病毒感染的長效融合肽抑制劑的制作方法

文檔序號：3530140閱讀：598來源：國知局

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專利名稱：病毒感染的長效融合肽抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的肽，其是病毒活性的抑制劑和/或表現(xiàn)出抗融合特性。特別是，本發(fā)明涉及人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的經(jīng)修飾的肽抑制劑，其在各個病毒感染的治療中具有長效作用。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的肽和內(nèi)源性載體的偶聯(lián)物，特別是經(jīng)修飾的肽和多種流動的血液成分、尤其是流動的內(nèi)源性蛋白的偶聯(lián)物。發(fā)明背景雖然在正常細胞生物學(xué)過程中是尋常的，但膜融合活動也參與多種疾病狀態(tài)，包括例如有包膜病毒進入細胞內(nèi)。已知肽類能夠阻止或中斷膜融合相關(guān)性活動，包括例如抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒傳播給未感染細胞。譬如，合成肽DP-107和DP-178衍生自I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)跨膜(“TM”)糖蛋白gp41的獨立結(jié)構(gòu)域，是HIV-1侵染和HIV誘導(dǎo)的細胞-細胞融合的有效抑制劑。
Lambert等在“副粘病毒融合(F)蛋白的保守區(qū)的肽是病毒融合的有效抑制劑”Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.，March 5，1996，Vol.93(5)，pp.2186-91中公開了合成肽DP-107和DP-178(T-20)，它們衍生自I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)跨膜(TM)蛋白gp41內(nèi)的獨立結(jié)構(gòu)域，是HIV-1侵染和融合的有效抑制劑。利用計算機搜索策略(computerizedantiviral searching technology，C.A.S.T.)基于DP-107和DP-178(T20)的二級結(jié)構(gòu)，Lambert等在其它融合病毒的糖蛋白內(nèi)鑒定出類似于HIV-1gp41的DP-107和DP-178區(qū)的保守七重(復(fù))結(jié)構(gòu)域。由三種代表性副粘病毒呼吸道合胞病毒(RSV)、III型人副流感病毒(HPIV-3)和麻疹病毒(MV)衍生的抗病毒肽阻斷同源病毒介導(dǎo)的合胞體形成且表現(xiàn)的EC50值在0.015-0.250μM范圍內(nèi)。此外，這些肽對于病毒的來源非常有選擇性。
U.S.專利6,013,263、6,017,536和6,020,459在此全文引入作為參考，同樣地公開了36個氨基酸的肽DP178，其相當于源自HIV-1分離物L(fēng)AI(HIV-1LAI)的gp41的氨基酸638-673，和38個氨基酸的肽DP107，其相應(yīng)于HIV-ILAI的gp41的氨基酸558-595，兩者均表現(xiàn)出抗HIV-1活性。
盡管現(xiàn)有技術(shù)中公開的許多抗病毒或抗融合肽顯示出有效的抗病毒和/或抗融合活性，但這些肽存在體內(nèi)血漿半衰期短的缺陷，這主要歸因于血清清除快和肽酶和蛋白酶的作用。因此極大地降低了所述肽的有效抗病毒活性。所以，需要一種延長現(xiàn)有抗病毒和/或抗融合肽的半衰期并使這些肽的體內(nèi)作用時間更長久的方法。發(fā)明概述本發(fā)明符合這些和其他的需求，并且涉及具有抗病毒活性和/或抗融合活性的經(jīng)修飾的肽。這些經(jīng)修飾的肽提供增強的體內(nèi)穩(wěn)定性且降低了對肽酶或蛋白酶降解的敏感性。因而這些經(jīng)修飾的肽最大程度地減小了例如這些肽非常頻繁或者甚至連續(xù)給藥的需要。本發(fā)明的不同實施方式的產(chǎn)品可以用作例如對多種病毒感染的抵預(yù)和/或治療，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。參與病毒轉(zhuǎn)染(例如肝炎、埃-巴二氏病毒和其他有關(guān)病毒)的其他肽的修飾也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明涉及具有抗病毒和/或抗融合活性的肽的化學(xué)上反應(yīng)性修飾，因此這些經(jīng)修飾的肽可以與血液組分上可利用的官能度(functionalitis)反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的經(jīng)修飾的肽含有與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價鍵的反應(yīng)性基團。在本發(fā)明的另一實施方式中，反應(yīng)性基團可以是與血液蛋白上的巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺，所述的血液蛋白包括流動血液蛋白如白蛋白。
特別是，本發(fā)明涉及DP107和DP178肽及其類似物的化學(xué)反應(yīng)性修飾，類似物包括含有源自其他(非HIV)病毒氨基酸序列的肽，其相應(yīng)于產(chǎn)生DP107和DP178的HIV的gp41區(qū)并表現(xiàn)出抗病毒或抗融合活性。更特別地，其中這些肽可以對人呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)具有抗病毒作用。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1至SEQ ID NO86的肽的化學(xué)反應(yīng)性修飾。
本發(fā)明也涉及用于預(yù)防和/或治療病毒感染的組合物，其中含有用所述反應(yīng)性基團修飾的具有抗病毒活性的肽。更特別地，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療AIDS、人呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的組合物。附表簡述通過參考附表可以更好地理解本發(fā)明，其中表1列出了常見氨基酸及其單字母和三字母縮寫，和常用的保護基。
表2表示DP178羧基端平截。
表3表示DP178氨基端平截。
表4表示DP107羧基端平截。
表5表示DP107氨基端平截。
表6表示HIV-2NIHZDP178類似物羧基端平截。
表7表示HIV-2NIHZDP178類似物氨基端平截。
表8表示RSV F2區(qū)DP107類似物羧基端平截。
表9表示RSV F2區(qū)DP107類似物氨基端平截。
表10表示RSV F1區(qū)DP178類似物羧基端平截。
表11表示RSV F1區(qū)DP178類似物氨基端平截。
表12表示HPV3 F1區(qū)DP178類似物羧基端平截。
表13表示HPV3 F1區(qū)DP178類似物氨基端平截。
表14表示HPV3 F1區(qū)DP107類似物羧基端平截。
表15表示HPV3 F1區(qū)DP107類似物氨基端平截。
表16表示典型的抗RSV肽。
表17表示典型的抗HPV3肽。
表18表示典型的抗SIV肽。
表19表示典型的抗MeV肽。序列表的簡述參考序列列表將更好地理解本發(fā)明，其中SEQ ID NO1表示DP178的肽序列。
SEQ ID NO2表示DP107的肽序列。
SEQ ID NO3-9表示某些DP178類似物的肽序列。
SEQ ID NO10-30表示相應(yīng)于DP178和DP107的RSV F1區(qū)和F2區(qū)和典型的抗RSV肽的肽序列；SEQ ID NO3 1-62表示相應(yīng)于DP178和DP107的HPIV3 F1區(qū)和典型的抗HPIV3肽的肽序列；SEQ ID NO63-73表示相應(yīng)于DP178的SIM和典型的抗SIV肽的肽序列；且SEQ ID NO74-78表示相應(yīng)于DP178的MeV和典型的抗MeV肽的肽序列。發(fā)明詳述為了確保完全理解本發(fā)明，提供下列定義抗病毒肽在此所用的抗病毒肽將是指抑制細胞的病毒感染的肽，其通過例如抑制細胞-細胞融合或游離病毒感染。感染的途徑可以包括膜融合，如同有包膜病毒情況中所出現(xiàn)的；或一些涉及病毒和細胞結(jié)構(gòu)的其他融合活動。抑制特定病毒的病毒感染的肽可以相對于該特定病毒引用，例如抗HIV肽、抗RSV肽等。
抗融合肽抗融合肽是指證實有能力抑制或降低兩個或多個實體如病毒-細胞或細胞-細胞之間的膜融合活動的水平的肽，其相對于肽不存在下出現(xiàn)膜融合的水平而言。
HIV和抗HIV肽導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征的人免疫缺陷病毒(HIV)是反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒屬的一員。HIV存在兩種流行類型HIV-1和HIV-2，業(yè)已鑒定出其各自具有多種株。HIV以CD-4+細胞為靶向，而病毒的進入依賴于HIV蛋白gp41與CD-4+細胞表面受體的結(jié)合?？笻IV肽是指對HIV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離病毒對CD-4+細胞的感染和/或抑制感染和未感染CD-4+細胞之間的HIV誘導(dǎo)的合胞體形成。
