專利名稱：阿魏酸酯衍生物,3,9－二阿魏基香豆雌酚和含有它的美容產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及3，9-二阿魏基香豆雌酚和一種含有它的皮膚化妝品，更具體地說，涉及一種新型皮膚化妝品，從美容的觀點(diǎn)來看它能夠提高抗衰老、美白和毛發(fā)種植作用并且能夠治療皮膚的失調(diào)。
背景技術(shù)：
皮膚老化是指隨年齡增長而形成皺紋或下垂的情況。最近關(guān)于皮膚老化的研究大致分為兩個(gè)方面；一方面是組織學(xué)研究，例如基質(zhì)形成或結(jié)締組織如皮膚膠原遭到破壞的機(jī)理，另一方面是免疫學(xué)研究，例如氧化壓力與老化之間的關(guān)系。
首先，從組織學(xué)的觀點(diǎn)來看，皮膚收縮和下垂的原因是膠原蛋白纖維或彈性蛋白纖維的退化[M.Oshima等，Matrix，13，187(1993)；S.Harumiya等，J.Biocham.，120，745(1996)]。此外皮下組織和肌肉組織的支撐力下降也增加了皺紋。特別是膠原，它是膠原蛋白纖維和彈性蛋白的最初原料，在成纖維細(xì)胞中合成并形成膠原蛋白纖維和彈性蛋白。
成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜具有信號(hào)受體糖蛋白，它能夠特異性地識(shí)別營養(yǎng)通道和胞外物質(zhì)。此受體與離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道連接，并且如果外部物質(zhì)到達(dá)成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體，信號(hào)就會(huì)傳送到細(xì)胞中，最終到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)部。指令合成膠原蛋白，且比普通狀態(tài)下更多的蛋白質(zhì)被合成出來并釋放出細(xì)胞核。通過細(xì)胞中的各種細(xì)胞器，蛋白質(zhì)生長并從細(xì)胞中釋放出來。釋放出來的蛋白質(zhì)成為細(xì)胞之間膠原纖維或彈性蛋白的基礎(chǔ)，因此有彈性的皮膚具有較強(qiáng)的支撐力[A.Hayasho等，F(xiàn)ragnance J.，2，32(1992)]。但是隨年齡的增長真皮中膠原的生物合成急劇減少，并且各種壓力如紫外線或環(huán)境污染導(dǎo)致形成皺紋[M.Oshima等，Matrix，13，187(1993)]。
從免疫學(xué)的觀點(diǎn)來看，人體內(nèi)或體外的氧化壓力破壞了細(xì)胞和生物結(jié)締組織，這會(huì)增加皺紋的數(shù)目并使它們更深。此外，當(dāng)生物抗氧化材料的生物合成能力隨年齡增長而降低時(shí)，氧化材料的活化不可避免，如活性氧會(huì)逸出體外或者不可避免地發(fā)生代謝，導(dǎo)致加速皺紋形成[L.H.Kligman等，J.Invest.Dermatol.93，210(1989)；H.Tanaka等，Arch.Dermatol.Res.，285，352(1993)；M.D.Carbonare等，J.Photochem.Photobiol.B.Biol.，14，105(1992)；T.Okada等，F(xiàn)ragnance J.，1123(1993)]。因此為了防止機(jī)體包括皮膚的氧化，必須要人工攝取或使用抗氧化劑。
自然界有許多材料具有抗氧化功能?？寡趸δ艿脑砜梢园匆韵路绞浇忉?。形成細(xì)胞膜的脂質(zhì)容易被過氧化物或其它氧活性種所攻擊，這些活性氧產(chǎn)生于環(huán)境因素，如紫外線或污染或者內(nèi)部因素如精神壓力。它們轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化脂質(zhì)，并且形成自由基聚合物，導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞[T.Shibamoto等，American Chem Soc 154(1994)]。保護(hù)胞內(nèi)物質(zhì)的細(xì)胞膜的損壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壞死和皮膚老化。在細(xì)胞膜脂質(zhì)被氧化之前抗氧化材料先被氧化，因此防止了脂質(zhì)被氧化。到目前為止，在化妝品行業(yè)所使用的抗氧化材料是各種植物提取物，如生育酚和抗壞血酸。但是有一個(gè)問題就是它們非常不穩(wěn)定或者沒有表現(xiàn)出足夠的效果。
