>[0161] 測試樣品
[0162] · V.A.A.M.:以Ig/IOml的濃度將表1所示的組成的氨基酸混合物(V.A.A.M.)懸浮 于注射用水(大塚制藥)而制備。
[0163] ?各種氨基酸:將L-丙氨酸(Ala)、L_甲硫氨酸(Met)、L_苯丙氨酸(Phe)、L_精氨酸 (Arg)、甘氨酸(Gly)分別以lg/10ml的濃度懸浮于注射用水(大塚制藥)而制備。
[0164] 表1
[0166] 動物實驗
[0167] 將6周齡的Wistar系雄性大鼠（SLC社)預(yù)備飼養(yǎng)1周而用于測試。基于體重分組(媒 介物組、V.A.A.M.組、丙氨酸組、甲硫氨酸組、苯丙氨酸組、精氨酸組、甘氨酸組的7個組，各 組n = 6)，禁食18小時(其中，水設(shè)為自由攝?。?。
[0168] 從尾靜脈進行采血(time-30)，之后立即經(jīng)口施用lOml/kg的測試樣品（測試樣品 的劑量為lg/kg)(V.A.A.M.組、丙氨酸組、甲硫氨酸組、苯丙氨酸組、精氨酸組、甘氨酸組)或 注射用水（媒介物組）。30分鐘后，再次進行采血（timeO)后，立即腹腔內(nèi)施用（0.2mg/kg、 4ml/kg)腎上腺素（（R)-( -腎上腺素，和光純藥工業(yè)）。其后，隨時間推移每15分鐘進行采 血(t ime 15、30、45、60、75 )，至腎上腺素施用的75分鐘后。從采集的血液獲得血漿，測定血液 中的甘油。
[0169] 測定
[0170] 血液中的甘油：使用甘油檢測試劑盒（Glycerol Assay Kit; Cayman Chemical CamPany)按照附屬的說明書測定血楽:中的甘油。算出由各測量時間的測定值減去time-30 的測定值所得的值，將其設(shè)為血液中甘油濃度的變化量。接著，由血液中甘油濃度的變化 量，算出timeO~75的曲線下的面積(AUC)。進而，算出各氨基酸組的AUC相對于媒介物組的 AUC的變化率（％)。
[0171] (2)結(jié)果
[0172] 圖1顯示血液中甘油濃度的變化率(甘油AUC變化率[Glycerol AUC change])。丙 氨酸組、甲硫氨酸組、苯丙氨酸組、精氨酸組、甘氨酸組均顯示高于V.A.A.Μ.組的值。
[0173] 由此得知:丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸與現(xiàn)有的氨基酸組合物相 比，顯示高的脂質(zhì)代謝促進效果。
[0174] 但是，確認了各種氨基酸的味道，結(jié)果得知：甲硫氨酸的味道和氣味不適于經(jīng)口攝 取。
[0175] 實施例2
[0176] 本發(fā)明的脂質(zhì)代謝促進劑(制備例1)與單獨的氨基酸的脂質(zhì)代謝促進效果的比較
[0177] (1)材料及方法
[0178] 測試樣品
[0179] ?"制備例Γ:以2.7g/10ml的濃度將表2所示的組成的氨基酸混合物(制備例1)懸 浮于注射用水(大塚制藥)而制備。在IOml懸液中包含L-精氨酸1.2g、L-丙氨酸0.57g及L-苯 丙氨酸〇.47g。
[0180] ?精氨酸：以1.2g/10ml的濃度將L-精氨酸懸浮于注射用水(大塚制藥)而制備。
[0181] ?丙氨酸：以〇.57g/10ml的濃度將L-丙氨酸懸浮于注射用水(大塚制藥)而制備。
[0182] ?苯丙氨酸：以0.47g/10ml的濃度將L-苯丙氨酸懸浮于注射用水(大塚制藥)而制 備。
[0185] 動物實驗
