)序列(用于分泌或保留的ER導(dǎo)向)(SEQ ID NO22)、胞質(zhì)前導(dǎo)序列(SEQ ID NO23)、H221 VL區(qū)(SEQ ID NO24)、接頭肽(SEQ ID NO25)、H221 VH區(qū)(SEQ IDNO26)和CD4跨膜和E19細(xì)胞質(zhì)結(jié)合域(用于保留于ER)(SEQ ID NO27)。免疫球蛋白前導(dǎo)序列(SEQ ID NO22)是鼠的免疫球蛋白前導(dǎo)序列，它被用于將基因產(chǎn)物引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以便被分泌或保留。胞質(zhì)前導(dǎo)序列(SEQ ID NO23)是一種早已報(bào)道的用于在胞內(nèi)表達(dá)抗體的序列(Biocca等人，1990歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)，9101-108，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。VH和VL序列(分別為SEQ IDNO24和SEQ ID NO26)是在PCR產(chǎn)物的克隆之后確定的。接頭肽(SEQ ID NO25)被用于功能性地表達(dá)Fv區(qū)。將人CD4跨膜區(qū)與腺病毒E19導(dǎo)向序列合二為一，以用于ER保留(SEQ ID NO27)。
這些PCR產(chǎn)物被克隆入pBBkan中，然后轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg，MD)中。用ABI熒光測(cè)序試劑盒(AppliedBiosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA)對(duì)具有正確限制性圖譜的克隆進(jìn)行測(cè)序。按試劑盒說(shuō)明書，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和干燥，然后由賓西法尼亞大學(xué)癌癥中心核心測(cè)序研究所(University of Pennsylvania Cancer Center Core Sequencing Facility)進(jìn)行凝膠電泳和分析。序列分析揭示，H221采用了J558 VH和JH3基因，并與VK1基因配對(duì)。載體、構(gòu)建物和插入片段序列示于圖8和表4。質(zhì)粒制備物在超級(jí)肉湯培養(yǎng)基(Super Broth)(1.2％w/v Difco胰蛋白胨、2.4％w/v Difco酵母提取物、0.5％v/v甘油、72mM磷酸氫二鉀、28mM磷酸二氫鉀)中生長(zhǎng)，然后根據(jù)制造商的方案用Qiagen 500端頭(tips)(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)進(jìn)行純化。在布比卡因預(yù)處理后(Wang等人，1993，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)904156-4160，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)，進(jìn)行DNA免疫接種。
增殖分析在無(wú)菌方式下，取出免疫接種小鼠的各脾臟，在RMPI中輕柔地使之破裂，用Gey′s溶液進(jìn)行處理以裂解紅細(xì)胞。將脾細(xì)胞接種至96孔平圓底的組織培養(yǎng)板(Falcon 3072；Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，每孔為500,000個(gè)細(xì)胞，終體積為200微升。將一式三份的孔暴露于僅培養(yǎng)基、2微克/毫升伴刀豆球蛋白A、5和25微克/毫升H221單克隆抗體、以及5∶1或25∶1(脾細(xì)胞∶刺激物)用絲裂霉素C殺傷過(guò)的H221雜交瘤細(xì)胞。在37℃，用25微克/毫升絲裂霉素C在PBS中處理106雜交瘤細(xì)胞/毫升45分鐘，然后用PBS洗滌3次以去除毒素。在37％和5％二氧化碳下培養(yǎng)3天之后，將1μCi含氚胸苷(NEN Life Sciences，Boston，MA)加至20微升培養(yǎng)液中，18小時(shí)后，在Tomtec Harvester 96(Tomtec，Orange，CT)上收獲平板。過(guò)濾物(filtermats)被干燥，然后用Microbeta 1450閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)對(duì)β閃爍進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞分析將5×105/毫升的脾細(xì)胞與2微克/毫升伴刀豆球蛋白A和絲裂霉素C處理過(guò)的刺激物(脾細(xì)胞與刺激物之比為20∶1)一起培養(yǎng)24小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基以去除促細(xì)胞分裂素。培養(yǎng)4天后，將細(xì)胞收集入10毫升培養(yǎng)基中，在Ficoll上于1500g離心20分鐘。接著，細(xì)胞被計(jì)數(shù)，然后按下列效應(yīng)子∶靶細(xì)胞之比，與數(shù)目固定的靶細(xì)胞一起接種于各圓底孔中100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1。靶細(xì)胞是這樣制備的將107個(gè)活的H221細(xì)胞再懸浮于250微升培養(yǎng)基中，然后加入75μCi51Cr-鉻酸鈉(NEN/Life Sciences，Boston，MA)，然后在室溫下孵育2小時(shí)。然后，用RPMI完全培養(yǎng)基洗滌這些細(xì)胞3次，并再懸浮以進(jìn)行平板接種。平板在800rpm離心2分鐘，然后在37℃孵育5和16小時(shí)，在5和16小時(shí)時(shí)小心地取出50微升上清液，用Optiphase閃爍流體(Wallace Inc.，Gaithersburg，MD)在閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行計(jì)數(shù)。特異性裂解百分比按下式進(jìn)行計(jì)算
(自發(fā)釋放是僅在培養(yǎng)基中孵育的細(xì)胞所釋放的cpm，而總釋放是通過(guò)在1％SDS中孵育而使全部靶細(xì)胞裂解所釋放的cpm)。