目前對(duì)于大部分應(yīng)用于抗老化化妝品中的功能材料，由于技術(shù)上的限制，抗老化效果僅僅在體外試驗(yàn)結(jié)果和臨床試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行討論，而沒有證實(shí)組織學(xué)方面的改進(jìn)。也就是說，這些年來作為化妝品開發(fā)的抗老化材料僅集中在體外免疫學(xué)效應(yīng)。因此，不能確信這些材料會(huì)帶來實(shí)質(zhì)性的抗皺紋效果。
基于以上情況，本發(fā)明人發(fā)明了具有超強(qiáng)抗氧化作用的3，9-二阿魏基香豆雌酚，它是由阿魏酸和香豆雌酚合成的，它可以解決化學(xué)不穩(wěn)定性或缺乏效果的問題，并且對(duì)于抑制老化和皺紋的形成具有組織學(xué)和免疫學(xué)效應(yīng)。
發(fā)明概述開發(fā)具有實(shí)質(zhì)性抗老化功能的材料并不容易。如上所述，原材料和以抗老化概念市場化的產(chǎn)品集中在抗老化效果上，但是在實(shí)踐中也沒能獲得所希望的效果。
抗氧化作用可以在一定程度上防止內(nèi)部產(chǎn)生或外部進(jìn)入的活性氧種類的攻擊。但是從組織學(xué)的觀點(diǎn)來看，這種功能沒有保證實(shí)質(zhì)性的抗老化效果，如皺紋的明顯消失。因此，已經(jīng)需要開發(fā)由抗氧化功能而具有免疫學(xué)抗老化功能的材料或產(chǎn)品，并且進(jìn)一步能夠加速皮膚膠原的產(chǎn)生，由此皮膚恢復(fù)和皮膚彈性以及皺紋改進(jìn)效果都是優(yōu)異的。
作為基本方向，本發(fā)明人試圖開發(fā)能夠加強(qiáng)免疫學(xué)功能的材料以用于抗老化以及在組織學(xué)上改進(jìn)皮膚的皺紋?？紤]到上述內(nèi)容，我們由阿魏酸和香豆雌酚合成了一種新型的抗老化材料，其中阿魏酸以其優(yōu)異的抗氧化性能著稱，而香豆雌酚則作為前體以其加速膠原合成的優(yōu)異性能而著稱。
阿魏酸存在于阿魏、松脂、水稻植物的葉子中，并以其抗菌性、抗癌性和適度的抗氧化性能而著稱[M.G.Smart等，Aust.J.PlantPhysical.6，485(1979)]。此外，已知它還具有防止血栓凝聚的功能，并且用作食品的一種防腐劑[T.Tsukiya等，Jpn.Lolai7518621(1975)，C.A.83，7602v(1975)]。阿魏酸是從植物樹脂中提取出來的，并由澳大利亞的H.Hlasiwets及其同事于1866年命名[H.Hlasiwets等，Ann.138，61(1866)]。
從氧分子衍生出的氧活性種基本上是在代謝過程中產(chǎn)生的，且在人體內(nèi)它們的濃度應(yīng)當(dāng)保持穩(wěn)定。濃度太低會(huì)對(duì)代謝造成不良影響，而濃度太高則會(huì)導(dǎo)致生物分子如細(xì)胞器的細(xì)胞脂質(zhì)膜的過氧化[A.M.Kligman等，J.Am.Acad.Dermatol.，15，836(1986)；E.J.VanScott等，Cutis.，43，222(1989)]。
阿魏酸對(duì)衍生于氧分子的各種氧活性種具有輕微的氧化能力，而對(duì)于氧化的過渡金屬如鐵離子或銅離子則具有較強(qiáng)的氧化能力[M.G.Smart等，Aust.J.Plant Physical.6，485(1979)]。此外還報(bào)道了阿魏酸被用來防止天然油脂如亞麻籽油的自動(dòng)氧化。已經(jīng)證實(shí)阿魏酸是化妝品、醫(yī)療和食品領(lǐng)域中作為抗氧化材料的一種活性材料。
然而，阿魏酸只具有簡單的抗氧化功能，并且主要用作添加劑以防止產(chǎn)品中的有效組分被過渡金屬或其它引入的氧活性種所氧化[T.Tsukiya等，Jpn.Kokai 751862191975]，C.A.83，7602v(1975)]。
香豆雌酚通常見于豆科植物中，具有適度的抗氧化效果，并且已知具有抗炎癥、抗菌和抗病毒作用[Darbarwar.M.等，J.Sci.Ind.Res.，35，297(1982)；Jeffrey，B.H.等，Phytochemical Dictionary，Taylor&Francis，London，pp418(1933)]。
