專利名稱：Hcv疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HCV疫苗。
免疫系統(tǒng)是已演化出來以保護多細胞生物免受感染性微生物侵害的相互關(guān)聯(lián)的細胞類型和分子之復雜網(wǎng)絡。其可分為演化較早的先天(或天然)免疫和適應性(或獲得性)免疫。先天免疫系統(tǒng)針對病原體的識別模式通常是廣譜和基本的。對于這種有限數(shù)目的分子結(jié)構(gòu)，已演化出種系編碼的受體。相反地，適應性免疫系統(tǒng)-B細胞和T淋巴細胞—可識別大量種類的抗原性結(jié)構(gòu)。受體，根據(jù)表達其的細胞類型稱為B細胞受體(BCR，其可溶性版本被稱為抗體)和T細胞受體(TCR，只有與細胞表面結(jié)合的形式)，由體細胞重組產(chǎn)生并且顯示克隆性分布。因此，最初只有少量具有某些特異性的細胞。一旦接觸抗原，這些細胞開始分裂(克隆性擴增)以產(chǎn)生能夠與所述抗原結(jié)合的效應群體。在消除抗原后，特異性識別該抗原的特異性細胞亞群體作為免疫記憶保留下來。綜合起來所述適應性免疫系統(tǒng)是慢速的(與天生免疫相比)，但卻是特異性的并且其在反復暴露于給定的病原體/抗原后得到提高。
T細胞在適應性免疫中具有中心作用。其受體(TCR)識別“主要組織相容性復合物”(MHC或HLA)細胞表面的肽復合物。這些肽稱為T細胞表位，代表抗原的降解產(chǎn)物。存在兩種主要類型的T細胞CD8-陽性細胞毒T細胞(CTL)被限定于MHC I類。CD4-陽性輔助T細胞(HTL)限定于MHC II類。HTL對適應性免疫的許多特征來說是必需的所謂“專門的抗原呈遞細胞”(APC)的激活、免疫球蛋白(Ig)類型轉(zhuǎn)換、生發(fā)中心反應和Ig親和力成熟、CTL的激活、免疫記憶、免疫應答的調(diào)節(jié)等。
MHC分子在細胞內(nèi)部收集肽并將其在細胞表面上呈遞給T細胞的TCR。有兩種主要類型的MHC，由CD8-陽性CTL識別的I類和由CD4陽性HTL識別的II類。
MHCI類分子由45kDa的膜錨定α鏈和12kDA的非共價附著b2微珠蛋白(b2m)組成。X射線晶體學(Stern和Wiley 1994)三維結(jié)構(gòu)的解析顯示α鏈擁有在兩端都封閉的并且可容納8至11個氨基酸長度的肽裂隙。I類分子是遍在表達的并且其提供來源于細胞質(zhì)蛋白的肽。這些蛋白被蛋白酶體降解，所得的肽被主動地轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。在那里，在幾種伴侶蛋白的幫助下，形成了MHC肽復合物，并被轉(zhuǎn)運至所述細胞表面(Heemels 1995)。因此，MHCI類蛋白反映了細胞表面的蛋白質(zhì)組并允許T細胞識別細胞內(nèi)的病原體或惡性腫瘤細胞。
MHCII類分子由兩個分別為35kDa和30kDa的膜錨定蛋白(α-和β-)組成。這些蛋白在一起形成了在兩端開口的裂隙，其可容納多種長度的肽，通常從12至25個氨基酸。盡管存在這些差異，但I類和II類分子具有驚人的結(jié)構(gòu)相似性((Stern和Wiley 1994)。II類分子只在專門的APC(包括樹突狀細胞(DC)、B細胞和巨噬細胞/單核細胞)中表達。這些細胞在內(nèi)體途徑中專門化，以吸收和加工抗原。在其剛剛生物合成后，II類分子被所謂的恒定鏈(Ii)復合，這在ER中阻止肽的結(jié)合。當含有II類Ii復合物的囊泡與含有外源抗原的降解產(chǎn)物的囊泡融合時，Ii被降解直至所述MHC結(jié)合裂隙只與所謂的CLIP肽復合為止。后者在伴侶分子如HLA-DM的幫助下與抗原肽交換(Villadangos 2000)。最后，MHC肽復合物再被呈遞至APC表面，其以多種方式與HTL相互作用。
由于多基因和非常多態(tài)性的原因，MHC系統(tǒng)高度復雜。人中的I類α鏈存在稱為HLA-A、-B和-C的三個基因座。同樣，存在三個II類α鏈基因座(DRA、DQA、DPA)；II類β鏈基因座狀況甚至更加復雜，因為存在4種不同的DRβ鏈(DRB1、2、3、5)以及DQB和DPB。除了單態(tài)DRα鏈DRA，在群體中，各基因座存在許多不同的等位基因(數(shù)打至數(shù)百)(Klein 1986)。不同的等位基因?qū)﹄木哂酗@著不同的結(jié)合特異性。等位基因命名為例如HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或HLA-DPA*0101/DPB*0401。
通過各種方法已鑒定了T細胞表位(Van den Eynde 1997)。T細胞系和克隆已經(jīng)例如用于篩選cDNA表達文庫(例如在經(jīng)合適的HLA-分子轉(zhuǎn)染的COS細胞背景中)?？蛇x擇地，也使用了生物化學方法。后者包括洗脫來自靶細胞表面的MHC分子的天然配體，通過幾個層析步驟分離這些肽，在表位重建測定中分析其與淋巴細胞的反應性和通過質(zhì)譜儀進行測序(Wolfel等人1994，Cox等人1994)。
近年來高靈敏性的細胞因子檢測測定法(如IFN-γ ELIspot)的出現(xiàn)允許使用淋巴細胞直接離體地篩選重疊的合成肽(Maecker 2001，Kern 2000，Tobery 2001)。最初，Kern等人(1999&2000)使用重疊的9mer肽庫陣列在體外進行CD8+T細胞表位作圖。后來，Tobery等人(2001)修飾了該方法并證明含有多至64個20mer的肽庫可用于在小鼠中篩選CD8+和CD4+T細胞表位。這兩種方法都基于監(jiān)控抗原特異性應答，通過細胞內(nèi)染色(Kern等人，2000)或ELLspot測定(Tobery等人，2001)測量IFN-γ產(chǎn)生來進行監(jiān)控。CD4+T細胞在使用15mer的混合物時的應答與用完整的可溶性蛋白作為抗原時所測得的應答幾乎相當，同時，令人毫不驚奇的是，CD8+T細胞的應答顯著高于通?？珊雎缘挠每扇苄缘鞍状碳ず髾z測到的應答。此外，CD8+T細胞對15個氨基酸肽的混合物之應答與用8-12個氨基酸肽(經(jīng)選擇代表已知的MHC I類的最小表位)獲得的應答相似。絕大部分與細胞膜結(jié)合的肽酶在這些情況下負責將肽“剪”成最優(yōu)化的長度(Maecker等人，2001)。
引人注目的另一種選擇是用特異性淋巴細胞篩選合成的組合肽文庫。例如，由以位置掃描形式排列的200種混合物組成的十肽文庫已成功地用于鑒定刺激T細胞的克隆類型群體的肽配體(Wilson，等人，J.Immunol.，1999，1636424-6434)。
通過所謂的“反向免疫學方法”(Rammensee 1999)已鑒定了許多T細胞表位。在這種情況下產(chǎn)生潛在的T細胞表位的蛋白是已知的，并且就HLA結(jié)合基序?qū)ζ湟患壭蛄羞M行掃描。通常數(shù)打至數(shù)百的候選肽或甚至全套交疊肽被合成，并對其與HLA分子的結(jié)合進行檢驗。通常，選擇最好的結(jié)合者以進一步表征其與T細胞的反應性。例如可通過在體外或體內(nèi)在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的幫助下活化(priming)T細胞來進行該測定。
丙型肝炎病毒(HCV)是在世界范圍內(nèi)慢性感染大約1.7億人口的黃病毒科的成員?，F(xiàn)已描述了至少6種HCV基因型和超過50種亞型。在美國、歐洲和日本，基因型1、2和3最為普便。HCV基因的地理分布差異很大，在美國和部分西歐地區(qū)基因型1a占主導，而在南歐和中歐1b占主導(Bellentani 2000)。
HCV是通過腸胃外或經(jīng)皮膚傳播的，并在肝細胞中進行復制。大約15％的患者遭受與病毒清除和恢復相關(guān)的急性自限性肝炎。大約80％經(jīng)感染的人變成慢性攜帶者。感染通常無癥狀地持續(xù)緩慢發(fā)展數(shù)年，但最終HCV是導致硬化(肝臟疾病的最后階斷)和肝癌的主要原因(Liang 2000)。HTL和CTL應答的強度和質(zhì)量決定患者是否康復(自發(fā)地或由于治療的原因)或發(fā)展成慢性感染(Liang 2000)。
標準的HCV治療方法包括聚乙二醇化的α干擾素和抗病毒的利巴韋林(ribavirin)的組合。在大約50％的HCV患者中獲得病毒學應答，所述應答依賴于基因型。很明顯這種治療的低耐受力和相當大的副作用使得需要新的治療性干涉(包括治療疫苗)(Corngerg 2002)。然而，目前缺乏對導致成功免疫應答的MHC組合表位的詳細理解(Ward2002)。因此，發(fā)展基于表位的治療性疫苗要求對針對完整的HCV的T細胞應答進行綜合分析。
HCV病毒體包含9.5kb編碼大約3000個氨基酸的大單一多蛋白的正單鏈RNA基因組。通過宿主和HCV編碼的蛋白水解酶活性將后者加工成至少10個蛋白(Liang 2000)。重要的是，HCV RNA依賴性RNA聚合酶為差錯傾向的，產(chǎn)生病毒準種的演變并促成免疫逃避變體(Farci 2000)。
