-50°C，逐漸有白色沉淀產(chǎn)生，放置 〇.5h，直至沉淀完全析出；過(guò)濾后，將沉淀以丙酮重結(jié)晶； ②N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸對(duì)-硝基苯酯（MA-GG-ONp)的合成 將5. 24g甘氨酰甘氨酸（0. 04mol)溶于4N的NaOH溶液，加入0. 04mol甲基丙烯酰氯 及10ml4N的NaOH溶液；室溫?cái)嚢?h，酸化至pH2,沉淀以50%乙醇/水重結(jié)晶得N-甲基 丙烯酰甘氨酰甘氨酸；取5g(0. 025mol)上述結(jié)晶后的N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸溶于 二甲基甲酰胺，加入5. 65gN，N-二環(huán)己基碳二胺（簡(jiǎn)稱DCC，0? 027mol)及3. 8g(0? 027mol) 對(duì)-硝基苯酚（簡(jiǎn)稱〇Np)，-KTC攪拌3h，室溫?cái)嚢?h，過(guò)濾除去沉淀，濾液濃縮至一定體 積，過(guò)濾除去沉淀，加入乙酸乙酯，沉淀以乙醇/乙醚（1 :1)重結(jié)晶； ③pHPMA的合成 以2, 2-偶氮二異丁腈(簡(jiǎn)稱AIBN)為引發(fā)劑，HPMA與適量的MA-GG-ONp通過(guò)自由基聚 合沉淀反應(yīng)制得一系列聚合物前體(聚合物單體：引發(fā)劑：溶劑=12. 5:3:84. 5wt%);將AIBN 與HPMA溶于丙酮，再與MA-GG-ONp的DMSO溶液混合；混合液置于安瓿中，通氮?dú)夂竺芊?，?50°C反應(yīng)24h;沉淀物溶于甲醇，并于乙醚再沉淀得到純品，真空干燥得蘭色固體粉末； 二、pHPMA-coated(pc) -Ad.mda-7.egfp接合物的合成及檢測(cè) 取pHPMA-ONp溶于25ill雙蒸水中形成終濃度為lOmg/ml溶液；加入含有Ad.mda-7.egfp(IOicVp)的10%甘油/PBS溶液100yl，4°C反應(yīng)12h形成最終的接合物；反應(yīng)完成后 取5ill產(chǎn)物，與無(wú)血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的A549細(xì)胞孵育，同時(shí)加入等量Ad.mda-7.egfp 及1640培養(yǎng)基作為對(duì)照，a后吸棄上清，PBS沖洗三次，加入含10%血清1640培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)IOh后，倒置熒光顯微鏡下488nm藍(lán)光激發(fā)，觀察照相； 三、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及檢測(cè) 取pHPMA-ONp溶于25ul雙蒸水中形成終濃度為lOmg/ml溶液；加入含有Ad.mda-7.egfp(101Qvp)的10%甘油/PBS溶液100iil，4°C反應(yīng)2h后加入終濃度為lOOng/ml的ACPPs， 于4°C繼續(xù)反應(yīng)IOh形成最終的接合物；反應(yīng)完成后取5ul產(chǎn)物，與無(wú)血清1640培養(yǎng)基培 養(yǎng)的A549細(xì)胞孵育，同時(shí)加入等量Ad.mda-7.egfp及1640培養(yǎng)基作為對(duì)照，2h后吸棄上 清，PBS沖洗三次，加入含10%血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)IOh后，倒置熒光顯微鏡下488nm 藍(lán)光激發(fā)，觀察照相； 四、 動(dòng)態(tài)光散射法（dynamic light scattering，DLS)測(cè)量腺病毒及其接合物的粒徑 合成pc-Ad. mda_7. egfp及ACPPs-pc-Ad. mda_7. egfp兩種接合物，合成方法如L2. 2 及1. 2. 3.;反應(yīng)完成后將兩種接合物用S400柱（27-5140-01GE Health care)進(jìn)行純化.取 純化后的兩種接合物樣品（l〇9vp)及Ad. mda-7. egfp (109vp)，加入終體積為1000 ii 1的雙 蒸水中，動(dòng)態(tài)光散射儀（ZetaSizer，Malvern，UK)于659nm波長(zhǎng)90度測(cè)試角度進(jìn)行粒徑測(cè) 試； 五、 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá) A549細(xì)胞以IO4/孔接種96孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)上樣，實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為 空白對(duì)照組Ad.mda-7.egfp、pc-Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp,三組腺病毒 上樣量為l〇4vp/細(xì)胞；48h后吸棄上清，PBS沖洗三次，以100illTritonX-100裂解細(xì)胞， 