[0041] 取中等極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1:2的比例裝柱，然后將上述備用的 濃縮液以1. 5柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再 用40-50%乙醇進行洗脫，洗脫流速為2. 5柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥、粉 碎，得到紅背葉根提取物。得率為0.35%。
[0042] 實施例5
[0043] 將紅背葉根藥材，用乙醇回流提取1次，乙醇濃度120%，加醇量為藥材重量的10 倍，提取時間60min。合并提取液，濾過并減壓濃縮，將濃縮液離心，取上清液減壓濃縮備用。
[0044] 取中等極性大孔吸附樹脂，按與生藥重量比1:2的比例裝柱，然后將上述備用的 濃縮液以1. 5柱體積/小時的流速通過此大孔樹脂柱，完全通過后，先用去離子水洗脫，再 用40-60%乙醇進行洗脫，洗脫流速為2. 5柱體積/小時。收集乙醇洗脫液，減壓干燥、粉 碎，得到紅背葉根提取物。得率為0. 27%。
[0045] 實施例6藥理實驗例
[0046] 為評價紅背葉根提取物的抗HBV效果進行體內抗鴨乙肝病毒（DHBV)的實驗研宄。
[0047] 1實驗材料
[0048] I. 1實驗動物同日孵化三日齡廣州麻鴨，雄性，質量（40-50)克。
[0049] 1. 2藥物紅背葉根提取物為實驗例1制備的提取物（HE);陽性對照藥阿德福韋 酯（ADV)，新銀河化工有限公司；按常規(guī)方法制備紅背葉根3種不同提取物：石油醚提取物 (PE)，乙酸乙酯提取物（EE)，正丁醇提取物（BE)。
[0050] 1. 2試劑標準D-HBV陽性血清；DNA聚合酶（Takara公司）；引物設計（賽百 盛生物工程有限公司合成）；上游引物（5 ' -GAT CCACTCCTGGGAAACAA-3 '）；下游引物 (5' -CAGACAGCGTGGCTAATTGA-3'）；NC 膜（Amersham 公司）；DHBV 質粒；缺 口翻譯藥盒； promega 公司。
[0051] 1. 3儀器PCR儀（BI0METRA);紫外分光光度計（BIOMETRA) ;ZF-25全自動凝膠成像 分析系統(tǒng)。
[0052] 2 方法
[0053] 2. 1采血剛孵化的1日齡雛鴨，適應性養(yǎng)3天后，經脛靜脈用1次性采血針采血約 0. 5mL，裝入1次性Eppendorf管中，整個過程注意不要交叉污染。在離心機中以7000rpm 離心4:15min后，取血清。鴨及血清均相應編號。
[0054] 2. 2常規(guī)PCR法篩選先天性感染的DHBV雛鴨PCR反應條件為：94°C 5min ;預變性 之后94°C變性30s，56°C退火45s，72 °C延伸45s，共35個循環(huán)；4°C保存。取PCR反應產物 6 μ 1，加入上樣緩沖液2 μ 1，充分混勻后加入到在1. 5%瓊脂糖凝膠（含終濃度0. 5 μ g/ml 溴乙錠）電泳槽齒孔中，80V恒壓電泳30分鐘，凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察并照相，參照陽性 血清和IOObp DNA Ladder Marker印跡檢測PCR結果，陽性血清在217bp附近可見明顯條 帶。PCR篩選450只鴨子篩選出101只D-HBV陽性鴨子，斑點雜交發(fā)現(xiàn)有12只為假陽性，陽 性率約為19. 8%。
[0055] 2. 3分組及給藥方法
[0056] 將篩選出的先天感染鴨隨機分為14組，每組平均約7只。紅背葉根4種不同提取 物：本發(fā)明提取物（HE)，石油醚提取物（PE)，乙酸乙酯提取物（EE)，正丁醇提取物（BE)均 分高（high)、中（middle)、低劑量（low)組（簡寫h，m，1)，共12組，陽性對照藥阿德福韋酯 (ADV)組，模型對照組，一共14組。紅背葉根4種提取物高、中、低劑量組則分別按12g *kg' 6g · kg'3g · kg4生藥量，ADV按15mg · kg 4與蒸餾水混合制成水溶液，每天一次性灌胃。 模型對照組以等體積生理鹽水灌胃。每周復測體重一次，調整藥量灌胃，共灌胃14d。
[0057] 2. 4鴨血清DHBV檢測
[0058] 每組動物分別于給藥前IcU給藥后7d、給藥后14d、停藥后5d自脛靜脈采血，離心。 收集血清。按缺口翻譯試劑盒操作說明書，用印標記作探針，將40 μ L血清點于硝酸纖維膜 上，進行斑點雜交，放射白顯影圖片斑點，在酶標儀上檢測OD值（濾光片為490nm)，以OD值 間接代表病毒載量。
[0059] 2. 5統(tǒng)計方法