盡管在過去15年中在本領(lǐng)域提出了許多觀點并且在這期間已提出許多有前景的抗原候選者，但在市場上仍然沒有HCV疫苗(也沒有令人滿意的治療方法；唯一可獲得的治療方法，如上述α干擾素和利巴韋林的組合，只在少數(shù)患者身上有效)。在HCV序列公開后的早期，許多表位和抗原被建議作為與HCV疾病抗爭的有效手段(例如Koziel等人，J.Virol.67(12)，7522-7532；Shirai等人，J.Virol.68(5)(1994)，3334-3342；Ler-oux-Roels等人，Hepatology 23(1)(1996)，8-16；Hoffmann等人，Hepatology 21(3)(1995)，632-638；Sarobe等人，J.Clin.Invest.102(6)(1998)，1239-1248；Battegay等人，J.Virol.69(4)(1995)，2462-2470；Wentworth等人，Int.Imunol.8(5)(1996)，651-659；Rehermann等人，J.Virol.70(10)(1996)，7092-7102；Diepolder等人，J.Virol.71(8)(1997)，6011-6019；Lamonaca等人，Hep-atology 30(4)(1999)，1088-1098；WO 00/11186、WO 95/12766、WO 95/27733、WO 94/20127、WO 95/25122、WO 95/22317、WO 94/25601、WO 92/03458和WO 93/00365)。此外，已用黑猩猩開展了重要的原理驗證性離體中和研究，黑猩猩是除了智人以外的其它容易患上慢性HCV感染的物種。事實上，通過急性減退和慢性感染對比在個體和黑猩猩中誘導免疫應答的研究，到目前為止只揭示了在活性病毒感染建立后最初的潛在保護性免疫應答的情景。然而，在暴露于HCV之前，經(jīng)腸胃外免疫之后，預防性疫苗保護的關(guān)聯(lián)預期主要是在肝外。只有少數(shù)疫苗有效性研究使用黑猩猩進行研究并且這些研究顯示在用完全相同的克隆(用于免疫和攻擊)進行低劑量同源攻擊后，最多保護7只動物中的5只免受感染。此外，HCV呈現(xiàn)出高度的可變性，所述高度可變性為HCV提供了逃避由疫苗或感染誘導的免疫應答的能力。考慮到這個問題，也曾提出以不同的大蛋白片段組合作為DNA疫苗的另一種可選擇的接種策略(Rollier等人，J.Virol.78(1)(2004)，187-196；Dunas-Carrera等人，Biotech.Appl.Biochem.Imm.Publ.(29.September 2003；BA20030112))。
盡管過去15年特別是過去10年取得的所有進步，但仍迫切需要發(fā)展新的針對HCV的治療方法和接種策略(Heile等人，J.Virol.74(15)(2000)，6885-6892)。
因此本發(fā)明的目的是提供這種針對HCV的有效治療方法和接種策略。
因此本發(fā)明提供了包含至少2個表位的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，各表位來自不同的熱點(hotspot)表位，其中熱點表位定義為包含選自下列的肽的表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，F(xiàn)TDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR，LINTNGSWHINRTALNCNDSL，TTILGIGTVLDQAET，F(xiàn)DS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，VVCCSMSYTWTGALITPC，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
在2003年8月27日提交的申請WO 04/024182(要求2002年9月13日的A1367/2002的優(yōu)先權(quán))中，描述了用于分離接種疫苗用的HCV肽，特別是HCV T細胞表位的新方法。在該申請中，第一次公開了“HCV熱點表位”的概念T細胞表位“熱點”定義為至少包含超過一個T細胞表位的短肽序列。例如，兩個或多個表位可相互間隔很短(很短定義為少于5-10個氨基酸)，或相互之間直接相連，或部分或甚至完全重疊。熱點可以只包含I類或II類表位，或兩者都包含。熱點上的表位可具有不同的HLA限制性。
由于I類和II類抗原加工的高度復雜性和選擇性途徑(如導言中所提到的)的原因，不能只通過多肽序列輕易地預測T細胞的表位。盡管被廣泛使用，但用于T細胞表位預測的計算機算法產(chǎn)生高比例的假陰性和假陽性。
因此，即使對單個T細胞表位在多肽序列內(nèi)也不是顯然的，對于熱點更是如此。根據(jù)本發(fā)明將幾個完全不同的實驗方法組合起來對T細胞表位進行鑒定，包括表位捕獲、HLA-轉(zhuǎn)基因動物和人單核細胞的體外刺激。將所有這三種方法系統(tǒng)地應用于跨越目的抗原的重疊肽上，以使能夠綜合地鑒定表位。在這種不限定于特定的HLA等位基因而是揭示群體內(nèi)所有可能被靶向的表位的綜合分析后，表位熱點才可以變得明晰。在抗原內(nèi)，只有少數(shù)(如果有的話)序列顯示熱點的特征。因此熱點的鑒定總是件令人吃驚的事情。
T細胞表位熱點提供了重要的有利方面熱點可激活和可被受試者的不同T細胞克隆識別。熱點(當包含具有不同HLA限制性的表位時)可與來自不同非HLA匹配的個體之T細胞相互作用。
基于表位的疫苗，目前已瞄準所選普遍性HLA等位基因，例如HLA-A2，所述基因在大約一半的白種人中表達。因為其它等位基因頻率較低，因此針對廣泛的世界人口范圍的基于表位的疫苗必須包含許多不同的表位。疫苗的化學實體(例如肽)的數(shù)目受制于來自生產(chǎn)、配制和產(chǎn)品穩(wěn)定性的限制。
熱點使這種具有廣泛的世界人口范圍的基于表位的疫苗成為可能，因為其通過有限數(shù)量的肽提供了顯著大量的表位。事實上，目前所擁有的現(xiàn)有技術(shù)(參見上述關(guān)于本領(lǐng)域討論的表位的文獻和仍未開發(fā)出HCV疫苗的事實)已清楚地顯示，發(fā)展HCV疫苗已被認為是很困難的，同時顯示盡管在過去10年里積累了豐富的關(guān)于HCV抗原在幾種感染模型中引起體液和細胞免疫應答的有效性的文獻，但在發(fā)展HCV疫苗和治療方法方面總體上是失敗的。HCV感染的治療和預防總是復雜而難以預測的。
現(xiàn)在本發(fā)明的概念(通過提供基于HCV熱點表位特征的疫苗)第一次使得HCV免疫接種系統(tǒng)成為可能，所述系統(tǒng)提供了用于HCV感染的患者(特別是慢性感染的患者)的合適的和特異性的預防接種和有效的治療方案。
本申請的發(fā)明人顯示了在HCV疫苗中只使用一個或兩個特異性表位是不足以滿足免疫接種的。提供HCV蛋白混合物(核心、E1和E2作為DNA疫苗；Duenas-Carrera等人(2003))或這些HCV蛋白的大片段的混合物(核心、E1、E2和NS3作為DNA疫苗；Rollier等人，(2004))的概念也沒有帶來想要的結(jié)果。
本發(fā)明的HCV疫苗包含含有來自上面所列熱點表位之表位的短多肽。本發(fā)明疫苗不依賴于與DNA疫苗相關(guān)的風險和不確定性(缺少長效免疫應答；主要在肝外作用；作用模式、定位等)。此外，本發(fā)明也不會面臨全蛋白或長鏈蛋白片段生產(chǎn)的生產(chǎn)問題。
通過功能性測定已鑒定了此處公開的熱點表位，所述功能性測定主要使用Th1/Tc1型反應(即，γ干擾素)作為示值讀數(shù)(read-out)。眾所周知(整個或至少大片段)抗原不僅包含這種激動性表位，也可以編碼拮抗性配體。這種拮抗劑潛在地存在于整個抗原中，在熱點中的缺乏可妨礙免疫原性和疫苗的有效性。此外，整個抗原幾乎肯定誘導體液免疫應答。這種抗體應答本身對存在于細胞內(nèi)的HCV影響極小，但其可嚴重地減弱想要的T細胞應答。由于其受限制的長度，來源于本發(fā)明的熱點表位不太可能誘導不想要的抗體應答。最終，HCV抗原只有相對小的部分在不同基因型之間是保守的。因此，用于疫苗的整個抗原可以誘導針對非保守區(qū)或表位的應答，所述應答與絕大多數(shù)患者無關(guān)。相反地，此處公開的熱點來源于在主要HCV基因型1、2和3中保守性大于80％的區(qū)域。
HLA-super類型(如在例如WO 01/21189中公開的)描述了在一些情況下給定的HLA I類T細胞表位不是專門地被限定在并且只限定在一個HLA等位基因上，而且還可以在另一個HLA等位基因的背景中被T細胞識別(例子肽可結(jié)合HLA-B*0702和B*3501)。本質(zhì)上這種肽在群體中具有更廣泛的HLA蓋度，從而成為引人注目的疫苗候選者。
相反地，本發(fā)明的T細胞表位熱點顯著不同于這種HLA-super類型，因為本發(fā)明的熱點是蛋白內(nèi)的肽區(qū)域，所述蛋白顯示具有非常大量的不同的相鄰和甚至重疊的表位。熱點在相對短的區(qū)域遞送了大量的表位，同時保證正確地加工熱點內(nèi)的表位。
事實上，本發(fā)明的熱點在不同HCV種類間顯示相當?shù)偷淖儺悾鱿喈數(shù)偷淖儺愂蛊涓欣赜糜谝呙缤緩?，因為即使只使用小的多肽也可能存在異源攻擊。無論以任何方式，本發(fā)明提供的表位不會超過100個氨基酸長度，但通常明顯更短。優(yōu)選地本發(fā)明的表位的長度至少是6、7、8、9、10、11或12個氨基酸。最大長度13、15、20、25、30、40或50個氨基酸也被認為是優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，用于給定疫苗的表位可選自上述熱點區(qū)域。當然，在疫苗中可提供整個熱點區(qū)域或僅提供其部分(只要所述部分包含至少一個表位)。然而，如果在疫苗中提供一個或多個(例如，2、3、4、5或6個)表位是有利的，其包含完整的熱點區(qū)域或至少含有超過一個表位的區(qū)域。本發(fā)明所使用的表位也可以是在上面定義的熱點“主”序列上具有缺失(優(yōu)選地缺失1、2、3、4、5、6或7個氨基酸)的序列變體。優(yōu)選地，熱點序列內(nèi)的缺失不會改變所述表位；當然盡管缺失但必須在所述熱點區(qū)域保留至少一個表位。
特別優(yōu)選地，在疫苗中提供了表位混合物，所述表位混合物由一組只具有一種表位的肽與另一組具有超過一種表位的肽混合構(gòu)成。例如包含至少一種或至少兩種具有一種表位的肽和至少一種或至少兩種具有超過一種表位(例如，整個熱點序列)的肽的疫苗是優(yōu)選的。
可以不作任何修飾的多肽形式提供表位；合適地可用某些化學或生物學部分修飾所述多肽鏈，特別是考慮有關(guān)溶解或藥物配制時(例如，如WO01/78767中所描述的)。用于本HCV疫苗的表位可以包含整個熱點區(qū)域或其連續(xù)片段(包含至少一個所述熱點內(nèi)所包含的表位)或包含所述熱點的非連續(xù)部分(但是，至少也包含一個所述熱點內(nèi)包含的表位；在這種情況下可在該熱點的非連續(xù)部分提供一個或多個連接體(例如，氨基酸或肽連接體))。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的HCV疫苗包含至少三個，特別地至少四個表位，各表位來自不同熱點表位。
