otein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem 279, 49523-49532)。
[0077] I. 3主要試劑
[0078] Dihydroergocristine, dihydroergotamine, ergotamine,2-bromo-a -ergoc ryptine, metergoline, pergolide mesylate salt and DAPT i勻貝勾自 Sigma-Aldrich。 a -ergociyptine 和 CABA 購自 Toronto Research Qiemicals Inc.。四環(huán)素購自 Applichem。Methylergometrine購買自Tocris。AMBE由吉爾多獻（上海）有限公司合成。
[0079] X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購自 Roche 公司。Glo lysis buffer, Bright-Glo Iuciferase assay reagents 矛口 CytoTox-OneTm kit 丈勻貝勾自 Promega。 DMEM、FBS、Blasticidine、Zeocine、Hygromycine B、G418、Puromycine、Lipofectamine 2000、Opti-MEM、膜蛋白酶、青霉素/鏈霉素均購自于Invitrogen公司。human Beta Amyloid[l-x]，[l-40]or[l_42]colorimetric ELISA 試劑盒購自 I 化公司。
[0080] C-T15 (識別 APP 和 APP-CT巧購自 Sigma-Aldrich，MAB1563 或 abl34195 (識別 PSl-NT 巧分別購自 Millipore 和 Abeam, UD-I(識別Pen-S)來自于 Dr.H. Helena Karl 紳熱 m 化arolinska Institute, Sweden), NCT164(識別 NCT)購自抓 Bioscience, anti-Notch Abl744antibody (識別 NICD)購自 Cell Signaling Technology,識別 P-actin 的抗體購 自abmart公司。.
[0081] 其它藥品或試劑均購自Sigma-Aldrich。
[0082] 叫traClear 封板膜來自 Platemax PCR-TS，美國。
[0083] 本發(fā)明中采用的實驗方法如下：
[0084] 實施例1、基于APP底物的Y-分泌酶活力測定的工程細胞株（簡稱TlOO)的構建
[0085] 基于APP底物的Y-分泌酶活力測定的工程細胞株（簡稱TlOO)的構建方法，具 體詳見生物技術2013年第23卷第4期《Y -分泌酶抑制劑的高通量細胞篩選模型的建立 及研究〉〉，雷希領，于晶，吳方。
[0086] 亦即，主要構建方法如下：
[0087] 將化ex化Ia細胞W 5X IO5個/ml的濃度接種于6孔板，細胞在6孔板中長到 90 % -95 % 時更換培養(yǎng)基為 Opti-MEM。取加 g pGL4. 31 [luc2p/GAL4UAS/Hygro]質粒、 5ug的C99-GV-pcDNA4/T0質粒按照Lipofectamine 2000說明書轉染細胞，轉染48小時 后用膜蛋白酶消化下細胞后將其懸浮于12ml含有加 g/ml的Blasticidine、250ug/ml的 Hygromycine、200ug/ml的Zeocine的DMEM的培養(yǎng)基，用血細胞計數(shù)板計數(shù)后用含有選擇性 抗生素的培養(yǎng)基稀釋細胞濃度為5個細胞/ml。將細胞分入96孔板中，每個孔加入200ul， W保證每一個孔一個細胞。挑選單克隆擴大培養(yǎng)后將其接種于96-孔板中，加入終濃度為 lug/ml的四環(huán)素誘導并加入終濃度IOOnM的Y -分泌酶抑制劑DAPT處理24小時。加入 Bri曲t-Glo Iuciferase System Kit提供的裂解液充分裂解后將細胞裂解液轉移至Nunc 的96孔板中然后加入相應的英光色素酶底物，酶標儀檢測讀數(shù)。讀數(shù)最高且加入DAPT后 讀數(shù)與對照間差值最大的細胞株即為理想的用于篩選的細胞株一TlOO細胞。
