公司。
[0061] 十二烷基磺酸鈉（SDS)、三羥甲基氨基甲烷（Tris)、丙烯酰胺（Acr)、甲醇、脫脂奶 粉等購(gòu)于華美公司。
[0062] 2、方法
[0063] 2. IReal time PCR半定量檢測(cè)mRNA的表達(dá)
[0064] 2. I. 1 總 RNA 的提取
[0065] 按照Trizol總提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每組8份樣品雌雄各半，分別稱取胰腺、肝 臟組織，每份樣品組織l〇〇mg，提取總RNA。然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm和280nm的吸 光度值，檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量，-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0066] 2. L 2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈
[0067] 將提取的總RNA稀釋成1 μ g/ μ 1，然后按照RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一 鏈。
[0068] 2. I. 3Real time 定量 PCR 反應(yīng)
[0069] (I)引物序列
[0077] (5)擴(kuò)增產(chǎn)物定量分析
[0078] 通過(guò)Real time PCR擴(kuò)增儀，得到目的基因的Real time PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA起始濃度進(jìn)行定量分析，通過(guò)熒光定量PCR自動(dòng)分析并計(jì)算 結(jié)果，目的基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。
[0079] 2. 2Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)
[0080] 2. 2. 1組織總蛋白提取
[0081] 按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每組8份樣品雌雄各半，分別稱取胰腺、肝臟 組織，每份樣品組織l〇〇mg，剪碎后加入6倍體積的預(yù)冷細(xì)胞裂解液，超聲勻漿機(jī)勻漿粉碎 20s，間隔20s，3次，15000rpm于4°C離心20min，吸取上清液為組織細(xì)胞總蛋白。采用酸試 劑法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量，用裂解緩沖液調(diào)整各標(biāo)本至相同蛋白濃度。
[0082] 2. 2. 2Western雜交檢測(cè)蛋白的表達(dá)
[0083] 取蛋白液40 μ 1，加10 μ 1的5倍的樣品緩沖液，加5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯 酰胺濃縮膠電泳，條件150V，30mA，1. 5小時(shí)。硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)印液中平衡10分鐘，然后 按照膠在負(fù)極、膜在正極的原則，經(jīng)2小時(shí)50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜1次。用含5%去脂奶 粉的TTBS封閉4°C過(guò)夜，取出膜后，TBS洗膜5分鐘X 3次，分別加入各目的基因的多克隆 一抗（1:400)，室溫下孵育2小時(shí)。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1:2000)，室溫下孵育2小 時(shí)，TTBS洗5分鐘X2次，TBS洗5分鐘X 1次，酶顯法顯色。結(jié)果以actin作為內(nèi)參，采 用FlourChem V2.0凝膠成像分析軟件（America)分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn) 行定量分析。
[0084] 2.3免疫組化檢測(cè)!1即-1€[和!1即-4€[表達(dá)
[0085] 2. 3. 1光鏡切片的制作
[0086] 2. 3. 2免疫組化染色采用SABC法
[0087] (1)操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
[0088] (2) 3%過(guò)氧化氫封閉過(guò)氧化物酶，反應(yīng)lOmin，蒸餾水沖洗3次，每次2min。滴加 復(fù)合消化酶以暴露抗原，室溫5min，抗原修復(fù)。
[0089] (3) 0.1 MPBS沖洗5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫40min。滴加一抗（不同 種蛋白的特異性抗體）4°C過(guò)夜。
[0090] (4)次日晨取出PBS洗4次，每次5min。滴加生物素化二抗，37°C室溫孵育20min。 0.1 M PBS洗4次，每次5min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的SABC液，37°C室溫孵育20min。 0.1 M PBS 洗 3 次，每次 5min。
[0091] (5)DBA顯色：DBA顯色，溜水洗。蘇木素復(fù)染2min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中 性樹(shù)脂封片。
[0092] 2. 3. 3結(jié)果分析方法
