肝細(xì)胞核因子HNF-1α、HNF-4α在制備預(yù)防或治療宮內(nèi)生長遲緩的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及肝細(xì)胞核因子HNF-I a、HNF-4 a 在制備預(yù)防或治療宮內(nèi)生長遲緩的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胎兒宮內(nèi)生長遲緩（intrauterine growth restriction，IUGR)是指出生體重低 于同胎齡平均體重的第十百分位或兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。IUGR是胚胎發(fā)育異常最常見的形式，其發(fā) 生率一般為7%，我國的平均發(fā)病率為6. 39%。造成IUGR的原因很多，如遺傳因素、宮內(nèi)感 染、母體飲食不良、母體營養(yǎng)儲存不良、子宮血流不足或營養(yǎng)物質(zhì)通過胎盤缺陷等。流行病 學(xué)研究顯示，母體懷孕時(shí)的狀況和胚胎的生長環(huán)境與個(gè)體成年后許多代謝性疾病的發(fā)生密 切相關(guān)，IUGR的兒童成年后易患高脂血癥、肥胖、高血壓、冠心病和2型糖尿病等。目前醫(yī) 學(xué)研究人員對于該疾病發(fā)生的機(jī)制研究還沒有深入和明確的方向或確定關(guān)鍵影響或調(diào)控 因子。
[0003] 肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF)是調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)基因特異性表達(dá) 的一類轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟有較多表達(dá)，并含有在進(jìn)化上相當(dāng)保守的DNA結(jié)合區(qū)，通過與各種 靶基因調(diào)控區(qū)順式作用元件的結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平對肝細(xì)胞分化和代謝 過程起重要作用。HNF家族主要包括CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP)、HNF-I、HNF-3、HNF-4、 D結(jié)合蛋白、HNF-6等六大類，這些轉(zhuǎn)錄因子及其相互作用構(gòu)成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，精確地控 制著肝臟的發(fā)育和肝細(xì)胞的功能。HNF-I包括HNF-Ia和HNF-I β兩個(gè)成員，HNF-Ia只在 分化完全的細(xì)胞中才能檢測到，在低分化或未分化的細(xì)胞中無表達(dá)。HNF-4包括HNF-4a、 HNF-4 β和HNF-4 γ三個(gè)成員，定位于人20號染色體長臂（20q)，為類固醇激素受體超家族 的孤兒受體，屬核受體超家族2A亞家族（NR2A)。HNF-4 a在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá)， 是調(diào)控肝細(xì)胞分化和維護(hù)肝細(xì)胞生物學(xué)功能的重要轉(zhuǎn)錄蛋白，在肝臟的形成和成人肝臟許 多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵的作用。
[0004] 目前有研究表明HNF-I a、HNF_3 β、HNF_4 a和C/EBP a在高分化的4個(gè)肝癌細(xì)胞 系中均表達(dá)，而在低分化的3個(gè)肝癌細(xì)胞系中均無表達(dá)，HNF-I a、HNF_4 a的高表達(dá)提示肝 癌分化良好，其中HNF-1 a和HNF-4 a可作為肝癌分化程度的標(biāo)志物。
[0005] 然而，目前關(guān)于HNF-I a、HNF-4 a與IUGR之間的關(guān)系還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供肝細(xì)胞核因子HNF-I a、HNF-4 a的 新用途。
[0007] 本發(fā)明提供了肝細(xì)胞核因子HNF-I a及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4 a及其調(diào)節(jié)劑在制備預(yù) 防和/或治療胎兒宮內(nèi)生長遲緩的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 所述的調(diào)節(jié)劑選自抑制劑或增效劑。