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（MultiskanGO,Thermo,FI)于波長(zhǎng)Xex488nmandXem538nm檢測(cè)綠色突光蛋 白表達(dá)，熒光量以相對(duì)熒光單位（RFU)計(jì)算； 六、 流式細(xì)胞儀檢測(cè)接合物感染能力 A549細(xì)胞以IO5/孔接種6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)上樣，實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為空 白對(duì)照組加入1〇〇U 1PBS，Ad. mda-7. egfp組、pc-Ad. mda-7. egfp組及ACPPs-pc-Ad. mda-7. egfp組,三組腺病毒用碘化丙啶（PI)進(jìn)行標(biāo)記15min,上樣量為104vp/細(xì)胞；12后吸棄 上清，PBS沖洗三次，胰酶消化后以1500g/分離心2min，用FACS Calibur?流氏細(xì)胞儀于 入ex540nm和入em625nm測(cè)量各組細(xì)胞內(nèi)PI熒光； 七、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp免疫逃逸能力檢測(cè)(抗腺病毒抗體中和實(shí)驗(yàn)）： A549細(xì)胞以IO4/孔接種96孔板，含人抗腺病毒抗體（Nab)血清以1 :20稀釋 于PBS液中，于56 °C滅活20min，取100y1上述稀釋血清分別與Ad.mda-7.egfp及 ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp孵育20min，加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋腺病毒） (108vp/100iil)，A549細(xì)胞以PBS液沖洗后，以Ad.mda-7.egfp感染無(wú)血清DMEM培養(yǎng)A549 細(xì)胞（IO4vp/細(xì)胞）為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分為抗腺病毒抗體組及無(wú)抗腺病毒抗體組，以IO4vp/ 細(xì)胞分別加入孵育前后的Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp,48h后吸棄上清， PBS沖洗三次，以100illTritonX-100裂解細(xì)胞，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（MultiskanGO,Thermo,FI) 于波長(zhǎng)Xex488nm與Xem538nm檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)，結(jié)果為實(shí)驗(yàn)組綠色熒光值與對(duì)照組 綠色熒光值之比； 八、ACPPs-pc-Ad. mda-7. egfp腫瘤革巴向性檢測(cè) HBE，A549,SW480, 0VCAR3四種細(xì)胞株以IO4/孔接種96孔板，分別以200iiL含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（A549，MDA-MB-231)和200iiL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基 (HBE,H印G2)培養(yǎng) 24h，以 104vp/ 細(xì)胞將ACPPs-pc-Ad.mda-7.Egfp感染四種細(xì)胞 48h， 吸棄上清，PBS沖洗三次，以100illTritonX-100裂解細(xì)胞，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan GO，Thermo，F(xiàn)I)于波長(zhǎng)Aex488nm與入em538nm檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)，熒光量以相對(duì)熒光 單位（RFU)計(jì)算； 九、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp接合物的穿膜活性檢測(cè) A549細(xì)胞以IO5/孔接種6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合時(shí)上樣，以染料PI對(duì)腺病毒進(jìn)行 標(biāo)記 15min，實(shí)驗(yàn)分為兩組，pc-Ad.mda-7.egfp組及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp組，上樣量為 IOVp/細(xì)胞；于37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后吸棄上清，以染料（5-〇r6-(N-Succinimidy loxycarbonyl)_3'，6' -〇, 0' -diace-tylfluorescein,CFSE)對(duì)細(xì)胞染色 15min，PBS沖洗 三次，加入200iiL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，NikonTI-S倒置熒光顯微鏡下觀察照 相； 十、ACPPs與pc-Ad.mda-7.egfp的細(xì)胞內(nèi)共定位檢測(cè) A549細(xì)胞以IO5/孔接種6孔板并生長(zhǎng)至50%融合，將用FITC標(biāo)記的ACPPs與pHPMA-ONp及PI標(biāo)記的Ad.mda-7.egfp進(jìn)行接合反應(yīng)，方法同1. 