μ I加入96孔板中，再加入已裝載細(xì)胞懸液100 μ 1，振蕩混勻，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)2h內(nèi)的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為300和610nm，以不加藥處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果按空白組的100%計(jì)算。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0045](3)結(jié)果與分析
[0046]如圖3所示，相比對(duì)照組(不用NB和/或Cur處理)來(lái)說(shuō)，NB組的細(xì)胞內(nèi)ROS基本無(wú)明顯趨勢(shì)，Cur組的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，而相比Cur組而言，NB和Cur聯(lián)合處理組其ROS進(jìn)一步提高，并呈時(shí)間依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NB能顯著提高Cur誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
[0047]實(shí)施例2右旋龍腦聯(lián)合去甲氧基姜黃素對(duì)H印G2細(xì)胞的影響
[0048]—、體外細(xì)胞存活率檢測(cè)
[0049](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0050]所用的實(shí)驗(yàn)材料大體與實(shí)施例1步驟一相同，區(qū)別僅在于:本實(shí)例使用去甲氧基姜黃素(DCur，購(gòu)于Sigma公司)取代實(shí)施例1的姜黃素。
[0051](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0052]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的!fepG2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞密度，以1.8X104cells/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ I ;24h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同方式處理，對(duì)照組為不添加去甲氧基姜黃素和/或右旋龍腦處理，實(shí)驗(yàn)組如下:一組加入100 μ I濃度分別為20、40、80 μ M的去甲氧基姜黃素處理24h，一組加入100 μ I濃度分別為20、40、80 μ g/ml的NB處理24h，第三組先用50 μ I濃度分別為20、40、80 μ g/ml的NB處理12h后再加入50 μ I濃度分別為20、40、80 μ M的去甲氧基姜黃素繼續(xù)處理24h，24h后，每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ I，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后小心吸去孔內(nèi)的上清液。之后每孔加入150 μ I DMS0，震蕩10min，570nm測(cè)吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(0D實(shí)驗(yàn)-OD空自)/咖對(duì)照-OD空白)X 100%。每實(shí)驗(yàn)重復(fù)二次。
[0053](3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0054]如圖4所示，相比其他處理組，當(dāng)先加入20 μ g/mlNB處理12h再加40 μ M DCur處理24h之后對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性最大。當(dāng)去甲氧基姜黃素(DCur)濃度為40μΜ時(shí)，其細(xì)胞存活率為58.03 %，然而當(dāng)先加入20 μ g/mlNB處理12h再加40 μ M DCur處理24h之后，其細(xì)胞存活率從58.03%下降到38.69%，下降了 19.34%。表明，添加NB之后，能顯著提高去甲氧基姜黃素對(duì)H印G2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0055]二、流式細(xì)胞分析
[0056](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0057]PI 染料
[0058](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0059]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，計(jì)數(shù)，以2X 14個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中(37°C, 5% CO2)培養(yǎng)24h，接著分別加入100 μ 120 μ g/ml NBUOO μ I40 μ M Cur 和 50 μ I 20 μ g/ml ΝΒ+50 μ I 40 μ M Cur (NB 先處理 12h，再加入 Cur 處理 24h)處理24h，再抽去培養(yǎng)基，加入ImL PBS清洗細(xì)胞3遍除去細(xì)胞外的右旋龍腦和去甲氧基姜黃素，然后加入胰酶消化，1500rpm離心5min，收集細(xì)胞，加入_20°C預(yù)冷的70%乙醇lmL，混勻，4°C過(guò)夜固定，次日，1500rpm離心5min，去上清，用PBS洗2遍，加500 μ I PI染液，混勻后避光靜置20min后，過(guò)300目篩，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣品至少分析10000個(gè)細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0060](3)結(jié)果與分析
[0061 ] 如圖5所示，相比對(duì)照組(不用NB和/或DCur處理)而言，NB組內(nèi)并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞峰，其SubG-1僅為0.6%，且G2/M期細(xì)胞數(shù)目為12.2% ；DCur組處理后凋亡細(xì)胞峰為2.2 %，且G2/M期細(xì)胞數(shù)目為28.2 %，相比DCur組，NB+DCur組中的細(xì)胞凋亡峰并沒(méi)有顯著提高，僅為2.5%，而G2/M期細(xì)胞從28.2%提高到41.3%，表明加入NB后，能顯著提高DCur誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的G2/M期細(xì)胞阻滯，而SubGl峰的數(shù)目并沒(méi)有顯著增加，表明NB和DCur并不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制細(xì)胞增殖。
[0062]三、ROS活性檢測(cè)
[0063](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0064]DHE熒光探針
[0065](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0066]操作大體與實(shí)施例1步驟三相同，區(qū)別僅在于:本實(shí)例使用去甲氧基姜黃素取代實(shí)施例1的姜黃素。
[0067](3)結(jié)果與分析
[0068]如圖6所示，相比對(duì)照組(不用NB和/或DCur處理)來(lái)說(shuō)，NB組的細(xì)胞內(nèi)ROS基本無(wú)明顯趨勢(shì)，DCur組的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，而相比DCur組而言，NB和DCur聯(lián)合處理組其ROS進(jìn)一步提高，并呈時(shí)間依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NB能顯著提高DCur誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
