泥螺多肽在抗前列腺癌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及泥螺酶解多肽的應(yīng)用,具體涉及泥螺多肽在抗前列腺癌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 泥螺(Bullactaexarata),俗稱"吐鐵"、"黃泥螺"、"梅螺"等,屬軟體動物門、腹足 綱、后鰓亞綱、頭楣目、阿地螺科、泥螺屬,為太平洋西岸海水及咸淡水特產(chǎn)的種類,由貝殼 和軟體兩部分組成,含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵和維生素等成分,多肽物質(zhì)豐富,在我國 廣泛分布于東海和黃海兩側(cè)的長江,是一種常見的水產(chǎn)品。
[0003] 惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類健康和生命的疾病,發(fā)病率越來越高,目前已有的 化療藥物雖對大多數(shù)腫瘤有一定的療效,但選擇性差、毒副反應(yīng)大、耐藥性等問題依然非常 明顯。因此,尋找高效、低毒、特異強的抗腫瘤藥物仍勢在必行。多肽因其分子量小、無免疫 原性、活性高、副作用小,尤其是對多藥抗性的腫瘤細胞系也有很好的抑制活性。海洋生物 多肽是目前海洋生物活性物質(zhì)研究的一個重要領(lǐng)域,一些生物活性多肽常以非活性狀態(tài)存 在于蛋白質(zhì)中,這些蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶的水解作用,使得隱藏于其中的活性肽釋放出來,有 可能發(fā)揮出比蛋白質(zhì)更多的生物活性。例如:如鄧偉等發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白酶解多肽對人宮頸癌 HeLa細胞株的體外生長有明顯的抑制作用;楊永芳等酶解紫貽貝所得的紫貽貝多肽對前 列腺癌PC-3細胞和DU-145細胞有特異性的增殖抑制作用,并且對DU-145細胞的抑制作用 強于對PC-3細胞的增殖抑制作用;姚如永等研究泥蚶多肽在0. 25-1.Og?L1范圍內(nèi),多肽 能明顯的抑制肺癌細胞A549和Ketr-3細胞的增殖,同時還能抑制細胞蛋白質(zhì)的合成,并呈 明顯的劑量依賴性。
[0004] 前列腺癌為男性高發(fā)的惡性腫瘤,其死亡率高居癌癥死亡率的第二位,僅次于肺 癌。近年來,隨著人們生活方式的改變、人口的老齡化以及診斷水平的不斷提升,我過前列 腺癌的發(fā)病率明顯呈上升趨勢。前列腺癌DU-145細胞是從前列腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出 來的,分化程度低,為雄激素依賴的前列腺癌細胞,具有強大的轉(zhuǎn)移潛能,缺乏內(nèi)源性的雄 激素受體的表達。DU-145細胞完全貼壁的時間通常為24h內(nèi),具有較強的侵襲和促血管新 生能力。研究泥螺酶解多肽多前列腺癌DU-145細胞的抑制作用,對前列腺癌藥物的理論研 究具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在酶解泥螺組織獲取泥螺多肽的基礎(chǔ)上,提供一種泥 螺多肽在抗前列腺癌藥物中的應(yīng)用,尤其是抗前列腺癌DU-145細胞。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種泥螺多肽在抗前列腺癌 DU-145細胞藥物中的應(yīng)用,前列腺癌DU-145細胞是從前列腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來的, 分化程度低,為雄激素依賴的前列腺癌細胞,具有強大的轉(zhuǎn)移潛能,缺乏內(nèi)源性的雄激素受 體的表達,其中藥物的具體實現(xiàn)形態(tài)可為片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑等。
[0007] 上述的泥螺多肽通過以下步驟制得:新鮮泥螺洗凈去殼,取泥螺組織搗碎,加入蒸 餾水勻漿,料液比為I: (3~4),勻漿后調(diào)節(jié)勻漿液的pH值為8~9,加入0. 4~0. 5%勻漿 液體積的胰蛋白酶,40~50°C保溫水解7~9h,水解完成后95~KKTC、10~15min進行 滅酶,4°C下水解液于9500~10000r/min離心15~20min,取上清液濃縮干燥得酶解粗提 物,將酶解粗提物溶于蒸餾水,分離純化得各泥螺多肽組分。