[0009] 本發(fā)明還提供了含有肝細(xì)胞核因子HNF-I α及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4a及其調(diào)節(jié)劑的 試劑盒在制備預(yù)防和/或治療胎兒宮內(nèi)生長遲緩的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了肝細(xì)胞核因子HNF-Ia及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4CI及其調(diào)節(jié)劑在制備 研究胎兒宮內(nèi)生長遲緩分子機(jī)制的試劑中的應(yīng)用。例如肝細(xì)胞核因子HNF-Ia的增效劑或 HNF-4 α的增效劑用于制備降低胎兒宮內(nèi)生長遲緩發(fā)生率的試劑以用于研究其中的分子調(diào) 控機(jī)理，肝細(xì)胞核因子HNF-I α的抑制劑或HNF-4 α的抑制劑用于制備提高宮內(nèi)生長遲緩 發(fā)生率的試劑以用于研究其中的分子調(diào)控機(jī)理。
[0011] 本發(fā)明還提供了含有肝細(xì)胞核因子HNF-Ia及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4CI及其調(diào)節(jié)劑的 試劑盒在制備研究胎兒宮內(nèi)生長遲緩分子機(jī)制的試劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了肝細(xì)胞核因子HNF-Ia及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4CI及其調(diào)節(jié)劑在制備 于胎兒期預(yù)防胎兒成年后患糖尿病、高脂血癥、肥胖、高血壓或冠心病的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了含有肝細(xì)胞核因子HNF-Ia及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4CI及其調(diào)節(jié)劑的 試劑盒在制備于胎兒期預(yù)防胎兒成年后患糖尿病、高脂血癥、肥胖、高血壓或冠心病的藥物 中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了 HNF-I α或HNF_4a在作為胎兒宮內(nèi)生長遲緩的診斷標(biāo)志物中的 應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0016] 本發(fā)明采用Wistar大鼠受孕期間給予低蛋白飲食致胎鼠宮內(nèi)營養(yǎng)不良，制作 IUGR模型，利用IUGR鼠和正常對照鼠，采用Real time-PCR、Western blot和免疫組化方 法檢測肝臟中HNF-I α和HNF-4 α的基因和蛋白水平的表達(dá)，通過比較發(fā)現(xiàn)IUGR幼鼠出生 后肝臟中HNF-I α和HNF-4 α蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平均少于正常對照鼠，提示HNF-I α 和HNF-4 α可用作預(yù)防或治療IUGR的靶標(biāo)，或診斷IUGR的標(biāo)志物。本發(fā)明首次研究證實(shí) 了 IUGR中HNF-I α及HNF-4 α水平的變化，有助于IUGR發(fā)生發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步研究，并有 助于從生命的源頭盡早地采取補(bǔ)救措施，降低IUGR和IUGR誘發(fā)的其他疾病的發(fā)生幾率。
【附圖說明】
[0017] 圖1.兩組幼鼠體重變化比較。與CON組比較，0天IUGR組體重明顯低于CON組， 差異有顯著性，？〈0.01，3周時(shí)兩組幼鼠體重差異無顯著性，卩>0.05,8周時(shí)11^1?組體重超過 CON組，差異有顯著性，Ρ〈0. 05。
[0018] 圖2. HNF-I α蛋白在肝臟中表達(dá)的Western blot圖譜。A圖為肝臟GAPDH蛋白表 達(dá)，B圖為肝臟HNF-I α蛋白表達(dá)，1、3和5為CON組，2、4和6為IUGR組，1、2條帶為0天， 3、4條帶為3周，5、6條帶為8周。
[0019] 圖3.兩組幼鼠肝臟HNF-Ia蛋白相對表達(dá)量比較。
[0020] 圖4. RT-PCR檢測IUGR對HNF-I α表達(dá)的影響。
[0021 ] 圖5.兩組幼鼠肝臟HNF-I α陽性表達(dá)細(xì)胞相對密度值比較。
[0022] 圖6.兩組幼鼠 HNF-I α在肝臟細(xì)胞陽性表達(dá)圖片。
[0023] 圖7. HNF-4 α蛋白在肝臟中表達(dá)的Western blot圖譜。A圖為肝臟GAPDH蛋白表 達(dá)，B圖為肝臟HNF-4a蛋白表達(dá)，1、3和5為CON組，2、4和6為IUGR組，1、2條帶為0天， 3、4條帶為3周，5、6條帶為8周。
[0024] 圖8.兩組幼鼠肝臟HNF-4 a mRNA相對表達(dá)量比較。
[0025] 圖9. RT-PCR檢測IUGR對HNF-4 α表達(dá)的影響。
[0026] 圖10.兩組幼鼠肝臟HNF-4 α陽性表達(dá)細(xì)胞相對密度值比較。
[0027] 圖11.兩組幼鼠 HNF_4a在肝臟細(xì)胞陽性表達(dá)圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 一、IUGR動物模型的建立
[0031] 1、材料
[0032] I. 1實(shí)驗(yàn)動物
[0033] 由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物室提供，健康的清潔級雌性Wistar大鼠40只， 雄性大鼠10只，體重220-280g。