SIV和抗SIV肽猿猴免疫缺陷病毒(SIV)是在易感猿猴子中引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)樣疾病的慢病毒?？筍IV肽是對SIV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制SIV對細胞的感染和抑制感染或未感染細胞之間合胞體形成。
RSV和抗RSV肽呼吸道合胞病毒(RSV)是一種呼吸道病原體，對于嬰兒和低齡兒童尤其危險，該病毒在他們中可以引起細支氣管炎(細小氣道的炎癥)和肺炎。RSV是負義、單鏈RNA病毒且是病毒的副粘病毒科的成員。RSV的感染途徑通常經(jīng)過呼吸道即鼻、咽喉、氣管、支氣管和細支氣管的粘膜?？筊SV肽是對RSV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離RSV病毒的粘膜細胞感染以及感染和未感染細胞之間的合胞體形成。
HPV和抗HPV肽人副流感病毒(HPIV或HPV)，如同RSV，是另一種導(dǎo)致呼吸道疾病的因素，而且如同RSV類病毒，是負義、單鏈RNA病毒，其是病毒的副粘病毒科的成員。存在四種已識別HIPV的血清型--HPIV-1、HPIV-2、HPIV-3和HPIV-4。HPIV-1是導(dǎo)致兒童中哮吼的原因，并且HPIV-1和HPIV-2皆引起上下呼吸道疾病。HPIV-3常常與細支氣管炎和肺炎有關(guān)?？笻PV肽是對HPV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離HPV病毒的感染和感染和未感染細胞之間合胞體形成。
MeV和抗MeV肽麻疹病毒(VM或MeV)是一種有包膜負義、單鏈RNA病毒，屬于病毒的副粘病毒科。如同RSV和HPV，MeV引起呼吸疾病，并且產(chǎn)生導(dǎo)致附加、機會性感染的免疫抑制。在一些情形中，MeV可以建立腦部的感染導(dǎo)致神經(jīng)學(xué)上的(neurlogical)并發(fā)癥?？筂eV肽是對MeV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離MeV病毒的感染和感染與未感染之間的合胞體形成。
DP-178和DP178類似物除非另外明確指出或記載，DP-178是指36個氨基酸DP-178肽，其相應(yīng)于HIV-1分離物L(fēng)AI(HIVLAI)的gp41糖蛋白的氨基酸殘基638-673并且具有序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO1)及其平截、缺失和/或插入。DP178肽的平截可以包括3-36個氨基酸的肽。缺失包括從DP178肽去除一個或多個氨基酸殘基，并且可以去除肽序列的一個鄰接部分和多個部分。插入可以包括一個氨基酸殘基或殘基鏈，并且可以在DP178肽的羧基或氨基末端或在該肽的內(nèi)部位置進行。
DP178肽類似物是肽，其氨基酸序列含有除HIV-1LAI之外的病毒的肽區(qū)的序列，其相應(yīng)于產(chǎn)生DP178的gp41區(qū)，以及其平截、缺失或插入。所述的其他病毒可以包括但不限于其他HIV分離物如HIV-2NIHZ、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和麻疹病毒(MeV)。DP178類似物也是指那些通過ALLMOTI5、107×178×4和PLZIP搜索基元鑒定或識別的具有與DP178相似的結(jié)構(gòu)和/或氨基酸基元的肽序列，其公開在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459并且在此引入。DP178類似物進一步是指稱作“DP178樣”的肽，該術(shù)語在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459中。
DP-107和DP107類似物除非另外明確指出或記載，DP-107是指38個氨基酸的DP-107肽，其相應(yīng)于HIV-1分離物L(fēng)AI(HIVLAI)的gp41糖蛋白的氨基酸殘基558-595并且具有序列NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQ ID NO2)及其平截、缺失和/或插入。DP107肽的平截可以含有3-38氨基酸的肽。缺失是包括從DP107肽去除一個或多個氨基酸殘基，并且可以去除肽序列的一個鄰接部分和多個部分。插入可以包括一個氨基酸殘基或殘基鏈，并且可以在DP107肽的羧基或氨基末端或在該肽的內(nèi)部位置進行。
DP107肽類似物是肽，其氨基酸序列含有除HIV-1LAI之外的病毒的肽區(qū)的序列，其相應(yīng)于產(chǎn)生DP107的gp41區(qū)，以及其平截、缺失或插入。所述的其他病毒可以包括但不限于其他HIV分離物如HIV-2NIHZ、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和麻疹病毒(MeV)。DP107類似物也是指那些通過ALLMOTI5、107×178×4和PLZIP搜索基元鑒定或識別的具有與DP107相似的結(jié)構(gòu)和/或氨基酸基元的肽序列，其公開在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459中。DP107類似物進一步是指稱作“DP107樣”的肽，該術(shù)語在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459中定義。
反應(yīng)性基團反應(yīng)性基團是能夠形成共價鍵的化學(xué)基團。所述的反應(yīng)性基團與DP-107或DP-178肽或其類似物或其他感興趣的抗病毒或抗融合肽偶聯(lián)或鍵合。反應(yīng)性基團一般在含水環(huán)境中穩(wěn)定，而且通常為羧基、磷酰基或適宜的?；蛘呤酋セ蚧旌纤狒?，或亞胺酸酯(鹽)，由此能夠與位于流動血液組分上的靶向位點處的官能度如氨基、羥基或巰基形成共價鍵。對于絕大部分，所述的酯應(yīng)包括酚類化合物，或是硫羥酸酯、烷基酯、磷酸酯等。
官能度官能度是血液組分上的與經(jīng)修飾的抗病毒肽上的反應(yīng)性基團反應(yīng)形成共價鍵的基團。官能度包括鍵合酯反應(yīng)性實體的羥基；與馬來酰亞胺、亞胺酸酯和硫酯基反應(yīng)的巰基；鍵合羧基、磷?；蝓；陌被缓团c氨基鍵合的羧基。
血液組分血液組分可以或固定或流動。固定的血液組分是非流動血液組分且包括組織、膜受體、間質(zhì)蛋白、纖維蛋白、膠原、血小板、內(nèi)皮細胞、上皮細胞及其相關(guān)的膜和膜受體、體細胞、骨骼肌和平滑肌細胞、神經(jīng)元組分、骨細胞和破骨細胞以及全部機體組織，尤其是與循環(huán)和淋巴系統(tǒng)有關(guān)的組織。流動的血液組分是在任意延長的時間內(nèi)不具有固定位點的血液組分，一般不超過5分鐘，更經(jīng)常是1分鐘。這些血液組分與膜無關(guān)，而且長時間存在于血液內(nèi)并以至少0.1μg/ml的最低濃度存在。流動的血液組分包括血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和免疫球蛋白如IgM和IgG。流動的血液組分的半衰期至少約12小時。
保護基保護基是用來保護肽衍生物不發(fā)生自身反應(yīng)的化學(xué)基團。多種保護基公開在本文和U.S.5,493,007(在此引入作為參考)中。此類保護基包括乙酰基、芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(CBZ)等。具體的保護氨基酸列在表1中。
連接基因連接(間隔)基團是將反應(yīng)性實體鍵合或相連于抗病毒或抗融合肽的化學(xué)基團。連接基團可以包括一個或多個烷基部分、烷氧基部分、鏈烯基部分、炔基部分或被烷基部分取代的氨基部分、環(huán)烷基部分、多環(huán)部分、芳基部分、多芳基部分、取代芳基部分、雜環(huán)部分和取代雜環(huán)部分；連接基團也可以含有聚乙氧基氨基酸，例如AEA((2-氨基)乙氧基乙酸)或優(yōu)選的連接基團AEEA([2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸)。
敏感官能團-敏感官能團是代表抗病毒和/或抗融合肽上的潛在反應(yīng)位點的基團。如果存在，可以選擇敏感官能團作為連接體-反應(yīng)性基團修飾的連接點。敏感官能團包括但不限于羧基、氨基、巰基和羥基。
經(jīng)修飾的肽-經(jīng)修飾的肽是已經(jīng)通過連接反應(yīng)性基團修飾的抗病毒和/或抗融合肽。所述的反應(yīng)性基團可以通過連接基團與所述的肽連接，或任選地不采用連接基團。也可以考慮把一個或多個附加氨基酸引入所述的肽以便于反應(yīng)性基團的連接。經(jīng)修飾的肽可以體內(nèi)給藥使其在體內(nèi)發(fā)生與血液組分的結(jié)合，或者首先使它們與體外血液組分結(jié)合并且將所得的偶聯(lián)肽(如下定義)體內(nèi)給藥。
偶聯(lián)肽-偶聯(lián)肽是已經(jīng)與血液組分通過經(jīng)修飾的肽的反應(yīng)性基團和血液組分的官能度之間的共價鍵、在可有可無的連接基團下偶聯(lián)的經(jīng)修飾的肽。本申請中所用的術(shù)語“偶聯(lián)肽”可以更加具體地指特定的偶聯(lián)肽，例如“偶聯(lián)DP178”或“偶聯(lián)DP107”。