更優(yōu)選地，所述HCV疫苗包含至少五個表位，各表位來自不同的熱點表位。盡管這種基于表位的疫苗包含的表位越多，有關(guān)配制的問題越大，但權(quán)衡廣泛的保護能力和配制缺點(特別是有關(guān)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的缺點)，4、5或6個表位的數(shù)目是最優(yōu)的。
因此，在某些情況下包含至少六個表位(各來自不同的熱點表位)的HCV疫苗也可以是本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。最優(yōu)的熱點表位數(shù)目也依賴于所選擇的表位相互之間的相對相互作用，已證明所述相互作用是疫苗中某些長度較短的多肽組合的主要障礙。
本發(fā)明的優(yōu)選的HCV疫苗的特征在于表位選自下列KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL，YLLPRRGPRL，LPRRGPRL，GPRLGVRAT，RLGVRATRK；GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVL，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT；DLMGYIPAV，GYIPLVGAPL，DLMGYIPLVGAPL；CINGVCWTV，GEVQVVSTATQSFLAT，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV；HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，MWNFISGIQYLAGLSTLPGN，NFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，QYLAGLSTL，HMWNFISGI；VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKI，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI，DYPYRLWHY，TVNYTIFKI，TINYTIFK，TVNFTIFKV，HYPCTVNYTI，HYPCTVNFTI，RMYVGGVEHR；AAWYELTPAETTVRLR，TPAETTVRL；GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLG，GQGWRL-LAPITAYSQ，RLLAPITAY，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，GQGWRLLAP-ITAYSQQTRGLLG，AYSQQTRGLL，AYSQQTRGL；IGLGKVLVDILAGYGAGVAGAL-VAFK，ILAGYGAGV，VAGALVAFK，GYGAGVAGAL；VVCCSMSYTWTGALITPC，SMSYTWTGALITP，SMSYTWTGAL，SYTWTGALI；FTDNSSPPAVPQTFQV；LEDRDRSELSPLLLSTTEW，LEDRDRSELSPLLLST，RSELSPLLL，ELSPLLLST，DRDRSELSPL，LEDRDRSEL，LEDRDRSEL；YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，YLVAYQATV；MSTNPKPQRKTKRNTNR，PQRKTKRNTNR，QRKTKRNTN，RKTKRNTNR，MSTNPKPQR，MSTNPKPQK；LINTNGSWHINRTALNCNDSL，NGSWHINRTALNCNDSL，LINTNGSWHI，RTALNCND-SL，LINTNGSWHINRTALN，SWHINRTALN；TTILGIGTVLDQAET，TTILGIGTV，TILGIGTVL；FDSSVLCECYDAGAAWYE，F(xiàn)DSSVLCECYDAGCA，VLCECYDAGA，VVLCECY-DAGAAWYE；ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，ARLIVFPDL，RLIVFPDLGV，RVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV；GVLFGLAYFSMVGNW；TRVPYFVRAQGLIRA；TTLLFNILGGWVAAQ，LLFNILGGWV.
通常，從一組表位中只應選擇一種表位，以獲得良好的結(jié)果。當然不是所有上面所列的熱點表位都具有相同的強度，而且不同組群之間功效可能不同。優(yōu)選地，個體的接種策略可用于主要基于HLA覆蓋范圍的各組。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的HCV疫苗的特征在于其包含至少一種來自至少兩種，優(yōu)選地至少三種，更優(yōu)選地至少四種下列熱點表位的表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA.
對于不同的特異性，本發(fā)明的HCV疫苗包含至少一種來自兩種，優(yōu)選地至少三種，特別地至少四種下列熱點表位的表位VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，
FTDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR和LINTNGSWHINRTALNCNDSL.
對于進一步不同的特異性，本發(fā)明的HCV疫苗包含至少一種來自至少兩種，優(yōu)選地至少三種，特別地至少四種下列熱點表位的表位TTILGIGTVLDQAET，F(xiàn)DS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
作為此處所列的精確的抗原和表位的另一種備擇，在本發(fā)明的疫苗中可使用抗原/表位變體。根據(jù)同源物(包含一個或多個存在于同源HCV株系上的交換)或異源表位設(shè)計優(yōu)選的變體。其中優(yōu)選的變體是通過保守性氨基酸替代從此處公開的序列變化而來的變體。這些替代是用另一個具有類似特征的氨基酸替代多肽上給定氨基酸的替代。通?？醋鞅Ｊ靥娲氖窃谥咀灏被酇la，Val，Leu和Ile之間用一個置換另一個；羥基殘基Ser和Thr的交換、酸性殘基Asp和Glu的交換、酰胺殘基Asn和Gln之間的替代、堿性殘基Lys和Arg之間的替代和芳香族殘基Phe和Tyr之間的置換。
在這個方面特別優(yōu)選的是具有此處公開的任何多肽的氨基酸序列的變體，在所述變體中以任何組合發(fā)生了1、2、3、4或5個氨基酸殘基的替代、刪除或添加。在這些變體當中優(yōu)選的是不改變本發(fā)明多肽的性質(zhì)和活性的沉默替代、添加和刪除。在此方面特別優(yōu)選的是保守替代。特別適合的氨基酸替代是此處公開的同源序列中包含的氨基酸的替代。因此此處公開的抗原或表位的合適序列變體包括一個或多個存在于一種或多種HCV株系或血清型中的變異(優(yōu)選地基于這種同源變異的1、2、3、4或5個氨基酸交換)。這些抗原包含可以是天然發(fā)生的序列或新近建立的人工序列的序列。這些優(yōu)選的抗原變體基于這種天然發(fā)生的序列變異，例如形成針對本發(fā)明多肽的抗原性區(qū)域的“混合序列”。例如，此處公開的給定HCV序列可通過包含這樣的一個或多個變異進行修飾從而產(chǎn)生該給定(天然發(fā)生的)抗原或表位序列的人工(即，非天然發(fā)生的)變體。
很清楚通過氨基酸交換改進的、保守的或至少不顯著地阻止表位的T細胞激活能力之來源于本發(fā)明表位或肽的表位或肽也屬于本發(fā)明的表位或肽。因此，本表位或肽也包含不含有來源于HCV特定株系的原始序列但引發(fā)相同的或優(yōu)選地提高的T細胞應答的表位或肽。這些表位稱作“不規(guī)則表位(heteroclitic)”。這些表位包括任何表位，所述表位能夠引發(fā)與原始表位相同的T細胞并且優(yōu)選地在體內(nèi)或體外具有優(yōu)選地更有效的T細胞激活能力。本發(fā)明也包括來自其它HCV株系的各同源表位。
通過合理設(shè)計，即考慮單個殘基對結(jié)合MHC/HLA的貢獻(例如Ramensee等人，1999(Immunogenetics 50213-219或Sturniolo等人1999(Nature Biotechnology 17555-562)中所描述的)和潛在地與TCR發(fā)生相互作用的殘基的系統(tǒng)性交換和用針對原始表位的T細胞檢驗所得序列，從而可獲得不規(guī)則表位。這種設(shè)計對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可行的并且無需過多實驗。
另一種可能性包括用針對原始表位的T細胞來篩選肽文庫。優(yōu)選的方法是定向掃描合成的肽文庫。這種方法已在例如Blake等人1996()和Hemmer等人1999()和此處給出的參考文獻中進行了詳細描述。
作為由同源HCV衍生的氨基酸序列代表的表位或不規(guī)則表位的另一種選擇，也可使用模擬這些表位的物質(zhì)例如“肽模擬”或“逆向倒位肽(retro-inverso-peptides)”。
此外，化學基團特別是氨基酸殘基、連接體(和結(jié)合到載體上)、轉(zhuǎn)運促進基團等可加到本發(fā)明的HCV疫苗中的肽的N和/或C末端。WO01/78767中描述的氨基酸附著是優(yōu)選的。
設(shè)計改善的熱點表位的另一方面是用增強其刺激T細胞的能力的物質(zhì)與其一起配制或?qū)ζ溥M行修飾。這些包括T輔助細胞表位、脂質(zhì)或脂質(zhì)體(或WO01/78767中所描述的優(yōu)選的修飾)。
增加表位的T細胞刺激能力的另一種方法是用免疫刺激物質(zhì)與其一起配制，所述免疫刺激物質(zhì)是例如抗體、細胞因子或趨化因子如白細胞介素-2、-7、-12、-18、I類和II類干擾素(IFN)、特別是IFN-α、GM-CSF、TNF-α、flt3-配體等。
