專利名稱：水包油型疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的水包油型疫苗組合物。具體地說，本發(fā)明涉及一種以水包油型乳劑為主的的疫苗佐劑制品，所述的水包油型乳劑含有一種可代謝的油角鯊烯、α-生育酚、TWEEN 80，通過包含一種甘油三酯已經(jīng)將其改進(jìn)；此外，這些疫苗佐劑可以任意含有一種QuilA(優(yōu)選QS21)和3D-MPL的免疫活性級(jí)分。
三辛精(C27H50O6)是甘油三酯類中的一種油并且在本領(lǐng)域中是公知的(《脂類手冊(cè)》(Lipid Handbook)(1986)Gunstone，F(xiàn).，Harwood，J.和Padley，F(xiàn).編輯，Chapman和Hall出版，368-377頁)。
QS21是一種HPLC純化的皂草苷的非毒性級(jí)分，皂草苷來源于南美皂樹(Quillaja Saponaria Molina)的樹皮，且其(也稱作QA21)制備方法公開在美國專利5,057,540中。
3 De-O-?；膯瘟柞；珹是一種由Ribi Immunochem，Montana生產(chǎn)的眾所周知的佐劑。在化學(xué)領(lǐng)域它以具有4、5或6位?；湹?De-O-?；瘑瘟柞；幕旌衔锏男问教峁?。另一方面，它可以根據(jù)GB2,220,211(Ribi)公開的方法來制備。3 De-O-?；膯瘟柞；珹的優(yōu)選形式及其制備方法公開在國際專利申請(qǐng)92/116556中。
水包油型乳劑本身是本領(lǐng)域眾所周知的且已經(jīng)有提示將其用作佐劑組合物(EPO 399843)。
國際專利申請(qǐng)95/17210中公開了一種以角鯊烯、α-生育酚和TWEEN 80為主的乳劑系統(tǒng)，它選擇性地用免疫刺激劑QS21和/或3D-MPL來配制。它們是各種免疫反應(yīng)、包括某些模型系統(tǒng)中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)在內(nèi)的非常有效的誘導(dǎo)物。在靶細(xì)胞的感染或未加控制的腫瘤抗原合成過程中自然發(fā)生誘發(fā)的CTL反應(yīng)，其中靶抗原的酶降解發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。這種現(xiàn)象使得來源于病原體或腫瘤特異性抗原的胞質(zhì)肽類進(jìn)入Th 1途徑并出現(xiàn)在與MHC 1型分子相關(guān)的細(xì)胞表面上。如果一種疫苗抗原不進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并在其中復(fù)制那么它將進(jìn)入Th 2途徑并最終出現(xiàn)在與MHC II型分子相關(guān)的細(xì)胞表面上。這種可選擇的途徑一般導(dǎo)致輔助T細(xì)胞反應(yīng)和抗原特異性抗體反應(yīng)。
如上所述，在接種疫苗后，一種病原體特異性抗原沒有進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)且由此不會(huì)進(jìn)入Th 1途徑并最終誘發(fā)CTL反應(yīng)。Th 1反應(yīng)已經(jīng)被刺激的一種可識(shí)別信號(hào)是促進(jìn)Th 1型細(xì)胞因子、例如IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生。IFN-γ的分泌與對(duì)包括寄生蟲、細(xì)菌和病毒在內(nèi)的胞內(nèi)病原體的保護(hù)性反應(yīng)有關(guān)。由IFN-γ激活的白細(xì)胞可促進(jìn)殺滅胞內(nèi)的病原體并增加Fc受體的表達(dá)。直接的細(xì)胞毒性也可以發(fā)生，特別是在與淋巴毒素(TH 1細(xì)胞的另一種產(chǎn)物)的協(xié)同作用中。IFN-γ也是一種NK細(xì)胞的誘導(dǎo)物和產(chǎn)物，它們是主要的先天保護(hù)效應(yīng)物。通過IFN-γ或其它機(jī)理產(chǎn)生的Th 1型反應(yīng)可對(duì)鼠IgG2a免疫球蛋白同種型提供更好的輔助作用。
當(dāng)用3D-MPL和QS21進(jìn)行配制時(shí)，上述專利申請(qǐng)(國際專利申請(qǐng)?zhí)枮閃O 95/17210)中所涉及的水包油型乳劑是Th 1型免疫反應(yīng)的有效誘導(dǎo)物。因此，當(dāng)這些佐劑與抗原有關(guān)時(shí)，它們優(yōu)先刺激與Th 1反應(yīng)有關(guān)的IgG亞同種型(鼠IgG2a)并且還將誘導(dǎo)顯著水平的IFN-γ產(chǎn)生和抗原特異性胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。
堿性水包油/QS21/3D-MPL制劑可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞溶解的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的這一觀察結(jié)果是顯著的，正如已經(jīng)證實(shí)這些反應(yīng)在某些動(dòng)物模型中可誘導(dǎo)對(duì)疾病的保護(hù)作用一樣。
