范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。
[0031 ] 實(shí)施例
實(shí)施例1:鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白0mp22原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
將鮑曼不動(dòng)桿菌菌株ATCC 17978在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600=
0.4-0.6)，取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為0mp22-F (5，GGATCC ATG CGT GCA TTAGTT ATT T 3，)；0mp22-R (5，GAATTC TTA TTG TTT AGC ATA AAT G 3’)；PCR體系具體為:菌液:2yL;0mp22_F: 2yL;0mp22_R:2yL;dNTP:2yL;Taq酶:0.25yL； 10 XTaq酶buffer: 2.5yL;水:14.25yL ICR程序?yàn)?①94°C預(yù)變性5分鐘；②變性94°C，30秒；退火56°C，30秒;延伸72°C，I分鐘，循環(huán)35次;③最后延伸72°C，10分鐘。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收(北京天根生物)，回收產(chǎn)物以T-A連接至pMD19T_simple載體(Takara公司)，連接體系具體為:pMD19T_simple載體:0.5yL;片段:4.4yL; T4連接酶:0.5yL; T4連接酶buffer: 0.6yL。16°C連接過(guò)夜。將連接后的重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆以T載體測(cè)序引物進(jìn)行鑒定。將pTh1HisA原核表達(dá)載體(Invitrogen公司)及陽(yáng)性T載體重組質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶(Takara公司)BamHI及EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為:載體/質(zhì)粒:13yL; EcoRI酶:2yL； BamHI: 2yL ；10 X buffer: 3yL，37°C酶切3小時(shí)。膠回收酶切產(chǎn)物后加入DNA連接酶(Takara公司)進(jìn)行連接，連接體系為:Omp22片段:4.7yL; pTh1HisA載體:0.2yL; DNA連接酶:0.5yL; DNA連接酶buffer:0.6yL, 16°C連接過(guò)夜。將DNA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。
[0032]實(shí)施例2:鮑曼不動(dòng)桿菌0mp22重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，具體方法為，將陽(yáng)性克隆接種至已加入氨芐西林(100mg/mL)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16小時(shí)后以1:5的比例轉(zhuǎn)接菌液進(jìn)入新的帶氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，待菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入IPTG(ImmoVL)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，控制誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37°C，誘導(dǎo)表達(dá)6個(gè)小時(shí)(圖2)。
[0033]實(shí)施例3:0mp22亞單位疫苗抗原的制備及純化
將誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜后的樣品以室溫12000g離心10分鐘，收集菌體，以PBS洗滌兩次菌體后進(jìn)行超聲波破碎，破碎條件為10%最大功率，工作5秒，停5秒，持續(xù)10分鐘。破碎后的樣品以12000g離心10分鐘，收集包涵體沉淀，將包涵體以Wash buffer (2OmM tris-Hcl, ρΗ8.8，IM尿素)洗滌3次后加入Solut1n buffer (2OmM tris-Hcl, ρΗ8.8，8Μ尿素)溶解，被溶解后的包涵體以Binding buffer (20mM tris-Hcl, pH8.8 )透析4°C過(guò)夜進(jìn)行重折疊，透析液以HisTrap FF (GE Healthcare)進(jìn)行純化，經(jīng)Elut1n buffer (2OmM tris-Hcl,pH8.8，IM咪唑)梯度洗脫后收集不同組分的純化產(chǎn)物并以SDS-PAGE檢測(cè)，收集0mp22蛋白所在組分(圖2)。
[0034]實(shí)施例4:重組亞單位疫苗抗原0mp22的動(dòng)物免疫
將重組的0mp22以不同劑量(5，10，20，50ug)與Img氫氧化鋁佐劑1:1混合，以混合液分別在O天、14天、28天進(jìn)行三次皮下或肌肉免疫。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)別的環(huán)境中。第二次及第三次免疫后的7天或21天采血進(jìn)行0mp22特異性抗體的ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果證實(shí)特異性抗體滴度超過(guò)I X 104(圖3)；以免疫后血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果證明經(jīng)0mp22免疫后的血清能特異性識(shí)別多株臨床分離株中的0mp22蛋白(圖4)。以此證明經(jīng)鮑曼不動(dòng)桿菌0mp22免疫后，小鼠產(chǎn)生了高水平的特異性抗體水平。
[0035]實(shí)施例5:重組亞單位疫苗抗原0mp22的體內(nèi)主動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)