[0069]實(shí)施例3右旋龍腦聯(lián)合雙去甲氧基姜黃素對(duì)H印G2細(xì)胞的影響
[0070]一、體外細(xì)胞存活率檢測(cè)
[0071](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0072]所用的實(shí)驗(yàn)材料大體與實(shí)施例1步驟一相同，區(qū)別僅在于:本實(shí)例使用雙去甲氧基姜黃素(BDCur，購(gòu)于Sigma公司)取代實(shí)施例1的姜黃素。
[0073](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0074]操作大體與實(shí)施例2步驟一相同，區(qū)別僅在于:本實(shí)例使用雙去甲氧基姜黃素取代實(shí)施例2的去甲氧基姜黃素。
[0075](3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0076]如圖7所示，當(dāng)先加入20 μ g/mlNB處理12h再加40 μ M BDCur處理24h之后對(duì)肝癌細(xì)胞毒性最大。當(dāng)雙去甲氧基姜黃素(BDCur)濃度為40 μM時(shí)，其細(xì)胞存活率為78.98%,然而當(dāng)先加入20 μ g/ml NB處理12h再加40 μ M BDCur處理24h之后，其細(xì)胞存活率從78.98%下降到55.41 %，下降了 23.57%。表明，添加NB之后，能顯著提高雙去甲氧基姜黃素對(duì)H印G2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0077]二、流式細(xì)胞分析
[0078](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0079]PI 染料
[0080](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0081]操作大體與實(shí)施例2步驟二相同，區(qū)別僅在于:本實(shí)例使用雙去甲氧基姜黃素取代實(shí)施例2的去甲氧基姜黃素。
[0082](3)結(jié)果與分析
[0083]如圖8所示，相比對(duì)照組而言，NB組內(nèi)并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞峰，其SubG-1僅為0.6%，且G2/M期細(xì)胞數(shù)目為12% ;BDCur組處理后凋亡細(xì)胞峰為2.3%，且G2/M期細(xì)胞數(shù)目為17.5%，相比BDCur組，NB+BDCur組中的細(xì)胞凋亡峰并沒(méi)有顯著提高，僅為1.5%，而G2/M期細(xì)胞從17.5%提高到29.5%，表明加入NB后，能顯著提高BDCur誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的G2/M期細(xì)胞阻滯，而SubGl峰的數(shù)目并沒(méi)有顯著增加，表明NB和BDCur并不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制細(xì)胞增殖。
[0084]三、ROS活性檢測(cè)
[0085](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0086]DHE熒光探針
[0087](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0088]操作大體與實(shí)施例1步驟三相同，區(qū)別僅在于:本實(shí)例使用雙去甲氧基姜黃素取代實(shí)施例1的姜黃素。
[0089](3)結(jié)果與分析
[0090]如圖所9示，相比對(duì)照組來(lái)說(shuō)，NB組的細(xì)胞內(nèi)ROS基本無(wú)明顯趨勢(shì)，BDCur組的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，而相比BDCur組而言，NB和BDCur聯(lián)合處理組其ROS進(jìn)一步提高，并呈時(shí)間依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NB能顯著提高BDCur誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
[0091]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于治療肝癌的藥物，其特征在于:由活性組分組成或是由活性成分和載體組成；其中，活性成分為姜黃素類化合物與右旋龍腦。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于治療肝癌的藥物，其特征在于:所述的姜黃素類化合物為姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素中的至少一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于治療肝癌的藥物，其特征在于:所述的右旋龍腦和所述的姜黃素類化合物按質(zhì)量摩爾比2?8 μ g:2?Snmol配比。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于治療肝癌的藥物，其特征在于: 所述的姜黃素類化合物為姜黃素時(shí)，所述的右旋龍腦和所述的姜黃素類化合物按質(zhì)量摩爾比I yg:lnmol配比； 所述的姜黃素類化合物為去甲氧基姜黃素時(shí)，所述的右旋龍腦和所述的姜黃素類化合物按質(zhì)量摩爾比I μ g:2nmol配比； 所述的姜黃素類化合物為雙去甲氧基姜黃素時(shí)，所述的右旋龍腦和所述的姜黃素類化合物按質(zhì)量摩爾比I μ g:2nmol配比。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于治療肝癌的藥物，其特征在于:所述的載體是用于將所述的用于治療肝癌的藥物制備成不同劑型的藥物輔料。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于治療肝癌的藥物，其特征在于:所述的用于治療肝癌的藥物的劑型包括緩釋片劑、顆粒劑和凝膠劑。7.權(quán)利要求1?6任一項(xiàng)所述的用于治療肝癌的藥物的制備方法，其特征在于包括如下步驟:按劑型不同，將右旋龍腦、姜黃素類化合物與載體混合，按不同劑型的制備方法制備得到；對(duì)于劑型為緩釋片劑時(shí)，制備原則是先釋放右旋龍腦，再釋放姜黃素類化合物，更為有利于姜黃素類化合物的吸收和利用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于治療肝癌的藥物及其制備方法。該藥物由活性組分組成或是由活性成分和載體組成；其中，活性成分為姜黃素類化合物與右旋龍腦。該藥物按劑型不同，將右旋龍腦、姜黃素類化合物與載體混合，按不同劑型的制備方法制備得到；對(duì)于劑型為緩釋片劑時(shí)，制備原則是先釋放右旋龍腦，再釋放姜黃素類化合物，更為有利于姜黃素類化合物的吸收和利用。該藥物作用肝癌細(xì)胞HepG2后能有效的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M細(xì)胞周期阻滯導(dǎo)致細(xì)胞凋亡以及通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明提供的藥物能有效的治療肝癌，且右旋龍腦和姜黃素聯(lián)合用藥對(duì)人體正常細(xì)胞毒性低，基本無(wú)明顯影響。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/12, A61K9/22, A61K31/045
【公開(kāi)號(hào)】CN105030743
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510510659
【發(fā)明人】蘇健裕, 陳建平, 李琳, 覃業(yè)霞
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年8月19日