上述國際專利申請(qǐng)WO 95/17210中所述的實(shí)例可與產(chǎn)生不同直徑油滴的各種配制方法相比擬。如光子相關(guān)光譜學(xué)(photon correlationspectroscopy)(質(zhì)量分布)所測(cè)定的具有大約500nm顆粒直徑的制劑表現(xiàn)出優(yōu)越的佐劑特性。鑒于增加的IgG2a/b抗體滴度和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性(CMI)，因此上述這種工藝特性突出了來源于具有較大尺寸油滴的佐劑的巨大益處。
國際專利申請(qǐng)WO 95/17210中的乳劑(其用途已經(jīng)在上述討論)顯然會(huì)保持常規(guī)非Th 1誘導(dǎo)佐劑的巨大優(yōu)點(diǎn)。盡管較大的顆粒在作為具有可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的最佳油滴的制劑中顯得很突出，但是它仍存在缺乏穩(wěn)定性這一缺陷。令人遺憾的是，當(dāng)有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)時(shí)，由于所述乳劑中油滴的尺寸較大，所以所述乳劑會(huì)破裂。實(shí)際上，為了獲得均勻的疫苗制品，所述乳劑必須在使用前迅速制備。
本發(fā)明解決了乳劑不穩(wěn)定的這一難題且保持了為達(dá)到最佳佐劑活性而應(yīng)具有的較大水包油液滴的優(yōu)選直徑。通過在有甘油三酯油存在的情況下配制水包油型乳劑已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了這一目的。
本發(fā)明的水包油型乳劑是穩(wěn)定的。因此在延長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)所述油滴的直徑可保持相對(duì)恒定的水平。
優(yōu)選的情況是本發(fā)明的乳劑不會(huì)在4℃下1年的時(shí)間期限內(nèi)形成霜或分離成兩相，且更優(yōu)選在2年的時(shí)間期限內(nèi)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了一種疫苗或藥物制劑，它們含有一種抗原以及3 De-O-?；膯瘟柞；珹、QS21、一種甘油三酯和一種水包油型乳劑，其中所述的甘油三酯可以是三辛精且水包油型乳劑含有一種可代謝的油(諸如角鯊烯)、α-生育酚和TWEEN80。這類配方適合于大多數(shù)的單價(jià)疫苗或多價(jià)疫苗。另外，所述的水包油型乳劑可以含有span85。3 De-O-?；膯瘟柞；珹的一種優(yōu)選形式公開在國際專利申請(qǐng)公開號(hào)為92116556-SmithKline BeechamBiologicals s.a.中。
在穩(wěn)定的水包油型乳劑中發(fā)現(xiàn)的油滴大小范圍是本發(fā)明的重要方面。正如光子相關(guān)光譜學(xué)所測(cè)定的，預(yù)計(jì)本發(fā)明的實(shí)施方案是油滴直徑基本上在300-600nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選基本上在約350-550nm的范圍內(nèi)，且最優(yōu)選基本上在450-500nm的范圍內(nèi)。盡管本文所述的許多實(shí)例具有的油滴大小基本上為500nm，但是本發(fā)明適用于水包油型乳劑，其中油滴的直徑基本上大于500nm，由此油滴的直徑可以具有基本上600nm或600nm以上的平均油滴大小，這對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是可以領(lǐng)會(huì)的。因此，油滴的直徑基本上可以在500-600nm的范圍內(nèi)。與本發(fā)明相關(guān)的“基本上”的定義是在所述范圍內(nèi)的油滴數(shù)量大于80％，優(yōu)選大于90％，且最優(yōu)選大于95％。
為使任意的水包油型組合物適合于人體給藥，乳劑系統(tǒng)的油相必須含有一種可代謝的油。術(shù)語可代謝的油的含義在本領(lǐng)域中是眾所周知的?？梢詫⒖纱x的定義為“能夠通過新陳代謝轉(zhuǎn)化的”(Dorland’sIllustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。所述的油可以是任意的植物油、魚油、動(dòng)物油或合成的油，它對(duì)于使用者來說是沒有毒性的且能夠通過新陳代謝而轉(zhuǎn)化。堅(jiān)果類、種子類和谷物類是普通的植物油來源。合成的油也是本發(fā)明的組成部分且可以包括商購的油類，諸如NEOBEE及其它。角鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯(tetracosahexaene))是一種不飽和的油，大量的角鯊烯是在鯊魚肝的油中發(fā)現(xiàn)的，而較小量的角鯊烯是在橄欖油、麥胚油、米糠油和酵母中發(fā)現(xiàn)的，且角鯊烯是本發(fā)明中特別優(yōu)選使用的一種油。角鯊烯是一種可代謝的油，依據(jù)為它是合成膽固醇的一個(gè)中間產(chǎn)物這一事實(shí)(Merck索引，第10版，進(jìn)入號(hào)8619)。