[0034] 1. 2 試劑
[0035] 動物飼料：低蛋白飼料由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，熱卡為 1572kJ/100g，其中脂肪6. 7%，碳水化合物63. 4%，蛋白質(zhì)含量僅為8. 0% ;標(biāo)準(zhǔn)飼料熱卡 為15831^/10(^，其中蛋白質(zhì)23%，脂肪4.5%，碳水化合物57.8%。
[0036] 50 %葡萄糖注射液加蒸餾水配置成25 %葡萄糖注射。
[0037] 2、方法
[0038] 將Wistar大鼠按雌：雄=4:1的比例于前一晚上合籠，第二天晨起用鹽水棉簽做 陰道涂片，以光學(xué)顯微鏡下見到發(fā)絲樣團(tuán)狀物為受孕，記為受孕第一日，隨機(jī)分為生長遲緩 組（IUGR組）和正常對照組（C0N組），IUGR組喂給低蛋白飼料，CON組喂給標(biāo)準(zhǔn)飼料，溫度 24°C，濕度60%，光照12小時(shí)。每天更換墊料，添給飼料、水。孕鼠均自然分娩，子鼠出生 后于生后12小時(shí)內(nèi)測體重，精確到0.0 lg。IUGR診斷標(biāo)準(zhǔn)：體重低于正常對照組平均體重 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差者為IUGR鼠。
[0039] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0040] 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)土準(zhǔn)差（X±S)表示，采用方差分析對組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果進(jìn) 行比較，兩組間相同時(shí)間點(diǎn)用t檢驗(yàn)，兩組鼠出生體重比較采用X2檢驗(yàn)，制作統(tǒng)計(jì)圖表，數(shù) 據(jù)用SPSS 11. 5軟件處理，P〈0. 05為有顯著性差異。
[0041] 4、結(jié)果
[0042] 兩組母鼠孕期為21天，低蛋白飲食組IUGR發(fā)生率61. 32%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)組IUGR 發(fā)生率為9. 28%，低蛋白飲食組明顯高于標(biāo)準(zhǔn)飼料組（X2= 58. 36, P〈0. 001)，兩組有顯著 性差異。IUGR組平均出生體重比對照組低22. 88% (t = 6. 58, P〈0. 05)，差異性顯著。生 后3周IUGR組體重仍稍低于CON組，4周時(shí)追趕上CON組，兩組幼鼠體重?zé)o顯著性差異，8 周時(shí)體重明顯高于CON組，有顯著性差異（P〈0. 05)。兩組幼鼠體重?cái)?shù)值見表1、圖1。
[0043] 表1 IUGR組和CON組幼鼠體重比較（叉土爲(wèi))
[0044]
[0045] 注：* * Ρ〈0· 01，* Ρ〈0· 05。
[0046] 二、IUGR 對 HNF-I α 和 HNF-4 α 影響的研究
[0047] 1、材料
[0048] I. 1實(shí)驗(yàn)動物
[0049] I. I. 1動物分組
[0050] CON組：標(biāo)準(zhǔn)飲食組，正常體重新生鼠、3周、8周，各取8只，雌雄各半。IUGR組：低 蛋白飲食組，體重低于2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的新生鼠、3周、8周，各取8只，雌雄各半。
[0051] 1.1. 2標(biāo)本的采集
[0052] 新生鼠測體重，斷頭處死，3周齡和8周齡子鼠給5%水合氯醛腹腔注射麻醉，CON 組和IUGR兩組新生鼠、3周和8周子鼠，取胰腺和肝臟，各留取三份標(biāo)本，兩份胰腺、肝臟 于-70°C冰箱保存，做Western blot和Real time-PCR備用；另一份胰腺、肝臟放入4%多 聚甲醛溶液中，固定。
[0053] 1. 2 試劑
[0054] 組織蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司，總蛋白定量試劑由南京建成生物工 程研究所提供。
[0055] HNF-I α、山羊抗大鼠和HNF-4 α、兔抗大鼠抗體（Santa Cruz，美國），DBA顯色試 劑盒（ZLI-9032,北京中山）。
[0056] 大鼠 HNF-1 a、HNF_4 α 和內(nèi)參照憐酸甘油酸脫氛酶（glyceraldehydes phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物參照Gene Bank中的基因序列，由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成。
[0057] Trizol Reagent :美國 Invitrogen Life technologies 公司。
[0058] DNA Marker 購自大連 TaKaRa 公司。
[0059] RT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。
[0060] 瓊脂糖購自美國Promega