一種蝙蝠蛾擬青霉中性胞外多糖的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖的新用途，具體設(shè)及一種騙幅蛾擬青 霉中性胞外多糖的改善腸道菌群和微環(huán)境中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 騙幅蛾擬青霉（Paecilomyceshepiali)是天然冬蟲夏草分化成熟后期的一種重 要內(nèi)生真菌，其中化學組成分析表明騙幅蛾擬青霉的化學組成與天然冬蟲夏草更為接近， 含有蟲草素、甘露醇、蟲草多糖、生物堿類等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗福 射、調(diào)節(jié)機體免疫能力等多種生物功能?，F(xiàn)階段，采用人工蟲草內(nèi)生真菌進行液體發(fā)酵已成 為人工蟲草制品的重要來源。其中，我們研究發(fā)現(xiàn)在用該菌株進行液體培養(yǎng)時，其菌絲體能 將大量的多糖類聚合物即胞外多糖分泌到發(fā)酵液中。多項研究顯示，食藥用菌胞外多糖具 有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能。
[0003] 近年來，越來越多的研究表明大量未被胃腸道直接吸收的膳食營養(yǎng)物質(zhì)可W被腸 道微生物代謝，并引起菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物的改變進而影響機體健康。人體腸道內(nèi)棲居 著大量的微生物，數(shù)量可達10"，種類可在500種W上，編碼了約100萬基因，且大多為人體 不具有功能基因。腸道微生物廣泛參與了多種膳食成分的代謝，大量研究表明腸道微生物 構(gòu)成與機體病原菌防御、免疫功能和多種代謝性疾病都有重要聯(lián)系。而膳食中不易消化的 多糖如纖維素、菊粉糖、抗性淀粉和其它非淀粉多糖等進入大腸后會被其中數(shù)量和種類眾 多的腸道微生物所代謝，從而引起腸道微生態(tài)環(huán)境改變。但相較于功能性低聚糖，多糖類的 腸道調(diào)節(jié)功能研究還較少。
[0004] 研究表明，具有特定結(jié)構(gòu)的多糖可W被大腸內(nèi)的細菌代謝并能引起腸道菌群結(jié)構(gòu) 的改變，同時可產(chǎn)生對腸道和機體健康有益作用的短鏈脂肪酸。如Ibr址im和Anishetty 通過對厚壁菌口、擬桿菌口和放線菌口基因組數(shù)據(jù)庫所編碼的多糖類代謝相關(guān)酶基因的分 析表明腸道微生物可W建立起碳水化合物宏代謝組網(wǎng)絡(luò)（meta-met油olomenetwork)作為 機體代謝的延伸?；炔捎皿w外發(fā)酵模型研究了云芝糖膚任S巧對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及 對體系中短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明PSP可W顯著提高發(fā)酵體系中雙歧桿菌、乳酸 菌的比例，降低梭狀菌、葡萄球菌、腸球菌比例，但對大腸桿菌沒有顯著影響，同時短鏈脂肪 酸的測定表明PSP可W增加乙酸、丙酸、下酸等短鏈脂肪酸和乳酸的產(chǎn)量。而關(guān)于騙幅蛾擬 青霉胞外多糖在該方面的活性還未見報道，為此，本研究深入研究了該菌所產(chǎn)生的胞外多 糖對腸道微生物和腸道微環(huán)境的影響，研究結(jié)果可W為該多糖作為益生元產(chǎn)品開發(fā)提供理 論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明目的在于公開一種騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖在改善腸道菌群組成和微 環(huán)境W及在保健品和功能性食品中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖在提高人體腸道益生菌增殖效率和短 鏈脂肪酸產(chǎn)量中的作用w及在保健品和功能性食品中的應(yīng)用。
[0007] 所述的騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖是通過下述方法制備的：
[0008] (1)從保存于±豆斜面培養(yǎng)基的騙幅蛾擬青霉（Paecilomyceshepiali)HNl菌株 的母種中挖取大小約為0. 5cmX0. 5cm菌絲體塊，接種于裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的容量為 250mL的=角瓶中，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，120巧m下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時，即可獲 得種子液。種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30.OOg/l，酵母膏6.OOg/l，憐酸二氨鐘1. 50g/l，硫 酸儀 0. 50g/l，麥芽汁 10.OOg/l，±豆汁 10.OOg/L，抑 6. 5 ;
[0009] 似取步驟（1)中的種子液接種于裝有200血發(fā)酵培養(yǎng)基的容量為500血的^角 瓶中，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%接入種子液，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，然后在12化pm 下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120小時后，將發(fā)酵產(chǎn)物于4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離屯、15分鐘后，收集上 清液即為騙幅蛾擬青霉（Paecilomyceshepiali)HNl菌株發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：薦 糖50g/l，酵母膏1. 50g/l，硫酸錠5.OOg/l，憐酸二氨鐘1. 50g/l，硫酸儀0. 05g/l，±豆汁 15.OOg/l，麥芽汁 15.OOg/L，pH6. 5 ;
[0010] (3)將步驟（2)中獲得的騙幅蛾擬青霉（PaecilomyceshepialUHNl菌株發(fā)酵液， 50°C減壓濃縮至原體積的1/2,加3倍體積的無水乙醇，沉淀12小時，用80%乙醇洗涂3次 后，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離屯、15min收集沉淀即可獲得胞外粗多糖；