[0093] 每個(gè)切片取5個(gè)不同視野，在計(jì)算機(jī)圖像分析儀上掃描數(shù)據(jù)，棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)， 觀察表達(dá)部位，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0094] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0095] 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X 土S)表示，同一組內(nèi)比較采用方差分析F檢 驗(yàn)，不同組間相同時(shí)間點(diǎn)間比較采用t檢驗(yàn)，制作統(tǒng)計(jì)圖表，數(shù)據(jù)用SPSS 11. 5軟件處理， P〈0. 05為有顯著差異性。
[0096] 4、結(jié)果
[0097] 4. IIUGR幼鼠肝臟HNF-I α表達(dá)情況
[0098] 4. I. IWestern blot 結(jié)果
[0099] 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)HNF-I α蛋白在肝臟中的表達(dá)，Western blot圖譜 見(jiàn)圖2。
[0100] 兩組幼鼠肝臟HNF-I α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2、圖3。
[0101] 表2兩組幼鼠肝臟HNF-I α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（χ 土s )
[0103] 注：* Ρ〈0· 05, * * Ρ〈0· 01。
[0104] Real time PCR半定量檢測(cè)HNF-I a mRNA的表達(dá)，兩組幼鼠肝臟HNF-I α的基因轉(zhuǎn) 錄水平表達(dá)情況見(jiàn)表3、圖4。結(jié)果顯示，相比于CON組，IUGR組新生鼠 （t = 3. 15, Ρ〈0. 01)， 3 周鼠 （t = 2·51，Ρ〈0·05)，8 周鼠 （t = 2.39，P〈0.05)，gp IUGR組 HNF-Ia 的 mRNA 表達(dá)量 均明顯低于CON組，差異性顯著。
[0105] 表3兩組幼鼠肝臟HNF-I α的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)（X±S)
[0108] 注：* Ρ〈0· 05。
[0109] 免疫組化檢測(cè)HNF-I α表達(dá)，兩組幼鼠肝臟HNF-I α陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的相對(duì)密度值 比較見(jiàn)表4、圖5,兩組幼鼠 HNF-I α在肝臟細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)圖片見(jiàn)圖6。免疫組化方法觀察到， 棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，在肝臟細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，通過(guò)圖像分析儀檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量，兩組比較分析， IUGR組新生鼠 （t = 3· 23，Ρ〈0· 01)，3周鼠 （t = 2· 83，Ρ〈0· 05)，8 周鼠 （t = 2· 42，Ρ〈0· 05)， IUGR組HNF-I α的表達(dá)量均明顯低于CON組，差異性顯著。
[0110] 表4肝臟HNF-I α陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的相對(duì)密度值比較S)
[0112] 注：* Ρ〈0· 05, * * Ρ〈0· 01。
[0113] 4. 2IUGR幼鼠肝臟HNF-4 α表達(dá)情況
[0114] 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)HNF-4 α蛋白在肝臟中的表達(dá)，Western blot圖譜 見(jiàn)圖7。
[0115] 兩組幼鼠肝臟HNF-4 α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，與CON組相比，IUGR 組新生鼠 （t = 2· 99，Ρ〈0· 01)，3 周鼠 （t = 2· 33，Ρ〈0· 05)，8 周鼠 （t = 2· 46，Ρ〈0· 05)，IUGR 組的HNF-4 α蛋白的表達(dá)量均明顯低于CON組，差異性顯著。
[0116] 表5兩組幼鼠肝臟HNF-4 α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（χ± s )
[0118] 注：* Ρ〈0· 05, * * Ρ〈0· 01。
[0119] Real time PCR半定量檢測(cè)HNF-4 amRNA的表達(dá)，兩組幼鼠肝臟HNF-4 α的基因 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況見(jiàn)表6、圖8-9。結(jié)果顯示，與CON組相比，IUGR組新生鼠 （t = 2. 62， Ρ〈0· 05)，3 周鼠 （t = 2. 79, Ρ〈0· 05)，8 周鼠 （t = 2. 89, P > 0· 05)，IUGR 組 HNF-4 α 的 mRNA 表達(dá)量均明顯低于CON組，差異性顯著。8周鼠差異性不顯著。
[0120] 表6兩組幼鼠肝臟HNF_4a的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)（X±S)