盡管其準(zhǔn)確的機(jī)理尚未清楚，但已知它能加速結(jié)締組織如皮膚和內(nèi)部器官中膠原的生成，并且據(jù)信它具有抗老化或抗皺紋的效果[Bickoff，E.M.等，J.Anim.Sci.，19，4(1960)]。但是在黑豆中香豆雌酚的含量極少，因此簡單的提取方法達(dá)不到所需效果。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是以大量合成的方式來生產(chǎn)香豆雌酚并將其與具有優(yōu)異抗氧化效果的材料如阿魏酸結(jié)合起來，由此在化妝品領(lǐng)域開發(fā)一種具有實(shí)質(zhì)性抗老化效果和改進(jìn)皮膚彈性效果并兼有美白效果的新材料。
盡管已知大約有三種合成香豆雌酚的方法，但合成香豆雌酚并未統(tǒng)一化。本發(fā)明人使用了這三種方法之一[E.M.Bickoff等，J.Am.Chem.Soc.，80，4381(1958)]。所使用的方法是由總共7個(gè)步驟組成的總合成方法。本發(fā)明生產(chǎn)了一種具有較強(qiáng)抗氧化效果并通過加速皮膚結(jié)締組織的生成而兼有抗老化和皮膚美白效果的新材料。
附圖簡述

圖1表明根據(jù)本發(fā)明的3，9-二阿魏基香豆雌酚的合成方法和化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2表明分別在第一組和對(duì)照組無毛大鼠的皮膚中有關(guān)膠原增加的組織學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，其中在第一組中使用本發(fā)明的3，9-二阿魏基香豆雌酚。(A原生質(zhì)，B膠原(藍(lán))，C細(xì)胞核，D皮脂腺，E汗腺，F(xiàn)脂肪，G神經(jīng)層)。
發(fā)明詳述(1)香豆雌酚的合成為了研究所合成的材料的物理和化學(xué)性能，使用Mel-TempII(實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，美國)無校準(zhǔn)來測量熔點(diǎn)。為了研究合成的中間體材料和最終化合物的結(jié)構(gòu)，使用日立CW-60MHz和Varian FT-500MHz的1H-NMR光譜儀得到1H-NMR譜圖，使用Varian FT-500MHz的13C-NMR光譜儀得到13C-NMR譜圖，使用Jasco FT-IR-5300光譜儀得到紅外譜圖，使用Carry UV-VIS光譜儀得到紫外吸收譜圖?；瘜W(xué)位移以δ單位示出，以TMS(四甲基硅烷)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物，并且數(shù)據(jù)以“化學(xué)位移(積分強(qiáng)度，多重性，偶合常數(shù))”記錄。
作為合成香豆雌酚的第一個(gè)步驟，50克2，4-二甲氧基苯甲醛、40克饒丹寧和150克乙酸鈉溶解在200毫升乙酸中，然后加熱到約130℃以合成2，4-二甲氧基苯亞甲基-饒丹寧。該產(chǎn)物幾乎不溶，并且在瓶中迅速變成固體。將其冷卻后，加入200毫升蒸餾水以萃取乙酸鈉和乙酸。隨后過濾此固體產(chǎn)物，并用過量蒸餾水洗滌直至乙酸的味道幾乎都除去。用約250毫升的熱乙醇萃取并除去剩余的雜質(zhì)直至獲得細(xì)小的針狀黃色產(chǎn)物。
作為合成2，4-二甲氧基苯基硫代丙酮酸的第二個(gè)步驟，將20克第一步得到的2，4-二甲氧基苯亞甲基-饒丹寧漂浮在80毫升15％的氫氧化鈉水溶液和20毫升14％的硫酸鈉的混合物中，然后在氮?dú)庵袑⑵鋽嚢璨⒓訜岬?00℃(大約10分鐘)直至固體完全溶解。此混合物在冰浴中冷卻并設(shè)置pH值為2-4以得到沉淀，過濾此沉淀物，用蒸餾水洗滌，然后用200毫升乙酸乙酯萃取。除去水層后，完全濃縮乙酸乙酯以得到暗橙色的針狀晶體。
作為合成2，4-二甲氧基苯基丙酮酸肟的第三個(gè)步驟，18.79克甲醇鈉溶解在無水甲醇中，加入鹽酸化羥基胺濃縮水溶液并攪拌5分鐘以得到羥基胺。過濾羥基胺溶液之后，加入24克2，4-二甲氧基苯基硫代丙酮酸，并回流加熱直至不再排出硫化氫(大約1小時(shí))。
冷卻反應(yīng)后的混合物并在減壓下除去甲醇。然后用過量的5％氫氧化鈉萃取出極少量的雜質(zhì)，然后沉淀并過濾。通過在水溶液中加入200毫升乙酸乙酯來萃取和除去雜質(zhì)后，用35％的鹽酸水溶液將其pH值設(shè)定在2.0以萃取出固體產(chǎn)物。萃取出的固體產(chǎn)物用200毫升乙酸乙酯再萃取以除去殘余的水，再次真空濃縮并除去乙酸乙酯。最后抽真空以得到細(xì)小的針狀晶體。
