徐長(zhǎng)卿c21甾體提取物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及徐長(zhǎng)卿C21留體提取物及其制備方法，還涉及徐長(zhǎng)卿 C21留體提取物在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，它以細(xì)胞異常增殖和轉(zhuǎn)移為特 點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)資料表明，2000年全球新發(fā)惡性腫瘤病例約1000萬(wàn)，死亡620萬(wàn)， 患病2200萬(wàn)例；預(yù)計(jì)到2020年惡性腫瘤新發(fā)病例將達(dá)到1500萬(wàn)，死亡1000萬(wàn)，患病3000 萬(wàn)例?；熓菒盒阅[瘤綜合療法的方法之一，廣泛用于術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后，但腫瘤細(xì)胞多藥 耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重影響化療對(duì)惡性腫瘤的療效?？朔[瘤藥物的多藥耐藥，恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞 對(duì)藥物的敏感性，尋找高效低毒的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前腫瘤治療藥物的研宄方 向。
[0003] 腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和 作用機(jī)制完全不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是腫瘤難治愈的主要 原因之一，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，90%的癌癥化療失敗歸因于多藥耐藥。
[0004] 徐長(zhǎng)卿系蘿摩科Asclepiadaceae牛皮消屬植物徐長(zhǎng)卿 (Bge.)Kitag.的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為《中國(guó)藥典》2010年版所收載，味 辛，性溫，具有祛風(fēng)化濕，止痛止癢的功能，用于風(fēng)濕痹痛，胃痛脹滿，牙痛，腰痛，跌撲損傷， 蕁麻瘆，濕瘆?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床應(yīng)用主要集中在鎮(zhèn)痛和皮膚疾病等方面(張永清，等.中醫(yī)研 宄，2005,18 (11) :55-58.)，藥理研宄集中在其所含的化學(xué)成分丹皮酚上，研宄表明丹皮酚 具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗蛇毒、保護(hù)心血管和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用（曾粵. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012,31 (11):125-126.)。已有文獻(xiàn)報(bào)道從徐長(zhǎng)卿中分離鑒定C21甾體類 化合物，但目前未見(jiàn)高含量徐長(zhǎng)卿C21留體提取物的產(chǎn)品；未見(jiàn)有關(guān)徐長(zhǎng)卿C21留體在制備 腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，開(kāi)發(fā)利用迄今為止應(yīng)用尚 不廣泛的蘿摩科牛皮消屬植物徐長(zhǎng)卿謂(Bge. )Kitag.，尤其是其 C21甾體類成分。
[0006] 本案發(fā)明人通過(guò)對(duì)徐長(zhǎng)卿進(jìn)行細(xì)致深入的研宄，發(fā)明了高含量徐長(zhǎng)卿C21留體提 取物提取分離純化方法，制得的提取物經(jīng)藥理活性研宄證明具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作 用，因而完成了本發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明提供徐長(zhǎng)卿C21留體提取物及其制備方法和用途。
[0008]本發(fā)明的徐長(zhǎng)卿C21留體提取物從徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖中提取，其中C21留體重 量百分含量為50~95%，制備方法包括以下步驟： a)徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粗粉用第一溶劑回流提取，濾過(guò)，提取液合并，提取液減壓濃 縮； b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無(wú) 色，棄去洗脫液； c) 用第二溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液； d) 用第三溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液； e) 將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹(shù)脂柱D941色譜，用第四溶劑洗脫，收集洗脫液，減 壓濃縮、干燥得徐長(zhǎng)卿C21留體提取物； 在以上步驟中，其中步驟a)的第一溶劑為0~100%乙醇溶液，步驟b)大孔吸附樹(shù)脂包 括非極性或弱極性大孔吸附樹(shù)脂，步驟c)的第二溶劑為10~50%乙醇溶液，步驟d)的第三 溶劑為60~90%乙醇溶液，步驟e)的第四溶劑為90%乙醇溶液。
[0009] 本發(fā)明的徐長(zhǎng)卿C21留體提取物從徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖中提取，優(yōu)選的其中C21 甾體重量百分含量為70~95%，制備方法包括以下步驟： a) 徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粗粉加70~90%乙醇回流提取，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙 醇； b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱DlOl色譜，用水洗脫至洗脫液 近無(wú)色，棄去洗脫液； c) 用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液； d) 用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液； e) 將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹(shù)脂柱D941色譜，6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集 洗脫液，減壓濃縮、干燥得徐長(zhǎng)卿C21留體提取物。
[0010] 本發(fā)明提供徐長(zhǎng)卿C21甾體提取物的制備方法，該方法包括以下步驟： a) 徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粗粉用第一溶劑回流提取，濾過(guò)，提取液合并，提取液減壓濃 縮； b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，用水洗脫至洗脫液近無(wú) 色，棄去洗脫液； c) 用第二溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液； d) 用第三溶劑洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液； e) 將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹(shù)脂柱D941色譜，用第四溶劑洗脫，收集洗脫液，減 壓濃縮、干燥得徐長(zhǎng)卿C21留體提取物； 在以上步驟中，其中步驟a)的第一溶劑為0~100%乙醇溶液，步驟b)大孔吸附樹(shù)脂包 括非極性或弱極性大孔吸附樹(shù)脂，步驟c)的第二溶劑為10~50%乙醇溶液，步驟d)的第三 溶劑為60~90%乙醇溶液，步驟e)的第四溶劑為90%乙醇溶液。