[0088] 實施例2、測定不同濃度的DAPT在TlOO細胞株上對Y -分泌酶活性的抑制
[0089] 我們用實施例1中新構建的細胞篩選模型測試了已知的Y -分泌酶的非過渡態(tài)類 似物抑制劑DAPT。具體操作如下：96孔板中接種IOOul濃度為5X 1〇5個/ml的TlOO細 胞。待細胞生長24小時后加入Iul (終濃度，lug/ml)的四環(huán)素誘導C99-GV的表達，同時 加入IuIDMSO(終濃度，1% )為對照，并加入Iul終濃度分別為10uM、luM、0. luM、0.0 luM的 化合物?；衔锾幚?4小時后加入IOOul的細胞裂解液，裂解5分鐘后，取90ul裂解液于 NUNC的96孔板子中，并加90ul英光色素酶底物，酶標儀下測試英光色素酶活力。
[0090] 我們W DMSO作為陰性化合物評價抑制劑的抑制率（抑制率= [I-(Vcempeund-VuMnduced)/^(VDMSD-Vunmduced)] *100% )。我們測得 DAPT 的 IC日。約為 600nM，我們測 得的ICe。與報道的半致死計量基本相同。
[0091] 實施例3、Y -分泌酶純酶和重組蛋白APP-ClOO的純化
[0092] Y -分泌酶純酶從過表達Y -分泌酶四個組分的工程細胞株S20中純化得到。 ClOOflag是Y-分泌酶的直接底物，其是APP經目-分泌酶酶切后的片段C99并偶聯(lián)了一個 flag標簽 W便于純化。其均參照化trick C. Rraering 中 BiochemistiT. 43, 9774-89 (2004) 中描述的方法純化得到。
[0093] 實施例4、測定不同濃度的化合物雙居麥角汀在TlOO細胞株上對Y -分泌酶活性 的抑制
[0094] 96孔板中接種IOOul濃度為5 X IO5個/ml的Trex化Ia C99細胞。待細胞生長24 小時后加入Iul (終濃度，lug/ml)的四環(huán)素誘導C99-GV的表達，同時加入Iul DMSO (終濃 度，1% )和IuIDAPT (終濃度，2umol .L 1)的為對照，并加入Iul終濃度分別為50uM、20uM、 10uM、5uM、2uM的化合物。化合物處理24小時后加入IOOul的細胞裂解液，裂解5分鐘后， 取90ul裂解液于NUNC的96孔板子中，并加90ul英光色素酶底物，酶標儀下測試英光色素 酶活力。同時，相應的培養(yǎng)基測乳酸脫氨酶活力，W評價其細胞毒性。得到的濃度-活性曲 線。如圖2所示；化合物雙居麥角汀在T-IOO細胞株上測得的ICw~25uM，且其沒有細胞 毒性。
[0095] 實施例5、測定不同濃度的化合物雙居麥角汀對細胞內內源性Y -分泌酶活性的 抑制
[0096] 在24孔板中接種500ul濃度2X IO5個/ml的肥K293或者AG06848細胞。待細 胞生長24h后分別用20uM、10uM、5uM、2uM濃度的雙居麥角汀處理細胞，加相同濃度的DMSO 做對照，并加20uM的DAPT做對照，同時更換細胞培養(yǎng)液。待處理24h后，細胞用含有1 % NP-40的裂解液裂解，BCA法定量后，取相同蛋白量的蛋白進行凝膠電泳，并用C-T15抗體檢 測APP表達量的變化及APP-CTF積聚，目-actin作為內參。同時相應的培養(yǎng)基用A-beta total試劑盒檢測A-beta量的變化。得到結果如圖3所示；在肥K293細胞中，雙居麥角汀 計量依賴性的引起APP-CTFs積聚并在20uM條件下降低大約30%的A-beta的量；在來源于 阿爾茨海默癥病人的，PSl基因上包含有突變（A246巧的成纖維細胞中，其亦引起APP-CTFs 的積聚和約40 %的A-beta量的減少。
[0097] 實施例6、測定不同濃度的化合物雙居麥角汀對細胞內Notchl途徑的影響
[0098] 在24孔板中接種500ul濃度2X IO5個/ml的肥K293細胞。待細胞生長24h后， 瞬時轉染APP基因或者h