可以將所述的水包油型乳劑單獨(dú)使用或與其它佐劑或免疫刺激劑一同使用且由此本發(fā)明的一個(gè)重要的實(shí)施方案是一種水包油型制劑，它含有角鯊烯或另一種可代謝的油、一種甘油三酯(諸如三辛精)、α-生育酚和聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯(TWEEN 80TM)。所述的水包油型乳劑還可以含有span85和/或卵磷脂。因此，在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中包括一種佐劑組合物，它含有由角鯊烯、TWEEN 80TM、α-生育酚組成的一種水包油型乳劑，其中在所述乳劑中油滴具有的平均直徑基本上在300-600nm。本發(fā)明還提供了一種疫苗，它包括一種由角鯊烯、TWEEN 80TM、α-生育酚組成的水包油型乳劑和一種抗原或抗原制品，其中所述乳劑中油滴具有的平均直徑基本上在300-600nm。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述的佐劑組合物或疫苗組合物進(jìn)一步含有QS21和3D-MPL。
本發(fā)明的疫苗制品優(yōu)選含有一種能夠引起對(duì)人病原體的免疫反應(yīng)的抗原或抗原組合物，所述的抗原或抗原組合物來源于HIV-1(諸如tat、nef、gp120或gp160)、人皰疹病毒(諸如gD或其衍生物)或立即早期蛋白(諸如來自HSV1或HSV2的ICP27)、巨細(xì)胞病毒((特別是人)(諸如gB或其衍生物))、輪狀病毒(包括活的減毒病毒)、EB病毒(諸如gp350或其衍生物)、水痘-帶狀皰疹病毒(諸如gpI、II和IE63)；或來源于一種諸如乙型肝炎病毒這樣的肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；或來源于其它的病毒病原體，諸如副粘病毒屬呼吸道合胞病毒(諸如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18，諸如L1、L2、E6或E7抗原)、黃病毒(例如黃熱病毒、登革病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒；或來源于細(xì)菌病原體，諸如奈瑟球菌屬的種類，包括淋病奈瑟球菌和腦膜炎奈瑟球菌(例如莢膜多糖及其接合物、運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、PilC、粘附素)；鏈球菌屬的種類，包括肺炎鏈球菌(例如莢膜多糖及其接合物、PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結(jié)合蛋白)、化膿鏈球菌(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁質(zhì))、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、變異鏈球菌；嗜血桿菌屬的種類，包括流感嗜血桿菌B型(例如PRP及其接合物)、不可分型的(non typeable)流感嗜血桿菌(例如OMP26、高分子量的粘附素、P5、P6、脂蛋白D)、杜克氏嗜血桿菌；莫拉氏菌屬的種類，包括粘膜炎莫拉氏菌、也稱作粘膜炎布蘭漢氏球菌(例如高和低分子量的粘附素和侵染素)；博德特氏桿菌屬的種類，包括百日咳博德特氏桿菌(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀凝血素、腺苷酸環(huán)化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏桿菌和支氣管炎博德特氏菌；分枝桿菌屬的種類，包括結(jié)核分枝桿菌(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌；軍團(tuán)菌屬的種類，包括侵肺軍團(tuán)菌；埃希氏桿菌屬的種類，包括腸產(chǎn)毒素大腸桿菌(例如定居因子、熱不穩(wěn)定毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀菌毒素樣毒素或其衍生物)；弧菌屬的種類，霍亂弧菌(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌屬的種類，包括索氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀氏菌；耶爾森氏菌屬的種類，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(例如Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森施菌；彎曲桿菌屬的種類，包括空腸彎曲桿菌(例如毒素、粘附素和侵染素)和大腸彎曲桿菌；沙門菌屬的種類，包括傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌；利斯特氏菌屬的種類，包括單核細(xì)