[0122] 注：*Ρ〈0·05。
[0123] 免疫組化檢測(cè)HNF-4 α表達(dá)，兩組幼鼠肝臟HNF-4 α陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的相對(duì)密度值 比較見(jiàn)表7、圖10,兩組幼鼠 HNF_4a在肝臟細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)圖片見(jiàn)圖11。免疫組化方法觀 察到，棕黃色為HNF-4 α陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，通過(guò)圖像分析儀檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量，兩組比較分析， IUGR組新生鼠 （t = 3· 30，Ρ〈0· 01)，3周鼠 （t = 2· 93，Ρ〈0· 05)，8 周鼠 （t = 2· 66，Ρ〈0· 05)， IUGR組HNF-4 α的表達(dá)量均明顯低于CON組，差異性顯著。
[0124] 表7兩組幼鼠肝臟HNF_4a陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的相對(duì)密度值比較（X±S)
[0126] 注：* Ρ〈0· 05, * * Ρ〈0· 01。
[0127] 以上實(shí)驗(yàn)表明，在IUGR鼠出生后0天、3周和8周，HNF-I α和HNF-4 α的蛋白和 mRNA表達(dá)水平均顯著少于CON組，提示HNF-I α和HNF-4 α可作為IUGR的治療靶標(biāo)，或作 為診斷IUGR的標(biāo)志物。
[0128] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 肝細(xì)胞核因子HNF-la及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4a及其調(diào)節(jié)劑在制備預(yù)防和/或治療胎 兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)劑選自抑制劑或增效劑。3. 含有肝細(xì)胞核因子HNF-la及其調(diào)節(jié)劑或HNF_4a及其調(diào)節(jié)劑的試劑盒在制備預(yù)防 和/或治療胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的藥物中的應(yīng)用。4. 肝細(xì)胞核因子HNF-la及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4a及其調(diào)節(jié)劑在制備研究胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng) 遲緩分子機(jī)制的試劑中的應(yīng)用。5. 含有肝細(xì)胞核因子HNF-la及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4a及其調(diào)節(jié)劑的試劑盒在制備研究 胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩分子機(jī)制的試劑中的應(yīng)用。6. 肝細(xì)胞核因子HNF-la及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4a及其調(diào)節(jié)劑在制備于胎兒期預(yù)防胎兒 成年后患糖尿病、高脂血癥、肥胖、高血壓或冠心病的藥物中的應(yīng)用。7. 含有肝細(xì)胞核因子HNF-la及其調(diào)節(jié)劑或HNF-4a及其調(diào)節(jié)劑的試劑盒在制備于胎 兒期預(yù)防胎兒成年后患糖尿病、高脂血癥、肥胖、高血壓或冠心病的藥物中的應(yīng)用。 8. HNF-1a或HNF-4a在作為胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及肝細(xì)胞核因子HNF-1α、HNF-4α在制備預(yù)防或治療宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明建立了IUGR大鼠模型，通過(guò)比較IUGR鼠和正常對(duì)照鼠，發(fā)現(xiàn)IUGR幼鼠出生后肝臟中HNF-1α和HNF-4α蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平均少于正常對(duì)照鼠，提示HNF-1α和HNF-4α可用作預(yù)防或治療IUGR的靶標(biāo)，或診斷IUGR的標(biāo)志物。本發(fā)明為首次證實(shí)IUGR中HNF-1α及HNF-4α表達(dá)水平下降，有助于IUGR發(fā)生發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步研究，并有助于從生命的源頭盡早地采取補(bǔ)救措施，降低IUGR和IUGR誘發(fā)的其他疾病的發(fā)生幾率。
【IPC分類】C12Q1/68, A61P3/04, A61P9/12, A61P3/00, A61P3/10, A61P3/06, A61K38/19, G01N33/68, A61P9/10, A61K45/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105267954
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510856396
【發(fā)明人】張 杰, 胡畔
【申請(qǐng)人】上海市第一人民醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日