體內(nèi)腫瘤攻擊在3次DNA接種的最后一次時(shí)，用降植烷(1毫升，腹腔內(nèi))對(duì)小鼠進(jìn)行致敏。一周后，對(duì)小鼠(6只/組)腹腔內(nèi)注射106個(gè)活H221雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞已洗滌過(guò)2次，并以107細(xì)胞/毫升的濃度再懸浮于無(wú)菌PBS中。在前2周內(nèi)每周檢查小鼠是否有腫瘤生長(zhǎng)的信號(hào)(可觸摸的腫塊或腹水)，隨后每2周檢查一次。在攻擊后4周時(shí)，殺死小鼠，解剖下腫瘤塊，并稱重以確定腫瘤質(zhì)量。在有惡性腹水的小鼠中，腹水的細(xì)胞內(nèi)含物也被稱重并加入到腫瘤質(zhì)量中。
抗-DNA抗體分析用抗-dsDNA ELISA法(Madaio等人，1984，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.).132872，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。
結(jié)果獨(dú)特型DNA免疫接種引發(fā)特異性的免疫應(yīng)答在初步試驗(yàn)中，將純化的質(zhì)粒DNA接種入AKR×DBA/2小鼠中，在數(shù)次加強(qiáng)免疫之后，評(píng)估小鼠的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。對(duì)照包括殺滅的雜交瘤細(xì)胞和純化的H221單克隆抗體。在檢測(cè)不到的針對(duì)抗-DNA IL/IM Fab片段的血清學(xué)應(yīng)答的情況下(用標(biāo)記的鏈球菌G蛋白進(jìn)行檢測(cè))，用構(gòu)建物可引發(fā)淋巴細(xì)胞增殖性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答這兩種針對(duì)H221細(xì)胞的應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答被進(jìn)一步仔細(xì)地評(píng)估。對(duì)于每組4只AKR×DBA/2小鼠的各組，用質(zhì)粒DNA和鹽酸布比卡因同時(shí)接種一次。一周后，殺死小鼠，評(píng)估其細(xì)胞毒性T細(xì)胞和增殖反應(yīng)。結(jié)果示于圖9和10。
在評(píng)估單次DNA接種后脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)的試驗(yàn)中，用100微克DNA和0.25％布比卡因接種小鼠一次。在一周后，取出脾細(xì)胞，或者僅與培養(yǎng)基一起孵育，或者與殺滅的H221細(xì)胞一起孵育，或者與H221 Fab一起孵育。通過(guò)用純化的H221單克隆抗體(25或5微克/孔)，或用殺滅的抗-DNA IL/IM雜交瘤細(xì)胞(20,000或100,000細(xì)胞/孔)刺激免疫脾細(xì)胞，來(lái)評(píng)估增殖情況。陽(yáng)性對(duì)照是用殺滅的H221細(xì)胞(殺滅的細(xì)胞)進(jìn)行接種，陰性對(duì)照是僅用載體進(jìn)行接種。在培養(yǎng)3天后，細(xì)胞用含氚胸苷脈沖過(guò)夜，然后測(cè)定摻入情況的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)。對(duì)于2種濃度的Fab和2種濃度殺滅的H221細(xì)胞，給出了一式三份的孔的平均值ΔCPM(試驗(yàn)值減去僅培養(yǎng)基時(shí)的值)±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果示于圖9。
在評(píng)估單次DNA接種后細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的試驗(yàn)中，用100微克DNA和0.25％布比卡因接種小鼠一次。在一周后，取出脾細(xì)胞，與伴刀豆球蛋白A和殺滅的H221細(xì)胞(效應(yīng)子∶沉積物之比為20∶1)一起孵育。24-48小時(shí)后，除去伴刀豆球蛋白A，加入細(xì)胞并再繼續(xù)培養(yǎng)，總共培養(yǎng)5天。陽(yáng)性對(duì)照w是用殺滅的H221細(xì)胞(殺滅的細(xì)胞)進(jìn)行接種，陰性對(duì)照是僅用載體進(jìn)行接種。在培養(yǎng)5天后，通過(guò)非連續(xù)梯度離心分離出效應(yīng)細(xì)胞，然后用于在不同比例下裂解經(jīng)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。特異性裂解百分比如“材料和方法”章節(jié)中所述的那樣進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于一式三份的測(cè)量值，給出了特異性裂解百分比的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果示于圖9。在全部3張圖中，都顯示對(duì)照(殺滅的H221細(xì)胞和單用載體的情況)以供參照。結(jié)果示于圖10A、10B和10C。
與其他試驗(yàn)相同，最佳的增殖反應(yīng)是由殺滅的雜交瘤細(xì)胞所引發(fā)的(圖9)。對(duì)于大多數(shù)構(gòu)建物，可觀察到可檢測(cè)的應(yīng)答(與單用載體相比)，但是程度很輕。對(duì)于用殺滅的細(xì)胞或用ER-保留型疫苗免疫的小鼠，針對(duì)純化mAb的增殖反應(yīng)是顯著的(與主軸(backbone)對(duì)照相比，超過(guò)2倍標(biāo)準(zhǔn)差)。對(duì)于ER-保留型疫苗和VH可溶且VH-胞質(zhì)型疫苗兩者，針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的增殖反應(yīng)是顯著的(與主軸(backbone)對(duì)照相比，超過(guò)2倍標(biāo)準(zhǔn)差)。
與之相反，引導(dǎo)的CTL應(yīng)答是驚人的(圖10)。除了可溶的重鏈V區(qū)(VHsol)這種構(gòu)建物之外，所有的構(gòu)建物都與作為測(cè)試中陽(yáng)性對(duì)照的殺滅的細(xì)胞同等良好地或更佳地引發(fā)CTL活性。在其他試驗(yàn)中，與對(duì)照相比，VHsol可引發(fā)顯著的CTL應(yīng)答(在100∶1的效應(yīng)子∶靶細(xì)胞之比時(shí)，在典型試驗(yàn)中VHsol和對(duì)照的特異性裂解百分比分別為22％和10％)。對(duì)于胞質(zhì)型和ER引導(dǎo)型構(gòu)建物，觀察到了優(yōu)異的應(yīng)答，這表明引導(dǎo)至這些區(qū)室可加強(qiáng)CTL應(yīng)答。除了ER-保留型疫苗之外，F(xiàn)v構(gòu)建物通?？梢l(fā)更強(qiáng)的CTL。
