黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的提取方法，以及該提取得到的活性組分在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃綠蜜環(huán)菌，俗稱黃蘑菇，其風(fēng)味獨(dú)特，是一種優(yōu)良的野生食用與藥用真菌，也是一種重要的高原生物資源，在青海祁連被稱為祁連“八寶”之一。野生黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體子肥厚，味道鮮美、滑脆爽口，具有特殊的香味，且營(yíng)養(yǎng)豐富，含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、生物堿、揮發(fā)油和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有少量有機(jī)酸、黃酮、強(qiáng)心苷、揮發(fā)油、甾體三萜類、苷類、香豆素萜類、鞣質(zhì)、酚類等化合物。特別是砸的含量很高，具有很強(qiáng)的抗肺癌功能。研究表明黃綠蜜環(huán)菌還具有防治神經(jīng)炎、腳氣病、促進(jìn)兒童發(fā)育、抗衰老、抗流感以及抗腫瘤等生物活性。
[0003]公開號(hào)為101709322B的中國(guó)發(fā)明專利“生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的方法”公開了一種通過黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸；公開號(hào)為101113413B的中國(guó)發(fā)明專利“一種黃綠蜜環(huán)菌纖溶酶及其生產(chǎn)方法”公開了一種利用黃綠蜜環(huán)菌代謝合成纖溶酶的方法；公開號(hào)為100999750B的中國(guó)發(fā)明專利“一種微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化對(duì)羥基苯甲醇合成天麻素的方法”公開了一種利用黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化合成天麻素的方法。上述中國(guó)專利文件中關(guān)于黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體的研究，主要集中在生物轉(zhuǎn)化上，并未涉及黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體的化學(xué)成分，對(duì)其化學(xué)成分的研究甚少。
[0004]李世峰等發(fā)表的“兩種野生食用菌抗氧化及抗腫瘤活性研究”(中國(guó)食用菌[J].2004, 24(3):58-63)中公開了一種黃綠蜜環(huán)菌抗腫瘤活性組分的提取方法:將子實(shí)體粉碎，用80%乙醇加熱回流3h，重復(fù)提取3次，提取液合并濃縮后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，剩余部分用三倍體積無水乙醇沉淀，共得到石油醚相、乙酸乙酯相、剩余醇溶相和水溶性粗多糖四相提取物，分別烘干備用。該方法存在以下缺陷:(I)采用傳統(tǒng)的溶劑萃取法(液液萃取)進(jìn)行有效活性組分的提取，批次之間不具有重復(fù)性，即無法保證第一批萃取得到的物質(zhì)組分與第二批萃取得到的物質(zhì)組分之間的一致性；(2)采用這種液液萃取的方法，物質(zhì)在不同溶劑中的分配過程需要的時(shí)間非常長(zhǎng)，而且要多次萃取(一般三次，每次換新的溶劑)、然后合并，這導(dǎo)致整個(gè)提取過程的時(shí)間周期長(zhǎng)，試劑耗費(fèi)量大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的提取方法，該方法對(duì)樣品初步處理后，主要采用高效液相色譜進(jìn)行分離純化，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的提取方法，該方法包括以下步驟:
[0008](I)以黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體為原料，室溫陰干處理后，在40?60°C溫度下烘干脫水，然后進(jìn)行超微粉碎處理，獲得超微粉；
[0009](2)將步驟⑴所得的超微粉按Ig: (5?15)mL的料液比加入乙醇，在30?70°C溫度下提取I?6h，每0.5h?Ih攪拌一次，室溫靜止I?5h后離心，取沉淀重復(fù)I?3次，所得上清液減壓濃縮至膏狀，獲得黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物；
[0010](3)按質(zhì)量體積比(g/mL)加入5?10倍的正己烷-乙醇二元混合溶劑，進(jìn)行超聲溶解，溶解后過有機(jī)濾膜，得到黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物的樣品溶液；
[0011](4)將步驟(3)獲得的小分子乙醇提取物的樣品溶液在以填料為正相分離材料Silica的制備色譜上進(jìn)行分離純化，采用A為正己烷、B為乙醇的二元流動(dòng)相體系，分離純化的條件為:0?18min 93% A-7% B(即按體積百分比93% A、7% B配比而成，下同理)等度洗脫、18?28min 60% A_40% B等度洗脫、28?45min 5% A_95% B等度洗脫，根據(jù)紫外吸收光譜收集27.25-28.5min洗脫液(Fr7)，減壓濃縮并烘干，得到本發(fā)明抗肺癌活性組分。
[0012]作為優(yōu)選，所述步驟(I)中超微粉碎在-20?4°C溫度下進(jìn)行，時(shí)間為5?20min。
[0013]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中乙醇的提取溫度為30?70°C，優(yōu)選為65°C。
[0014]作為優(yōu)選，所述步驟(3)中正己烷-乙醇二元混合溶劑的正己烷與乙醇的體積比為 2: I。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟(3)中有機(jī)濾膜的孔徑為0.22?0.45 μ m
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟(4)中制備色譜采用的分離色譜柱的直徑為50mm、柱長(zhǎng)為250mm，正相分離材料Silica的粒徑為8?10 μ m。
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟(4)中制備色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，進(jìn)樣量為1.4g，流速為50mL/mino