鑒于上述定義，本發(fā)明具有現(xiàn)有抗病毒和抗融合肽的特性的優(yōu)越性?？梢岳盟龅碾囊种频牟《景ǖ幌抻诶缭诿绹鴮＠?,013,263、6,017,536和6,020,459的表V-VII和IX-XIV中所列病毒的所有毒株。這些病毒包括，例如人反轉(zhuǎn)錄病毒，包括HIV-1、HIV-2；和人T淋巴細胞病毒(HTLV-I和HTLV-II)；和非人反轉(zhuǎn)錄病毒，包括牛造白細胞組織增生病毒、貓肉瘤病毒、貓白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猿猴肉瘤病毒、猿猴白血病和綿羊進行性肺炎病毒。非反轉(zhuǎn)錄病毒也可以通過本發(fā)明的肽抑制，包括人呼吸道合胞病毒(RSV)、犬瘟熱病毒、新城疫病毒、人副流感病毒(HPIV)、流感病毒、麻疹病毒(MeV)、埃-巴氏病毒、乙型肝炎病毒和猿猴Mason-Pfizer病毒。非有包膜病毒也可以用本發(fā)明的肽抑制，并且包括但不限于細小核糖核酸病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、腸道病毒、埃可病毒、柯薩奇病毒、乳頭多瘤空泡病毒如乳頭狀瘤病毒、細小病毒、腺病毒和呼腸孤病毒。
如實施例所述，HIV融合肽的作用機理已經(jīng)在本申請背景部分中探討，并且所述肽的抗病毒和抗融合特性業(yè)已很好地確立。相應(yīng)于羧基末端胞外結(jié)構(gòu)域序列的合成肽(例如，LAI毒株的B型HIV-1的氨基酸殘基643-678或源自相似毒株的殘基638-673以及殘基558-595)已經(jīng)顯示出在非常低的濃度下抑制病毒介導(dǎo)的細胞-細胞融合。融合肽與天然病毒gp41的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)區(qū)競爭，由此干擾病毒進入細胞的融合/感染。
本發(fā)明的重點在于利用DAC(藥物活性復(fù)合物)技術(shù)、通過選擇性地將肽偶聯(lián)在蛋白載體上修飾選定的抗病毒和/或抗融合肽，賦予這種肽改進的生物利用度、延長的本申請和更良好的分布，但不改變肽的抗病毒特性。本發(fā)明選擇(但不限于)的載體是白蛋白，通過其游離巰基與用馬來酰亞胺基團修飾的抗病毒和/或抗融合肽偶聯(lián)。
對HIV-1融合/感染的預(yù)防非常有效的若干肽序列業(yè)已公開在文獻中。例如，肽DP178結(jié)合與融合有關(guān)的gp41的構(gòu)象。因此在本發(fā)明的一個實施方式中，修飾DP178和DP178樣肽。同樣地，本發(fā)明的其他實施方式包括用于抗HIV的DP107和DP107樣肽以及類似于在RSV、HPV、MeV和SIV病毒中發(fā)現(xiàn)的DP107和DP178的肽的修飾。
1.DP178和DP107
A.DP178肽DP178肽相應(yīng)于源自HIV-1LAI分離物的跨膜蛋白gp41的氨基酸殘基638-673，并且具有36個氨基酸的序列(從氨基向羧基末端讀取)NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID NO1)除了全長DP178的36聚體以外，本發(fā)明的肽包括含有3-36個氨基酸殘基的DP178肽的平截(即，肽的大小范圍是三肽至36聚多肽)，這些平截肽如表2和3所示。
此外DP178的氨基酸替換也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。HIV-1和HIV-2包膜蛋白在結(jié)構(gòu)式上不同，但在HIV-1和HIV-2相應(yīng)DP178的區(qū)域內(nèi)存在明顯的氨基酸保守性。該氨基酸保守性具有周期性，提示了一些結(jié)構(gòu)和/或功能的保守性。因此，氨基酸替換的一種可能類型將包括那些預(yù)計穩(wěn)定本發(fā)明的DP178肽的結(jié)構(gòu)的氨基酸變化。利用在此所述的DP178和DP178類似物序列，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地編譯DP178共有序列并由此確定代表優(yōu)選氨基酸替換的保守性氨基酸殘基。
氨基酸替換可以具有保守或非保守性。保守的氨基酸替換由用具有相似電荷、大小和/或疏水特性的氨基酸置換DP178肽序列的一個或多個氨基酸組成，例如谷氨酸(E)對天門冬氨酸(D)的氨基酸替換。非保守性替換由用具有相異電荷、大小和/或疏水特性的氨基酸置換DP178肽序列的一個或多個氨基酸組成，例如谷氨酸(E)對纈氨酸(V)的替換。
DP178的氨基酸插入可以由一個氨基酸殘基或殘基鏈組成。插入可以在DP178或DP178平截肽的羧基或氨基末端進行，并且可以在肽的內(nèi)部位置進行。
所述的插入在長度上一般為2-15個氨基酸。值得考慮的是，在感興趣肽的羧基或氨基末端進行的插入可以在更加寬的大小范圍內(nèi)，優(yōu)選約2至約50個氨基酸。可以將一個或多個所述插入引入DP178或DP178平截中，只要這樣的插入使所得的肽仍然可以通過上述107×178×4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基元識別。
優(yōu)選的氨基或羧基末端插入是長度范圍在約2至約50個氨基酸殘基內(nèi)的肽，這些肽分別相應(yīng)于實際DP178 gp41氨基酸序列氨基或羧基側(cè)的gp41蛋白區(qū)域。所以，優(yōu)選的氨基末端或羧基末端氨基酸插入將含有g(shù)p41氨基酸序列，該序列緊接于gp41蛋白的DP178區(qū)的氨基或羧基端。
DP178或DP178平截的缺失也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述的缺失由除去DP178或DP178樣肽序列的一個或多個氨基酸組成，并且所得肽序列的長度的下限為4-6個氨基酸。
所述缺失可以包括肽序列的一個鄰接部分或一個以上的不連續(xù)部分?？梢詫⒁粋€或多個這樣的缺失引入DP178或DP178平截中，只要這些缺失得到的肽可以通過上述107×178×4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基元識別。
B.DP107肽DP107是一種38個氨基酸的肽，其具有有效的抗病毒活性，并且相應(yīng)于源自HIV-1LAI分離物的跨膜蛋白gp41的氨基酸殘基558-595，如下所示NH2-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ-COOH (SEQ ID NO2)
除了全長DP107的38聚體以外，本發(fā)明的肽包括含有3-38個氨基酸殘基的DP107肽的平截(即，肽的大小范圍是三肽至38聚多肽)，這些平截肽如表4和5所示。
此外DP178的氨基酸替換也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如同DP178,在HIV-1和HIV-2相應(yīng)DP178的區(qū)域內(nèi)也存在明顯的氨基酸保守性。該氨基酸保守性具有周期性，提示了結(jié)構(gòu)和/或功能的保守性。因此，氨基酸替換的一種可能類型包括那些預(yù)計穩(wěn)定本發(fā)明的DP107肽的結(jié)構(gòu)的氨基酸變化。利用在此所述的DP107和DP107類似物序列，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地編譯DP107共有序列并由此確定代表優(yōu)選氨基酸替換的保守性氨基酸殘基。
氨基酸替換可以具有保守或非保守性。保守的氨基酸替換由用具有相似電荷、大小和/或疏水特性的氨基酸置換DP107肽序列的一個或多個氨基酸組成，例如谷氨酸(E)對天門冬氨酸(D)的氨基酸替換。非保守性替換由用具有相異電荷、大小和/或疏水特性的氨基酸置換DP107肽序列的一個或多個氨基酸組成，例如谷氨酸(E)對纈氨酸(V)的替換。
氨基酸插入可以由一個氨基酸殘基或殘基鏈組成。插入可以在DP107或DP107平截肽的羧基或氨基末端進行，并且可以在肽的內(nèi)部位置進行。
所述的插入在長度上一般為2-15個氨基酸。值得考慮的是，在感興趣肽的羧基或氨基末端進行的插入可以在更加寬的大小范圍內(nèi)，優(yōu)選約2至約50個氨基酸。可以將一個或多個所述插入引入DP107或DP107平截中，只要這樣的插入得到的肽仍然可以通過上述107×178×4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基元識別。
優(yōu)選的氨基或羧基末端插入是長度范圍在約2至約50個氨基酸殘基內(nèi)的肽，分別相應(yīng)于實際DP107 gp41氨基酸序列氨基或羧基側(cè)的gp41蛋白區(qū)域。所以，優(yōu)選的氨基末端或羧基末端氨基酸插入將含有g(shù)p41氨基酸序列，該序列緊接于gp41蛋白的DP107區(qū)的氨基或羧基端。
DP107或DP107平截的缺失也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述的缺失包括除去DP107或DP107樣肽序列的一個或多個氨基酸，并且所得肽序列的長度的下限為4-6個氨基酸。
所述缺失可以包括肽序列的一個鄰接部分或一個以上的不連續(xù)部分?？梢詫⒁粋€或多個這樣的缺失引入DP107或DP107平截中，只要這些缺失得到的肽可以通過上述107×178×4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基元識別。
DP107和DP107平截全面公開在美國專利5,656,480中，其在此全文引入作為參考。
2.DP107和DP178類似物本發(fā)明的相應(yīng)于上述DP178的類似物、DP178平截、DP107和DP107平截序列的肽可以在其它病毒中發(fā)現(xiàn)，包括例如非HIV-1有包膜病毒、非有包膜病毒和其它非病毒生物。