根據(jù)進一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的HCV表位或HCV肽制備用于治療或預防丙型肝炎病毒(HCV)感染的HLA限制性疫苗的用途。
優(yōu)選的本發(fā)明的HCV疫苗包含至少兩種下列表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DLMGYIPAV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，GYKVLVLNPSVAAT，CINGVCWTV，AAWYELT-PAETTVRLR，YLVAYQATVCARAQAP PPSWD，TAYSQQTRGLLG，HMWNEIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
優(yōu)選地，該HCV疫苗包含至少4種，優(yōu)選地至少5種，至少6種，至少8種或所有這十二種表位。
本發(fā)明另一優(yōu)選的HCV疫苗至少包含下列表位中的兩種KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKVAAWYELTPAETTVRLR，TAYSQQTRGLLG，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGK-VLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
優(yōu)選地，該HCV疫苗包含至少4種，至少5種，特別地所有這7種表位。
本HCV疫苗優(yōu)選地包含至少一個A2表位和至少一個DR1表位。
本HCV疫苗優(yōu)選地包含至少一個DR7表位。
下列表位組合被認為是特別強大的(至少一組來自(1)至(5)組中的至少三組)(1)KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK或KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL或YLLPRRGPRLGVRATRK或YLLPRRGPRL或LPRRGPRL或，LPRRGPRLGVRATRK或GPRLGVRATRK或RLGVRATRK或KFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK，(2)AYAAQGYKVLVLNPSVAAT或AYAAQGYKVL或AAQGYKVLVLNPSVAAT或KVLVLNPSVAAT或GYKVLVLNPSVAAT或AYAAQGYKVLVLNPSV或AYAAQGYK-VLVLNPSVAA或AAQGYKVLVLNPSVA或AYAAQGYKVLPSVAAT或AYAAQGYKV-LAAT，(3)DLMGYIP(A/L)VGAPL或DLMGYIPALVGAPL或DLMGYIP(A/L)VG或DLMGYIP(A/L)VGAP或DLMGYIP(A/L)V或DLMGYIPLVGAPL或DLMGYIPLVGA或DLMGYIPLV，(4)GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV或GEVQVVSTATQSFLAT或CINGVCWTV或VSTATQSFLATCINGVCWTV或TQSFLATCINGVCWTV或GEVQVVSTATQSFLAT-CING或GEVQVVSTATQSFLAT，(5)HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA或MWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA或HMWN-FISGI或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN或NFISGIQYLAGLSTLPGN或QYLAGLSTL或HMWNFISGIQYLAGLSTL或HMWNFISGISTLPGNPA或HMWQYLAGLSTLPGNPA或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN；特別是已證明包含表位GYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA的HCV疫苗特別強大。
優(yōu)選地，為本發(fā)明HCV疫苗提供特別合適的輔助物質(zhì)。因此某些類型的免疫刺激物質(zhì)已被證明對本發(fā)明是有利的。
因此，優(yōu)選的HCV疫苗進一步包含含有序列R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之間的整數(shù)，優(yōu)選地是5，X是帶正的天然和/或非天然氨基酸殘基，Z是選自L、V、I、F和/或W的氨基酸殘基，而R1和R2是相互獨立地選自-H、-NH2、-COCH3、-COH、至多達20個氨基酸殘基的肽或肽反應性基團或具有或不具有肽的肽連接體；X-R2的可以是所述肽(“肽A”)的C末端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯。
另一個優(yōu)選的HCV疫苗實施方案進一步包含具有式(I)的結(jié)構(gòu)的免疫刺激性寡脫氧核酸分子(ODN)
式(1) 其中R1選自次黃嘌呤和尿嘧啶，任何一個X是O或S，任何一個NMP是2’脫氧核苷酸單磷酸或單硫代磷酸，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基1-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷-或N-異戊基-脫氧腺苷-單磷酸或-單硫代磷酸、NUC是2’脫氧核苷，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧肌苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧尿苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷-或N-異戊基-脫氧腺苷，a和b是0至100之間的整數(shù)，前提是a+b在4和150之間，和B和E是核酸分子(“I-/U-ODN”)的5’或3’末端的公共基團。
本發(fā)明的HCV疫苗組合物可進一步包含聚陽離子化合物，優(yōu)選地聚陽離子多聚體、更優(yōu)選地聚陽離子肽，特別是多聚精氨酸、多聚賴氨酸或抗微生物肽。
用于本發(fā)明的聚陽離子化合物可以是任何展示W(wǎng)O97/30721的特征效應的聚陽離子化合物。優(yōu)選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機聚陽離子、堿性聚氨基酸或其混合物。這些聚氨基酸應當具有至少4個氨基酸殘基的鏈長度。特別優(yōu)選的是包含肽鍵的物質(zhì)，如多聚賴氨酸、多聚精氨酸和在超過8個特別是超過20個氨基酸的范圍內(nèi)包含超過20％、特別地超過50％堿性氨基酸的多肽或其混合物。其它優(yōu)選的聚陽離子和其藥物組合物描述于WO 97/30721(例如，聚乙烯亞胺)和WO 99/38528。優(yōu)選地這些多肽包含20至500個氨基酸殘基，特別優(yōu)選地包含30至200個殘基。這些聚陽離子化合物可通過化學或重組方法產(chǎn)生或可來源于天然來源。
陽離子(多)肽也可以是聚陽離子抗菌微生物肽。這些(多)肽可以是原核或動物或植物來源，或可以是通過化學地或重組方法產(chǎn)生的。肽也可以屬于防衛(wèi)素類別。這種宿主防衛(wèi)肽或防衛(wèi)素也是本發(fā)明的聚陽離子多聚體的優(yōu)選形式。通常，允許作為激活(或下調(diào))適應性免疫系統(tǒng)(優(yōu)選地由APC(包括樹突狀細胞)介導的)的終產(chǎn)物的化合物用作聚陽離子多聚體。
用于本發(fā)明的方法的聚陽離子物質(zhì)是cathelicidin，所述cathelicidin來源于抗微生物或其衍生物(WO 02/13857 A，此處引用作為參考)，特別是來源于哺乳動物cathelicidins，優(yōu)選地來自人、牛或小鼠的抗微生物肽或刺激神經(jīng)組織的化合物例如(人)生長激素(如WO 01/24822中所描述的)。
來源于天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽、觸角足肽、脫乙酰殼多糖或殼多糖的其它衍生物)或其它通過生物化學或重組方法產(chǎn)生的來源于這些肽或蛋白的肽。其它優(yōu)選的聚陽離子化合物是來自cathelin特別是小鼠、?；蛱貏e是是人的cathelin和/或cathelicidin的相關(guān)的或衍生的物質(zhì)。相關(guān)的或衍生的來自cathelin物質(zhì)包含完整的或部分的具有至少15-20個氨基酸殘基的來自cathelin序列。衍生可包括用不屬于20種標準氨基酸中的氨基酸替代或修飾天然氨基酸。此外，陽離子殘基可引入這類cathelin分子中。優(yōu)選地將這些cathelin分子與本發(fā)明的HCV肽組合物組合。然而，令人驚奇的原來是這些cathelin也具有與抗原佐劑相同的作用，從而進一步無需加入進一步的佐劑。因此可能在含有或不含有其它免疫刺激物質(zhì)的疫苗制劑中使用這類cathelin分子作為有效的佐劑。
優(yōu)選地，本HCV疫苗進一步包含了Al(OH)3佐劑和/或聚陽離子肽。
根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，上述肽A是KLKL5KLK和/或上述I-/U-ODN是寡d(TC)13。
在特定實施方案中，HCV疫苗可優(yōu)選地進一步包含含有CpG基序的寡脫氧核苷酸。
優(yōu)選地，以在15分鐘內(nèi)在37℃下可重構(gòu)的形式凍干本發(fā)明的HCV疫苗。取決于HCV疫苗中的個體表位，這可能是件困難的工作。因此，本發(fā)明也提供了用于配制這種HCV疫苗的有效方法。
本發(fā)明的HCV疫苗優(yōu)選地包含10μg至10mg各表位(每劑)。