胞增生利斯特氏菌；螺桿菌屬的種類，包括幽門螺桿菌(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素)；假單胞菌屬的種類，包括銅綠假單胞菌；葡萄球菌屬的種類，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；腸球菌屬的種類，包括糞腸球菌、屎腸球菌；梭狀芽孢桿菌屬的種類，包括破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(例如破傷風(fēng)毒素及其衍生物)、肉毒梭狀芽孢桿菌(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)、難辯梭狀芽孢桿菌(例如梭狀芽孢桿菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢桿菌屬的種類，包括炭疽芽孢桿菌(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒狀桿菌屬的種類，包括白喉棒狀桿菌(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體屬的種類，包括布氏疏螺旋體(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、嘎氏疏螺旋體(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏螺旋體(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體；埃里希氏體屬的種類，包括馬埃里希氏體和人粒細(xì)胞埃利希病的藥劑；立克次氏體屬的種類，包括立氏立克次氏體；衣原體屬的種類，包括砂眼衣原體(例如MOMP、肝素結(jié)合蛋白)、肺炎衣原體(例如MOMP、肝素結(jié)合蛋白)、鸚鵡鳥熱衣原體；鉤端螺旋體屬的種類，包括問號(hào)狀鉤端螺旋體；密螺旋體屬的種類，包括蒼白密螺旋體(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體、舌骨痢疾密螺旋體；或來源于寄生蟲，諸如瘧原蟲屬的種類，包括惡性瘧原蟲；弓形蟲屬的種類，包括鼠弓形體(例如SAG2、SAG3、Tg34)；內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)的種類，包括溶組織內(nèi)阿米巴；巴貝蟲屬(Babesia)的種類，包括田鼠巴貝蟲；錐蟲屬的種類，包括克氏錐蟲；賈第鞭毛蟲屬的種類，包括蘭氏賈第鞭毛蟲；Leshmania的種類，包括L.major；肺囊蟲屬的種類，包括卡氏肺囊蟲；毛滴蟲屬的種類，包括陰道毛滴蟲；裂體屬(Schisostoma)的種類，包括曼氏裂體吸蟲；或來源于酵母，諸如假絲酵母屬的種類、包括白色假絲酵母；隱球酵母屬的種類、包括新型隱球酵母。
乙型肝炎表面抗原的衍生物在本領(lǐng)域中是眾所周知的且包括、尤其是那些歐洲專利申請(qǐng)EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP 198-474中所列的PreS1、PreS2表面抗原。在一個(gè)優(yōu)選的方面中，特別是當(dāng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的疫苗制品含有HIV-1抗原(gp120)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明第疫苗制品含有如上文所定義的gD2t。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有所述佐劑的疫苗包括被看作可導(dǎo)致生殖器疣的HPV病毒(HPV6或HPV11及其它)以及可導(dǎo)致宮頸癌的HPV病毒(HPV16、HPV18及其它)。特別優(yōu)選形式的疫苗含有L1顆粒或殼粒以及含有一種或多種選自HPV6和HPV11蛋白E6、E7、L1和L2的抗原的融合蛋白。最優(yōu)選形式的融合蛋白是如GB 9515478.7中公開的L2E7和GB9717953.5中公開的蛋白D(1/3)-E7。
本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步含有來源于可導(dǎo)致瘧疾的寄生蟲的抗原。例如，優(yōu)選的來源于惡性瘧原蟲的抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一種雜合蛋白，該蛋白基本上含有通過乙型肝炎表面抗原的preS2部分的4個(gè)氨基酸與乙型肝炎病毒表面(S)抗原連接的惡性瘧原蟲環(huán)子孢子(CS)蛋白的所有C末端部分。其完整的結(jié)構(gòu)公開在國際專利申請(qǐng)PCT/EP92/02591中，公開號(hào)為WO 93/10152，要求的優(yōu)先權(quán)為申請(qǐng)?zhí)?124390.7的UK專利申請(qǐng)。當(dāng)在酵母中表達(dá)時(shí)，RTS作為脂蛋白顆粒產(chǎn)生，而當(dāng)將它與來自HBV的S抗原一同表達(dá)時(shí)，它產(chǎn)生一種混合的顆粒、稱作RTS，S。TRAP抗原在國際專利申請(qǐng)PCT/GB89/00895中描述，公開號(hào)為WO 90/01496。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是一種瘧疾疫苗，其中抗原制品含有RTS，S與TRAP抗原的組合物。其它可能成為多級(jí)瘧疾疫苗成分候選者的瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其瘧原蟲屬種類中的類似物。