作為合成2，4-二甲氧基苯基乙腈的第四個(gè)步驟，10克干燥的肟和6毫升無水乙酸酯在水浴中一起加熱到100℃。它們非常劇烈地反應(yīng)2-3分鐘。加入約50毫升蒸餾水后劇烈攪拌之后，它們呈油狀，然后立即轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w。用稀碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用2-丙醇再蒸餾，得到象牙狀粗針狀晶體。
作為合成α-(2，4-二甲氧基苯基)-2，4-二羥基乙酰苯的第五個(gè)步驟，4.4克2，4-二甲氧基苯基乙腈和8克間苯二酚溶解在50毫升無水乙醚中，用HCl氣體飽和約2小時(shí)，然后在0℃保持5天。過濾沉淀在乙醚溶劑中的酮亞胺鹽，然后加到蒸餾水中，隨后在100℃加熱直至形成透明的板狀沉淀物。過濾此沉淀物，并在填充有藍(lán)色二氧化硅的干燥器中真空干燥。
作為合成3-(2，4-二甲氧基苯基)-4，7-二羥基香豆素的第六個(gè)步驟，6.69克α-(2，4-二甲氧基苯基)-2，4-二羥基乙酰苯和4.1毫升氯代甲酸甲酯在150毫升無水丙酮中回流并加熱4小時(shí)。冷卻反應(yīng)混合物，用300毫升蒸餾水稀釋，然后用35％的鹽酸酸化。過濾生成的沉淀物，通過真空蒸發(fā)除去丙酮，在殘留液中殘留的液體和殘留的沉淀物過濾，沉淀物溶解在100毫升甲醇中，加入少量茜素黃，然后加入溶于甲醇中的20％氫氧化鉀直至指示劑變成暗黃色，同時(shí)在氮?dú)庵袑⑵浼訜幔缓笤偌訜?0分鐘。
反應(yīng)后的混合物冷卻，并加入200毫升蒸餾水，然后用35％的鹽酸酸化以得到沉淀物。將沉淀物重結(jié)晶以得到白色粉末。作為合成香豆雌酚的最后步驟，在第六個(gè)步驟中得到的1.00克香豆素和2克鹽酸苯胺在氮?dú)庵杏?10-220℃加熱4小時(shí)。冷卻后的反應(yīng)混合物用蒸餾水洗滌以除去鹽酸苯胺，用少量乙酸乙酯和丙酮除去暗粉紅色的雜質(zhì)。
純化到一定程度后，將其溶解在丙酮和甲醇的混合物中，并用150毫克活性炭加熱10分鐘。用填充有硅藻土的過濾器將活性炭過濾掉，然后將其真空濃縮直至殘留約200毫升溶劑。殘留的溶劑在常溫下放置，然后過濾所得沉淀物。過濾后的香豆雌酚在真空干燥器中徹底干燥。為了證實(shí)在各個(gè)步驟所得到的材料以及它們的純度，分析它們的熔點(diǎn)以及各種光譜數(shù)據(jù)并與參考文獻(xiàn)做對(duì)比。
至于在第一個(gè)步驟中合成的2，4-二甲氧基苯甲饒丹寧，熔點(diǎn)為270-273℃(參考文獻(xiàn)中為275℃)，產(chǎn)率為90％。
至于在第二個(gè)步驟中合成的2，4-二甲氧基苯基硫代丙酮酸，產(chǎn)率為86％，熔點(diǎn)為166-168℃(參考文獻(xiàn)中為168-170℃)。
至于在第三個(gè)步驟中合成的2，4-二甲氧基苯基丙酮酸肟，產(chǎn)率為91％，熔點(diǎn)為149℃(參考文獻(xiàn)中為149℃)。在傅立葉變換紅外光譜中，峰位置在3232，3077，2961，1697，1616，1588，1509，1467，1422和1210cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，60MHz)光譜中，峰的位置在6.89(1H.m)，6.50(2H.m)，3.80(3H.s)，3.75(3H.s)和3.70(2H.s)ppm。
至于在第四個(gè)步驟中合成的2，4-二甲氧基苯基乙腈，產(chǎn)率幾乎定量，Rf為0.70(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔點(diǎn)為76℃(參考文獻(xiàn)中為76℃)。在傅立葉變換紅外光譜(IBr)中，峰位置在2952，2848，2244，1620，1509，1413，1267，1217，1044cm-1，在1H-NMR(CDCl3，60MHz)光譜中，峰的位置在7.24(1H，d，9.6Hz)，6.50(2H.m)，3.85(3H.s)，3.81(3H.s)，3.60(2H.s)ppm。
至于在第五個(gè)步驟中合成的α-(2，4-二甲氧基苯基)-2，4-二羥基乙酰苯，產(chǎn)率為35％，Rf為0.36(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔點(diǎn)為155℃(參考文獻(xiàn)中為156℃)。在傅立葉變換紅外光譜(KBr)中，峰位置在3261，3006，2951，1634，1507，1235，1154，1134cm-1，在1H-NMR(CDCl3，60MHz)光譜中，峰的位置在7.78(1H.m)，7.03(1H.m)，6.40(4H.m)，4.10(2H.s)，3.75(6H.d)ppm。