經(jīng)不同劑量的0mp22亞單位疫苗抗原免疫三次后的小鼠，在最后一次免疫后三周進(jìn)行臨床分離的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的腹腔感染，以I X 16CFU濃度的鮑曼不動(dòng)桿菌混合10%的豬粘液素(Sigma公司)通過(guò)腹腔感染小鼠，感染后的7天對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)50ug劑量0mp22免疫后的小鼠存活率為100%，對(duì)照組存活率為O(圖5)，同時(shí)在小鼠外周血(圖7)、肝臟、肺、腎臟、脾臟中的細(xì)菌載量在疫苗組中較對(duì)照組降低了 14-1O6倍(圖6)，且在血清中炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低(圖13)，顯示了該亞單位疫苗抗原具有較高的免疫保護(hù)性。
[0036]實(shí)施例6:重組亞單位疫苗抗原0mp22的被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)
經(jīng)50ug 0mp22亞單位疫苗抗原免疫三次后的小鼠，取其抗血清，在進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌Abl感染前I小時(shí)通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，隨后以I X 16CFU濃度的鮑曼不動(dòng)桿菌Abl混合10%的豬粘液素通過(guò)腹腔感染小鼠，感染后的7天對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)被動(dòng)免疫后的小鼠保持了 100%的存活率，而對(duì)照組為0(圖8)，且在小鼠外周血(圖10)、肝臟、肺、腎臟、脾臟中的細(xì)菌載量在疫苗組中較對(duì)照組降低了 15-1O6倍(圖9)，且在血清中炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低(圖14)，顯示了針對(duì)0mp22的抗血清具有被動(dòng)免疫效果，在體內(nèi)具有有效的殺菌活性。
[0037]實(shí)施例7:抗0mp22血清的交叉保護(hù)性試驗(yàn)
經(jīng)50ug 0mp22亞單位疫苗抗原免疫三次后的小鼠，取其抗血清，在細(xì)菌感染前I小時(shí)通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，隨后以不同醫(yī)院分離的I X 16CFU濃度的鮑曼不動(dòng)桿菌Ab4和Abl4分別混合10%的豬粘液素通過(guò)腹腔感染小鼠，感染后的7天對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)被動(dòng)免疫后的小鼠感染Ab4后仍保持了較高的存活率(圖11)，感染Ab 14后保持了 100%的存活率(圖12)，而對(duì)照組的存活率均為O。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗，其特征在于:該亞單位疫苗的抗原即鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白Omp22，其基因核酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其編碼的蛋白即為鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗抗原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:2所示。2.權(quán)利要求1中所述的鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗，其特征在于:所述的鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗抗原蛋白Omp22具有激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的感染具有高效的免疫保護(hù)作用。3.權(quán)利要求2中所述的鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗抗原(Omp22)的應(yīng)用，其特征在于:將所述的Omp22蛋白按照50yg每劑的接種量，與Img氫氧化招佐劑按照體積比1:1進(jìn)行混合，混合液進(jìn)行皮下或肌肉三次接種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了一種鮑曼不動(dòng)桿菌的亞單位疫苗抗原蛋白與其應(yīng)用方法。鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白Omp22的基因核酸序列如序列表SEQ？IDNO:1所示，其編碼的蛋白即為鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗抗原蛋白氨基酸序列，如表SEQ？IDNO:2所示。其制備方法：構(gòu)建Omp22疫苗抗原的原核表達(dá)質(zhì)粒Omp22-pThioHisA，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)后回收并純化Omp22重組蛋白，將該重組蛋白與氫氧化鋁佐劑混合，該混合液可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的感染具有高效的免疫保護(hù)作用，可用于預(yù)防鮑曼不動(dòng)桿菌的感染。
【IPC分類】C07K14/21, C12N15/11, A61K39/02, A61P31/04
【公開號(hào)】CN105497884
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510978193
【發(fā)明人】馬雁冰, 黃惟巍, 姚宇峰, 楊旭, 孫文佳, 劉存寶, 白紅妹
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月23日