[0186] 將6周齡的Wistar系雄性大鼠（SLC社)預(yù)備飼養(yǎng)1周而用于測試?；隗w重分組(媒 介物組、"制備例Γ組、精氨酸組、丙氨酸組、苯丙氨酸組的5組，各組n = 6)，禁食18小時（其 中，水設(shè)為自由攝?。?br>[0187] 從尾靜脈進行采血（time-30)，之后立即經(jīng)口施用5ml/kg的測試樣品（V.A.A.M. 組、"制備例Γ組、精氨酸組、丙氨酸組、苯丙氨酸組)或注射用水(媒介物組）。30分鐘后，再 次進行采血（timeO)后，立即腹腔內(nèi)施用（0.2mg/kg、8ml/kg)腎上腺素（（R)-( -腎上腺 素，和光純藥工業(yè)）。其后，隨時間推移每15分鐘進行采血(丨丨1^15、30、45、60、75、90)，至腎 上腺素施用的90分鐘后。從采集的血液獲得血漿，測定血液中的甘油。
[0188] 測定
[0189] 血液中的甘油：使用甘油焚光檢測試劑盒(Glycerol Fluorometric Assay Kit; Cayman Chemical CamPany)，按照附屬的說明書測定血衆(zhòng)中的甘油。算出由各測量時間的 測定值減去time-30的測定值所得的值，將其設(shè)為血液中甘油濃度的變化量。
[0190] 統(tǒng)計學(xué)處理方法
[0191]測定值用平均值土標準誤差表示。就數(shù)據(jù)而言，使用統(tǒng)計軟件Stat View5.0-J，利 用F檢驗的等方差檢驗后，利用Fisher的PLSD進行檢驗。顯著性水平設(shè)為5%。
[0192] ⑵結(jié)果
[0193] 圖2顯示血液中甘油濃度的變化量（Δ甘油）。"制備例Γ組與媒介物組相比，血液 中甘油濃度的變化量保持在更高的水平。在腎上腺素施用后15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分 鐘及75分鐘（丨丨1^15、30、45、60、75)，"制備例1"組與媒介物組相比，顯示顯著更高的（？< 0.05)血液中甘油濃度的變化量。與媒介物組相比，苯丙氨酸組血液中甘油濃度的變化量僅 在腎上腺素施用后30分鐘（time30)顯著地升高。沒有觀察到其它組與媒介物組的顯著差 異。
[0194] 由此得知：就丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸而言，與單獨攝取相比，將這3種組合攝取 顯示了更高的脂質(zhì)代謝促進效果。
[0195] 實施例3
[0196] 本發(fā)明的脂質(zhì)代謝促進劑(制備例3)與現(xiàn)有的氨基酸組合物(V.A.A.M.)的脂質(zhì)代 謝促進效果的比較
[0197] (1)材料及方法
[0198] 測試樣品
[0199] · V.A.A.M.:以3g/IOml的濃度將表1所示的組成的氨基酸混合物(V.A.A.M.)懸浮 于注射用水(大塚制藥)而制備。
[0200] ?"制備例3" ：以3g/10ml的濃度將表3所示的組成的氨基酸混合物（制備例3)懸浮 于注射用水(大塚制藥)而制備。
[0201] 表3
[0203] 動物實驗
[0204] 將6周齡的Wistar系雄性大鼠（SLC社)預(yù)備飼養(yǎng)1周而用于測試?；隗w重分組(媒 介物組、V. A. A. M.組、"制備例3"組的3組，各組η = 7 )，禁食18小時(其中，水設(shè)為自由攝?。?。 [0205] 從尾靜脈進行采血（time-30)，之后立即經(jīng)口施用5ml/kg的測試樣品（V.A.A.M. 組、"制備例3"組)或注射用水(媒介物組）（表4)。30分鐘后，再次進行采血(timeO)后，立即 腹腔內(nèi)施用(〇.2mg/kg、8ml/kg)腎上腺素（（R)-( -腎上腺素，和光純藥工業(yè)）。其后，隨時 間推移每15分鐘進行采血(丨加615、30、45、60、75、90)，至腎上腺素施用的90分鐘后。從采集 的血液獲得血漿，測定血液中的甘油。
[0208] 測定