混合物中各表位的數(shù)目和特別是其濃度視應用而變化。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在要遞送至患者的HCV疫苗中各肽的濃度在5μg/ml至5mg/ml、優(yōu)選地50μg/ml至4mg/ml、更優(yōu)選地100μg/ml至3mg/ml的范圍內(nèi)變化。
由于本發(fā)明的凍干方法的原因，本發(fā)明的凍干HCV疫苗優(yōu)選地包含痕量乙酸。
本發(fā)明的另一個方面也涉及本HCV疫苗用于制備用于預防和治療HCV感染的藥物的用途，即，給個體特別是HCV患者或處于獲得HCV感染風險的個體(例如，醫(yī)院職員、臨床研究人員、獻血人員等)施用有效的HCV疫苗免疫藥物。
溶解肽混合物例如本發(fā)明的HCV疫苗可能是非常困難的。因此，本發(fā)明的目的提供了用于溶解本發(fā)明的HCV肽混合物(即，由兩種或多種肽特別是親水性和疏水性肽組成的肽混合物)的方法。另一個目的是獲得用于生產(chǎn)滅菌的和任選地凍干的包含肽混合物的藥物制劑的方法。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了用于制備包含溶解的本發(fā)明HCV肽混合物藥物的制劑之方法，其特征在于通過用包含至少一種有機酸的水溶液溶解所述肽混合物，所述有機酸選自甲酸、醋酸、丙酸、丁酸和其鹵代或羥基化形式。為了延長保存限期，可進一步將所述溶解的肽混合物除菌(通過過濾、輻射、熱處理、化學滅菌或其它方法)和凍干。
在優(yōu)選的實施方案中，肽混合物包含親水性和疏水性肽。當然本方法也適用于只包含一種類型的肽的肽混合物(特別是包含例如兩種或多種親水性肽的混合物)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，溶解在本發(fā)明水溶液中的肽包含至少6種，優(yōu)選地至少8種，更優(yōu)選地至少10種，特別優(yōu)選地至少12種氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，可以溶解肽和包含最大數(shù)目為30、40或50(或甚至高達100，盡管由于更長的抗原片段之不利方面的原因使得長表位是較不優(yōu)選的)個氨基酸的多肽。
本發(fā)明肽的這個方面的特征在于其溶解性。在水溶液中溶解度低于100μg/ml的肽被認為是疏水性的。另一方面，親水性肽以超過100μg/ml的濃度溶解在緩沖水溶液中。親水性肽可進一步分成陽離子(＞20％堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、陰離子(＞20％酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸)和富含羥基肽(＞30％-OH，包括氨基酸例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。
因此本發(fā)明的另一個方面涉及用于制備本HCV疫苗的方法，其特征在于下列步驟-通過化學方法合成至少兩種上面定義的表位，-通過包含至少一種有機酸的水溶液溶解這些表位，所述有機酸選自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和其鹵代或羥基化形式，-混合所述溶解的表位，和-任選地凍干所述經(jīng)混合的表位。
為方便貯藏可將所述HCV肽混合物進行深度冷凍(如果不進行凍干步驟)。
通過標準的化學方法(例如，依照Merrifield的固相合成)合成本發(fā)明的肽混合物中的肽。當然所述肽也可通過重組產(chǎn)生的或天然分離的蛋白之化學或酶促片段化而獲得。在另一個實施方案中，從真核和原核細胞中直接分離HCV肽。在所有這三種情況下，在某些情形在目的肽或多肽凍干和混合在一起前要求對其進行額外的純化。
用于水溶液(用于溶解肽的)中的有機酸是藥物可接受的，這是對該特殊方法的基本要求。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述有機酸是任選地含有乙腈的乙酸和/或甲酸。
實驗顯示(依賴于肽混合物的組成)水溶液中有機酸的濃度必須至少為10％，優(yōu)選地至少20％，優(yōu)選地至少30％，優(yōu)選地至少40％，優(yōu)選地至少50％，優(yōu)選地至少60％。
在一些情況下，向水溶液中加入有機酸的衍生物(例如，乙腈)可以幫助溶解含有更大量疏水性肽的肽混合物。有機溶劑(例如DMSO和DMF)也有助于增進含有高疏水性肽濃度的肽混合物的溶解。然而，包含DMSO和/或DMF的水性肽混合物不能冷凍干燥。
在優(yōu)選的實施方案中，當要將產(chǎn)物凍干時向所述肽混合物中加入膨脹劑。特別地，在較低的肽濃度時，不能保證形成良好的凍干塊。因此在量較低時加入肽膨脹劑。優(yōu)選的膨脹劑是山梨醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和其混合物。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過過濾對溶解的肽混合物進行滅菌。為了獲得增加的產(chǎn)物回收和允許過濾大量的肽混合物，所包含的肽必須完全溶解并且不能形成凝膠。
溶解的或任選地滅菌的肽混合物可直接或在裝入瓶中后進行凍干。凍干法是種延長上述肽混合物的保存期限的有用和有效的方法。對于溶解的肽，可獲得最多包含5％的殘留溶劑(在含水的系統(tǒng)中是水)和痕量有機酸的肽混合物凍干制劑，所述制劑可在含有NaCl和/或山梨醇的緩沖水溶液中在10分鐘內(nèi)重構(gòu)＞95％，優(yōu)選地98％，特別優(yōu)選地99％，產(chǎn)生渾濁的懸浮液或清澈的溶液(依賴于所述肽混合物的組成)。這種快速重構(gòu)在緊急情況下是特別必要的，在所述情況下必須在數(shù)分鐘內(nèi)提供整個凍干瓶劑量的幾乎完全重新溶解的即用溶液。
通過下列實施例和附圖更詳細地描述發(fā)明，當然發(fā)明不會被限定于其中。


圖1顯示KLK/O-d(IC)13誘導HCV肽特異性I類細胞免疫應答；實施例實施例1.來源于HCV的肽與HLA II類分子的結(jié)合根據(jù)WO04/024182，合成幾種摻入重疊的反應性HCV肽或不含關(guān)鍵殘基(如半胱氨酸)的序列的新肽。重新檢驗這些新肽與II類可溶性HLA分子的親和力并將結(jié)果與用原始肽獲得的結(jié)果進行比較(表1)。
表1.所選來源于HCV的肽和其15mer對應物與可溶性HLA II類分子的結(jié)合(“+++”強親和力，“++”中等親和力，“+”弱親和力，“-”無親和力，“nd”沒有進行；核心結(jié)合基序用下劃線標出)。
在肽1798的情況下，與其更短的對應物(B84-B96)相比其對DRB1*0101和DRB1*0401的親和力消除可能是由于長序列(26個氨基酸)的原因造成的，所述長序列可具有阻止結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)?？梢灶A期在體內(nèi)，在蛋白水解酶切割后，肽1798將產(chǎn)生兩個更短的II類表位。除去肽1827和1829(分別為肽C114和1604的衍生物)上的半胱氨酸(C)殘基似乎對結(jié)合DRB1*0401分子是至關(guān)重要的但不會本質(zhì)上改變對其它受試DR亞型的親和力。
實施例II.HCV表位熱點的鑒定和表征如上所述，T細胞表位熱點(“熱點”)被定義為至少包含超過一種T細胞表位的短肽序列。例如，兩種或多種表位相互之間具有很短間隔(很短間隔定義為少于5-10個氨基酸)，或相互之間直接相連，或部分或甚至完全重疊。熱點可以只包含I類或II類表位或包含兩者的組合。熱點上的表位可具有不同的HLA限制性。
由于I類和II類抗原加工的高度復雜性和選擇性途徑(參見導言)，僅根據(jù)多肽的序列不能容易地預測T細胞表位。盡管被廣泛地使用，但用于細胞表位預測的計算機算法會產(chǎn)生高比率的假陰性和假陽性。
因此，多肽序列內(nèi)甚至單個T細胞表位也不易判明，對于熱點更是如此。根據(jù)本發(fā)明將幾種完全不同的實驗方法組合起來以對T細胞進行表位鑒定，包括表位捕獲，HLA轉(zhuǎn)基因動物和人單核細胞的體外刺激。將所有三種方法系統(tǒng)地應用于跨越目的抗原的重疊肽上，使能夠?qū)Ρ砦贿M行綜合鑒定。在進行這種不限定于特定的HLA等位基因而是揭示群體內(nèi)所有可能被靶向的表位的綜合分析后，表位熱點才可變得顯而易見。在抗原內(nèi)，只有少數(shù)(如果有的話)序列顯示熱點特征。因此熱點鑒定總是件令人驚奇的事情。
T細胞表位熱點提供重要的有利方面熱點可激活和可被受試者的不同T細胞克隆識別。熱點(當包含具有不同HLA限制性表位時)可與來自不同的非HLA匹配個體的T細胞相互作用。
目前基于表位的疫苗已瞄準所選普遍性HLA等位基因，例如HLA-A2，所述基因在大約一半的白人體內(nèi)表達。因為其他等位基因頻率較低，所以具有廣泛世界人口覆蓋性的基于表位的疫苗必須包含許多不同的表位。疫苗中化學實體(例如肽)的數(shù)目受限于來源于生物、配制和產(chǎn)品穩(wěn)定性的限制。
熱點使這種具有廣泛的世界人口蓋度基于表位的疫苗成為可能，因為其通過有限數(shù)目的肽提供了顯著大量的表位。
表2HCV保守區(qū)域內(nèi)的T細胞表位熱點。
以粗體顯示熱點(包括一些變異)，包含于熱點內(nèi)的表位以正常字體(normal font)顯示。給出肽的數(shù)目和序列以及HLAI類和II類覆蓋度。如果原始數(shù)據(jù)不是由WO04/024182提供的，那么就參考文獻資料。

實施例III.HCV表位熱點Ipep 1426至少包含HLA-A*0201和幾個混雜II類T細胞表位該實驗的主要目的是將“熱點”Ipep 1426的免疫原性與單個表位的進行比較，所述Ipep 1426包含至少一個HLA-A*0201表位(Ipep1334)和2個混雜的II類表位(Ipeps 1006和1425)。用1426或者用1334、1006、1425的混合物體外刺激來自幾個健康HLA型血液供體的外周血單核細胞(PBMC)。進行三輪刺激產(chǎn)生寡克隆T細胞系。然后，通過γ干擾素(IFN-γ)ELIspot分析估計針對所有四種肽的應答。