至于在第六個(gè)步驟中合成的3-(2，4-二甲氧基苯基)-4，7-二羥基香豆素，產(chǎn)率為87％，Rf為0.30(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔點(diǎn)為260-263℃(參考文獻(xiàn)中為263-264℃)。在傅立葉變換紅外光譜(KBr)中，峰位置在3343，3121，2968，2941，2851，1689，1622，1514，1277cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，60MHz)光譜中，峰的位置在7.78(1H.m)，7.15(4H.m)，7.70(4H.m)，3.82(3H.s)，3.75(3H.s)ppm。
至于在最后的步驟中合成的香豆雌酚，產(chǎn)率為70％，Rf為0.54(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，熔點(diǎn)為382-383℃(參考文獻(xiàn)中為385℃)。在傅立葉變換紅外光譜(KBr)中，峰位置在3377，1705，1631，1499，1264，1092，1014cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)光譜中，峰的位置在7.80(1H.d，8.42Hz)，7.66(1H.d，8.42Hz)，7.15(1H.d，2.20Hz)，6.91(3H.m)ppm。
13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)光譜中，峰的位置在165.23，163.45，162.75，161.57，159.90，158.60，126.64，124.57，118.55，117.82，117.74，108.10，107.05，105.99，102.66ppm，這表明合成進(jìn)行地很好。
第五個(gè)步驟的產(chǎn)率較低，這在參考文獻(xiàn)中也發(fā)現(xiàn)了。因此加倍反應(yīng)時(shí)間并提高反應(yīng)溫度是無效的。據(jù)信該反應(yīng)符合動(dòng)力學(xué)方面，進(jìn)行的并不好。通?？偖a(chǎn)率約為15％。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式實(shí)施例1阿魏酸酯衍生物，合成3，9-二阿魏基香豆雌酚為了通過阿魏酸和香豆雌酚的酯化反應(yīng)得到新的合成材料3，9-二阿魏基香豆雌酚，阿魏酸購于Sigma公司，香豆雌酚在上述方法中合成。
至于用來確定合成材料的物理性能的方法，熔點(diǎn)用Mel-TempII(實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，美國)來測定，無校準(zhǔn)。合成材料的結(jié)構(gòu)用BrukerFT-300MHz 1H-NMR光譜儀、Bruker FT-75MHz 13C-NMR光譜儀、Jasco-FT-IR 5300光譜儀和UV-VIS光譜儀來確定。化學(xué)位移用偏離內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物TMS(四甲基硅烷)的δ單位來指示，并且數(shù)據(jù)記錄為“化學(xué)位移(積分強(qiáng)度，多重性，偶合常數(shù))(Hz)”。
合成方法將詳細(xì)解釋。與氣體吸收管連接的冷凝器接到100毫升的兩口圓底燒瓶上，加入152毫克阿魏酸和5毫升THF，阿魏酸完全溶解。然后，加入110毫克亞硫酰氯并在水浴中加熱和攪拌。以30分鐘的時(shí)間間隔收集少量樣品，并用甲醇加熱1分鐘。然后進(jìn)行用來檢測未反應(yīng)材料存在的TLC測試以確定反應(yīng)的終點(diǎn)(大約1小時(shí))。反應(yīng)結(jié)束后，THF真空抽干，加入100毫克香豆雌酚和15毫升DMSO并完全溶解。加熱同時(shí)攪拌之，以1小時(shí)的時(shí)間間隔進(jìn)行TLC測試以檢測反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物冷卻至室溫，加入5％的碳酸氫鈉水溶液20毫升，然后攪拌10分鐘。然后，將其過濾以除去不溶的固體。過濾后的液體加入5％的鹽酸以使pH值設(shè)定在6-7，然后萃取出最終的產(chǎn)物。萃取后的產(chǎn)物過濾并用蒸餾水洗滌數(shù)次以除去酸和堿，然后在填充有二氧化硅的干燥箱中真空干燥1天以得到褐色的化合物(圖1) 。