這些制品還可以含有一種抗腫瘤抗原并且用于在免疫療法中治療癌癥。例如，該佐劑制品可應(yīng)用于腫瘤排斥抗原，諸如那些前列腺、乳腺、結(jié)腸直腸、肺、胰管、腎的腫瘤或黑素瘤。典型的抗原包括可用于治療黑素瘤的MAGE1和MAGE3或其它MAGE抗原、PRAME、BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，《最新免疫學(xué)觀點(diǎn)》(CurrentOpinions in Immunology)8，pps 628-636；Van den Eynde等，《國際臨床和實(shí)驗(yàn)室研究雜志》(International Journal of Clinical &Laboratory Research)(1997年提交)；Correale等(1997)，《國家癌癥協(xié)會(huì)雜志》(Journal of National Cancer Institute)89，p293)。實(shí)際上這些抗原在各種類型的腫瘤中被表達(dá)，諸如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。其它腫瘤特異性抗原適合于與本發(fā)明的佐劑一起使用且包括但不限于前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、MUC-1和癌胚抗原(CEA)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種含有本發(fā)明佐劑組合物和腫瘤排斥抗原的疫苗。
本發(fā)明中一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是一種含有激素抗原促性腺素釋放激素(GnRH)的疫苗組合物。這種抗原的免疫原性接合物公開在WO 95/20600、EP 0117934、US 4,302,386和US 5,006,334中。這類疫苗特別適用于治療癌癥?？梢灶A(yù)見本發(fā)明的組合物將用于制備含有來源于疏螺旋體屬的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原制品、以重組方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或肽類和嵌合融合蛋白。特別地，所述抗原是OspA。這種OspA可以是一種以脂質(zhì)化的形式依附于宿主細(xì)胞(大腸桿菌)的完全成熟的蛋白質(zhì)、稱作(Lipo-OspA)或是一種非脂質(zhì)化的衍生物。這類非脂質(zhì)化的衍生物包括非脂質(zhì)化的NS1-OspA融合蛋白，它具有流感病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白(NS1)的前81個(gè)N-末端氨基酸，且這類非脂質(zhì)化的衍生物還包括完整的OspA蛋白以及另一種蛋白質(zhì)；MDP-OspA是一種攜帶3個(gè)另外的N-末端氨基酸的OspA的非脂質(zhì)化形式。
可以將本發(fā)明的疫苗用于變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防或治療。這類疫苗可以含有過敏原特異性(例如Der p 1)和過敏原非特異性抗原(例如stanworth十肽)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種本文所述用于醫(yī)藥領(lǐng)域的疫苗。
預(yù)計(jì)借助于將所述疫苗經(jīng)粘膜途徑、例如口腔或鼻內(nèi)途徑或通過非腸道途徑、例如經(jīng)肌內(nèi)途徑進(jìn)行給藥可以將本發(fā)明的疫苗制品用于保護(hù)對(duì)一種疾病敏感或治療患此病的哺乳動(dòng)物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，三辛精可代謝的油(優(yōu)選角鯊烯)之比大約為1∶10-10∶1，優(yōu)選1∶5-5∶1。QS213D-MPL之比一般大約為1∶10-10∶1；優(yōu)選1∶5-5∶1且通?；緸?∶1。3D-MPLQS21的最佳協(xié)同作用的優(yōu)選范圍是2.5∶1-1∶1。一般用于人體給藥的QS21和3D-MPL在疫苗中的含量為每次劑量1μg-1000μg的范圍，優(yōu)選每次劑量10μg-500μg，更優(yōu)選每次劑量20-200μg，特別優(yōu)選每次劑量20-100μg，且最優(yōu)選每次劑量10-50μg。一般水包油乳劑含有2-10％的角鯊烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的TWEEN 80。