[0209] 血液中的甘油：使用甘油檢測試劑盒（Glycerol Assay Kit; Cayman Chemical CamPany)，按照附屬的說明書測定血楽:中的甘油。算出由各測量時間的測定值減去time-30 的測定值所得的值，將其設(shè)為血液中甘油濃度的變化量。
[0210] 統(tǒng)計學(xué)處理方法
[0211]測定值用平均值土標準誤差表示。就數(shù)據(jù)而言，使用統(tǒng)計軟件Stat View5.0-J，利 用F檢驗的等方差檢驗后，利用Fisher的PLSD進行檢驗。顯著性水平設(shè)為5%。
[0212] ⑵結(jié)果
[0213] 圖3顯示血液中甘油濃度的變化量。"制備例3"組與V.A.A.M.組相比，血液中甘油 濃度的變化量保持在更高的水平。在腎上腺素施用后30分鐘（time30)及45分鐘（time45)， "制備例3"組與媒介物組相比，顯示顯著更高(P<0.05)的血液中甘油濃度的變化量。
[0214] 由以上的結(jié)果得知:與現(xiàn)有的氨基酸組合物相比，以高水平包含丙氨酸、苯丙氨酸 及精氨酸的本發(fā)明的脂質(zhì)代謝促進劑，顯示更高的脂質(zhì)代謝促進效果。
[0215] 實施例4
[0216]本發(fā)明的脂質(zhì)代謝促進劑(制備例3)在飼喂高脂肪食物并施加運動負荷的動物中 的脂質(zhì)代謝促進效果 [0217] ⑴材料及方法
[0218] 測試樣品及飼料
[0219] · 0.1 %CMC溶液:將羧甲基纖維素(和光純藥）以0. lw/v%的濃度溶于注射用蒸餾 水而制備。
[0220] · V · A· A ·M·:以Ig/1Oml的濃度將表1所示的組成的氨基酸混合物(V· A · A ·M·)懸浮 于0.1 % CMC溶液而制備。
[0221] · V.A.A.M.+C〇Q10+L-肉堿：分別以lg/10ml、CoQ10為 10mg/10ml、68mg/10ml的濃 度將表1所示的組成的氨基酸混合物(V. A. A. M .)、輔酶Q10 (CoQl 0，太陽化學(xué))和L-肉堿(三 榮源FFI)懸浮于0.1 % CMC溶液而制備。
[0222] ?"制備例3" ：以lg/lOml的濃度將表3所示的組成的氨基酸混合物（制備例3)懸浮 于0.1 % CMC溶液而制備。
[0223] · AIN-93M(0RIENTAL酵母工業(yè)）：將組成示于表5。為用于使用由美國國立營養(yǎng)研 究所(AIN)在1993年(AIN-93)所發(fā)布的小鼠、大鼠的營養(yǎng)研究的標準精制飼料。
[0224] · HFD-60(0RIENTAL酵母工業(yè)）：將組成示于表5。具有60%的來自脂肪的卡路里的 尚脂肪伺料。
[0225] 表 5
[0227] 動物實驗
[0228] 將3周齡的C57BL/6J系雄性小鼠（CLEA社）進行1周預(yù)備飼養(yǎng)及1周的跑步機馴化 后，用于測試?；隗w重分組(第0天）（正常組(n = 9)、高脂肪組(n = 10)、H+V.A.AH(n = 9)、肝1厶】1.+(：〇010+1^肉堿組(11=10)、!1+"制備例3"組(11=10)的5組），隨后從分組至42 天后的測試最終日（第42天），自由攝取AIN-93M(正常組)或HFD-60(高脂肪組、H+V.A.A.M. 組、H+V. A. A. M. +CoQl0+L-肉堿組、H+ "制備例3"組）（其中，水設(shè)為自由攝?。?。
[0229] 測試樣品的施用
[0230]除測試最終日之外的42天每天(第0天~第41天)使用飼喂針經(jīng)口強飼測試樣品（H +V.A.A.M.組、肝￥.六^.]\1.+(：〇010+1^-肉堿組、!1+"制備例3"組）或0.1%01(：溶液（正常組、高 脂肪組）。1周制備1次測試樣品或0.1 %CMC溶液用于使用，以表6所示的劑量（施用體積 10mL/kg)進行施用。