肽1426，誘導類似于包含于其序列中單個表位所誘導的T細胞應答。特別地，成功地產(chǎn)生了針對HLA-A*0201限制性表位1334的CD8陽性T細胞。
表3肽誘導的寡克隆T細胞系的IFN-γ分泌。
通過在體外用肽1426或用肽1006+1425+1334的混合物進行三輪引發(fā)，從兩個HLA型健康個體產(chǎn)生細胞系。通過IFN-γ ELIspot估計在這些系中CD4陽性和CD8陽性T細胞的反應性(“+++”非常強，“++”強，“+”顯著，“-”無IFN-γ分泌)。
實施例IV.通過五種不同的HCV衍生的肽、抗微生物肽KLK和合成的寡脫氧核苷酸o-d(IC)13的組合注射誘導強烈的HCV特異性I型細胞應答。
小鼠HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠(HHD.1)肽 將肽p83、p84、p87、p89、p1426用于疫苗。
p83HCV-衍生的肽，(KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL)p84HCV-衍生的肽，
(GYKVLVLNPSVAAT)p87HCV-衍生的肽，(DLMGYIPAV)p89HCV-衍生的肽，(CINGVCWTV)p1426HCV-衍生的肽，(HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA)p1274作為非相關(guān)肽用于再刺激(YMDGTMSQV；HLA-A*0201限制性的)通過標準的固相F-moc合成方法合成所有多肽，用HPLC純化和通過質(zhì)譜學分析純度。
劑量每種肽200ug/小鼠通過MPS(Multiple Peptide System，USA)合成KLKKLKLLLLLKLK-COOH劑量10nmol/小鼠通過Purimex Nucleic Acids Technology，Gttingen合成oligo-d(IC)13(＝ODNla)ODN 5′ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICICICIC3′劑量0.4nmol/小鼠制劑 10mM Tris/135mM NaCl；pH～7
建立實驗(5只小鼠/組)1.HCV肽2.HCV肽+KLK+o-d(IC)13在第0、14和28天給HHD.1小鼠兩只后爪皮下(s.c.)注射含有上面所列化合物的總體積為100μl/小鼠(50μl/爪)的試劑。在第35天(最后一次免疫后7天)通過磁力分離(MACS，Miltenyi)從脾細胞的單個細胞懸浮液中分離CD4+和CD8+T細胞。用介質(zhì)(背景對照)溫育T細胞，或在用于接種的不同肽或非相關(guān)肽p1274存在的情況下，用來自新生HDD.1小鼠的經(jīng)輻射的脾細胞作為APC再免疫T細胞。過夜溫育后，使用ELIspot測定分析IFN-γ產(chǎn)量。
圖1顯示在用五種來源于HCV的肽和KLK/o-d(IC)13共注射后，誘導了大量由抗p84、p87、p89、p1426的CD4+T細胞產(chǎn)生的IFN-γ。此外，檢測到由抗p87、p89的CD8+T細胞的強IFN-γ產(chǎn)生。
實施例V肽混合物(HCV肽加多聚L精氨酸)的溶解肽混合物包含肽83、84、87、89、1426和作為免疫素的pR(參見表4)，其中肽83和84溶于水和DMSO，肽87和89水溶性較差但能容易地溶于DMSO中，而肽1426只溶于DMSO。為生產(chǎn)懸浮制劑，首先必需將肽83和84溶解在緩沖水溶液中，將肽87、89和1426溶解在DMSO中。滅菌過濾后可將所述溶液混合形成最終的懸浮液。
水/乙腈混合物以及DMSO和DMF不能用作溶劑，并且其會產(chǎn)生這樣的懸浮物，所述懸浮物由于堵塞過濾器從而不能進行滅菌過濾。令人吃驚的是發(fā)現(xiàn)50％的乙酸/水混合物溶解所有組分。所獲得的包含上述肽的肽溶液可容易地滅菌過濾而無任何過濾堵塞。
表4 肽混合物I
下列實施例(實施例V.1至V.12，表5至16)說明，包含至少兩種具有可變長度的肽的肽混合物和根據(jù)本發(fā)明氨基酸組合物適合溶解。此外表中顯示已知的肽對HLA I類和II類分子的親和力。
實施例V.1表5 多肽混合物II
實施例V.2表6多肽混合物III
實施例V.3表7多肽混合物IV
實施例V.4表8多肽混合物V
實施例V.5表9多肽混合物VI
實施例V.6表10多肽混合物VII
實施例V.7表11多肽混合物VIII
實施例V.8表12多肽混合物IX
實施例V.9表13多肽混合物X
實施例V.10表14多肽混合物XI
實施例V.11表15多肽混合物XII
實施例V.12表16多肽混合物XIII
實施例VI.設(shè)計本發(fā)明進一步的HCV疫苗變體的基本原理表17優(yōu)選的“熱點I”組合
優(yōu)選的熱點I組合的特征肽的數(shù)目12通過半胱氨酸的潛在的肽相互作用在3個肽(1846、89、1547)中存在4個Cys；潛在的肽同型和異型二聚體以及寡聚體的形成。
覆蓋的HCV抗原數(shù)目5(核心、E2、NS3、NS4、NS5)覆蓋的HLA I類等位基因至少8個A2(8次)、A3(2次)、A11(2次)、A24(1次)B7(2次)、B35(1次)、B60(1次)Cw7(1次)覆蓋的HLA II類混雜肽結(jié)合的多個等位基因DR1(8次)、DR4(6次)、DR7(8次)、DR11(7次)優(yōu)選的熱點I組合由來源于5個不同HCV抗原的保守區(qū)(在基因型1、2、3中＞80％)的12個肽組成。總共覆蓋了至少8個重要的HLAI類等位基因(每個基因1-8次)，其在歐洲中提供了83-91％的人口覆蓋，在美國白種人提供了89-91％的覆蓋，在日本人中提供了87-89％的覆蓋(根據(jù)來自HLA-prevalence studies，Gjertson和Terasaki，編，HLA 1998，American Society of Histocompatibility andImmunogenetics，Lenexa，Kansas，USA的數(shù)字進行估計)。類似地，覆蓋了幾種重要的HLA II類等位基因，主要由所謂的混雜肽(結(jié)合超過一種HLA II類等位基因)。單獨地特別普遍的等位基因(DR1、4、7、11)被獨立地覆蓋了6-8次。重要的是，DR11被覆蓋了7次。這些等位基因的存在與HCV感染的自發(fā)恢復有關(guān)聯(lián)(Thursz等人，1999Lancet354(9196)2119-24)。包含于該熱點組合中的大量表位不僅確保了廣泛的人口覆蓋度，從而確保了疫苗的實用性，而且還確保了在使用這種組合物治療的個體中的廣泛免疫應答。這是有功效的前提條件，因為HCV感染的自發(fā)恢復與通常針對10個或更多表位的廣泛的免疫應答相關(guān)聯(lián)(Day等人，2002 J Virol.76(24)12584-95)。
針對多個表位的T細胞應答也降低HCV表位逃避變體(不再包含被免疫應答靶向的表位的HCV病毒)演變的風險，因為在同一時間被靶向的表位越多，病毒同一時刻改變其自身越困難。在黑猩猩上的實驗已確定這些HCV逃避變體是維持慢性感染的重要機制(Weineretal，1995 Proc Natl Acad Sci U S A.92(7)2755-9)。
最后，靶向大部分HCV抗原(核心、E2、NS3、4、5)而不是例如僅靶向一個也提供了重要的有利方面不同的抗原可被T細胞差異地識別(例如由于抗原加工上的差異的原因造成的，或由個體的特定HLA單元型控制的)。還有，在HCV生命周期中，不同抗原具有不同的功能重要性。
熱點I組合也包含來源于熱點(Ipep87來源于Ipep87EX，Ipep89來源于Ipep89EX)的單個表位。這具有將想要的應答故意集中在特定表位上的有利方面。例如使用Ipep89保證產(chǎn)生HLA-A2限制性CTL應答，盡管使用89EX可導致HLA-A2限制性CTL應答，但該應答可被伴隨的DR4或DR7限制性T輔助細胞應答削弱。
使用熱點組合具有優(yōu)于使用全長抗原(無論是以重組蛋白或作為DNA疫苗的形式)的許多有利方面。如在前面段落中所詳細說明的，在某些情況下使用單個表位可優(yōu)于使用熱點或完整的抗原。其次，通過主要使用Th1/Tc1型反應(即V干擾素)作為示值讀出進行功能測定已鑒定了此處公開的熱點。眾所周知，抗原不僅包含這種激動性表位，而且也可以編碼拮抗性配體。這種拮抗劑潛在地存在于整個抗原上，但在熱點上的缺少可妨礙疫苗的免疫原性和有效性。再次，完整的抗原幾乎一定會誘導體液免疫應答。這種抗體應答自身對存在于細胞內(nèi)的HCV具有很小的影響，但其可以嚴重地削弱想要的T細胞應答。熱點，由于其有限的長度，不太可能誘導不想要的抗體應答。最后，在不同基因型之間只有HCV抗原中相對小的部分保守。因此，用于疫苗的完整抗原可以誘導針對非保守區(qū)域或表位的應答，所述應答與大多數(shù)患者無關(guān)。相反地，此處公開的熱點來源于在主要的HCV基因型1、2和3中保守性大于80％的區(qū)域。
表18優(yōu)選的“熱點II”的組合
優(yōu)選的“熱點II”的組合的特征肽數(shù)目7通過半胱氨酸的潛在的肽相互作用1個Cys(1846)；潛在的1846的同型二聚體的形成。
覆蓋的HCV抗原數(shù)目5(核心、E2、NS3、NS4、NS5)覆蓋的HLA I類等位基因至少7個A2(5次)、A3(2次)、A11(2次)、A24(1次)B7(2次)、B35(1次)Cw7(1次)覆蓋的HLA II類混雜肽結(jié)合的多個等位基因DR1(6次)、DR4(5次)、DR7(5次)、DR11(5次)優(yōu)選的熱點II組合由來源于5個不同的HCV抗原的保守區(qū)(在基因型1、2、3中＞80％)的7個肽組成?？偣哺采w了至少7個重要的HLA I類等位基因(1-5次)，在歐洲提供了81-90％的人口覆蓋，在美國白種人提供了89-91％的覆蓋以及在日本人中提供了85-88％的覆蓋(根據(jù)來自HLA-prevalence studies，Gjertson和Terasaki，編，HLA 1998，American Society of Histocompatibility andImmunogenetics，Lenexa，Kansas，USA的數(shù)字進行估計的)。類似地，覆蓋了幾種重要的HLA II類等位基因，其主要由所謂的混雜肽(結(jié)合超過一個HLA II類等位基因)。單獨地特別普遍的等位基因(DR1、4、7、11)被獨立地覆蓋了5-6次。重要的是，DR11被覆蓋了5次。這些等位基因的存在與HCV感染的自發(fā)恢復有關(guān)聯(lián)(Thursz等人，1999Lancet354(9196)2119-24)。