角鯊烯α-生育酚的優(yōu)選比小于或等于1，在這種情況下可產(chǎn)生一種更為穩(wěn)定的乳劑。還可以含有1％含量的span85。在某些情況中，本發(fā)明的疫苗制品進(jìn)一步含有另一種穩(wěn)定劑是有利的。疫苗制品一般在《疫苗的新趨勢(shì)和開發(fā)》(New Trends and Developmentsin Vaccines)一書中描述，該書由Voller等編輯，University Park出版社出版，Baltimore，Maryland，U.S.A.，1978。例如Fullerton在美國專利4,235,877中描述了用脂質(zhì)體包囊的技術(shù)。例如Likhite在美國專利4,372,945中和Armor等在美國專利4,474,757中公開了將蛋白質(zhì)與高分子連接的技術(shù)。
將每一疫苗劑量中蛋白質(zhì)的量按照可在典型疫苗中誘發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)而沒有顯著性副作用的用量進(jìn)行選擇。這類用量根據(jù)所用的特異性免疫原以及它存在的多少而改變。一般來說，預(yù)計(jì)每一劑量包括1-1000μg的蛋白質(zhì)、優(yōu)選2-100μg、最優(yōu)選4-40μg。對(duì)于特殊疫苗的最佳用量可以通過包括觀察受試體中適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究結(jié)果來確定。在初始接種疫苗后，受試者可以在充分的時(shí)間間隔接受一次或幾次的加強(qiáng)免疫接種。
制備實(shí)施例中所述的水包油型乳劑的方法包括將油相與一種PBS/TWEEN 80TM溶液混合且隨后用一種勻漿器進(jìn)行勻漿的步驟，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很清楚包括使所述混合物兩次通過注射器針頭步驟的方法適合于勻化小體積的液體。同樣地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在微量流體控制機(jī)(M 110S微量流控機(jī)，最大入口壓力6巴(出口壓力約850巴)時(shí)，最多通過50次，時(shí)間期限2分鐘)中控制乳化過程以便產(chǎn)生較小或較大體積的乳劑。這種調(diào)節(jié)作用可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)，所述的常規(guī)實(shí)驗(yàn)包括將所得的乳劑測(cè)定至制劑達(dá)到具有所需直徑的油滴為止的步驟?？梢詫⒈景l(fā)明的這種制劑用于預(yù)防和治療的目的。
本發(fā)明還提供了一種用于使水包油型乳劑穩(wěn)定的方法，所述的水包油型乳劑不能穩(wěn)定地保持兩年的期限，該方法包括向所述的油相添加甘油三酯的步驟。在本方法中優(yōu)選使用的甘油三酯是三辛精。
實(shí)施例1，佐劑配方水包油乳劑型佐劑由有機(jī)相(α-生育酚、三辛精和角鯊烯)、水相(PBS)和一種或幾種乳化劑(包括TWEEN 80)組成，按照與WO95/17210中所述類似方式來制備該佐劑。
將TWEEN 80溶于磷酸緩沖鹽水(PBS)中以得到一種0.4％的PBS溶液。為生成100ml乳劑，緩慢添加5g的DLα-生育酚、0-5ml角鯊烯和0-5ml三辛精，然后渦旋以充分混合。在攪拌油相的同時(shí)，逐滴加入90ml的PBS/TWEEN 80溶液并充分混合。接著使用一種勻漿器(ultrathurax型)勻化所得制備液。(可選擇的是，對(duì)于小體積來說，通過使物質(zhì)通過注射器針頭兩次來勻化它們。)借助于通過微量流體控制機(jī)(M 110S微量流控機(jī))來乳化所述的制備液。在最大入口壓力為6巴(出口壓力約為850巴)時(shí)使所述的乳劑最多通過50次，時(shí)間持續(xù)2分鐘。所得油滴具有的大小約為300-600nm。
所試驗(yàn)的水包油型乳劑的具體內(nèi)容參見表1。表1，選擇性地含有三辛精的SB26乳劑配方，用于穩(wěn)定性試驗(yàn)
實(shí)施例2，佐劑的穩(wěn)定性1在不同的時(shí)間期限和儲(chǔ)存條件下檢測(cè)上述實(shí)施例中所述的佐劑制劑的穩(wěn)定性。將佐劑制劑的起始大小與在75℃下儲(chǔ)存超過8小時(shí)、37℃或45℃下儲(chǔ)存1個(gè)月、4℃下儲(chǔ)存12個(gè)月后或在包括以3000×g離心步驟的加速衰變?cè)囼?yàn)后發(fā)現(xiàn)的佐劑制劑的大小進(jìn)行比較。
通過光子相關(guān)光譜學(xué)測(cè)定水包油油滴的平均大小并表示為計(jì)數(shù)率(CR)、強(qiáng)度分布、質(zhì)量分布和顆粒的平均大小(表5)。
向大顆粒的水包油乳劑型佐劑(在此前該佐劑已經(jīng)不穩(wěn)定)中添加三辛精，這使得這類乳劑可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。本發(fā)明能夠使這種以實(shí)驗(yàn)室為基礎(chǔ)的有效佐劑系統(tǒng)在長(zhǎng)期的商業(yè)環(huán)境中使用。實(shí)施例3，佐劑的穩(wěn)定性2在較長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)重復(fù)佐劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例2)。結(jié)果參見表6。