防止雜交瘤攻擊的保護(hù)作用為了評(píng)估這些DNA疫苗在防止產(chǎn)生自身抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)攻擊方面的保護(hù)效力，用100微克DNA疫苗和布比卡因，按2周一次的間隔，對(duì)每組5-6只小鼠的各組進(jìn)行免疫。用活的抗-DNA IL/IM雜交瘤細(xì)胞(H221細(xì)胞)腹腔內(nèi)攻擊小鼠。4周后，評(píng)估小鼠的腫瘤負(fù)荷和腹水。所有具有腫瘤或腹水的小鼠都被殺死，切下腫瘤，測(cè)定腫瘤負(fù)荷。結(jié)果示于圖11A和11B。圖11A顯示了各接種組的腫瘤質(zhì)量。平均值顯示于柱狀圖中，并重迭標(biāo)出了各小鼠的測(cè)量值。圖11B顯示了在4周時(shí)，各組中患質(zhì)量的小鼠比例。以腫瘤負(fù)荷平均值的下降為證據(jù)，顯示出數(shù)種DNA疫苗有特異性效果。與殺滅細(xì)胞接種組的3/6和接受載體的對(duì)照組的2/5相比，F(xiàn)v和VHER保留型疫苗分別在6/6和4/5小鼠組中防止了腫瘤的形成。
與基線應(yīng)答相比，幾乎所有被評(píng)估的小鼠都顯示出血清抗-DNA效價(jià)的增加。對(duì)于這個(gè)參數(shù)在各組之間沒(méi)有顯著差異，盡管與單用載體相比，用FvER-保留型疫苗免疫的組中觀察到抗-DNA水平較低(對(duì)于FvER-保留型疫苗，效價(jià)增加為0.83±0.41，而載體對(duì)照組小鼠中為1.6±0.55，p＝0.025，Student′s t-測(cè)試)。因此，最強(qiáng)的疫苗的確顯著降低了該模型動(dòng)物中循環(huán)的抗-DNA的水平。
在存活者中的免疫應(yīng)答在腫瘤攻擊后存活的數(shù)只小鼠中，評(píng)估它們對(duì)殺滅的H221細(xì)胞的CTL活性和增殖情況。這包括了3只用殺滅的細(xì)胞免疫的小鼠，3只用胞質(zhì)Fv構(gòu)建物免疫的小鼠，和3只用ER-保留型Fv構(gòu)建物免疫的小鼠。在5周時(shí)(在開(kāi)始腫瘤攻擊后的38天)，殺死小鼠，并且如圖9所述，測(cè)定脾細(xì)胞對(duì)于殺滅的H221細(xì)胞的增殖反應(yīng)。對(duì)于各小鼠，顯示了一式三份的孔的平均CPM，并根據(jù)所接受的疫苗進(jìn)行標(biāo)示。CTL應(yīng)答有所下降(小鼠沒(méi)有在分析之前進(jìn)行加強(qiáng)免疫)，其中在用ER保留型構(gòu)建物免疫的小鼠中觀察到最高的應(yīng)答(在50∶1的效應(yīng)子∶靶細(xì)胞之比下，特異性裂解為13％)，但是在其他小鼠中觀察到類似應(yīng)答(在用殺滅的細(xì)胞免疫的小鼠中為7％在用Fv胞質(zhì)型構(gòu)建物免疫的小鼠中為7％)。與之相反，增殖反應(yīng)仍強(qiáng)烈(圖12)。最初用殺滅的細(xì)胞或用胞質(zhì)導(dǎo)向型Fv構(gòu)建物免疫的小鼠，在體外對(duì)殺滅的H221細(xì)胞有應(yīng)答(與單用培養(yǎng)基的對(duì)照(721±409和5,044±1,902)相比，CPM平均值分別為7,488±5,864和6,663±4,171)。相反，最初用ER保留型Fv構(gòu)建物免疫的那些小鼠，在體外對(duì)殺滅的H221細(xì)胞有應(yīng)答(與單用培養(yǎng)基的4,651±1,345)相比，CPM平均值為37,351±9,004)。這一強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)通過(guò)平行培養(yǎng)物中IL-2產(chǎn)量增加而得以反映(與用殺滅的細(xì)胞免疫的培養(yǎng)物相比，在用Fv內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留型疫苗免疫的培養(yǎng)物中，IL-2產(chǎn)量平均高2倍)。同時(shí)，這些結(jié)果顯示，在用Fv內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留型疫苗免疫并且攻擊后存活的小鼠中，有強(qiáng)的細(xì)胞增殖反應(yīng)。
討論這些研究表明，在沒(méi)有可檢測(cè)的體液免疫應(yīng)答的情況下，獨(dú)特型DNA免疫接種能夠引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，對(duì)于大多數(shù)評(píng)估的疫苗，CTL應(yīng)答水平相當(dāng)于或超過(guò)了用殺滅細(xì)胞所引發(fā)的CTL應(yīng)答(圖10)。然而，與殺滅細(xì)胞型疫苗相反，在DNA免疫接種后幾乎檢測(cè)不到增殖反應(yīng)(這通常與TH應(yīng)答相關(guān))(圖9)。因此，可以用獨(dú)特型DNA免疫接種來(lái)引發(fā)強(qiáng)CTL應(yīng)答，而同時(shí)僅引發(fā)輕微的TH應(yīng)答。這可以研究CTL在引導(dǎo)保護(hù)性免疫力方面的效力。通過(guò)將DNA疫苗引導(dǎo)至具體的細(xì)胞區(qū)室，可顯著增加這些獨(dú)特型DNA疫苗的免疫原性，尤其是在CTL引導(dǎo)方面(圖10)。引導(dǎo)至胞質(zhì)和保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可增強(qiáng)CTL應(yīng)答，這對(duì)于MHC I類限制性應(yīng)答是可預(yù)期的。觀察到Fv疫苗(同時(shí)有VH和VL區(qū))的免疫原性高于僅VH區(qū)。這可能是因?yàn)橛懈鄶?shù)目的表位被呈遞給免疫系統(tǒng)。連接肽的直接效應(yīng)還不能被排除。
如果疫苗被導(dǎo)向合適的胞內(nèi)區(qū)室，那么獨(dú)特型DNA免疫接種能夠保護(hù)小鼠以避免組織相容性的腫瘤攻擊(圖11)。這種保護(hù)性應(yīng)答很明顯是由細(xì)胞免疫力所造成的，因?yàn)樵谠撓到y(tǒng)中即使在腫瘤攻擊后的存活小鼠中也檢測(cè)不到體液免疫。所看到的保護(hù)作用最可能是由引發(fā)的CTL應(yīng)答所導(dǎo)致的，因?yàn)镋R保留型疫苗作為“最具保護(hù)力”的疫苗，引發(fā)了強(qiáng)的CTL應(yīng)答。這暗示，是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的抗原濃度和引發(fā)CTL，導(dǎo)致了保護(hù)性免疫。其他因素可能對(duì)保護(hù)性應(yīng)答有貢獻(xiàn)，例如在用于免疫接種的構(gòu)建物中存在非自身的抗原決定蔟。用ER保留型疫苗免疫的且在腫瘤攻擊后存活的小鼠，引發(fā)了抑制性的增殖反應(yīng)(圖12)。這表明，ER保留型FvDNA疫苗導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤攻擊產(chǎn)生次級(jí)應(yīng)答，在該次級(jí)應(yīng)答中對(duì)獨(dú)特型特異的T細(xì)胞的數(shù)目顯著膨脹。在最初用殺滅細(xì)胞或Fv胞質(zhì)型疫苗免疫的存活小鼠中，該增殖反應(yīng)并不那么高。這可能與攻擊后免疫應(yīng)答的時(shí)間有關(guān)，因?yàn)樵谘芯恐袃H對(duì)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了采樣。然而，ER保留型疫苗在引發(fā)強(qiáng)次級(jí)應(yīng)答方面的選擇性效果，得到了該組別中小鼠得到充分保護(hù)而避免了腫瘤攻擊這一結(jié)果的支持。