與組合I相反，組合II具有明顯更少的肽(7比12)，組合II在這種產(chǎn)品的可生產(chǎn)性、配制和競爭性生產(chǎn)上具有潛在的有利方面。重要的是，只存在一種具有半胱氨酸側(cè)鏈的肽(1846)。因此，在這種組合中只形成1846的同型二聚體而不會形成異型二聚體或寡聚體。
同時，組合II覆蓋相同的5個HCV抗原和與組合I相似數(shù)量的HLA I類和II類等位基因。因此，在前面部分討論的觀點也適合于組合II。
從制劑開發(fā)的觀點上看，組合II具有優(yōu)于組合I的有利方面(只有7個而非12個組分)。最重要的是，只有一種肽(1846)攜帶自由半胱氨酸側(cè)鏈。因此，只可能形成1846的同型二聚體而不可能形成異型二聚體或寡聚體。
實施例VIIHCV疫苗102劑量最優(yōu)化試驗產(chǎn)生T細胞免疫原性在臨床試驗過程中，將許多肽/多聚精氨酸混合物用作疫苗給健康志愿者施用。各組由12個受試者組成，受試者呈HLA-A2陽性。受試者接受4次接種，每次間隔一個月(在3至6月隨訪)。在第1次訪問至第6次訪問，在最后一次接種后一個月(第7次訪問)和在最后一次接種3個月后(第8次訪問)抽取血液用于免疫學分析。為了監(jiān)控臨床試驗，Intercell已建立用于確定在GLP/GCP應變性下免疫學終點的具有當今技術(shù)水平的T細胞測定法γ干擾素ELIspot測定法、T細胞增殖測定法、HLA四聚體/FACS測定法。這些測定法允許對由治療性HCV疫苗誘導的表位特異性T細胞應答進行可靠的測量。所述疫苗誘導的T細胞免疫應答用作功效的替代參數(shù)(Keilholz等人，JImmunother.2002Mar-Apr；25(2)97-138)。
通過T細胞增殖測定法確定作為初級終點(primary end point)的T細胞免疫原性。
增殖測定法允許在生物學樣品(如人血)中檢測肽特異性T細胞。所述測定法的基本原理是，T細胞在用其T細胞抗體特異性識別的肽刺激后，通過分泌細胞因子和隨后進行增殖來產(chǎn)生反應?？赏ㄟ^各種方法測量細胞的增殖；最靈敏的方法按照將放射性標記的胸苷整合到細胞分裂前合成的DNA中的量進行分級。該反應可在96孔板中進行。各孔含有固定數(shù)量的細胞，所述細胞在抗原/肽存在的情況下培養(yǎng)數(shù)天。在最后16-20小時加入用氚標記的胸苷(3H-胸苷)。然后將細胞收集到濾紙板上含游離放射性的培養(yǎng)基介質(zhì)被清洗掉，但DNA粘附在濾紙上。通過β閃爍計數(shù)器可對摻入的放射性進行定量。通常產(chǎn)量以每分鐘的計數(shù)表示(cpm)。
通過γ干擾素ELIspot確定作為次級終點的T細胞免疫原性ELIspot允許在生物學樣品(如人血)中對肽特異性、功能性(即，分泌細胞因子)T細胞進行定量。所述測定法的基本原理是，T細胞在用所述T細胞受體特異性識別的肽刺激后通過分泌細胞因子如IFN-γ起反應。該反應可在96孔板中進行。用特異性針對IFN-γ的Mab包被該板的濾紙孔。然后，各分泌IFN-γ的細胞留下IFN-γ印跡，所述印跡隨后可用顏色反應進行觀察。使用自動板讀數(shù)器可計算印跡數(shù)。獲得的數(shù)目就是樣品中肽特異性、分泌IFN-γ的T細胞的頻率。
進行作為額外的次級終點的HLA-四聚體/FACS分析
HLAI類四聚體(HLA分子和抗原肽的復合物的可溶性重組形式)結(jié)合用于T細胞識別的抗原特異性T細胞受體。通過對熒光四聚體使用流式細胞儀，可容易地計算和表征抗原特異性CD8+T淋巴細胞。所述測定使用了與HCV疫苗I類表位復合的由Beckman CoulterImmunomics生產(chǎn)的根據(jù)HLA-A*0201定做的iTagTM-四聚體。
如果受試者在第4次至第8次訪問中的任一次顯示明顯的T細胞應答而在處理前沒有應答時，他們就被分類為應答者。
相對于接受鹽水的25個受試者對照組中25％的比例，可獲得高達92％的最高應答者比率(針對任何肽，在第4次至第8次訪問中的任一次，在三種T細胞測定中的任一種中)。
Ipep89、Ipep84和Ipep1426中每個肽的應答者比率此處顯示了針對T細胞表位熱點肽pep89(I類T細胞表位)、Ipep84和Ipep1426的應答的例子。在4次每次間隔1個月的接種后獲得這些應答。對于B組，使用只含有多聚L精氨酸的疫苗。對于C組，使用含有5種肽(包括Ipep89、Ipep84和Ipep1426)的混合物的疫苗。對于G組，使用含有與C組相同的5種肽的混合物和作為完全合成的T細胞佐劑的多聚L精氨酸的疫苗。
表19顯示在對照組B中在ELIspot和HLA-四聚體/FACS分析中沒有觀察到應答者和觀察到3個總計只有3次陽性觀察的應答者。后者可以解釋為在增殖測定中獲得的假陽性應答者比率。
在只包含肽但沒有多聚L精氨酸的C組中，觀察到在ELIspot中1個針對Ipep84的應答者，在增殖分析中觀察到5個和4個分別針對Ipep84和Ipep1426的應答者，以及在HLA-四聚體/FACS分析中4個針對Ipep89的應答者。最后G組(具有與C組中相同的肽再加上多聚L精氨酸)顯示，在所有三種測定中觀察到所有受試者都是應答者。重要的是，特別一致(所有三種肽)和持續(xù)的(參見完全陽性觀察的數(shù)目)ELIspot應答表明功能性T細胞依賴于作為合成的T細胞佐劑的多聚L精氨酸。
表19在B、C和G組中每種肽的應答者和陽性訪問數(shù)目。
注REV/PEIV應答者-ELISPOT應答者(I類或II類)；n/H(％)-每個肽的應答者除以處理組中應答者數(shù)目的比例RPII應答者-T-細胞增殖應答者(僅對II類)RFI應答者-HLA-四聚體/FACS應答者(僅對I類)疫苗應答者-任何RES/REIV，RPII或RFI1.T-細胞增殖應答僅對IPEP1426計算2.FACS應答僅對IPEP 89計算。
個體時程(ELISpot)例子G組受試者5表20顯示了獲自G組特定受試者的系列血點的干擾素γ，ELISpot結(jié)果(5肽+聚-L-精氨酸)。在訪問5中(一個月于兩次II類表位Ipep84免疫接種后的次級免疫)，1426顯示應答，在第三次免疫后，在所有應答中達到峰值，I類表位Ipep89顯示應答。此外，Ipep1426顯示持續(xù)應答，即使在訪問8的末次接種3個月后。
表20來自G組的5個受試者在一段時間內(nèi)針對Ipep 89、84、1426的ELIspot值(每1百萬PBMC的印跡數(shù)，減去背景的；將非顯著值設(shè)為零)。
參考文獻Aichinger G等人，1997.J.Biol.Chem.27229127-29136.
Ausubel FM等人(editors)，2001.Current Protocols in MolecularBiology，卷1-4，John Wiley and Sons(出版商).
Bellentani S等人，Microbes Infect.2000Nov；2(14)1757-63.
Bonifacino JS等人(editors)，2001.Current Protocols in CellBiology，卷1-2，John Wiley and Sons(出版商).
Cornberg M等人，Curr Gastroenterol Rep.2002 Feb；4(1)23-30.
Cox AL等人，1994.Science 264716-719Coligan JE等人(editors)，2001.Current Protocols in Immunology，卷1-4，John Wiley and sons(出版商).
Farci P等人，Semin Liver Dis.2000；20(1)103-26Gavin MA等人，1993.J Immunol.1513971-80Gorga，JC等人，1987.J.Biol.Chem.26216087-16094.
Heemels，MT等人，1995.Annu.Rev.Biochem.64463-491Kern F等人，2000.Eur J Immun 301676-1682Kern F等人，1999.J Virol 73(10)8179-8184Klein，J，1986.Natural History of the MHC，John Wiley and Sons(出版商)Kronenberg M等人，1999.Immunol Today 20515-21.
Kwok WW等人，2001.Trends Immunol 22(11)583-588.
Lalvani A等人，1997.J.Exp.Med.186(6)859-865.
Liang TJ等人，Ann Intern Med.2000 Feb 15；132(4)296-305.
Maecker HT等人，2001.J Immunol Methods 25527-40Nijman HW等人，1993.Eur.J.Immunol.，6，1215-9Novak N等人，2001.J.Immunol.1666665-6670.
Parker，KC等人，1994.J.Immunol.152163.
Rammensee，HG等人，1999.Immunogenetics 50213-219Stern LJ等人，1994.Structure 2245-251Sturniolo T等人，1999.Nature Biotechnology 17555-562.
Tobery WT等人，2001.J Immunol Methods 25459-66.
Valli A等人，1993.J.Clin.Invest.91616-628Van den Eynde BJ，等人，1997.Curr Opin Immunol.5684-93Villadangos JA等人，2000.Immunity 12233-239Ward S等人，Clin Exp Immunol.2002May；128(2)195-203.
