爾馬林1小 時(shí)以上、以60 %乙醇1小時(shí)、70 %乙醇1小時(shí)、80 %乙醇1小時(shí)、95 %乙醇1小時(shí)、100 %乙 醇1小時(shí)浸漬3次、二甲苯1小時(shí)浸漬2次、石蠟（保溫在65°C ) 1小時(shí)浸漬3次，其后用 包埋盒制作組織塊。用切片機(jī)將組織塊切成厚度20~50nm，作為組織切片。將切片粘貼 到載玻片進(jìn)行脫石蠟處理。脫石蠟處理在載有完全干燥的組織切片的載玻片上用二甲苯 清洗5分鐘浸漬3次、100 %乙醇1分鐘浸漬2次、95 %乙醇稍微清洗，依次用80%、70%、 60%乙醇、自來水進(jìn)行同樣地稍微清洗，浸漬于離子交換水中，接著進(jìn)行馬松三色（Masson Trichrome)染色。浸漬于媒染劑（10%三氯乙酸水溶液、10%重鉻酸鉀水溶液）10~15分 鐘，用自來水清洗5分鐘、浸漬于鐵礬蘇木精液（2g蘇木精100%乙醇100mL溶液、0. 5g硝 酸鐵（III) *9H20、25%鹽酸100mL溶液）5分鐘，進(jìn)行輕輕地水洗。用1 %鹽酸70%乙醇溶 液進(jìn)行分類。水洗10分鐘進(jìn)行漂白，浸漬于離子交換水中，浸漬于I液（1%比布列希猩紅 90ml、1 %酸性品紅10ml、醋酸Iml) 2~5分鐘，進(jìn)行輕輕地水洗。浸漬于II液（5g磷鉬酸、 5g磷鎢酸蒸餾水200ml) 30分鐘以上，進(jìn)行輕輕地水洗，浸漬于III液（2. 5g苯胺藍(lán)、2ml醋 酸、蒸餾水100ml) 5分鐘，進(jìn)行輕輕地水洗。浸漬于1 %醋酸水5分鐘，進(jìn)行快速水洗。用 60%、70 %、80%、95%乙醇進(jìn)行稍微清洗，100%乙醇5分鐘浸漬3次。二甲苯5分鐘浸漬 3次，使用封入液通過蓋玻片覆蓋組織。使載玻片干燥后通過顯微鏡觀察。另外，同樣的組 織切片也進(jìn)行了蘇木精?曙紅染色。脫石蠟處理后，用自來水進(jìn)行流水清洗3~5分鐘，浸 漬于邁耶（Mayer)氏蘇木精液中5分鐘。用25~37°C的流水清洗3~5分鐘，浸漬于曙 紅液中5分鐘。用60%、70%、80%、95%乙醇進(jìn)行稍微清洗，100%乙醇5分鐘浸漬3次。 二甲苯5分鐘浸漬3次，使用封入液通過蓋玻片覆蓋組織。使載玻片干燥后通過顯微鏡觀 察。在任意染色方法中，含乳鐵蛋白飼養(yǎng)飼料組的腎臟與不含乳鐵蛋白的飼料組相比，組織 的間質(zhì)纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤（upper)、半月體形成（lower)均比非給藥組輕微[圖4-C]。
[0174] [實(shí)施例5]通過局部施瓦茨曼反應(yīng)（Local Shwartzman Reaction (LSR))模型的 乳鐵蛋白的治療效果（非自身免疫疾病模型）
[0175] I. LSR樽銦1的制作和評價(jià)1
[0176] 使6周齡的C57BL/6j習(xí)慣2周，從8周齡開始給予含乳鐵蛋白飼料或?qū)φ诊暳? 周。在第10周齡時(shí)將源自大腸桿菌的脂多糖（LPS;Sigma)以mg/ml的方式溶解于PBS(-) 中，對每一只小鼠進(jìn)行30G針皮下注射IOOyg，作為第1天。將小鼠重組體TNF-a (R&D Systems，Inc.產(chǎn)品編號410-MT)以成為lOOμg/ml的方式溶解于PBS(-)中，對每一只小 鼠在同一部位進(jìn)行皮下注射〇.3iig，作為第2天。在第3天，肉眼評價(jià)同一部位的出血。含 乳鐵蛋白飼料組與對照組相比顯著地抑制了皮下出血的范圍。皮下出血的重癥度從出血范 圍和壞死發(fā)現(xiàn)來看，以肉眼分類為0,無；1，輕癥；2,中等癥狀；3,重癥；4,中心壞死，進(jìn)行點(diǎn) 數(shù)化[表2]，與對照組相比，含乳鐵蛋白飼料組中重癥度顯著降低（p〈0. 0001)[圖5-A、B]。