DNA疫苗的能夠進(jìn)行表達(dá)、細(xì)胞定位的能力以及DNA疫苗的其他參數(shù)，使得它們特別適用于研究引發(fā)的、可導(dǎo)致體內(nèi)保護(hù)作用的免疫應(yīng)答的本質(zhì)。DNA免疫接種已用于抵抗各種不同的典型腫瘤抗原，其中包括我們研究中使用表達(dá)人CD4的鼠淋巴瘤細(xì)胞，類似的使用β-半乳糖苷酶基因、人癌胚抗原、來(lái)自人p53基因突變形式的單個(gè)表位的系統(tǒng)。這些研究確立了DNA免疫接種在對(duì)抗典型腫瘤抗原方面的有用性。事實(shí)上，所有這些使用的抗原都是外源蛋白質(zhì)，它們的免疫原性通常比臨床上遇到的腫瘤自身抗原大得多。
已有報(bào)道，在有或沒(méi)有連鎖表達(dá)人GM-CSF的情況下，可在同時(shí)編碼人Cγ1和Cκ的表達(dá)載體中使用鼠淋巴瘤的VH和VL區(qū)(Syrengelas等人，1996，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)21038-1041，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。因此，該抗原具有與感興趣的自身-V區(qū)相連的外源抗原決定蔟。用這些構(gòu)建物進(jìn)行的肌內(nèi)或皮內(nèi)DNA接種，導(dǎo)致了抗-獨(dú)特型抗體的應(yīng)答以及在體內(nèi)部分防止腫瘤攻擊的保護(hù)作用。人GM-CSF的連鎖表達(dá)可明顯增強(qiáng)所引發(fā)的應(yīng)答。DNA免疫可誘導(dǎo)針對(duì)弱的、原本不能被識(shí)別的腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，而這取決于DNA所導(dǎo)致的額外刺激(即人恒定區(qū)和GM-CSF)。
獨(dú)立的同生型(syngeneic)V區(qū)DNA免疫，已表明能夠在自身免疫疾病的鼠模型中引發(fā)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。已表明，基于DNA且針對(duì)鼠Vβ8.2基因的免疫，可以保護(hù)H-2u小鼠防止試驗(yàn)性自身免疫性腦膜炎(EAE)(Waisman等人，1996，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)2899-905，該文獻(xiàn)在此引用作為參考)。檢測(cè)到了細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且結(jié)果揭示DNA免疫切斷了在該系統(tǒng)中由表達(dá)Vβ8.2的克隆所支配的病原性T細(xì)胞。它們的免疫方法(使用獨(dú)立的不與前導(dǎo)肽或CDR3相連的V區(qū))，沒(méi)有顯示出攜帶Vβ8.2的細(xì)胞被消除的證據(jù)。表1細(xì)小RNA病毒科鼻病毒屬(醫(yī)用)造成50％的普通感冒。
Etheroviruses(醫(yī)用)包括脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒，ECHO病毒，人腸道病毒例如甲肝病毒。
Apthoviruses(獸醫(yī)用)這些是足或口腔疾病病毒。
靶抗原VP1，VP2，VP3，VP4，VPGCalcivirus科Norwalk組病毒(醫(yī)用)這些病毒是傳染性胃腸炎的重要成因。披膜病毒科α病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)其實(shí)例包括Senilis病毒、RossRiver病毒和東方和西方腦膜炎病毒。
呼腸孤病毒屬(醫(yī)用)風(fēng)疹病毒。黃病毒科例如(醫(yī)用)登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦膜炎病毒、圣路易斯腦膜炎病毒和虱傳腦膜炎。丙肝病毒(醫(yī)用)這些病毒不屬于任何科，但被認(rèn)為或者是披膜病毒或者是黃病毒。與披膜病毒科最為相似。冠狀病毒科(醫(yī)用和獸醫(yī)用)傳染性支氣管炎病毒(禽)豬可轉(zhuǎn)移胃腸道病毒(豬)豬血細(xì)胞凝集腦脊髓炎病毒(豬)貓腸道病毒(貓)狗冠狀病毒(狗)人呼吸道冠狀病毒引起約40％普通感冒。EX.224E，0C43。
注意冠狀病毒可能引起甲肝、乙肝和丙肝以外的肝炎。
靶抗原
E1-又稱M蛋白或基質(zhì)蛋白E2-又稱S蛋白或刺突蛋白E3-又稱HE或血細(xì)胞凝集elterose糖蛋白(并不是存在于所有的冠狀病毒中)N-核衣殼彈狀病毒科Vesiliovirus屬狂犬病毒(醫(yī)用和獸醫(yī)用)狂犬病靶抗原G蛋白，N蛋白線狀病毒科(醫(yī)用)出血熱病毒，例如Marburg病毒和Ebola病毒副粘病毒科副粘病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)腮腺炎病毒，新Castle病病毒(重要的雞病毒)麻疹病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)麻疹病毒、狗瘟熱肺病毒(醫(yī)用或獸醫(yī)用)呼吸道合胞病毒正粘液病毒科(醫(yī)用)流感病毒環(huán)蛇屬病毒科環(huán)蛇病毒屬(醫(yī)用)加利福尼亞腦膜炎，LA Crosse白蛉熱病毒屬(醫(yī)用)Rift峽谷熱Hantavirus屬Puremala是一種hemahagin熱病毒內(nèi)羅畢病毒屬(獸醫(yī)用)內(nèi)羅畢綿羊病還有許多未歸類的環(huán)蛇屬病毒屬沙粒病毒科(醫(yī)用)LCM，Lassa熱病毒呼吸道腸道病毒科呼吸道腸道病毒屬可能是一種人病原Rotavirus兒童急性呼吸道腸道炎眶病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)克羅拉多虱傳熱病毒、Lebombo(人)、馬腦膜炎病毒、藍(lán)舌病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒科致癌病毒亞科(獸醫(yī)用和醫(yī)用)貓白血病病毒、HILVI和HTLVII慢性病毒亞科(醫(yī)用和獸醫(yī)用)HIV，貓免疫缺陷病毒、馬傳染病病毒、貧血病毒泡沫狀病毒亞科乳多空病毒科多瘤病毒亞科(醫(yī)用)BKU和JCU病毒乳頭瘤病毒亞科(醫(yī)用)與癌癥或乳頭瘤的惡性發(fā)展有關(guān)的許多種病毒腺病毒(醫(yī)用)EXAD7，ARD.