[0011] (4)將步驟（3)制得的胞外粗多糖通風揮去乙醇，加少量去離子水復(fù)溶后，用氯仿 和正下醇體積比為4 : 1的混合溶液脫蛋白3次后，將水相溶液冷凍干燥獲得粗多糖冷凍 干粉；
[0012] (5)將步驟（4)所得粗多糖溶解后，上樣于DEAE-52纖維素柱，并用去離子水進行 洗脫，收集洗脫液進行減壓濃縮，去離子水透析72小時，濃縮后冷凍干燥，即得到中性胞外 多糖組分。制備的中性胞外多糖組分為灰白色粉末，其中多糖含量94. 36%，蛋白質(zhì)含量 4. 58%，分子量為1. 78X105,單糖組成為甘露糖：核糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉 伯糖=53.62 : 3.20 : 3.51 : 13. 10 : 14. 17 : 2. 24。
[0013] 下面對本發(fā)明做進一步的解釋和說明：
[0014] 人糞樣體外厭氧混合培養(yǎng)實驗
[0015] 通過使用健康人群的糞樣收集年齡為25-30歲之間的身體健康受試者新鮮全便 加入適量0.Imol/LpH7. 2的PBS緩沖液中，然后置于厭氧培養(yǎng)箱中用縱滿混合器混合均 勻作為厭氧發(fā)酵多糖的原始菌樣備用。
[0016]接種及中性胞外多糖的體外厭氧混合培養(yǎng)：分別設(shè)置空白組、陽性對照組和樣品 組，空白組只加入含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，陽性對照組和樣品組除加入含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，分別加 入終濃度為Img/血的經(jīng)滅菌處理的低聚果糖（K)巧和騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖組分，每 組設(shè)3個平行。然后在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)分別按體積比1 : 9接種步驟（1)所配制的人糞便混 合液，混勻后置于37°C厭氧培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、4化時分別取500yL發(fā) 酵液進行分析，其中150yL用于SCFA的分析，100yL用于細胞FI甜計數(shù)，250yL用于測 定多糖變化。采用高效液相色譜0PLC)法測定厭氧發(fā)酵體系中不同時間的短鏈脂肪酸含 量。
【附圖說明】
[0017] 圖1騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖在體外厭氧發(fā)酵體系中代謝變化
[0018] 圖2騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖對發(fā)酵體系中甲酸產(chǎn)量的影響
[0019] 圖3騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖對發(fā)酵體系中乙酸產(chǎn)量的影響
[0020] 圖4騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖對發(fā)酵體系中丙酸產(chǎn)量的影響
[0021] 圖5騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖對發(fā)酵體系中下酸產(chǎn)量的影響 陽022] 圖6騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖對發(fā)酵體系中乳酸產(chǎn)量的影響
[0023] 圖7騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖對發(fā)酵體系中總酸產(chǎn)量的影響
【具體實施方式】
[0024] 下面通過實施例，對本發(fā)明作進一步描述。 陽02引實施例1 : 陽0%] 騙幅蛾擬青霉中性胞外多糖的制備：
[0027] (1)從保存于±豆斜面培養(yǎng)基的騙幅蛾擬青霉（Paecilomyceshepiali)HNl菌株 的母種中挖取大小約為0. 5cmX0. 5cm菌絲體塊，接種于裝有l(wèi)OOmL種子培養(yǎng)基的容量為 250mL的=角瓶中，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，120巧m下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時，即可獲 得種子液。種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30.OOg/l，酵母膏6.OOg/l，憐酸二氨鐘1. 50g/l，硫 酸儀 0. 50g/l，麥芽汁 10.OOg/l，±豆汁 10.OOg/L，抑 6. 5; 陽02引 似取步驟（1)中的種子液接種于裝有200血發(fā)酵培養(yǎng)基的容量為500血的^角 瓶中，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%接入種子液，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，然后在12化pm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)120小時后，將發(fā)酵產(chǎn)物于4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離屯、15分鐘后，收集上清 液即為騙幅蛾擬青霉（Paecilomyceshepiali)HNl菌株發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：薦 糖50g/l，酵母膏1. 50g/l，硫酸錠5.OOg/l，憐酸二氨鐘1. 50g/l，硫酸儀0. 05g/l，±豆汁 15.OOg/l，麥芽汁 15.OOg/L，pH6. 5 ;
[0029] 做將步驟似中獲得的騙幅蛾擬青霉（Paecilomycesh巧iali)HNl菌株發(fā)酵液， 50°C減壓濃縮至原體積的1/2,加3倍體積的無水乙醇，沉淀12小時，用80%乙醇洗涂3次 后，在4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離屯、15min收集沉淀即可獲得胞外粗多糖；
[0030] (4)將步驟做制得的胞外粗多糖通風揮去乙醇，加少量去離子水復(fù)溶后，用氯仿 和正下醇體