Wilson DB等人，1999.J.Immunol.1636424-6434.
權(quán)利要求
1.包含至少兩種表位的丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，其中各表位來自不同的熱點表位，其中熱點表位定義為包含選自下列的肽的表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，F(xiàn)TDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR，LINTNGSWHINRTALNCNDSL，TTILGIGTVLDQAET，F(xiàn)DS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，VVCCSMSYTWTGALITPC，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
2.權(quán)利要求1的HCV疫苗，其包含至少三種，優(yōu)選地至少4種表位，各自來自不同的熱點表位。
3.權(quán)利要求1的HCV疫苗，其包含至少5種表位，各自來自不同的熱點表位。
4.權(quán)利要求1的HCV疫苗，其包含至少6種表位，各自來自不同的熱點表位。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的HCV疫苗，其特征在于所述表位選自下列KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL，YLLPRRGPRL，LPRRGPRL，GPRLGVRAT，RLGVRATRK；GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVL，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT；DLMGYIPAV，GYIPLVGAPL，DLMGYIPLVGAPL；CINGVCWTV，GEVQVVSTATQSFLAT，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV；HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，MWNFISGIQYLAGLSTLPGN，NFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，QYLAGLSTL，HMWNFISGI；VDYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKI，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，VDYPYRLWHYPCTVNYTIFKIRMYVGGVEHRL，DYPYRLWHYPCTVNYTIFKI，DYPYRLWHY，TVNYTIFKI，TINYTIFK，TVNFTIFKV，HYPCTVNYTI，HYPCTVNFTI，RMYVGGVEHR；AAWYELTPAETTVRLR，TPAETTVRL；GWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLGCIV，TAYSQQTRGLLG，GQGWRL-LAPITAYSQ，RLLAPITAY，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，GQGWRLLAP-ITAYSQQTRGLLG，AYSQQTRGLL，AYSQQTRGL；IGLGKVLVDILAGYGAGVAGAL-VAFK，ILAGYGAGV，VAGALVAFK，GYGAGVAGAL；VVCCSMSYTWTGALITPC，SMSYTWTGALITP，SMSYTWTGAL，SYTWTGALI；FTDNSSPPAVPQTFQV；LEDRDRSELSPLLLSTTEW，LEDRDRSELSPLLLST，RSELSPLLL，ELSPLLLST，DRDRSELSPL，LEDRDRSEL，LEDRDRSEL；YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，YLVAYQATV；MSTNPKPQRKTKRNTNR，PQRKTKRNTNR，QRKTKRNTN，RKTKRNTNR，MSTNPKPQR，MSTNPKPQK；LINTNGSWHINRTALNCNDSL，NGSWHINRTALNCNDSL，LINTNGSWHI，RTALNCND-SL，LINTNGSWHINRTALN，SWHINRTALN；TTILGIGTVLDQAET，TTILGIGTV，TILGIGTVL；FDSSVLCECYDAGAAWYE，F(xiàn)DSSVLCECYDAGCA，VLCECYDAGA，VVLCECY-DAGAAWYE；ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，ARLIVFPDL，RLIVFPDLGV，RVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV；GVLFGLAYFSMVGNW；TRVPYFVRAQGLIRA；TTLLFNILGGWVAAQ，LLFNILGGWV.
6.權(quán)利要求1至5中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含來自至少三種，優(yōu)選地至少4種下列熱點表位中的至少一種表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA.
7.權(quán)利要求1至6中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含來自至少兩種，優(yōu)選地至少三種，特別地至少4種下列熱點表位中的至少一種表位VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，AAWYELTPAETTVRLR，GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，F(xiàn)TDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRKTKRNTNR和LINTNGSWHINRTALNCNDSL.
8.權(quán)利要求1至7中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含來自至少兩種，優(yōu)選地至少三種、特別地至少4種下列熱點表位中的至少一種表位TTILGIGTVLDQAET，F(xiàn)DS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYFSMVGNW，TRVPYFVRAQGLIRA和TTLLFNILGGWVAAQ.
9.權(quán)利要求1至8中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含下列表位GYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIPAV，CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA
10.權(quán)利要求1至9中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK。
11.權(quán)利要求1至9中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含表位DLMGYIPAV。
12.權(quán)利要求1至9中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含表位CINGVCWTV。
13.權(quán)利要求1至9中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含表位HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。
14.權(quán)利要求1至9中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含表位GYKVLVLNPSVAAT。
15.權(quán)利要求1至9中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含表位VVCCSMSYTWTGALITPC。
16.權(quán)利要求1至15中任一項的HCV疫苗，其特征在于其進一步包含含有序列R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N是3至7之間的整數(shù)，優(yōu)選地是5，X是帶正電荷的天然和/或非天然氨基酸殘基，Z是選自L、V、I、F和/或W的氨基酸殘基，而R1和R2是相互獨立地選自-H、-NH2、-COCH3、-COH、具有至多達20個氨基酸殘基的肽或肽反應性基團或具有或不具有肽的肽連接體；X-R2可以是所述肽(“肽A”)的C末端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯。
17.權(quán)利要求1至16中任一項的HCV疫苗，其特征在于其進一步包含具有式(I)結(jié)構(gòu)的免疫刺激性寡脫氧核酸分子(ODN) 其中R1選自次黃嘌呤和尿嘧啶，任何一個X是O或S，任何一個NMP是2’脫氧核苷單磷酸或脫氧核苷單硫代磷酸，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧-鳥苷-或N-異戊基-脫氧腺苷-單磷酸或-單硫代磷酸，NUC是2’脫氧核苷，選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞嘧啶-、脫氧肌苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧尿苷-、5-甲基-脫氧胞嘧啶-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷-或N-異戊基-脫氧腺苷，a和b是0至100之間的整數(shù)，前提是a+b為4至150之間，和B和E是核酸分子(“I-/U-ODN”)的5’或3’末端的公共基團。
18.權(quán)利要求1至17中任一項的HCV疫苗，其特征在于其進一步包含Al(OH)3佐劑。
19.權(quán)利要求1至18中任一項的HCV疫苗，其特征在于其進一步包含聚陽離子肽。
20.權(quán)利要求1至19中任一項的HCV疫苗，其特征在于所述肽A是KLKL5KLK。
21.權(quán)利要求1至20中任一項的HCV疫苗，其特征在于所述I-/U-ODN是寡d(IC)13。
22.權(quán)利要求1至21中任一項的HCV疫苗，其特征在于其進一步包含含有CpG基序的寡脫氧核苷酸。
23.權(quán)利要求1至23中任一項的HCV疫苗，其特征在于其以在15分鐘內(nèi)在37℃下可重構(gòu)的形式被凍干。
24.權(quán)利要求1至23中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含20μg至10mg的各表位。
25.權(quán)利要求1至24中任一項的HCV疫苗，其特征在于其被凍干且包含痕量乙酸。
26.權(quán)利要求1至25中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含至少兩種下列表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DLMGYIPAV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，GYKVLVLNPSVAAT，CINGVCWTV，AAWYELT-PAETTVRLR，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，TAYSQQTRGLLG，HMWNFIS-GIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
27.權(quán)利要求25的HCV疫苗，其特征在于其包含至少4種，優(yōu)選地至少5種，特別地至少6種這些表位。
28.權(quán)利要求25的HCV疫苗，其特征在于其包含至少8種，優(yōu)選地所有12種這些表位。
29.權(quán)利要求1至25中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含至少兩種下列表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKVAAWYELTPAETTVRLR，TAYSQQTRGLLG，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，IGLGK-VLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
30.權(quán)利要求29的HCV疫苗，其特征在于其包含至少4種，優(yōu)選地至少5種，特別地所有12種這些表位。
31.權(quán)利要求1至30中任一項的HCV疫苗，其特征在于其包含至少一個A2表位，至少一個DR1表位，至少一個DR7表位或至少一個這些表位中的各個表位。
32.權(quán)利要求1至31中任一項的疫苗制備用于預防和治療HCV感染的藥物制劑的用途。
33.用于制備權(quán)利要求1至31中任一項的疫苗的方法，其特征在于下列步驟-通過化學方法合成至少兩個權(quán)利要求1至15和26至31中定義的表位，-通過包含至少一種有機酸的水溶液溶解這些表位，所述有機酸選自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和其鹵化或羥基化形式，-混合所述溶解的表位和-任選地凍干所述經(jīng)混合的表位。
全文摘要
公開了丙型肝炎病毒(HCV)疫苗，所述疫苗包含至少兩種表位，各表位來自不同的熱點表位，其中熱點表位定義為包含選自下列序列的肽的表位KFPGGGQIVG－GVYLLPRRGPRLGVRATRK，GYKVLVLNPSVAAT，AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，DLMGYIP(A/L)VGAPL，GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，HMWNFISGIQYLA-GLSTLPGNPA，VDYPYRLWHYPCT (V/I)N(F/Y) TIFK(V/I)-RMYVGGVEHRL，AAWYELTP AETTVRLR，GQGWRLLA-PITAYSQQTRGLLGCIV，IGLGKVLVDILAGYGAGVA-GALVAFK，F(xiàn)TDNSSPPAVPQTFQV，LEDRDRSELSPLLL-STTEW，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，MSTNPKPQRK-TKRNTNR，LINTNGSWHINRTALNCNDSL,TTILGIGTVLDQ-AET，F(xiàn)DS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，ARLIVFPDLGVR-VCEKMALY，AFCSAMYVGDLCGSV，GVLFGLAYF-SMVGNW，VVCCSMSYTWTGALITPC，TRVPYFVRA-QGLIRA和TTLLFNILGGWVAQ。
文檔編號C07K14/18GK1822856SQ200480019878
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者M·布什勒, J·弗里施, C·克拉德, K·林瑙, W·曹納, G·策特爾邁瑟爾 申請人:英特塞爾股份公司