[0177] 表2對含乳鐵蛋白飼料組(n = 16)與不含有飼料組（n = 15)的皮下出血進(jìn)行肉 眼觀察的評價(jià)分?jǐn)?shù)
[0178]
[0179] 2.組織評價(jià)方法
[0180] 將[實(shí)施例5]的"1. LSR模型1的制作和評價(jià)"中制作的小鼠通過頸椎脫臼 而使其安樂死，采取皮膚待測樣品制作40 %蠟塊，制作組織切片，進(jìn)行馬松三色（Masson Trichrome)染色，對皮下出血進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。浸漬于10%福爾馬林液24小時(shí)以上使其 固定。用自來水清洗福爾馬林1小時(shí)以上，以60%乙醇1小時(shí)、70%乙醇1小時(shí)、80%乙 醇1小時(shí)、95%乙醇1小時(shí)、100%乙醇1小時(shí)浸漬3次、二甲苯1小時(shí)浸漬2次、石蠟（在 65°C保溫）1小時(shí)浸漬3次，之后用包埋盒制作組織塊。使用切片機(jī)將組織塊切成厚度20~ 50nm，作為組織切片。將切片粘貼到載玻片進(jìn)行脫石蠟處理。脫石蠟處理在載有完全干燥 的組織切片的載玻片上用二甲苯清洗5分鐘浸漬3次、100%乙醇1分鐘浸漬2次、95 %乙 醇稍微清洗，依次用80 %、70 %、60 %乙醇、自來水進(jìn)行同樣地稍微清洗，浸漬于離子交換水 中，接著進(jìn)行馬松三色（Masson Trichrome)染色。浸漬于媒染劑（10 %三氯乙酸水溶液、 10 %重鉻酸鉀水溶液）10~15分鐘，用自來水清洗5分鐘、浸漬于鐵礬蘇木精液（2g蘇木 精100%乙醇100mL溶液、0. 5g硝酸鐵（III) ? 9H20、25 %鹽酸100mL溶液）5分鐘，進(jìn)行輕 輕地水洗。用1%鹽酸70%乙醇溶液進(jìn)行分類。水洗10分鐘進(jìn)行漂白，浸漬于離子交換水 中，浸漬于I液（1%比布列希猩紅90ml、1 %酸性品紅10ml、醋酸Iml) 2~5分鐘，進(jìn)行輕輕 地水洗。浸漬于II液（5g磷鉬酸、5g磷鎢酸蒸餾水200ml) 30分鐘以上，進(jìn)行輕輕地水洗， 浸漬于III液（2. 5g苯胺藍(lán)、2ml醋酸、蒸餾水100ml) 5分鐘，進(jìn)行輕輕地水洗。浸漬于1% 醋酸水5分鐘，進(jìn)行快速水洗。用60 %、70 %、80 %、95 %乙醇進(jìn)行稍微清洗，100 %乙醇5分 鐘浸漬3次。二甲苯5分鐘浸漬3次，使用封入液通過蓋玻片覆蓋組織。使載玻片干燥后 通過顯微鏡觀察。另外，同樣的組織切片也進(jìn)行了蘇木精?曙紅染色。脫石蠟處理后，用自 來水進(jìn)行流水清洗3~5分鐘，浸漬于邁耶氏（Mayer)蘇木精液中5分鐘。用25~37 °C 的流水清洗3~5分鐘，浸漬于曙紅液中5分鐘。用60 %、70 %、80 %、95 %乙醇進(jìn)行稍微 清洗，100%乙醇5分鐘浸漬3次。二甲苯5分鐘浸漬3次，使用封入液用蓋玻片覆蓋組織。 使載玻片干燥后通過顯微鏡觀察。
[0181] 在任意染色方法中，最后使用僅被同樣的組織切片顆粒球中的酯酶染色的特異性 酯酶染色法（氯醋酸酯酶）。脫石蠟處理后，用自來水進(jìn)行流水清洗3~5分鐘，用蒸餾水 清洗3次。在室溫下使組織干燥10~30分鐘，在室溫下浸漬于氯醋酸酯酶反應(yīng)液15~ 30分鐘。用自來水進(jìn)行流水清洗3~5分鐘，浸漬于邁耶（Mayer)氏蘇木精液5分鐘。用 25~37°C的流水清洗3~5分鐘，浸漬于曙紅液中5分鐘。用60 %、70 %、80 %、95 %乙醇 進(jìn)行稍微清洗，100%乙醇5分鐘浸漬3次。二甲苯5分鐘浸漬3次，使用封入液通過蓋玻 片覆蓋組織。使載玻片干燥后通過顯微鏡觀察。觀察到在不含乳鐵蛋白的飼料組中肌層上 部的皮下出血發(fā)現(xiàn)和血管內(nèi)的血栓形成明顯，而在含乳鐵蛋白飼料組中這些發(fā)現(xiàn)為輕度， 皮下組織中的中性粒細(xì)胞浸潤在含乳鐵蛋白飼養(yǎng)飼料組中得到了抑制[圖5-C]。