[0060] 數(shù)據(jù)用均數(shù)土標準差（Mean土SD)表示。采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件進行處理分析。 重復測量數(shù)據(jù)采用一般線性模型（general linear model, GLM)的repeated measures和 multivariate過程進行重復測量方差分析和多元方差分析，并進行不同時間點和不同組 間的兩兩比較。P〈〇. 05定為差異有統(tǒng)計學意義。
[0061] 3 結果
[0062] 3. 1治療前后藥物對鴨血清DHBV DNA的影響
[0063] 結果見表1。表1顯示不同時間點DHBV DNA變化無顯著性差異；各組間DHBVDNA 卻存在顯著差異；時間與分組間存在交互效應（F = 6. 393, P = 0. 000)。病毒對照組血清 DHBV DNA水平穩(wěn)定。陽性對照藥阿德福韋酯（ADV)給藥7d，14d(T7，T14)可顯著抑制血清 DHBV DNA (P〈0.01)，停藥5d(P5)后DHBV DNA顯著回升。給藥的提取物中，石油醚提取物高 劑量組（PE-h)在治療14d后血清DHBV DNA有下降趨勢（P〈0. 01)，停藥5天后仍保持下降 趨勢（?〈0.05)。效果最好的是本發(fā)明提取物，3個劑量在7(1，14(1〇7，1'14)可顯著抑制血清 DHBVDNA (P〈0. 01)，停藥5d(P5)后DHBV DNA有所回升，但相對給藥前仍有顯著降低。說明 本發(fā)明提取物具有較理想的抗乙肝病毒作用，是較有前途的候選藥物。
[0064] 表1各組鴨血清DHBV DNA的變化比較（一7)
[0065]
【主權項】
1. 一種紅背葉根提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 紅背葉根藥材用6-12倍量乙醇提取1-2小時，提取1-3次，合并乙醇提取液，過濾 后減壓濃縮； (2) 將步驟（1)所得濃縮液離心，上清液減壓濃縮備用； (3) 將步驟（2)得到的濃縮液，以1. 3-1. 7柱體積/小時的流速，上大孔吸附樹脂柱； (4) 用去離子水洗脫除去雜質后，再用乙醇洗脫，洗脫流速為2. 3-2. 7柱體積/小時； (5) 收集乙醇洗脫液減壓干燥，粉碎后得到紅背葉根有效部位提取物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的紅背葉根提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中 乙醇濃度為60% -90%。
3. 根據(jù)權利要求2所述的紅背葉根提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中 乙醇濃度為70% -80%。
4. 根據(jù)權利要求1所述的紅背葉根提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟（4)中 乙醇濃度為20% -60%。
5. 根據(jù)權利要求4所述的紅背葉根提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟（4)中 乙醇濃度為30% -50%。
6. 根據(jù)權利要求1所述的紅背葉根提取物的制備方法，其特征在于：所述步驟（5)得 到的紅背葉根有效部位提取物是以生物堿類及黃酮類為主要活性成分的提取物。
7. 由權利要求1-6所述制備方法制得的紅背葉根提取物。
8. 權利要求7所述紅背葉根提取物在制備抗乙肝藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅背葉根提取物及制備方法和在制備治療乙肝藥物的應用，其包括醇提、離心濃縮、上大孔吸附樹脂柱、乙醇洗脫、減壓干燥，得到紅背葉根有效部位提取物。本發(fā)明的提取工藝簡便合理，得到的紅背葉根有效部位提取物在抗鴨乙肝病毒實驗中，3個劑量在7d,14d(T7,T14)可顯著抑制血清DHBV DNA(P<0.01)，停藥5d(P5)后DHBV DNA有所回升，但相對給藥前仍有顯著降低，說明具有較理想的抗乙肝病毒作用，是較有前途的候選藥物，可應用于制備抗乙肝藥物。
【IPC分類】A61K36-47, A61P31-20, A61P1-16
【公開號】CN104586925
【申請?zhí)枴緾N201510047509
【發(fā)明人】呂志平, 劉強
【申請人】南方醫(yī)科大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月29日