所述的DP178和DP107類似物可以例如相應(yīng)于存在于有包膜病毒的跨膜(“TM”)蛋白中的肽序列，并且可以相應(yīng)于存在于非包膜和非病毒生物中的肽序列。所述肽可以具有抗融合活性、抗病毒活性，最特別的是對發(fā)現(xiàn)其中天然序列的病毒具有特異性的抗病毒活性，或者可以表現(xiàn)出調(diào)節(jié)涉及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)過程的性能。
A.DP178類似物DP178類似物是肽，其氨基酸序列含有例如其它(即非HIV-1)病毒的肽區(qū)的氨基酸序列，該氨基酸序列相應(yīng)于產(chǎn)生DP178的gp41肽區(qū)。所述的病毒可以包括但不限于其它HIV-1分離物和HIV-2分離物。
衍生自其它(即非HIV-1LAI)HIV-1分離物的相應(yīng)gp41肽區(qū)的DP178類似物可以包括，例如如下所示的肽序列NH2-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID NO3)NH2-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH(SEQ ID NO4)NH2-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID NO5)SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的肽分別衍生自HIV-1SF2、HIV-1RF和HIV-1MN。其它DP178類似物包括衍生自HIV-2的那些，包括SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的肽，它們分別衍生自HIV-2ROD和HIV-2NIHZ。其它有效的類似物包括SEQ ID NO8和SEQ IDNO9的肽，已經(jīng)證實它們具有抗病毒活性。
在本發(fā)明中，優(yōu)選DP178類似物表示那些其氨基酸序列相應(yīng)于gp41蛋白的DP178區(qū)的肽；另外，也可以考慮本此處所述的肽含有長度范圍在約2至約50個氨基酸殘基內(nèi)的氨基酸序列，該序列相應(yīng)于實際DP178氨基酸序列氨基或羧基端的gp41區(qū)。
表6和表7表示HIV-2NIHZDP178類似物的一些可能的平截，它們含有3至36氨基酸殘基的肽(即肽大小范圍是三肽至36聚多肽)。這些表中的肽序列是從氨基(左方)向羧基(右方)末端列出。
B.另外的DP178類似物和DP107類似物DP178和DP107類似物是通過例如用一個或多個上述107×178×4、ALLMOTI5或PLZIP計算機輔助搜索策略進行識別和鑒定。這些搜索策略鑒別出預(yù)知具有類似于DP107和/或DP178的結(jié)構(gòu)和/或氨基酸序列特征的附加肽區(qū)。
上述搜索策略全面公開在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459的第9部分中的實施例中。雖然這種搜索策略部分基于由DP107和DP178演繹的基本氨基酸基元，但它不僅僅基于搜索基本氨基酸序列同源性，因為這種蛋白序列同源性存在于病毒的主要組群中，但不存在于各主要組群之間。譬如，基本氨基酸序列同源性在HIV-1的不同毒株的TM蛋白內(nèi)或在猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的不同分離物的TM蛋白內(nèi)非常高。
公開在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459中的計算機搜索策略成功地鑒別了類似于DP107或DP178的蛋白的區(qū)域。這種搜索策略被設(shè)計為與市售序列數(shù)據(jù)庫包、優(yōu)選PC/Gene一起使用。
在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459中，設(shè)計了一系列的搜索基元107×178×4、ALLMOTI5和PLZIP基元，并且在從嚴到寬的嚴格范圍內(nèi)內(nèi)工程化，其中優(yōu)選107×178×4。經(jīng)過上述搜索基元鑒定的序列，例如那些在美國專利6,013,263、6,017,536和6,020,459中的表V-XIV中和本申請引入作為參考的所列序列，潛在地具有抗融合(如抗病毒)活性，可以另外用于抗融合(如抗病毒)化合物的鑒定。
3.其它抗病毒肽A.抗RSV肽抗RSV肽包括由RSV中相應(yīng)肽序列鑒定出的DP178和/或DP107類似物，其進一步鑒定能夠抑制RSV的病毒感染。感興趣的此類肽包括表16的肽和SEQ ID NO10至SEQ ID NO30的肽。特別感興趣的是下列肽
YTSVITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYK (SEQ ID NO14)TSVITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKN (SEQ ID NO15)VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV (SEQ ID NO16)IALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK (SEQ ID NO29)SEQ ID NO10的肽衍生自RSV的F2區(qū)，并且在美國專利6,103,236和6,020,459中利用相應(yīng)于DP107和DP178肽的所述搜索基元(即“DP107/178樣”)鑒定。SEQ ID NO14至SEQ ID NO16的肽分別具有SEQ ID NO10中所含的氨基酸序列，并且各自已經(jīng)顯示出抗RSV活性，特別是在低于50μg/ml的濃度下抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
SEQ ID NO11的肽衍生自RSV的F1區(qū)，并且在美國專利6,103,236和6,020,459中利用相應(yīng)于DP107的所述搜索基元(即“DP107樣”)鑒定。SEQ ID NO29含有SEQ ID NO10中所含的氨基酸序列，并且同樣地表現(xiàn)出抗RSV活性，特別是在低于50μg/ml的濃度下抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
B.抗HPIV肽抗HPIV肽包括由HPIV中相應(yīng)肽序列鑒定的DP178和/或DP107類似物，并且其進一步鑒定為可以抑制HPIV的病毒感染。感興趣的此類肽包括表17的肽和SEQ ID NO31至SEQ ID NO62的肽。特別感興趣的是下列肽VEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLI (SEQ ID NO52)RSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSV (SEQ ID NO58)NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKL (SEQ ID NO35)ALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI (SEQ ID NO38)LDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIG (SEQ ID NO39)DPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGN (SEQ ID NO40)
PIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNW (SEQ ID NO41)IDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWH (SEQ ID NO42)SEQ ID NO31的肽衍生自HPIV-3的F1區(qū)，并且在美國專利6,103,236和6,020,459中利用相應(yīng)DP107的所述搜索基元(即“DP107樣”)鑒定。SEQ ID NO52和SEQ ID NO58的肽分別具有SEQ ID NO30中所含的氨基酸序列，而且各自顯示出抗HPIV-3活性，特別是在低于1μg/ml的濃度下抑制HPIV-3-感染的Hep-2細胞和未感染的CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
SEQ ID NO32的肽衍生自HPIV-3的F1區(qū)，并且在美國專利6,103,236和6,020,459中利用相應(yīng)DP178的所述搜索基元(即“DP178樣”)鑒定。SEQ ID NO35和SEQ ID NO38至SEQ IN NO42的肽分別具有SEQ ID NO32中所含的氨基酸序列，而且各自顯示出抗HPIV-3活性，特別是在低于1μg/ml的濃度下抑制HPIV-3-感染的Hep-2細胞和未感染的CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
C.抗MeV肽抗MeV肽是由麻疹病毒(MeV)中相應(yīng)肽序列鑒定出的DP178和/或DP107類似物，其進一步鑒定為可以抑制麻疹病毒的病毒性感染。特別感興趣的此類肽包括表19的肽和SEQ ID NO74至SEQ ID NO86的肽。特別感興趣的是下列肽HRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLE (SEQ ID NO77)IDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESS (SEQ ID NO79)LGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESSDQ (SEQ ID NO81)PISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESSDQILR (SEQ ID NO84)衍生自麻疹病毒的序列在美國專利6,103,236和6,020,459中利用相應(yīng)DP178的所述搜索基元(即“DP178樣”)鑒定。SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81和SEQ ID NO83的肽分別具有由此鑒定的氨基酸序列，并且各自顯示出抗MeV活性，特別是在低于1μg/ml的濃度下抑制MeV感染的Hep2細胞和未感染的Vero細胞之間的融合和合胞體形成。