熔點(diǎn)高于400℃。FT-IR(KBr)光譜中各峰的位置在3423，2943，1728，1633，1597，1508，1417，1499，1257，1118，1030cm-1，在1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)光譜中，峰的位置在7.91(1H.d)，7.86(1H.d)，7.77(1H.m)，7.72-7.68(2H.m)，7.58-7.44(3H.m)，7.29-7.27(4H.m)，7.02-6.97(2H.m)，6.84-6.64(2H.m)，3.87(3H.s)，3.85(3H.s)ppm。
13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)光譜中，峰的位置在165.20，163.38，162.55，161.02，159.10，158.24，156.24，152.20，150.82，149.80，148.48，146.19，145.27，134.06，129.47，127.21，126.71，125.80，125.55，124.60，122.58，118.01，117.66，117.58，115.99，115.56，114.16，111.12，110.45，107.84，107.38，106.12，102.56，100.94，98.45，56.20，55.98ppm。這些數(shù)據(jù)表明合成了具有高純度的化合物。
實(shí)施例2測量阿魏酸酯衍生物的美白和抗氧化活性合成的3，9-二阿魏基香豆雌酚溶解在1，3-丁二醇中，以生成0.1％(wt/wt)的溶液。通過測定酪氨酸酶抑制效應(yīng)并使用NBT法來測量美白活性和抗氧化活性。0.1％的維生素C、0.1％的維生素E、曲酸和胚乳被用作樣品。
為了測量本發(fā)明的美白效果，100毫升0.2mg/ml的1-酪氨酸溶液和5毫升680單位/毫升的酪氨酸酶溶液(3400單位/毫克稀釋5倍)?？瞻自囼?yàn)的溶液是1毫升酪氨酸+1毫升磷酸緩沖液+1毫升蒸餾水。測試程序如下表1

1)混合A、B和C，在37℃保溫30分鐘。
2)加入D，保溫30分鐘。
3)10分鐘±10秒后，將其取出并在冷凍條件下用冰使反應(yīng)終止。
4)與對(duì)照樣品比較吸光度，測試對(duì)照組的吸光度，然后測試空白測試組的吸光度(在475nm處)。
酪氨酸酶活性抑制效應(yīng)(％)按以下方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果列于表2中。
酪氨酸酶活性抑制效應(yīng)(％)[1-(E-B/C)]×100(B空白測試組，C對(duì)照組，E測試組)
在結(jié)果中，3，9-二阿魏基香豆雌酚的酪氨酸酶抑制效應(yīng)大于維生素C或胚乳的抑制效應(yīng)，但是它要小于曲酸的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明3，9-二阿魏基香豆雌酚可以用作美白材料。
表2

為了測定抗氧化效果，由黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的活性氧用NBT法來測量，并且測定被測材料的活性氧消除效果?；钚匝跤牲S嘌呤和黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生。通過測量在560nm波長處由活性氧和氮藍(lán)四唑(NBT)的反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)色來測定活性氧。
使用以下樣品。
1)0.05M(50mM)Na2CO3緩沖液(MW＝105.99)一種溶液，其中5.25克(50mM)Na2CO3(Wako純化學(xué)品有限公司)溶解在純水中，然后混合50mM NaHCO3(MW＝84.01)并將pH設(shè)定在10.2。
2)3mM黃嘌呤溶液45.6mg黃嘌呤(Nakarai化學(xué)公司，MW＝152.11)溶解并設(shè)定在10毫升。
3)3mM EDTA溶液四乙酸乙二胺鈉(Tojin化學(xué)公司，mw＝60.1)溶解并設(shè)定在3mM。