，O.B.-引起呼吸道疾病部分腺病毒，例如275，引起腸炎細(xì)小病毒科(獸醫(yī)用)貓細(xì)小病毒引起貓腸炎貓腸炎病毒狗細(xì)小病毒豬細(xì)小病毒皰疹病毒科α皰疹病毒亞科單純皰疹病毒屬(醫(yī)用)HSVI，HSVII水痘病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)假狂犬病-水痘-帶狀皰疹病毒β皰疹病毒亞科巨細(xì)胞病毒屬(醫(yī)用)HCMV，Muromegalovirusγ皰疹病毒亞科淋巴隱病毒屬(醫(yī)用)EBV-(Burkitts淋巴細(xì)胞)，Rhadinovirus痘病毒科帶狀痘病毒亞科(醫(yī)用-獸醫(yī)用)天花病毒屬牛痘屬副痘病毒屬-(獸醫(yī)用)山羊痘病毒屬-獸醫(yī)用兔痘病毒屬豬痘病毒屬Entermopoxviridue亞科嗜肝DNA病毒科乙型肝炎病毒未分類的δ肝炎病毒表2細(xì)菌病原體革蘭氏陽(yáng)性病原球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌；和鏈霉球菌。
革蘭氏陰性病原球菌包括腦膜炎球菌和淋球菌。
病原性革蘭氏腸道桿菌包括腸桿菌；假單孢菌，不動(dòng)桿菌和eikenilla；類鼻疽；沙門氏菌；志賀氏菌；嗜血桿菌；軟下疳；不魯桿菌?。煌晾鸁?；巴斯德菌；鏈桿菌屬；念珠菌和螺菌屬；產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌；豬紅斑單毒絲菌；白猴菌；霍亂桿菌；炭疽桿菌；杜諾凡菌；和巴爾通氏體。
病原性厭氧菌包括破傷風(fēng)菌；肉毒菌和其它羧菌；結(jié)核菌；麻風(fēng)桿菌和其它分枝桿菌。病原性螺旋體病包括梅毒；密螺旋體病；；雅四疹；品它病和地方流行性梅毒；和鉤端螺旋體病。由較高級(jí)病原菌和病原性真菌引起的其它疾病包括放線菌?。恢Z卡菌??；隱球菌病，酵母菌病，組織胞漿菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉病，和毛霉菌病；孢子絲菌病，巴西芽生菌病，petriellidosis，球擬酵母菌屬，足分枝菌病和著色芽生菌?。缓推つw真菌病。
立克次體感染包括立克次體的和立克次體病。
支原體和衣原體感染的病例包括支原體肺炎；性病性淋巴肉芽腫；鸚鵡熱；和產(chǎn)期衣原體感染。真核病原由原蟲和蠕蟲引起的感染包括阿米巴?。化懠?；利什曼病；錐蟲?。还误w??；肺泡子蟲??；隆突；巴貝蟲病；賈第鞭毛蟲病；旋毛蟲病；馬來(lái)絲蟲病；血吸蟲??；線蟲；吸蟲；和絳蟲感染。
表3.用于PCR和重組PCR的引物分泌型和ER保留型前導(dǎo)序列5′GGGCGGCCGC AATGGACATG AGGGTCCCCG CTCAGCTCCT GGGGCTCCTG (SEQ ID NO8)3′CCTCTAGAAC ATTTGGCACC TGGGAGCCAG AGCAGCAGGA GCCCCAGGAG C (SEQ ID NO9)細(xì)胞質(zhì)前導(dǎo)序列5′GGGCGGCCGC AATGGGATGG AGCTGTAAGA GGCGCTCCTC GGAAG (SEQ ID NO10)3′CCCTCTAGAG TGGACACCAG CTGTAGCTGT TTCTTCCGAG GAGCG (SEQ ID NO11)CD4跨膜5′GTGCAGCCCA TGGCCCTGAT TGTG (SEQ ID NO12)3′TTCATTGGGC TAGGCATCTT CTTCAGATCT AGGTGC (SEQ ID NO13)ER-保留信號(hào)(腺病毒E19)5′TTCTTCAGAT CTAGGCGCAG TTTTATTGAT GAA (SEQ ID NO14)3′CGTAAAACGC GTTTAAGGCA TTTTCTTTTC (SEQ ID NO15)用于Fv表達(dá)的5′VκGGGGTTCTAG AGACATTGTG ATATCMCARW CTC (SEQ ID NO16)用于表達(dá)接頭肽的3′CL引物(以反平行方式書寫)CTGATAAGAT TTAGATTCGG AGCCAGAACC GGAAGATTTA CCTTCTGCAG CATCAGCCCG (SEQ IDNO17)用于單鏈表達(dá)的5′VH2引物GGGGTTCTAG AGAGGTCCAG CTGCARCARY CTGG (SEQ ID NO18)用于與接頭肽一起表達(dá)的5′VH引物GGCTCCGAAT CTAAATCTTA TCAGGAGGTC CAGCTGCARC ARYCTGG (SEQ ID NO19)用于跨膜/ER保留的3′IgG2a CHlATAGACCATG GGGGCTGTTG TTTTGGC (SEQ ID NO20)用于可溶性分泌的3′IgG2a CHlATAGAACGCG TGTCAGGCTG TTGTTTTGGC (SEQ ID NO21)M＝A或CR＝A或GW＝T或AY＝T或C表4免疫球蛋白前導(dǎo)序列(ER導(dǎo)向至分泌或保留)Met asp met arg val pro ala gln leu leu gly leu leu leu leu trpleu pro gly ala lys cys ser arg (SEQ ID NO22)胞質(zhì)前導(dǎo)序列Met gly trp ser cys lys arg arg ser ser glu glu thr ala thr alagly val his ser arg (SEQ ID NO23)H221VL區(qū)域Asp ile val ile ser gln ser pro ser thr leu ala val ser ala glyglu lys val thr met asn cys lys ser ser gln ser leu phe asn serarg thr arg lys asn tyr leu ala trp phe gln gln lys pro gly glnser pro lys leu leu ile tyr trp ala ser thr arg glu ser gly valpro asp arg phe thr gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thrile ser ser val gln ala glu asp leu ala val tyr tyr cys lys glnser tyr tyr leu arg thr phe gly gly gly thr arg leu