2. 3 ;反應(yīng)進(jìn)行12h后S400 柱純化樣品，以l〇4vp/ 細(xì)胞將ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp感染A549 細(xì)胞 4h，于NikonTI-S 倒置熒光顯微鏡下入ex488nm與入em538nm檢測(cè)FITC-ACPPs，入ex540nm和入em625nm檢測(cè) pc-Ad.mda-7.egfp(PI)，觀察照相； i--、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp穿膜活性的時(shí)間依賴性檢測(cè) A549細(xì)胞以IO5/孔接種6孔板并生長(zhǎng)至50%融合，ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp及pc-Ad.mda-7.egfp用PI標(biāo)記 15min，分別感染A549 細(xì)胞 20min、2h及 4h，PBS沖洗三次， 加入200iiL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，NikonTI-S倒置熒光顯微鏡下Xex540nm和 入em625nm觀察照相； 十二、Hoechst33342、PI雙染法檢測(cè)ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡 在6孔板中接種肺癌細(xì)胞株A549,生長(zhǎng)至40%滿后，分成3組，對(duì)照組1和對(duì)照組2 分別加入無(wú)血清 1640，pc-Ad.mda-7.egfp(104vp/cell)，實(shí)驗(yàn)組加入ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp(104vp/cell)處理，48小時(shí)后，反復(fù)PBS洗漆后加入終濃度5ug/ml的Hoechst33342, 避光染色10分鐘后加入終濃度為15ug/mlPI，避光染色10分鐘后，He〇Chst33342用氪激光 激發(fā)的紫外線熒光，PI用氬離子激光激發(fā)熒光，結(jié)果判斷：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，早 期凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，晚期凋亡細(xì)胞高藍(lán)光/紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種腫瘤靶向腺病毒高分子給藥系統(tǒng)，本系統(tǒng)（一）增強(qiáng)腫瘤靶向性。本發(fā)明采用靶向分子ACPPs與腫瘤過(guò)表達(dá)MMPs發(fā)生酶－底物反應(yīng)具有腫瘤靶向性。（二）降低了腺病毒給藥免疫清除效應(yīng)。本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)物ACPPs－pc-Ad.mda-7. egfp免疫清除少，故而循環(huán)半衰期長(zhǎng)，從而降低了腺病毒的給藥量，提高腺病毒的治療效果。（三）腺病毒定位于細(xì)胞胞漿，有利于治療基因的表達(dá)。本發(fā)明通過(guò)ACPPs的穿膜機(jī)理介導(dǎo)腺病毒跨越細(xì)胞膜屏障并定位于細(xì)胞胞漿，解決大分子藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)難及治療基因表達(dá)效率低下的問(wèn)題。（四）抗腫瘤譜廣。本發(fā)明給藥系統(tǒng)為黑色素瘤分化相關(guān)基因，能促進(jìn)多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡，在抗瘤抑瘤及降低毒副作用等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
【IPC分類】A61K48-00, G01N21-00, G01N15-14, C08F220-60, C12N15-861, G01N21-31, A61P35-00, C08F220-58
【公開(kāi)號(hào)】CN104758949
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410009224
【發(fā)明人】張雅潔, 李書華
【申請(qǐng)人】張雅潔, 李書華
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2014年1月8日