D.抗SIV肽抗SIV肽是由SIV中相應(yīng)肽序列鑒定出的DP178和/或DP107類似物，其進一步鑒定為可以抑制SIV的病毒性感染。感興趣的此類肽包括表18的肽和SEQ ID NO63至SEQ ID NO73的肽。特別感興趣的是下列肽WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQK(SEQ ID NO64)QEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL(SEQ ID NO65)EWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLN(SEQ ID NO66)WERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS(SEQ ID NO67)ERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSW(SEQ ID NO68)RKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWD(SEQ ID NO69)KVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDV(SEQ ID NO70)VDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF(SEQ ID NO71)DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFG(SEQ ID NO72)FLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGN(SEQ ID NO73)衍生自SIV跨膜融合蛋白的序列在美國專利6,103,236和6,020,459中利用相應(yīng)DP178的所述搜索序列(即“DP178樣”)鑒定。SEQ ID NO64至SEQ ID NO73的肽分別具有由此鑒定的氨基酸序列，并且各自作為粗品肽顯示出有效的抗SIV活性。
4.抗病毒和抗融合肽的修飾本發(fā)明涉及具有抗病毒和/或抗融合活性的肽的修飾，包括DP-107和DP-178及其類似物的這種修飾。所述的經(jīng)修飾的肽可以與血液組分上的可利用反應(yīng)性官能度經(jīng)共價鍵反應(yīng)。本發(fā)明還涉及所述的修飾、與血液組分的結(jié)合及其應(yīng)用方法。這些方法包括與給患者施用未偶聯(lián)肽相比延長偶聯(lián)抗病毒肽衍生物的有效治療壽命。所述的經(jīng)修飾的肽是設(shè)計成為DAC(藥物親和復(fù)合物)類型的肽，其含有抗病毒肽分子和連接基團以及能夠與流動的血液蛋白的反應(yīng)性官能度反應(yīng)的反應(yīng)性基團。通過與血液組分或蛋白反應(yīng)，所述的經(jīng)修飾的肽或DAC可以經(jīng)血液傳遞至適當?shù)奈稽c或受體。
為了與蛋白上的官能度形成共價鍵，人們可以利用多種活性羧基、特別是酯作為反應(yīng)性基團，其中羥基在經(jīng)修飾的肽所需要的水平為生理可接受的。當這些反應(yīng)性基團中采用多種不同的羥基時，最常見的將是N-羥基琥珀酰亞胺或(NHS)、N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，蛋白質(zhì)上的官能度是巰基且反應(yīng)性基團是含馬來酰亞胺基的基團，例如γ-馬來酰亞胺-丁酰胺(butyralamide)(GMBA)和馬來酰亞胺基(maleimido)丙酸(MPA)。
伯胺是NHS酯的主要靶向。蛋白質(zhì)的N末端上存在的可用α-氨基與NHS酯反應(yīng)。然而，蛋白質(zhì)上的α-氨基也可以不是NHS偶聯(lián)所需要的或可利用的。當5個氨基酸在其側(cè)鏈中含氮時，只有賴氨酸的ε-胺明顯地與NHS酯反應(yīng)。當NHS酯與伯胺的偶聯(lián)反應(yīng)釋放N-羥基琥珀酰亞胺時會形成酰胺鍵，如下圖所示在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，這種蛋白上的官能團應(yīng)是巰基且化學(xué)上的反應(yīng)性基團應(yīng)是含馬來酰亞胺基的基團，如MPA和GMBA(y-馬來酰亞胺-丁酰胺)。當反應(yīng)混合物的pH維持在6.5至7.4之間時馬來酰亞胺基首選肽上的巰基。在pH 7.0下，馬來酰亞胺基與巰基的反應(yīng)的速率比與胺反應(yīng)的速率快1000倍。馬來酰亞胺基和巰基之間形成穩(wěn)定的硫醚鍵，該硫醚鍵在生理條件下不能斷裂，如下面路線所示。 A.特異性標記更可取地，本發(fā)明的經(jīng)修飾的肽被設(shè)計為特異性地與流動血液蛋白質(zhì)上的巰基反應(yīng)。此類反應(yīng)適宜通過用馬來酰亞胺鍵(例如，由GMBS、MPA或其它馬來酰亞胺)修飾的肽與流動血液蛋白(如血清白蛋白或IgG)上的巰基之間的共價鍵來建立。
在某些環(huán)境下，采用馬來酰亞胺的特異性標記提供了比用基團如NHS和磺基-NHS的流動蛋白的非特異性標記若干種更好的優(yōu)越性。巰基在體內(nèi)不如氨基酸豐富。所以，本發(fā)明的馬來酰亞胺修飾的肽(即馬來酰亞胺肽)應(yīng)該與較少的蛋白共價鍵合。譬如，在白蛋白(最豐富的血液蛋白)中只存在一個巰基。因此，肽-馬來酰亞胺-白蛋白偶聯(lián)物將傾向于含有摩爾比約1∶1的肽和白蛋白。除白蛋白以外，IgG分子(II型)也具有游離巰基。由于IgG分子和血清白蛋白構(gòu)成了血液中可溶性蛋白的絕大多數(shù)，因而它們也構(gòu)成血液中多數(shù)的能夠與馬來酰亞胺修飾的肽共價結(jié)合的游離巰基。
此外，在含游離巰基的血液蛋白(包括IgG類)中，用馬來酰亞胺特異性標記導(dǎo)致肽-馬來酰亞胺-白蛋白偶聯(lián)物的優(yōu)先形成，這歸因于白蛋白自身的獨特特性。在多種物質(zhì)中高度保守的白蛋白的唯一游離巰基位于氨基酸殘基34(Cys34)上。目前業(yè)已證實，白蛋白的Cys34比位于其他含游離巰基的蛋白質(zhì)上的游離巰基具有更高的反應(yīng)性。這部分歸因于白蛋白Cys34具有非常低的pK值5.5。該值比普通半胱氨酸殘基的典型pK值低很多，所述的典型pK值一般為約8。由于這種低pK，在正常的生理條件下白蛋白的Cys34主要呈電離形式，這極大提高了其反應(yīng)性。除了低的Cys34pK值以外，另一個提高Cys34的反應(yīng)性的因素是其位置，它位于接近于白蛋白V區(qū)的一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的表面的裂隙內(nèi)。這樣的位置使Cys34非常容易被所有種類的配體利用，并且在Cys34作為游離基捕獲物和游離巰基清除劑的生物作用中是一個非常重要的因素。這些特性令Cys34非常容易和馬來酰亞胺-肽反應(yīng)，并且反應(yīng)速率的加快可以是馬來酰亞胺-肽與其他含游離巰基蛋白的反應(yīng)速率的1000倍。
肽-馬來酰亞胺-白蛋白偶聯(lián)物的另一優(yōu)越性是重現(xiàn)性，這種重現(xiàn)性與在Cys34處特定的1∶1的肽負載到白蛋白上有關(guān)。其他技術(shù)如戊二醛、DCC、EDC和其他化學(xué)活化(如游離胺)缺乏這樣的選擇性。譬如，白蛋白含有52個賴氨酸殘基，其中的25-30個位于白蛋白的表面并因此被偶聯(lián)反應(yīng)利用?；罨@些賴氨酸殘基，或者另外對肽修飾以通過這些賴氨酸殘基偶聯(lián)，得到異源偶聯(lián)物群體。即使采用1∶1摩爾比的肽和白蛋白，產(chǎn)物將由多種偶聯(lián)產(chǎn)物組成，一些含有0、1、2或更多肽/個白蛋白，并且各自具有隨機在25-30個可利用賴氨酸位點的任意一個或多個位點上偶聯(lián)的肽。由于可能存在多種組合形式，所以精確組合物和各偶聯(lián)批次性質(zhì)的特性記述變得困難，并且批次和批次之間的重現(xiàn)性幾乎是不可能的，致使此類偶聯(lián)物無法成為所期望的治療劑。此外，雖然通過白蛋白的賴氨酸殘基的偶聯(lián)似乎應(yīng)該至少具備每個白蛋白分子傳遞更多治療劑的優(yōu)點，但研究顯示1∶1的治療劑和白蛋白比例更加可取。在Stehle等的“負載率決定甲氨蝶呤-白蛋白偶聯(lián)物在大鼠中的腫瘤靶向特性”Anti-Cancer Drugs，Vol.8，pp.677-685(1997)(該文獻在此引入作為參考)中，作者報導(dǎo)抗癌氨甲蝶呤和經(jīng)戊二醛偶聯(lián)的白蛋白的1∶1比例產(chǎn)生最有希望的結(jié)果。這些偶聯(lián)物優(yōu)先被腫瘤細胞吸收，而攜帶5∶1至20∶1氨甲蝶呤分子的偶聯(lián)物改變了HPLC分布并在體內(nèi)迅速被肝臟攝取。由此假定在這些較高的比例下，白蛋白的構(gòu)象改變削弱了其作為治療載體的有效性。