glu (SEQ ID NO24)接頭肽Arg ala asp ala ala glu gly lys ser ser gly ser gly ser glu serlys ser tyr gln gly ser glu ser lys ser tyr gln (SEQ ID NO25)H221 VH區(qū)域Glu val gln leu gln gln ser gly ala glu leu val lys ser gly alaser val lys leu ser cys lys ala ser gly phe thr phe thr ser tyrtrp ile asn trp val lys gln arg ala gly gln gly leu glu trp ilegly asn ile tyr pro gly ser asn thr ile asn tyr ser glu asn phelys lys lys ala thr leu thr val asp thr ser ser ser thr ala tyrmet gln leu ser ser leu thr ser asp asp ser ala val tyr tyr cysala arg glu arg leu leu gly phe val tyr trp gly gln gly thr leuval thr val ser thr ala lys thr thr ala (SEQ ID NO26)CD4跨膜和E19細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(用于ER保留)Met ala leu ile val leu gly gly val ala gly leu leu leu phe ilegly leu gly ile phe phe arg ser arg arg ser phe ile asp glu lyslys met pro (SEQ ID NO27)序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Williams，William V.
Madaio，MichaelWeiner，David B.
(ii)發(fā)明名稱改良疫苗(iii)序列數(shù)目27(iv)通信地址(A)收信人Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris(B)街道One Liberty Place，46th floor(C)城市Philadelphia(D)州Pennsylvania(E)國(guó)家USA(F)郵編19103(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)Windows(D)軟件Wordperfect(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)資料
(A)申請(qǐng)?zhí)朥S60/029,592(B)申請(qǐng)日23-10月-1996(viii)律師/代理人信息(A)姓名DeLuca，Mark(B)登記號(hào)33,229(C)參考/案卷號(hào)UPN-3304(ix)通訊信息(A)電話215-568-3100(B)傳真215-568-3439(2)SEQ ID NO1(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Lys Gln Thr Leu Leu1 5(2)SEQ ID NO2(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Asp Glu Leu1(2)SEQ ID NO3(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Glu Lys Lys Met Pro1 5(2)SEQ ID NO4(i)序列特征(A)長(zhǎng)度330堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型兩種(both)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/分類符號(hào)CDS(B)位置1..330(xi)序列描述SEQ ID NO4GAC ATT GTG ATA TCA CAG TCT CCA TCC ACC CTG GCT GTG TCA GCA GGA 48Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAA TCC AGT CAG AGT CTG TTC AAC AGT 96Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser20 25 30AGA ACC CGA AAG AAC TAC TTG GCT TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45TCT CCT AAA CTG CTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC 240Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGC AAG CAA 288Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln85 90 95TCT TAT TAT CTT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AGG CTG GAA 330Ser Tyr Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu100 105 110(2)SEQ ID NO5(i)序列特征(A)長(zhǎng)度110氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser20 25 30Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln85 90 95Ser Tyr Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu100 105 110(2)SEQ ID NO6(i)序列特征(A)長(zhǎng)度330堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型兩種(both)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/分類符號(hào)CDS(B)位置1..427(xi)序列描述SEQ ID NO6GAG GTC CAG CTG CAG CAG CCT GGT GCT GAA CTT GTG AAG TCT GGG