[0008] 上述酶解粗提物的濃度在5~25mg/ml時,對DU-145細胞增殖抑制指數(shù)為36. 9~ 80. 7%,且增殖抑制指數(shù)與酶解粗提物的濃度呈正相關(guān)。
[0009] 上述分離純化步驟為超濾或依次為超濾和凝膠層析或依次為超濾、凝膠層析及反 相高效液相色譜。
[0010] 進一步,所述超濾步驟中使用10kd、5kd及3kd超濾膜,分別獲得分子量為10~ 5kd的組分Al,分子量為5~3kd的組分A2以及分子量小于3kd的組分A3, 20~25mg/ml 組分A3作用于DU-145細胞36h后的增殖抑制率為77~78%,且增殖抑制指數(shù)與組分A3 的濃度呈正相關(guān)。
[0011] 再進一步,所述凝膠層析中對組分A3進行洗脫,分別獲得Hl組分、H2組分和H3 組分,其中5~20mg/ml組分H2作用于DU-145細胞24h后的增殖抑制指數(shù)為為44. 1~ 81. 6%,且增殖抑制指數(shù)與組分H2的濃度呈正相關(guān);凝膠層析條件:選用S印hadexG-25凝 膠層析,裝柱后用去離子水平衡,濃度為50mg/mL、上樣4mL、速度為3ml/min,流動相為超純 水,280nm紫外檢測。
[0012] 又再進一步,采用反相高效液相色譜分離所述H2組分,分離獲得組分Fl和F2, 其中2. 5~3mg/ml組分Fl和組分F2作用于DU-145細胞24h后,對DU-145細胞的增 殖抑制率分別為31~33. 72 %和40~42. 04% ;反相高效液相色譜條件:選用Zorbax SB-C18 (4. 6X250, 5um);柱溫為20°C;流動相為1 %TFA和乙腈;梯度洗脫:從開始到30min 結(jié)束,乙腈濃度從0變化到40%,洗脫速度為I.OmL/min;進樣體積為50ul紫外檢測波長分 別為 214nm、280nm。
[0013] 上述組分Fl的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述,組分F2的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的優(yōu)點在于:前列腺癌是一種嚴重影響男性健康的惡性 腫瘤,本發(fā)明通過胰蛋白酶酶解泥螺組織獲取酶解粗提物,然后通過分離純化手段獲取泥 螺多肽的多種組分,研究各組分對前列腺癌DU-145細胞的影響。本發(fā)明中采用的泥螺為一 種低值貝類,原材料成本低,并且泥螺多肽的提取方法工藝簡單,反應(yīng)溫和,提取獲得的泥 螺多肽各組分對前列腺癌DU-145細胞的增殖抑制效果顯著,其中組分H2對DU-145細胞的 IC5。為I. 32mg/ml,為開發(fā)以泥螺多肽為原料的抗前列腺癌藥物提供理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例4中泥螺酶解粗提物對前列腺癌DU-145細胞的抑制率;
[0016] 圖2為實施例4中膜分離組分對DU-145細胞的抑制率;
[0017] 圖3為實施例4中A3組分經(jīng)Sephadex G-25柱層析曲線;
[0018] 圖4為實施例4中凝膠層析組分對DU-145細胞的抑制率的折線圖;
[0019] 圖5為實施例4中凝膠層析組分對DU-145細胞的抑制率的柱狀圖;
[0020] 圖6為實施例4中H2組分的反相高效液相圖譜;
[0021] 圖7反相高效液相色譜純化的組分對DU-145細胞的抑制率。
【具體實施方式】
[0022] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0023] 實施例1 :泥螺多肽的制備
[0024] (I. 1)原料處理
[0025] 取新鮮泥螺,將泥螺去殼、浙干后勻漿備用。
[0026] (1. 2)泥螺酶解工藝
[0027] 用高速組織搗碎機將泥螺組織搗碎勻漿,精密稱取勻漿液,用0.lmol/L的鹽酸 溶液和〇.lmol/L的NaOH溶液調(diào)pH值,加入胰蛋白酶酶解數(shù)小時,酶解條件為酶解溫度 45°C,pH為8. 7,料液比1:4,酶解時間8h,加酶量0. 48%。KKTC下滅酶15min,4°C下離心 15min(10000r/min),取上清液濃縮備用。
[0028] 實施例2 :DU_145細胞的培養(yǎng)和傳代