通過控制馬來酰亞胺-肽的體內(nèi)給藥，人們也可以控制體內(nèi)白蛋白和IgG的特異性標記。在常規(guī)的給藥中，所施用馬來酰亞胺-肽的80-90％將標記白蛋白而不到5％標記IgG。也可以出現(xiàn)游離巰基如谷胱甘肽的痕量標記。此類特異性標記適合于體內(nèi)應(yīng)用，它能夠精確計算所給藥物的理論半衰期。
除了提供受控的體內(nèi)特異性標記以外，馬來酰亞胺-肽可以提供離體血清白蛋白和IgG的特異性標記。這種離體標記包括將馬來酰亞胺-肽加入血液、血清或含有血清白蛋白和/或IgG的鹽水溶液中。一旦出現(xiàn)與馬來酰亞胺-肽離體偶聯(lián)，可以將血液、血清或鹽水溶液再次給予到患者血液中用于體內(nèi)治療。
與NHS-肽對照，馬來酰亞胺-肽在水溶液和游離胺的存在下一般相當穩(wěn)定。由于馬來酰亞胺-肽只與游離巰基反應(yīng)，通常不需要用保護基來防止馬來酰亞胺-肽發(fā)生自身反應(yīng)。此外，經(jīng)修飾的肽的增強了的穩(wěn)定性允許應(yīng)用進一步的純化步驟，例如利用HPLC制備非常純的適合體內(nèi)使用的產(chǎn)物。最后，增強了的化學(xué)穩(wěn)定性為產(chǎn)物提供了更長的半衰期。
B.非特異性標記本發(fā)明的抗病毒肽也可以被修飾用于血液組分的非特異性標記。對于非特異性標記，也采用與氨基鍵合，尤其是形成酰胺鍵。為了形成這種鍵，可以采用多種活性羧基、特別是酯作為化學(xué)反應(yīng)性基團，其中羥基部分在所需水平下為生理上可接受的。雖然這些連接劑中可以采用多種不同的羥基，但最常用的是N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)。
其他可利用的連接劑公開在U.S.專利5,612,034中，其在此引入作為參考。
經(jīng)修飾的肽的化學(xué)反應(yīng)性基團可以與其在體內(nèi)反應(yīng)的不同位點包括細胞，特別是血液紅細胞(紅細胞)和血小板；和蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白，包括IgG和IgM、血清白蛋白、鐵蛋白、甾類結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2-巨球蛋白等。那些與經(jīng)修飾的肽反應(yīng)且無法長時間存活的受體一般在約3天內(nèi)從人體宿主中消除?；谠谘褐械臐舛?，上述蛋白質(zhì)(包括細胞的蛋白)在血流中至少保留3天，并且可以特別保留5天或更長時間(一般不超過60天，更常見不超過30天)作為半衰期。
首先，反應(yīng)是與血液中的流動組分進行，特別是血液蛋白和細胞，更加特別是血液蛋白和紅細胞。所謂“流動”是指在任何長時間內(nèi)沒有固定位點，一般不超過5分鐘，更常為1分鐘，雖然一些血液組分可能在長時間內(nèi)相對靜止。最初，應(yīng)存在相對異源的官能化蛋白和細胞群體。然而，在多數(shù)情況中，上述群體在數(shù)天內(nèi)將從起始群體發(fā)生實質(zhì)性變化，這取決于官能化蛋白在血流中的半衰期。所以，通常是在約3天或更長時間內(nèi)，IgG將變?yōu)檠髦械闹饕倌芑鞍住?br> 通常，在給藥后5天，IgG、血清白蛋白和紅細胞在血液中是血液偶聯(lián)組分的至少約60mole％、通常至少約75mole％，并且IgG、IgM(基本在非常低的范圍)和血清白蛋白是非細胞偶聯(lián)組分的至少約50mole％、通常至少約75mole％、更常常是至少約80mole％。
通過給患者施用經(jīng)修飾的肽可以在體內(nèi)制得預(yù)期的非特異經(jīng)修飾的肽與和血液組分的偶聯(lián)物，該患者可以是人體或其他哺乳動物。給藥可以采取快速濃注或通過輸注長時間緩慢引入的形式、利用計量流量等進行。
如果希望，也可以通過把血液和本發(fā)明的經(jīng)修飾的肽混合來離體制備目標偶聯(lián)物，使經(jīng)修飾的肽和血液組分上的反應(yīng)性官能度共價鍵合，隨后把偶聯(lián)血液返回或施用給宿主。此外，上述制備也通過首先純化各血液組分或有限數(shù)量的組分如紅細胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等來實現(xiàn)，并且把這些離體組分與化學(xué)反應(yīng)性經(jīng)修飾的肽結(jié)合。隨后把官能化血液或血液組分返回給宿主，在體內(nèi)提供目標治療有效的偶聯(lián)物。在離體操作中也可以對血液進行處理防止其凝集。
5.經(jīng)修飾的抗病毒和抗融合肽的合成A.肽合成本發(fā)明的抗病毒和/或抗融合肽可以通過所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的固相肽化學(xué)的標準方法合成。譬如，肽可以通過固相化學(xué)技術(shù)按照下面由Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)第2版，Pierce Chemical Company，Rockford，III.，(1984))所述方法、利用Applied Biosystem合成儀制備。同樣地，可以合成多個肽片段，隨后連接在一起形成更大的肽片段。這些合成肽片段也在特定位置進行氨基酸替換。
對于固相肽合成，有關(guān)多種技術(shù)的概述可以參見J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和J.Meienhofer，《激素蛋白和肽》(Hormonal Proteins and Peptide)vol 2，p.46，Academic Press(New York)，1973。經(jīng)典的溶液合成法可參見G.Schroder和K.Lupke，《肽》(The Peptides)，Vol.1，AcacemicPress(New York)。一般地，這些方法包括一種或多種氨基酸或適當保護的氨基酸的順序加入使肽鏈延長。通常情況下，第一個氨基酸的氨基或羧基被適宜的保護基保護。隨后，該保護或衍生化的氨基酸連接在惰性固相載體上或在溶液中通過加入下一個在序列中具有互補(氨基或羧基)基團的適當保護的氨基酸且在適合形成酰胺鍵的條件下利用。隨后從新加入的氨基酸殘基上除去保護基并且加入下一個氨基酸(適當保護的)，并且如此繼續(xù)。
當全部預(yù)期的氨基酸已經(jīng)以適當?shù)男蛄羞B接后，依次或同時脫除任何殘留的保護基(和任何固相載體)，得到最終的多肽。通過對這種通用方法的簡單改進，可以一次性地向延長中的鏈上添加一個以上的氨基酸，譬如，通過偶聯(lián)(在不外消旋化手性中心的條件下)保護的三肽和適當保護的二肽，在脫保護后形成五肽。
特別優(yōu)選的制備本發(fā)明化合物的方法包括固相肽合成法，其中用酸或堿敏感基團保護氨基酸的α-N-末端。這樣的保護基應(yīng)該具有對肽鍵形成的條件穩(wěn)定的特性，同時易于脫除但不會破壞延長的肽鏈或不會使其中所含的任何手性中心外消旋化。適用的保護基是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Cbz)、聯(lián)苯基異丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、異冰片基氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧基羰基、鄰硝基苯基亞磺?；?、2-氰基-叔丁氧基羰基等。9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)保護基特別適合本發(fā)明的肽的合成。其他優(yōu)選的側(cè)鏈保護基是對于側(cè)鏈氨基如賴氨酸和精氨酸來說，是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?pmc)、硝基、對甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺?；bz、Boc和金剛烷基氧基羰基；對于酪氨酸來說，芐基、鄰溴芐氧基羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基和乙?；?Ac)；對于絲氨酸，叔丁基、芐基和四氫吡喃基；對于組氨酸，三苯甲基、芐基、Cbz、對甲苯磺?；?，4-二硝基苯基；對于色氨酸，甲酰基；對于天門冬氨酸和谷氨酸，芐基和叔丁基；和對于半胱氨酸，三苯基甲基(三苯甲基)。
在固相肽合成法中，α-C-末端氨基酸連接在適當?shù)墓滔噍d體或樹脂上。上述合成適用的固相載體是那些對逐級縮合-脫保護反應(yīng)的試劑和條件呈惰性且在所用介質(zhì)內(nèi)不溶解的物質(zhì)。C-末端羧基肽的合成所優(yōu)選的固相載體是4-羥基甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。α-C-末端酰胺肽的優(yōu)選固相載體是Applied Biosystems(Foster City，Calif.)出售的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰胺基乙基樹脂。在可有可無的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)或雙(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦(BOPCI)下，α-C-末端氨基酸與樹脂在N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)介導(dǎo)下在10至50℃的溫度內(nèi)、于溶劑(如二氯甲烷或DMF)中偶聯(lián)約1至約24小時。