GCC48Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GAC TTC ACT TTC ACC AGC TAC96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30TGG ATA AAC TGG GTG AAA CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT144Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45GGA AAA TTT TAT CCT GGT AGT GGT ACT ATT AAC TAC AGT GAA AAT TTT192Gly Lys Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Glu Asn Phe50 55 60AAG AAA AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC ACA TCC TCC AGT ACA TCC TAC240Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ser Tyr65 70 75 80ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAC GAC TCT GCG GTC TAT TAT TGT288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95GCA AGA GAA CGT CTC CTG GGG TTT GTT TAT TGG GGC CAA GGG ACT CTG336Ala Arg Glu Arg Leu Leu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu90 95 100GTC ACT GTC TCT ACA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC TAT CGG GGA388Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Arg Gly105 110 115TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GGC ACT427Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly Thr120 125 130(2)SEQ ID NO7(i)序列特征(A)長(zhǎng)度131氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種(both)(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Lys Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Glu Asn Phe50 55 60Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ser Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Leu Leu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Arg Gly115 120 125Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly Thr130 135 140(2)SEQ ID NO8(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8GGGCGGCCGC AATGGACATG AGGGTCCCCG CTCAGCTCCT GGGGCTCCTG 50(2)SEQ ID NO9(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CCTCTAGAAC ATTTGGCACC TGGGAGCCAG AGCAGCAGGA GCCCCAGGAG C51(2)SEQ ID NO10(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GGGCGGCCGC AATGGGATGG AGCTGTAAGA GGCGCTCCTC GGAAG 45(2)SEQ ID NO11(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CCCTCTAGAG TGGACACCAG CTGTAGCTGT TTCTTCCGAG GAGCG 45(2)SEQ ID NO12
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GTGCAGCCCA TGGCCCTGAT TGTG24(2)SEQ ID NO13(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13TTCATTGGGC TAGGCATCTT CTTCAGATCT AGGTGC 36(2)SEQ ID NO14(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14TTCTTCAGAT CTAGGCGCAG TTTTATTGAT GAA 33(2)SEQ ID NO15(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15CGTAAAACGC GTTTAAGGCA TTTTCTTTTC 30(2)SEQ ID NO16(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GGGGTTCTAG AGACATTGTG ATATCMCARW CTC 33(2)SEQ ID NO17(i)序列特征(A)長(zhǎng)度60堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO17CTGATAAGAT TTAGATTCGG AGCCAGAACC GGAAGATTTA CCTTCTGCAG CATCAGCCCG 60(2)SEQ ID NO18(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO18GGGGTTCTAG AGAGGTCCAG CTGCARCARY CTGG34(2)SEQ ID NO19(i)序列特征(A)長(zhǎng)度47堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO19GGCTCCGAAT CTAAATCTTA TCAGGAGGTC CAGCTGCARC