結(jié)果證明與不具有穩(wěn)定性的那些乳劑相比，在延長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)含有三辛精的水包油型乳劑是穩(wěn)定的。實(shí)施例4，使用穩(wěn)定的水包油乳劑型佐劑在小鼠中的接種研究在3種情況下(第0天、第14天、第28天)給數(shù)組Balb/C小鼠肌內(nèi)免疫接種含有瘧疾抗原RTS，S、HIV gp120、水包油型乳劑和選擇性存在的三辛精的實(shí)驗(yàn)用疫苗。根據(jù)WO 95/17210中所述的技術(shù)制備所使用的SB26水包油型乳劑。這些乳劑具有的平均油滴直徑為500nm且使用期限為1個(gè)月。還是根據(jù)WO 95/17210中所述的技術(shù)制備SB62(150nm-穩(wěn)定期2年以上)，并將兩者進(jìn)行比較以確保獲得的免疫反應(yīng)不受添加三辛精的阻礙。
SB26T1和SB26T2.5具有的平均顆粒大小約為500nm且在2年內(nèi)保持穩(wěn)定。公知3 De-O-?；瘑瘟柞；珹(3D-MPL)來自GB2220211(Ribi)。QS21是一種HPLC純化的皂草苷的非毒性級(jí)分，皂草苷來源于南美皂樹的樹皮，且其(也稱作QA21)制備方法公開在美國專利5,057,540中。
將第3次接種14天后的體液反應(yīng)結(jié)果列在下面的表2中。簡(jiǎn)言之，SB26T起非常有效的疫苗佐劑的作用。如此產(chǎn)生的反應(yīng)比由較小油滴直徑的水包油型乳劑(SB62)產(chǎn)生的那些反應(yīng)強(qiáng)烈。表2，HBsAg特異性抗體反應(yīng)
還測(cè)定了分離的脾細(xì)胞和腘淋巴結(jié)細(xì)胞中的CTL反應(yīng)。結(jié)果如附圖2中所示。簡(jiǎn)言之，作為第3次接種14天后測(cè)定的結(jié)果，SB62配方成功地誘導(dǎo)了RTS，S特異性(如HBs抗原CTL特異性所確定的)CTL活性。兩種SB26T配方也誘導(dǎo)了可比擬水平的CTL活性。實(shí)施例5，小鼠中由佐劑系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體同種型分布的研究在最終的接種14天后，在實(shí)施例4中所示的接種實(shí)驗(yàn)過程中取樣品。通過可得到的標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)法檢測(cè)樣品以研究所產(chǎn)生的IgG亞同種型的分布。將所得結(jié)果列在附

圖1和表3中，簡(jiǎn)言之，這種穩(wěn)定的乳劑型佐劑可刺激顯示出強(qiáng)Th 1和Th 2型免疫反應(yīng)的類似的IgG亞同種型。表3，HBsAg特異性抗體同種型的比例
實(shí)施例6，使用穩(wěn)定的水包油乳劑型佐劑在獼猴中進(jìn)行的接種研究在3種情況下(第0天、第28天和第84天)給數(shù)組5只獼猴免疫接種表4中給出的疫苗制品。如上所述制備抗原RTS，S和gp120。將這些疫苗以快速濃注形式肌內(nèi)注入獼猴左腿后部(gp120)或右腿后部(RTS，S)。每種疫苗的最終體積為0.5ml。表4，獼猴研究中所用的疫苗配方
每次接種14天后取血樣并檢測(cè)抗原特異性體液和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。
使用下列步驟檢測(cè)獼猴外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)的抗原特異性增生反應(yīng)·在含有5％FCS和抗菌素的RPMI1640培養(yǎng)基中以2.106/ml的密度培養(yǎng)100μl的菲可分離的PBLs、一式四份(在組織培養(yǎng)物處理的Falcon圓底96孔平板中)。注意將平底培養(yǎng)平板用于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)試驗(yàn)。
·添加每次按所需濃度稀釋的100μl蛋白質(zhì)。將單獨(dú)的培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照而ConA(5μg/ml)用作陽性對(duì)照。
·在添加1μCi/孔3H-胸苷前將細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)。
·在完全培養(yǎng)基中添加稀釋了20倍的20μl 3H-TdR(1mCi/ml儲(chǔ)備液)、持續(xù)16-18小時(shí)。
·使用一種平板收集器將培養(yǎng)物收集到特定的過濾平板上。
·用β-計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性。
將所有的細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃、7％CO2、90％濕度的條件下溫育。