當固相載體是4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰胺基乙基樹脂時，在與上述α-C-末端氨基酸偶聯(lián)之前，F(xiàn)moc基用仲胺、優(yōu)選哌啶裂解。與脫保護的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰胺基乙基樹脂偶聯(lián)的優(yōu)選方法是在DMF中利用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲六氟-磷酸(HBTU，1當量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當量)。成功保護的氨基酸的偶聯(lián)可以在所屬領(lǐng)域熟知的自動多肽合成儀中進行。在一個優(yōu)選實施方式中，用Fmoc保護生長肽鏈的α-N-末端氨基酸。通過用仲胺、優(yōu)選哌啶處理可以脫去生長肽鏈的α-N-末端側(cè)的Fmoc保護基。隨后將各種保護的氨基酸以約3倍摩爾過量引入，偶聯(lián)反應(yīng)適宜在DMF中進行。偶聯(lián)劑一般是O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1當量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當量)。
在固相合成結(jié)束時，樹脂上多肽的脫除和脫保護或者連續(xù)進行或者在一個操作中進行?？梢栽谕徊僮髦欣昧呀鈩┨幚順渲Y(jié)合的多肽來完成多肽的脫除和脫保護，裂解劑包括苯硫基甲烷、水、乙烷二硫醇和三氟乙酸。在多肽的α-C-末端為烷酰胺的情況中，樹脂用烷基胺通過氨解裂解。另外，肽可以通過酯基轉(zhuǎn)移，例如用甲醇，隨后通過氨解或直接酰胺基轉(zhuǎn)移脫除。保護的肽可以在此時純化，或者直接進行下一步。側(cè)鏈保護基的脫除是利用上述混合裂解劑進行。完全脫保護的肽通過一系列采用下列任何或全部類型的色譜步驟進行純化弱堿性樹脂(乙酸鹽型)上的離子交換；未衍生聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如Amberlite XAD)上的疏水吸附色譜；硅膠吸附色譜；羧甲基纖維素上的離子交換色譜；分配色譜，例如在Sephadex G-25、LH-20上或逆流分配；高效液體色譜(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-硅膠鍵合相柱填充上的反相HPLC。
這些ITP的分子量利用快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜法測定。
1.N-末端保護基如上所述，術(shù)語“N-保護基”是指那些用于保護氨基酸或肽的α-N-末端或保護氨基酸或肽的氨基在合成過程中不發(fā)生不期望反應(yīng)的基團。常用的N-保護基公開在“有機合成中的保護基”(Protective Groupsin Organic Synthesis，John Wiley & Sons，New York(1981))，其在此引入作為參考。另外，保護基可以作為前藥使用，其易于在體內(nèi)通過例如酶促水解裂解釋放出生物活性母體。α-N-保護基包括低級鏈烷酰基(loweralkanoyl)，例如甲?；?、乙?；?″Ac″)、丙?；?、新戊?；?、叔丁基乙?；龋黄渌；?，包括2-氯乙?；?、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙?；⑧彵蕉柞；?、鄰硝基苯氧基乙?；?、-氯丁?；?、苯甲?；?、4-氯苯甲?；?、4-溴苯甲?；?、4-硝基苯甲?；?；磺?；?，例如苯磺?；妆交酋；龋话被姿狨バ纬苫鶊F，例如芐氧基羰基、對氯芐氧基羰基、對甲氧基芐氧基羰基、對硝基芐氧基羰基、2-硝基芐氧基羰基、對溴芐氧基羰基、3，4-二甲氧基芐氧基羰基、3，5-二甲氧基芐氧基羰基、2，4-二甲氧基芐氧基羰基、4-乙氧基芐氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基芐氧基羰基、3，4，5-三甲氧基芐氧基羰基、1-(對聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、環(huán)戊基氧基羰基、金剛烷氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基、苯基硫代羰基等；芳烷基，例如芐基、三苯甲基、芐氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等；和甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基等。
2.羧基保護基如上所述，術(shù)語″羧基保護基″是指在進行涉及化合物的其他官能位點的反應(yīng)時用于阻隔或保護羧酸官能度的羧酸保護酯或酰胺基。羧基保護基公開在Greene的“有機合成中的保護基”pp.152-186(1981)，其在此引入作為參考。此外，羧基保護基可以用作前藥，由此羧基保護基可以易于在體內(nèi)裂解，例如通過酶促水解，釋放出生物活性母體。此類羧基保護基為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，它們業(yè)已廣泛應(yīng)用于青霉素和頭孢菌素領(lǐng)域中的羧基保護，如U.S.專利3,840,556和3,719,667所述，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。典型的羧基保護基是C1-C8低級烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；芳烷基，例如苯乙基或芐基及其取代衍生物，例如烷氧基芐基或硝基芐基等；芳基鏈烯基，例如苯基乙烯基等；芳基及其取代衍生物，例如5-二氫茚基等；二烷基氨基烷基，例如二甲基氨基乙基等)；烷酰氧基烷基，例如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、異丁酰氧基甲基、異戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、新戊酰乙基甲基、丙酰氧基甲基等；環(huán)烷酰氧基烷基，例如環(huán)丙基羰氧基甲基、環(huán)丁基羰氧基甲基、環(huán)戊基羰氧基甲基、環(huán)己基羰氧基甲基等；芳酰氧基烷基，例如苯甲酰氧基甲基、苯甲酰氧基乙基等；芳烷基羰氧基烷基，例如芐基羰氧基甲基、2-芐基羰氧基乙基等；烷氧基羰基烷基或環(huán)烷氧基羰基烷基，例如甲氧基羰基甲基、環(huán)己氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰氧基烷基或環(huán)烷氧基羰氧基烷基，例如甲氧基羰氧基甲基、叔丁氧基羰氧基甲基、1-乙氧基羰氧基-1-乙基、1-環(huán)己氧基羰氧基-1-乙基等；芳氧基羰氧基烷基，例如2-(苯氧基羰氧基)乙基、2-(5-二氫茚基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基烷基羰氧基烷基，例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酰氧基)乙基等；芳烷氧基羰氧基烷基，例如2-(芐氧基羰基氧基)乙基等；芳基鏈烯基氧基羰氧基烷基，例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基，例如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基，例如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷酰基氨基烷基，例如乙?；被谆?；雜環(huán)羰氧基烷基，例如4-甲基哌嗪基羰氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基，例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-(低級烷基)-2-氧代-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)烷基，例如(5-叔丁基-2-氧代-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基等；和(5-苯基-2-氧代-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)烷基，例如(5-苯基-2-氧代-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基等。
代表性的酰胺羧基保護基是氨基羰基和低級烷基氨基羰基。
優(yōu)選的本發(fā)明羧基保護化合物是其中保護的羧基是低級烷基、環(huán)烷基或芳烷基酯，譬如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、仲丁酯、異丁酯、戊酯、異戊酯、辛酯、環(huán)己酯、苯乙酯等；或烷酰氧基烷基、環(huán)烷酰氧基烷基、芳酰氧基烷基或芳烷基羰氧基烷基酯的化合物。優(yōu)選的酰胺羧基保護基是低級烷基氨基羰基。譬如，天門冬氨酸可以在α-C-末端用酸不穩(wěn)定基團(例如叔丁基)保護并在β-C-末端用氫化敏感基團(例如芐基)保護，隨后在合成過程中選擇性地脫保護。
B.肽的修飾本發(fā)明制備經(jīng)修飾的肽的方式可以根據(jù)含肽在內(nèi)的不同因素的本質(zhì)進行多種變化。合成方法的選擇應(yīng)簡便，提供高收率并且能夠得到高純度的產(chǎn)物。通常，化學(xué)反應(yīng)性基團應(yīng)在合成的最后階段產(chǎn)生，譬如，對于羧基，酯化生成活性酯。本發(fā)明制備經(jīng)修飾的肽的具體方法如下所述。