ARYCTGG 47(2)SEQ ID NO20(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO20ATAGACCATG GGGGCTGTTG TTTTGGC 27(2)SEQ ID NO21(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO21ATAGAACGCG TGTCAGGCTG TTGTTTTGGC 30(2)SEQ ID NO22(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Pro Gly Ala Lys Cys Ser Arg20(2)SEQ ID NO23(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Met Gly Trp Ser Cys Lys Arg Arg Ser Ser Glu Glu Thr Ala Thr Ala1 5 10 15Gly Val His Ser Arg20(2)SEQ ID NO24(i)序列特征(A)長(zhǎng)度110氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Asp Ile Val Ile Ser Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ala Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser20 25 30Arg Thr Arg Lys Asn Tyr leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln85 90 95Ser Tyr Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu100 105 110(2)SEQ ID NO25(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO25Arg Ala Asp Ala Ala Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser1 5 10 15Lys Ser Tyr Gln Gly Ser Glu Ser Lys Ser Tyr Gln20 25(2)SEQ ID NO26(i)序列特征(A)長(zhǎng)度122氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO26Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Ser Glu Asn Phe50 55 60Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Arg Leu Leu Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Ala115 120(2)SEQ ID NO27(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile1 5 10 15Gly Leu Gly Ile Phe Phe Arg Ser Arg Arg Ser Phe Ile Asp Glu Lys20 25 30Lys Met Pro3權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒，其特征在于，它含有可操作地連于調(diào)控元件的編碼序列，該編碼序列編碼連于或含有胞內(nèi)引導(dǎo)序列的免疫靶蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，該免疫靶抗原是變應(yīng)原、病原體抗原、癌癥相關(guān)抗原或連于自身免疫疾病相關(guān)細(xì)胞的抗原，或者該免疫靶抗原可引發(fā)與變應(yīng)原、病原體抗原、癌癥細(xì)胞抗原或抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，該胞內(nèi)引導(dǎo)序列是非天然信號(hào)序列。
4.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，該免疫靶抗原是變應(yīng)原、病原體抗原、癌癥相關(guān)抗原或連于自身免疫疾病相關(guān)細(xì)胞的抗原。
5.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，該胞內(nèi)引導(dǎo)序列將在細(xì)胞中表達(dá)的該免疫原性靶抗原引導(dǎo)定位于胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體。
6.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，該胞內(nèi)引導(dǎo)序列，引導(dǎo)在細(xì)胞中表達(dá)的該免疫原性靶抗原成為分泌型蛋白或膜結(jié)合蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，該胞內(nèi)引導(dǎo)序列選自下組DKQTLL(SEQ ID NO1)、位于免疫原性靶蛋白C末端的KDEL(SEQ ID NO2)，和在免疫原性靶蛋白C末端的DEKKMP(SEQ ID NO3)。
8.一種含有權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒的藥物組合物。
9.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，還含有多核苷酸功能增強(qiáng)子。
10.一種免疫個(gè)體以抵抗抗原的方法，其特征在于，給該個(gè)體施用權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
全文摘要
公開(kāi)了改良疫苗。改良疫苗包括一核苷酸序列,該核苷酸序列編碼的免疫靶蛋白連于胞內(nèi)引導(dǎo)序列或含有胞內(nèi)引導(dǎo)序列,該編碼序列可操作地連于調(diào)控元件。還公開(kāi)了使個(gè)體免疫的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1244807SQ97180856
公開(kāi)日2000年2月16日 申請(qǐng)日期1997年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月23日
發(fā)明者W·V·威廉斯, M·馬戴奧, D·B·韋納 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會(huì)