使用一種ELISA技術(shù)(參見實(shí)施例1)檢測(cè)抗RTS，S體液反應(yīng)(如使用HBs抗原所測(cè)定的)且結(jié)果如附圖3中所示。使用一種ELISA技術(shù)(參見實(shí)施例1)檢測(cè)抗gp120體液反應(yīng)且結(jié)果如附圖4中所示。如通過PBMC增生所測(cè)定的抗RTS，S和gp120介導(dǎo)的反應(yīng)如附圖5中所示。表5，佐劑穩(wěn)定性(參見實(shí)施例2)<
>腳注NA＝未得到表6，佐劑穩(wěn)定性(參見實(shí)施例3)
權(quán)利要求
1.一種包括穩(wěn)定的水包油型乳劑的佐劑組合物，其中油滴具有的平均直徑在300-600nm的范圍。
2.一種包括穩(wěn)定的水包油型乳劑的佐劑組合物，其中所述的水包油型乳劑含有一種可代謝的油和一種甘油三酯。
3.一種包括穩(wěn)定的水包油型乳劑的佐劑組合物，其中油滴具有的平均直徑在300-600nm的范圍，所述的水包油型乳劑含有一種可代謝的油和一種甘油三酯。
4.一種包括穩(wěn)定的水包油型乳劑的佐劑組合物，其中油滴具有的平均直徑在350-550nm的范圍，所述的水包油型乳劑含有一種可代謝的油和一種甘油三酯。
5.一種如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中所述的可代謝的油是角鯊烯。
6.一種如權(quán)利要求2和5中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中所述的甘油三酯是三辛精。
7.一種如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中甘油三酯∶可代謝的油之比在1∶10-10∶1的范圍。
8.一種如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中甘油三酯∶可代謝的油之比在1∶5-5∶1的范圍。
9.一種如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中所述的水包油型乳劑進(jìn)一步含有一種或多種免疫調(diào)制劑。
10.一種如權(quán)利要求9中所述的佐劑組合物，其中所述的免疫調(diào)制劑選自下列物質(zhì)組QS21；3D-MPL；和α-生育酚。
11.一種如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物，進(jìn)一步含有一種穩(wěn)定劑，諸如聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯(TWEEN 80TM)。
12.一種含有如權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的佐劑組合物的疫苗組合物，進(jìn)一步含有一種抗原或抗原制品。
13.一種如權(quán)利要求12中所述的疫苗組合物，其中所述的抗原或抗原制品由下列組中的微生物制備人免疫缺陷病毒；單純皰疹1型病毒；單純皰疹2型病毒；人巨細(xì)胞病毒；甲、乙、丙或戊型肝炎病毒；呼吸道合胞病毒；人乳頭瘤病毒；流感病毒；沙門菌屬；奈瑟球菌屬；疏螺旋體屬；衣原體屬；博德特氏桿菌屬；瘧原蟲屬和弓形蟲屬。
14.一種如權(quán)利要求12中所述的疫苗組合物，其中所述抗原制品來源于一種腫瘤抗原。
15.一種如權(quán)利要求12中所述的疫苗組合物，其中所述的抗原制品來源于促性腺素釋放激素(GnRH)。
16.一種包括油滴具有的平均直徑在300-600nm范圍的水包油型乳劑、一種抗原或抗原制品、QS21和3D-MPL的疫苗組合物，其中所述的水包油型乳劑含有一種可代謝的油、三辛精、TWEEN 80TM和α-生育酚。
17.一種用于制備如權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)所述的疫苗的方法，包括將一種水包油型乳劑、三辛精、3D-MPL、QS21和抗原或抗原制品混合的步驟。
18.基本如本文所述制品用于制備適于治療對(duì)病毒、細(xì)菌或寄生蟲病敏感患者或患有此類疾病患者的藥劑的用途。
19.基本如本文所述制品用于制備適于治療癌癥患者的藥劑的用途。
20.一種使不能穩(wěn)定地保存兩年的水包油型乳劑穩(wěn)定的方法，該方法包括向所述的水包油型乳劑的油相中添加一種甘油三酯的步驟。
21.一種如權(quán)利要求20中所述的方法，其中所述的甘油三酯是三辛精。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)的穩(wěn)定性水包油型乳劑及其作為疫苗佐劑的用途,所述乳劑具有的油滴直徑基本為300—600nm并含有甘油三酯。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1260723SQ98806134
公開日2000年7月19日 申請(qǐng)日期1998年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月11日
發(fā)明者N·加康, P·M·C·A·F·莫明 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司