[0011] 本發(fā)明提供徐長(zhǎng)卿C21甾體提取物的制備方法，優(yōu)選的該方法包括以下步驟： a) 徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粗粉加70~90%乙醇回流提取，濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙 醇； b) 將步驟a)獲得的提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱DlOl色譜，用水洗脫至洗脫液 近無(wú)色，棄去洗脫液； c) 用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液； d) 用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液； e)將步驟d)獲得的洗脫液，經(jīng)脫色樹(shù)脂柱D941色譜，6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集 洗脫液，減壓濃縮、干燥得徐長(zhǎng)卿C21留體提取物。
[0012] 本發(fā)明提供徐長(zhǎng)卿C21留體提取物在制備腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的用途。 [0013] 本發(fā)明的徐長(zhǎng)卿C21留體提取物通過(guò)下列研宄證明其具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐 藥作用，徐長(zhǎng)卿C21留體提取物通過(guò)下列方法得到的：徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖粉碎后，加90% 乙醇回流提取三次，每次用量為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的8倍體積量，每次提取時(shí)間為2 小時(shí)，分次濾過(guò)，提取液合并，減壓回收乙醇，所得提取物加水溶解，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱DlOl 色譜，填充大孔吸附樹(shù)脂DlOl體積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的0. 5倍體積，用水洗脫至 洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用30%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，用70%乙醇洗脫 至洗脫液近無(wú)色，收集洗脫液，經(jīng)已處理好的脫色樹(shù)脂D941柱色譜，填充脫色樹(shù)脂D941體 積為徐長(zhǎng)卿干燥根和根莖重量的〇. 5倍體積，用6倍柱體積90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減 壓濃縮，干燥，得徐長(zhǎng)卿C21留體提取物。
[0014] 構(gòu)建人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR，采用MTT法測(cè)定人胃癌多藥耐藥細(xì)胞 株對(duì)阿霉素、5-氟尿嘧啶和順鉑的耐藥倍數(shù)分別為276. 28倍、3. 63倍和1. 56倍；構(gòu)建人結(jié) 腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR，采用MTT法測(cè)定人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)阿霉素、順鉑 和5-氟尿嘧啶的耐藥倍數(shù)分別為273. 66倍、4. 05倍和2. 92倍；構(gòu)建人肺癌多藥耐藥細(xì)胞 株A549/T，采用MTT法測(cè)定人肺癌多藥耐藥株對(duì)紫杉醇、阿霉素和順鉑的耐藥倍數(shù)分別為 7. 16 倍、5. 30 倍和 2. 14 倍。
[0015] 徐長(zhǎng)卿C21留體提取物逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR對(duì)5-氟尿嘧 啶耐藥作用：?jiǎn)为?dú)5-氟尿嘧啶對(duì)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR半數(shù)抑制濃度為 29. 63±0. 83 #g/ml;5_氟尿嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取物50 #g/ml對(duì)人胃癌多藥耐 藥細(xì)胞株SGC7901/VCR半數(shù)抑制濃度為I. 67±1. 53 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為17. 86倍；5-氟尿 嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取物25 #g/ml對(duì)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR半數(shù)抑 制濃度為10. 33±3. 13 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2. 89倍。
[0016] 徐長(zhǎng)卿C21留體提取物逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR對(duì)阿霉素耐藥 作用：?jiǎn)为?dú)阿霉素對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為145. 04±9. 64 #g/ml;阿霉素聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/ VCR半數(shù)抑制濃度為I. 36±0. 16 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為106. 65倍；阿霉素聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21甾 體提取物25 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為10. 53 ± 1. 73 #g/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為13. 77倍。
[0017] 徐長(zhǎng)卿C21留體提取物逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR對(duì)5-氟尿嘧 啶耐藥作用：?jiǎn)为?dú)5-氟尿嘧啶對(duì)人結(jié)腸癌多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)抑制濃度為 31. 87±1. 49 #g/ml;5_氟尿嘧啶聯(lián)合徐長(zhǎng)卿C21留體提取物50 #g/ml對(duì)人結(jié)腸癌多藥 耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR半數(shù)