4)0.15％的BSA溶液15毫克BSA(V級(jí)，粉末，Sigma)溶解并設(shè)定在10毫升。
5)0.75mM NBT溶液61.32mg氮藍(lán)四唑(MW＝817.65，Tokyo化學(xué)公司)溶解于蒸餾水中并設(shè)定在100毫升。
6)黃嘌呤氧化酶溶液黃嘌呤氧化酶(Boehringer)稀釋約100倍，以至其空白測試的吸光度范圍在0.2-0.23。換句話說，用純水稀釋以至吸光度變化為A560＝0.3/20分鐘。
7)6mM CuCl2溶液102.29mg CuCl2·2H2O(MW＝134.45) 溶解于蒸餾水中并設(shè)定在100毫升。
使用以下的測量方法1.0.05M Na2CO3-2.4ml2.3mM黃嘌呤溶液-0.1ml3.3mM EDTA容液-0.1ml4.BSA溶液-0.1ml5.0.72mM NBT溶液-0.1ml6.黃嘌呤氧化酶溶液-0.1ml7.6mM CuCl2溶液-0.1ml(1)將1、2、3、4和5加入到小瓶中，再加入0.1ml樣品溶液，在5℃保溫10分鐘。
(2)加入6并立即攪拌，然后在25℃培養(yǎng)20分鐘。
(3)加入7后，反應(yīng)終止，然后測量在560nm處的吸光度。
(4)按同樣方法進(jìn)行空白測試，除了使用蒸餾水來代替樣品溶液并測量吸光度(Bt)。
(5)按同樣方法進(jìn)行樣品的空白測試，除了使用蒸餾水來代替6并測量吸光度(Bo)。
按以下方法計(jì)算效果，結(jié)果列于表3中。
抑制比例(％)＝[1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100St酶反應(yīng)完成后樣品溶液在560nm處的吸光度Bt酶反應(yīng)完成后空白測試溶液在560nm處的吸光度So反應(yīng)之前不添加酶時(shí)樣品溶液在560nm處的吸光度Bo反應(yīng)之前不添加酶時(shí)空白測試溶液在560nm處的吸光度結(jié)果表明其抗氧化作用與已知作為抗氧化劑的生育酚類似，但是不能測量維生素C的抗氧化作用，因?yàn)槠淇寡趸饔锰珡?qiáng)以至于它會(huì)與用來測量該效果的其它試劑反應(yīng)。
表33，9-二阿魏基香豆雌酚的抗氧化活性

實(shí)施例33，9-二阿魏基香豆雌酚的細(xì)胞毒性和活性檢測細(xì)胞為取自人的成纖維細(xì)胞(ATCC，Hs68)，在37℃于5％CO2，100％濕度的條件下培養(yǎng)于加有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中。于96孔板中接種細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/毫升)并在37℃孵育24小時(shí)。用0.2m的濾器滅菌后的樣品按照固定濃度加入，并進(jìn)一步在37℃孵育24小時(shí)。然后加入MTT試劑并在37℃孵育4小時(shí)，隨后移去培養(yǎng)液。加入1N的NaOH異丙醇溶液后攪拌20分鐘，測量在565nm處的吸光度。然后通過與未處理的細(xì)胞(存活率100％)比較來確定細(xì)胞程序死亡的濃度。
1，3-丁二醇中的50μM 3，9-二阿魏基香豆雌酚逐級(jí)稀釋以找到未顯示細(xì)胞程序死亡的濃度，結(jié)果在78μM(0.0048％)的范圍時(shí)未顯示細(xì)胞程序死亡。在LD50的細(xì)胞活性為20％，這是令人滿意的水平。
表4

實(shí)施例43，9-二阿魏基香豆雌酚的膠原形成效果(膠原增殖促進(jìn)效應(yīng)的皮膚組織測試)為證實(shí)合成的3，9-二阿魏基香豆雌酚的膠原形成效果，準(zhǔn)備10只雌性無毛8周大的大鼠。從2只大鼠上取皮，并用皮膚的側(cè)部和中部制備標(biāo)準(zhǔn)染色樣品以研究膠原增殖水平。其它8只大鼠分為兩組，即應(yīng)用組和對(duì)照組。
在相同的測試條件下，應(yīng)用組和對(duì)照組的整體(除了頭部和腹部)用0.1％(wt/wt)3，9-二阿魏基香豆雌酚的1，3-丁二醇溶液和1，3-丁二醇溶液處理15天和30天。
分別從應(yīng)用組和對(duì)照組中選出2只大鼠，切下它們的皮膚，然后由皮膚的側(cè)部和中部得到染色樣品。30天后，以同樣的方式得到皮膚染色樣品，對(duì)于對(duì)照組和應(yīng)用組得到的10個(gè)染色皮膚樣品，膠原增殖促進(jìn)效果根據(jù)8周大的皮膚情況做比較。2周后，與最初的8周大對(duì)照組和1，3-丁二醇應(yīng)用對(duì)照組比較，在3，9-二阿魏基香豆雌酚中發(fā)現(xiàn)膠原的合成和增殖。30天后在3，9-二阿魏基香豆雌酚應(yīng)用組中，真皮層的膠原增殖增加并且組織密度提高。由此結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)上證實(shí)3，9-二阿魏基香豆雌酚在膠原合成和膠原增殖促進(jìn)方面是效果優(yōu)異的(圖2)。