[0182] 3. LSR樽銦2的制作和評價(jià)2
[0183] 在背部皮下制作氣囊引起LSR，進(jìn)行了氣囊內(nèi)的DNA濃度測定和中性粒細(xì)胞的觀 察。首先在背部皮下以5ml用的注射器用30G針強(qiáng)勁地向皮下注射5ml的空氣，3天后每 只將IOOygLPS注入至氣囊內(nèi)。在其24小時(shí)后將0.3yg的TNF-a注入氣囊內(nèi)，進(jìn)而在 6小時(shí)后用2ml的滅菌PBS(-)清洗，回收。
[0184] 4.氣囊（清洗液）內(nèi)DNA濃度測宙
[0185] 將采集的清洗液移至1.5ml微小離心管，在室溫下以6000g離心5分鐘，使用 Picogreen dsDNA assay reagent測定上清中的DNA濃度，測定方法根據(jù)附帶的操作規(guī)程進(jìn) 行。含乳鐵蛋白飼料組與不含乳鐵蛋白的飼料組相比血中DNA量低，顯著地抑制了由NETs 所產(chǎn)生的DNA的放出（p = 0. 0015)[圖6-A]。
[0186] 5.中件粒細(xì)朐NETs形成觀察
[0187] 使用細(xì)胞離心涂片機(jī)2 (Cytospin2) (Shandon)將清洗液中的中性粒細(xì)胞固定在 載玻片上，用5 y M的DRAQ5進(jìn)行染色，通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。與對照組相比，在含乳鐵 蛋白飼料組中發(fā)現(xiàn)NETs形成的中性粒細(xì)胞減少[圖6-B]。
[0188] [實(shí)施例6]對于通過乳鐵蛋白尾靜脈給與的組蛋白血栓（彌散性血管內(nèi)凝血 (DIC))模型小鼠的存活率?存活延長的改善效果
[0189] 將溶解于生理鹽水、保溫在37°C的組蛋白（sigma，H9250)80mg/kg對11周齡 的雄C57BL/6小鼠進(jìn)行尾靜脈內(nèi)給與來制作DIC模型小鼠（Tobias A. et al.，blood， 29S印tember 2011，vol.ll8，no.l3，p.3708-3714)。作為預(yù)處理，將牛乳鐵蛋白（n = 8)以 20mg/kg進(jìn)行尾靜脈內(nèi)給與，在給與30分鐘后進(jìn)行組蛋白的尾靜脈內(nèi)給與，作為乳鐵蛋白 治療組。作為未治療對照組，在組蛋白給藥30分鐘之前將不含牛乳鐵蛋白的生理鹽水（n = 8) 100 y 1進(jìn)行尾靜脈內(nèi)給與。組蛋白給與后的存活率?存活延長的評價(jià)使用Kaplan-Meier 法進(jìn)行評價(jià)。關(guān)于未治療對象組，組蛋白給與的約20分鐘后開始逐漸開始死亡，2天后為2 只、4天后為1只，但牛乳鐵蛋白給與組即使經(jīng)過4天，8只都全部存活，可以明顯看出存活 率和存活延長的效果（圖7 :在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異p = 0. 0005)。
[0190] [實(shí)施例7]對于通過乳鐵蛋白尾靜脈給與的組蛋白血栓模型小鼠的止血效果（出 血時(shí)間）