[0029] (2. 1)細胞復(fù)蘇
[0030] 從液氮罐中取出存放的DU-145細胞株,快速的放入37°C恒溫水浴鍋中進行融化, 待融化后進入無菌工作室進行操作,用滅菌好的吸管將細胞株吸入離心管,加入2mL的F12 營養(yǎng)液或RPMI1640營養(yǎng)液,1000 rpm離心10min,去上清液,加入4ml的營養(yǎng)液,反復(fù)吹打使 細胞成為單個細胞。然后用吸管將細胞均勻的吸入到2個25mL的培養(yǎng)瓶中,放入5%C02、 37°C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),次日換液倒掉未貼壁的死亡細胞。
[0031] (2. 2)細胞培養(yǎng)
[0032] 將人前列腺癌細胞DU-145接種到分別含有10%胎牛血清(體積分數(shù))FBS和雙抗 (青霉素G100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的F12和1640營養(yǎng)液中,放置于37°C、5%CO2的恒 溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞貼壁生長,每1天換液一次,待細胞長滿培養(yǎng)瓶的80%左右時進行傳 代。按照1:2的比例進行傳代。收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。
[0033] (2. 3)細胞傳代
[0034] 先將長滿細胞的培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出放到無菌操作臺上。傳代時,先倒掉 瓶中的營養(yǎng)液,去除不貼壁生長的死細胞,用〇. 25%胰蛋白酶/0. 02%EDTA消化液混合消 化,不同細胞消化的時間不同,一般消化時間為3-5min;顯微鏡下觀察細胞,當(dāng)細胞間隙明 顯變大且細胞變圓變亮?xí)r,說明細胞已經(jīng)消化完畢,去掉消化酶液。在培養(yǎng)瓶中加入2. 5mL 左右的營養(yǎng)液,反復(fù)吹打消化好的貼壁細胞使之成為單個細胞,一般情況下一瓶細胞傳2 瓶,將傳代好的細胞置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0035] (2. 4)細胞凍存
[0036] 顯微鏡下觀察,當(dāng)細胞長到培養(yǎng)瓶的80%左右,選細胞形態(tài)好的進行凍存,倒去培 養(yǎng)液,加入消化液對細胞進行消化,鏡下觀察細胞間隙明顯時倒掉消化酶,再向培養(yǎng)瓶中加 入3mL左右的營養(yǎng)液,反復(fù)吹打使之成為單個細胞,吸入離心管內(nèi),lOOOrpm,離心10min,小 心的吸棄培養(yǎng)液,加入含有10%DMSO胎牛血清lmL,用吸管反復(fù)吹打細胞均勻后,吸入到無 菌凍存管中。先放入4°C冰箱中30min后,再放入液氮瓶口位置2h,最后放入液氮瓶中進行 凍存。
[0037] :實施例3 :酶解粗提物的分離純化
[0038] 首先選用超濾法對泥螺多肽酶解粗提液進行分離,超濾膜分別選用10kd,5kd, 3kd,分別截留到分子量10-5kd、5-3kd和小于3kd三個組分,冷凍干燥后分別配成20mg/mL 的濃度,用MTT法測定各個組分對前列腺癌DU145的抑制率。選出活性最高的一個組分,選 用S印hadexG-25凝膠層析,裝柱后用去離子水平衡,濃度為50mg/mL、上樣量為4mL、速度 為3ml/min,流動相為超純水,280nm紫外檢測。收集洗脫峰冷凍干燥成粉末,檢測對DU-145 細胞的增殖抑制率,并繪制曲線得出IC5。,將活性最高的大量收集冷凍干燥進行高效液相色 譜分析。
[0039] 將冷凍干燥好的泥螺樣品用0. 06 %TFA的水溶解到0. 6ml的離心管中,在 12000rpm,離心IOmin取上清液。高效液相條件:選用ZorbaxSB_C18(4.6X250,5um);柱 溫為20°C;流動相為1%TFA和乙腈;梯度洗脫:從開始到30min結(jié)束,乙腈濃度從0變化 到40%,洗脫速度為I.OmL/min;進樣體積為50ul,紫外檢測波長分別為214nm、280nm。
[0040] 實施例4 :MTT法探索泥螺多肽抗腫瘤活性
[0041] 取對數(shù)生長期的細胞制成懸液,接種至96孔板,每孔200yL,設(shè)5個平行孔,于 5%C02, 37