實(shí)施例5、6和7在這些實(shí)施例中，含有按照實(shí)施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚的化妝品做臨床上的比較。臨床測試用化妝品制劑是如表4中的面霜。
首先，加熱表5中的B相并在70℃保溫，然后向其中加入A相以預(yù)乳化，隨后用均質(zhì)混合器均勻乳化，然后緩慢冷卻以制備面霜。(實(shí)施例5-7，對(duì)比例)表5代表的面霜應(yīng)用于5名被測女性對(duì)象(20-35歲)的右臉，每日兩次，持續(xù)一個(gè)月。試驗(yàn)結(jié)束后，她們臉的顏色用影像分析儀做比較，并按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)最暗為5，中等為3，最亮為1。
表6比較了使用實(shí)施例5面霜的被測對(duì)象和使用對(duì)比例面霜的被測對(duì)象的臉顏色。
如表6中所示，使用含有3，9-二阿魏基香豆雌酚的面霜的被測對(duì)象的臉表現(xiàn)出更好的皮膚顏色改善效果。
表5面霜組合物

表6面霜的測試結(jié)果

結(jié)果表明本發(fā)明具有優(yōu)異的皮膚改善效果實(shí)施例88克95％的乙醇，0.05克聚吡咯烷酮，0.1克油醇，0.2克聚氧乙烯單油酸酯，0.2克香精，0.1克甲基對(duì)羥苯甲酸酯，少量抗氧化劑和少量顏料混合并溶解?；旌先芤褐屑尤?.05克實(shí)施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚和85.33克純化水中的5克甘油，攪拌以提供具有皮膚改善效果的化妝水。
實(shí)施例91.2克鯨蠟醇，10克角鯊?fù)椋?克凡士林，0.2克乙基對(duì)羥苯甲酸酯，1克單硬脂酸甘油酯，1克聚氧乙烯(加入20摩爾)單酯和0.1克香精混合并加熱到70℃。然后將0.5克實(shí)施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚、5克雙丙甘醇、2克聚乙二醇1500、0.2克三乙醇胺和76.2克純化水在75℃溶解。兩種溶液混合并乳化，然后冷卻以提供具有皮膚改善效果的水/油溶液。
實(shí)施例105克95％的乙醇，1.2克聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，0.3克Kitullose，0.2克透明質(zhì)酸，0.2克維生素E乙酸酯，0.2克甘草酸，0.1克乙基對(duì)羥苯甲酸酯，1克實(shí)施例1的3，9-二阿魏基香豆雌酚和適量顏料混合以提供具有皮膚改善效果的化妝品溶液。
根據(jù)本發(fā)明的3，9-二阿魏基香豆雌酚不僅具有優(yōu)異的美白效果和抗氧化效果，而且非常安全，并且可以應(yīng)用于各種美容用的化妝品。
權(quán)利要求
1.由阿魏酸和香豆雌酚的酯化反應(yīng)合成的3，9-二阿魏基香豆雌酚。
2.含有根據(jù)權(quán)利要求1的3，9-二阿魏基香豆雌酚的一種皮膚美容產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一種皮膚美容產(chǎn)品，含有0.01-10wt％的3，9-二阿魏基香豆雌酚。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有3,9－二阿魏基香豆雌酚的皮膚美容產(chǎn)品,特別是含有一種阿魏酸鍵合在香豆雌酚上的化合物的皮膚美容產(chǎn)品。該皮膚美容產(chǎn)品具有幾種優(yōu)異的改善美容失調(diào)的效果,諸如抗老化效果、美白效果和毛發(fā)種植效果。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1388756SQ01802431
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月23日
發(fā)明者表亨培, 李忠佑, 樸成敏, 趙永鎬, 李定宰, 金珍和 申請(qǐng)人:株式會(huì)社韓佛化粧品