[0191] 作為對于11周齡的雄C57BL/6小鼠的預(yù)處理，將牛乳鐵蛋白（n = 5)20mg/kg進(jìn) 行尾靜脈內(nèi)給與，在給與30分后，將溶解于生理鹽水、保溫在37°C的組蛋白（sigma，H9250) 以60mg/kg通過尾靜脈內(nèi)給與來檢查DIC模型小鼠的止血效果（Tobias A，et al.，Blood， 2011 ;118 :p. 3708-3714)(采用用于存活率?存活延長的組蛋白的75%量）。作為未治療 對照組，在組蛋白給與30分鐘之前，將不含牛乳鐵蛋白的生理鹽水（n = 5) 100 y 1進(jìn)行尾 靜脈內(nèi)給與。作為正常對照組（n = 5)替代牛乳鐵蛋白的預(yù)處理和組蛋白處理，分別使用 生理鹽水。在組蛋白給與20分鐘后將尾靜脈從末端以3mm切斷并浸漬于37°C的生理鹽水 中，每30秒鐘用濾紙擦拭血液測定出血時(shí)間（出血時(shí)間在用15分鐘以上的情況，在15分 鐘時(shí)進(jìn)行止血處理）（Fuchs TA，et al.，Blood，2011 ;118 :3708-3714)。在未治療對照組 中發(fā)現(xiàn)了顯著的出血時(shí)間延長（圖8 :未治療對照組與正常對照組的差異：P〈0. 0001)，但 牛乳鐵蛋白給與組的出血時(shí)間明顯縮短（圖8 :牛乳鐵蛋白給與組與未治療對照組的差異： P〈0. 0001) 〇
[0192] [實(shí)施例8]對于組蛋白血栓模型的乳鐵蛋白的肺組織出血抑制效果
[0193] 作為對11周齡的雄C57BL/6小鼠的預(yù)處理，將牛乳鐵蛋白（n = 4) 20mg/kg進(jìn)行尾 靜脈內(nèi)給與，在給與30分鐘后，將溶解于生理鹽水、保溫在37°C的組蛋白（sigma，H9250)以 80mg/kg通過尾靜脈內(nèi)給與來制作DIC模型小鼠（Tobias A.，et al.，Blood，29September 2011，；vol. 118 :no. 13, p. 3708-3714)。作為未治療對照組，在組蛋白給與30分鐘之前，將 不含牛乳鐵蛋白的生理鹽水（n = 4) 100 y 1進(jìn)行尾靜脈內(nèi)給與。作為正常對照組（n = 4)， 替代牛乳鐵蛋白的預(yù)處理和組蛋白處理，分別使用生理鹽水。在組蛋白（第2次的生理鹽 水）給與10分鐘后使小鼠安樂死，摘除肺組織，使用4%多聚甲醛固定肺組織。與未治療對 照組相比，牛乳鐵蛋白給與組幾乎未看到組織出血，肺組織為與對照組相同的色彩（圖9)。 未治療對照組的肺組織色的紅色增加，看到組織出血（圖9)。
[0194][實(shí)施例9]NETs形成抑制對乳鐵蛋白的特異性的活性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)
[0195] 報(bào)道稱乳鐵蛋白由于其N末端部分帶了正電，所以可與帶有負(fù)電荷的DNA分子結(jié) 合（He J,and Furmanski P. Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA. Nature. 1995 ;373(6516) :721_4.)。因此，對于通過 具有與乳鐵蛋白相近的分子量（Mff)和等電點(diǎn)（pi)的其他種類的蛋白質(zhì)是否可抑制NETs 形成進(jìn)行了研究實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用了以下蛋白質(zhì)。
[0196]表 3
[0197]
[0198] 血管生成素已知作為腫瘤血管成長因子（Strydom DJ，F(xiàn)ett JW，Lobb RR， Alderman EM, Bethune JL，Riordan JF，and Vallee BL. Amino acid sequence of human tumor de