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟(2)、(4)中減壓濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行，工藝條件為溫度70°C、真空度 0.08Mpa。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分在制備抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品中的應(yīng)用。該黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊、注射劑等。
[0020]按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的理解，該黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的給藥劑量應(yīng)根據(jù)治療對(duì)象的年齡、體重、疾病嚴(yán)重程度等因素而定，一般可以是100?200mg/天。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著效果:
[0022]1、先采用乙醇對(duì)黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體超微粉進(jìn)行提取，將其中的極性小分子物質(zhì)提取出，達(dá)到初步分離效果，有利于目的組分的提取，并且乙醇可回收再利用，既節(jié)約了提取成本，又低毒無污染。
[0023]2、再使用高效液相色譜進(jìn)行目的活性組分的分離:使用乙醇提取得到極性小分子物質(zhì)，經(jīng)過試驗(yàn)摸索，正己烷:乙醇=2: I的混合溶劑對(duì)其溶解性很好；Silica色譜柱對(duì)于非極性和中極性物質(zhì)有較好的分離效果，且各組分之間分離度也比較理想；而在本發(fā)明的洗脫條件下，可以保證進(jìn)樣量和流速在常規(guī)范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)均具有良好的重復(fù)性，使本發(fā)明方法得到的組分批次間一致性高，穩(wěn)定性好，可操作程度強(qiáng)。
[0024]3、采用制備色譜對(duì)含有活性組分的小分子提取物進(jìn)行分離純化，相對(duì)于傳統(tǒng)的溶劑萃取法，該制備方法穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，制備量大，試劑消耗量小，得到的物質(zhì)組分批次之間一致性高，分離純化過程的時(shí)間周期短。
[0025]4、本方法經(jīng)過超微粉碎、溶劑提取、過濾雜質(zhì)、制備色譜分離純化等一系列步驟后，從黃綠蜜環(huán)菌乙醇提取物中分離得到了活性組分，工藝簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，具有制備量大、穩(wěn)定可控、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，所得活性組分可用于研發(fā)制備抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品。
[0026]5、本發(fā)明拓展了抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品的原料來源，擴(kuò)大了黃綠蜜環(huán)菌的應(yīng)用范圍，使黃綠蜜環(huán)菌成為抗肺癌藥物或抗肺癌保健食品的有效組分原料，顯著提高了黃綠蜜環(huán)菌的附加值。
【附圖說明】
[0027]圖1所示的是本發(fā)明各實(shí)施例黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的提取方法中的色譜分離圖；
[0028]圖2所示的是本發(fā)明目的抗肺癌活性組分的抗肺癌活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0030]1、原料、材料:
[0031]黃綠蜜環(huán)菌采摘自青海省、由中科院西北高原生物研究所王啟蘭老師鑒定并經(jīng)過鑒定；A549細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院提供。
[0032]2、試劑:
[0033]分析級(jí)乙醇購(gòu)自天津市康科德科技有限公司；色譜級(jí)正己烷購(gòu)自Honeywell公司；DMS0購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。
[0034]3、儀器設(shè)備:
[0035]超微粉碎機(jī)購(gòu)自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠；正相Silica色譜柱購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司；制備型高效液相色譜儀購(gòu)自江蘇漢邦科技有限公司；細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自ACEAB1sciences Inc (艾森生物科學(xué)公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自英國(guó)RS B1tech公司。
[0036]實(shí)施例1:
[0037]本實(shí)施例黃綠蜜環(huán)菌抗肺癌活性組分的提取方法，包括以下步驟:
[0038](I)黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體室溫陰干處理后，在60°C烘干脫水，然后在_20°C超微粉碎5min，即得黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體超微粉。
[0039](2)取上述黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體超微粉lKg，加入12.0L分析乙醇在70°C提取6h，每
0.5h攪拌一次。室溫靜止5h后離心，取沉淀重復(fù)3次，合并所得上清液減壓濃縮至膏狀并于烘箱70°C干燥處理，即獲得黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物。
[0040](3)加入10倍體積的色譜級(jí)正己烷-色譜級(jí)乙醇混合溶劑將步驟(2)所得的小分子提取物進(jìn)行超聲溶解，正己烷與乙醇的比例為2:1。溶解后過0.22 μm有機(jī)濾膜，即得到黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物的樣品溶液。
[0041](4)將獲得的黃綠蜜環(huán)菌小分子乙醇提取物的樣品溶液在以填料為正相分離材料Silica(粒徑8 μπι)的制備色譜上進(jìn)行分離純化，采用的分離色譜柱直徑為50mm、柱長(zhǎng)為250mm，采用A為正己烷、B為乙醇二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離純化；分離純化的條件為:0?18min，93% A-7% B(A 與 B 體積比 93: 7 混合而成，下同理)；18 ?28min，60 % A-40 %B ；28?45min，5% A-95% B，按照梯度對(duì)樣品進(jìn)行洗脫；