[0231]表6
[0233] 利用跑步機的運動負荷
[0234] 分組~測試最終日（第0天~第42天)期間，以1周3次的頻率進行利用跑步機的運 動負荷（15m/分鐘~20m/分鐘，40分鐘）。
[0235] 體重測定
[0236] 分組~測試最終日（第0天~第42天)期間，以3天1次的頻率進行體重測定。
[0237] 組織采取
[0238] 在測試最終日（第42天)進行解剖而測定腎周圍脂肪組織及褐色脂肪組織的重量， 測定褐色脂肪組織中的UCP-I表達量。
[0239] 測定
[0240]褐色脂肪組織中的UCP-I表達量:使用小鼠線粒體褐色脂肪解偶聯(lián)蛋白I(UCPl) ELI SA試劑盒(⑶SABIO )，按照附屬的說明書測定褐色脂肪組織中的UCP-I表達量。
[0241] 統(tǒng)計學(xué)處理方法
[0242]測定值用平均值土標準誤差表示。就數(shù)據(jù)而言，使用統(tǒng)計軟件Stat View5.0-J，利 用F檢驗的等方差檢驗后，利用Fisher的PLSD進行檢驗。顯著性水平設(shè)為5%。
[0243] ⑵結(jié)果
[0244]圖4顯示測試期間的體重測定及采食量/體重的結(jié)果。與正常組相比，在高脂肪組 中，從施用第3天(day3)觀察到體重顯著地增加。與高脂肪組相比，在"制備例3"組中，從施 用第3~42天(day3~day42)觀察到顯著的體重抑制效果。另一方面，與高脂肪組相比，沒有 觀察到V. A. A. M.組及V. A. A. M. +CoQl 0+L-肉堿組在體重上的差異。就測試期間的采食量/體 重而言，與飼喂了AIN-93M的組相比，飼喂了HFD-60的各組顯示更低的值，但沒有觀察到飼 喂了 HFD-60的各組之間的差異。
[0245] 圖5顯示腎周圍的脂肪重量。與正常組相比，在高脂肪組中，重量顯著地增加。與高 脂肪組相比，制備例3組顯著地抑制脂肪組織重量的增加。另一方面，與高脂肪組相比，沒有 觀察到V. A. A. M.組及V. A. A. M. +CoQlO+L-肉堿組在脂肪組織重量上的差異。
[0246] 圖6顯示褐色脂肪組織中的UCP-I表達量。與正常組相比，在高脂肪組中，沒有觀察 至IjUCP-I表達量上的變化。與高脂肪組相比，制備例3組的UCP-I表達量顯著地增加。另一方 面，與高脂肪組相比，沒有觀察到V.A.A.M.組及V.A.A.M.+CoQlO+L-肉堿組在UCP-I表達量 上的差異。
[0247] 由以上的結(jié)果，可以確認本發(fā)明的脂質(zhì)代謝促進劑在施加運動負荷時的脂質(zhì)代謝 促進效果。
[0248] 實施例5
[0249] 本發(fā)明的脂質(zhì)代謝促進劑的脂質(zhì)代謝促進效果的效果確認
[0250] ⑴材料及方法
[0251 ]測試食品
[0252]使用外觀上不能識別內(nèi)容物的有無的膠囊（日本藥局方纖維素白膠囊(植物性)00 號），制備下述2種測試食品。
[0253] ?安慰劑:不包含內(nèi)容物的膠囊。
[0254] ?活性組:封入3g表3中記載的制備例3的膠囊。
[0255] 受試者
[0256] 為了進行受試者的選擇，預(yù)先對20歲以上的男性實施血液生物化學(xué)檢查、血液學(xué) 的檢查及自行車運動(VSO)。在自行車運動中，進行從運動開始至精疲力竭所需要的時間及 最大氧攝取量(VO 2Hiax)的測定。此外，通過預(yù)先民意測驗進行生活習(xí)慣的確認，基于上述結(jié) 果，以健康且在從運動開始至精疲力竭所需要的時間和VO 2Hiax上沒有偏斜為條件，進行受 試者的選擇。
[0257] 在這次測試中，在滿足下述(1)~(4)的判定基準的2個以上時，判斷為受