特別是，首先測定所選擇肽的抗病毒活性，隨后僅在肽的N端、C端或內(nèi)部用連接基團修飾。隨后測定這種經(jīng)修飾的肽-連接基團的抗病毒活性。如果抗病毒活性沒有急劇降低(即降低小于10倍)，則利用其體內(nèi)壽命測定該經(jīng)修飾的肽-連接體的穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定性沒有改進達到預(yù)期的水平，則在另一位點修飾該肽，重復(fù)該過程直至獲得預(yù)期的抗病毒水平和穩(wěn)定性。
更具體地說，選擇經(jīng)受連接體和反應(yīng)實體基團修飾的各肽應(yīng)按照下列標準修飾如果肽上的末端羧基可以利用且對抗病毒活性的保持沒有決定性作用，同時肽上不存在其他敏感官能團，則選擇該羧基作為連接體-反應(yīng)基團修飾的連接點。如果末端羧基參與抗病毒活性，或如果沒有羧基可以利用，則選擇任何其他對保持抗病毒活性沒有實質(zhì)影響的敏感官能團作為連接體-反應(yīng)實體修飾的連接點。如果在肽上存在若干個可利用的敏感官能團，保護基的聯(lián)合形式應(yīng)以一定方式應(yīng)用，以使連接體/反應(yīng)實體的加入和所有被保護敏感官能團的脫保護后，仍然能夠保持抗病毒活性。如果肽上沒有敏感官能團可利用，或者希望進行更簡單的修飾途徑，對于起始肽的修飾的合成實踐應(yīng)以能夠維持抗病毒活性的方式進行。在這種情況中，修飾發(fā)生在肽的相反末端。
NHS衍生物可以由羧酸在肽中不存在其他敏感官能團的條件下合成。具體而言，這種肽在無水CH2Cl2和EDC中與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，產(chǎn)物通過層析或重結(jié)晶從適當?shù)娜軇w系純化得到NHS衍生物。
另外，NHS衍生物可以從含有氨基和/或巰基和羧酸的肽合成。當分子中存在游離氨基或巰基時，優(yōu)選在加入NHS衍生物之前將這些敏感官能團保護起來。譬如，如果分子含有游離氨基，有必要在實施上述化學(xué)之前使胺轉(zhuǎn)化為Fmoc或優(yōu)選轉(zhuǎn)化為tBoc保護的胺。胺官能度不是在NHS衍生物的制備之后脫保護。所以，這種方法只適用于那些不必釋放其氨基產(chǎn)生預(yù)期抗病毒效應(yīng)的化合物。如果需要釋放氨基保持分子的原有特性，則不得不進行下面另一種化學(xué)。
此外，NHS衍生物可以從含有氨基或巰基但無羧酸的肽合成。當選擇的分子不含有羧酸時，可以利用一組雙官能連接體使分子轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性NHS衍生物。譬如，將乙二醇-雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(EGS)和三乙胺溶于DMF中，向其中加入含游離氨基的分子(與EGS的比例適宜為10∶1)，產(chǎn)生單NHS衍生物。為了從巰基衍生分子制備NHS衍生物，可以利用存在于DMF中的N-[馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)和三乙胺。馬來酰亞胺基與游離巰基反應(yīng)，利用在硅膠上層析或通過HPLC可以從反應(yīng)混合物純化NHS衍生物。
NHS衍生物也可以從含有多個敏感官能團的肽合成。各種情況已經(jīng)過分析且以不同的方式解決。然而，借助于大量市售的保護基和雙官能連接體，本發(fā)明可以應(yīng)用于任何肽，優(yōu)選通過一個化學(xué)步驟來修飾所述肽(如上所述)，或兩個步驟(如上所述包括敏感基團的在先保護)或三個步驟(保護、活化和脫保護)。只有在例外的情形中，需要利用多步(超過三個步驟)的合成把肽轉(zhuǎn)化為活性NHS或馬來酰亞胺衍生物。
馬來酰亞胺衍生物也可以由含有游離氨基和游離羧酸的肽合成。為了從氨基衍生化分子制備馬來酰亞胺衍生物，可以利用存在于DMF中的N-[γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)和三乙胺。琥珀酰亞胺酯基與游離氨基反應(yīng)，并且通過結(jié)晶或在硅膠上層析或HPLC可以從反應(yīng)混合物中純化馬來酰亞胺衍生物。
最后，馬來酰亞胺衍生物可以從含有多個其他敏感官能團且無游離羧酸的肽合成。當選擇不含有羧酸的分子時，可以利用一組雙官能交聯(lián)劑把該分子轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性NHS衍生物。譬如，通過游離胺和MPA的羧基的反應(yīng)、利用HBTU/HOBt/DIEA活化，在DMF中馬來酰亞胺基丙酸(MPA)可以和游離胺偶聯(lián)生成馬來酰亞胺衍生物。
許多市售的其他雜雙官能交聯(lián)劑可以在必要時作為替代。大量雙官能化合物可以用來連接實體。試劑的實例包括疊氮基苯甲酰肼、N-[4-(對疊氮基水楊基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)、雙磺基琥珀酰亞胺基辛二酸鹽、二甲基己二酰亞胺酯、二琥珀酰亞胺基酒石酸酯、N-y-馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-甲酸酯。
6.經(jīng)修飾的抗病毒肽的應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)修飾抗病毒肽可以在患有病毒感染的患者的治療中用作治療劑，并且可以按照下面所述的方法和所屬領(lǐng)域其它已知方法對患者給藥。經(jīng)修飾的肽的有效治療劑量可以通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法測定并且應(yīng)考慮肽的潛在毒性。
經(jīng)修飾的肽也可以預(yù)防性給予在先未感染個體。這有益于那些接觸病毒的危險性高的個體情況，這可能出現(xiàn)在與那些攜帶高危病毒傳染的已感染個體相接觸的個體中。這尤其有利于那些已知的病毒(如HIV病毒)的治療。例如，經(jīng)修飾的抗HIV肽的預(yù)防性給藥將有益于那些已經(jīng)接觸了HIV感染個體血液的保健工作者的情況，或在其它從事可能接觸HIV病毒的高危活動的個體情況。
7.經(jīng)修飾的抗病毒和抗融合肽的給藥通常，經(jīng)修飾的肽在給藥時應(yīng)存在于生理可接受的介質(zhì)中，例如去離子水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、鹽水、含水乙醇或其它醇、血漿、蛋白性溶液、甘露糖醇、葡萄糖水、醇、植物油等。其它可以含有的添加劑包括緩沖劑，其中介質(zhì)一般被緩沖在約5至10的pH范圍內(nèi)，而緩沖劑的濃度一般約為50至250mM；鹽，其中鹽的濃度通常約為5至500mM；生理可接受穩(wěn)定劑等。組合物可以被冷凍干燥以便常規(guī)儲存和運輸。
經(jīng)修飾的肽多數(shù)是經(jīng)非腸道給藥如血管內(nèi)(IV)、動脈內(nèi)(IA)、肌肉內(nèi)(IM)、皮下(SC)等。在適當情況中可以通過輸液給藥。在某些場合中，當官能團的反應(yīng)相對緩慢時，可以通過口服、經(jīng)鼻、直腸、透皮或氣溶膠給藥，由此偶聯(lián)物的特性允許傳遞到血管系統(tǒng)。通常應(yīng)采用單劑量注射，雖然如果需要時可以采用注射一次以上。經(jīng)修飾的肽可以利用任何工具給藥，包括注射器、套管針、插管等。
具體的給藥方式應(yīng)根據(jù)給藥量、是否單劑量快速濃注或是連續(xù)給藥等而改變。更加可取地，應(yīng)血管內(nèi)給藥，引入的位點對于本發(fā)明而言并不重要，優(yōu)選的位點是血流迅速的位置，例如靜脈內(nèi)，外周或中樞靜脈。發(fā)現(xiàn)也可以利用其它途徑，其中給藥與緩釋技術(shù)或保護性基質(zhì)相結(jié)合。這樣做的意圖在于，使經(jīng)修飾的肽有效分布在血液中，由此能夠與血液組分反應(yīng)。偶聯(lián)物的濃度將變化多端，通常約為1pg/ml至50mg/ml。血管內(nèi)給藥的總量一般應(yīng)在約0.1mg/ml至約10mg/ml、更常為約1mg/ml至約5mg/ml的范圍內(nèi)。
通過與長壽命血液組分如免疫球蛋白、血清白蛋白、紅細胞和血小板結(jié)合，產(chǎn)生了多個優(yōu)越性。所述肽的活性被延長到數(shù)天至數(shù)周。在這段時間內(nèi)只需要給藥一次?？梢垣@得更高的特異性，因為活性化合物主要與大分子鍵合，由此似乎很少被吸收到細胞內(nèi)干擾其它生理過程。
8.監(jiān)測經(jīng)修飾的肽的存在為了監(jiān)測經(jīng)修飾的肽的存在可以監(jiān)測哺乳動物宿主的血液一次或多次。通過采集一部分或宿主血液的樣本，可以測定出是否已經(jīng)有足夠量的肽與長壽命血液組分鍵合轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄委熁钚?，而且隨后可以測定血液中肽化合物的水平。如果希望，還可以測定肽究竟與何種血液組分鍵合。這在采用非特異性經(jīng)修飾的肽時非常重要。對于特異性馬來酰亞胺-修飾的肽，計算血清白蛋白和IgG的半衰期會更加簡單。
A.免疫測定本發(fā)明的另一方面涉及測定抗病毒肽和/或類似物或其衍生物和偶聯(lián)物在生物樣本(例如血液)中的濃度的方法，該方法利用了對所述的肽、肽類似物或其衍生物和偶聯(lián)物特異性的抗體；并且涉及此類抗體在與所述的肽、類似物和/或其衍生物或偶聯(lián)物可能有關(guān)的毒性的治療中的應(yīng)用。這是有益的，因為所述肽提高了的體內(nèi)穩(wěn)定性和壽命可能在治療中導(dǎo)致新的問題，包括中毒可能性的增加。
對特定肽、肽類似物或其衍生物具有特異性的單克隆或多克隆的抗治療劑抗體的應(yīng)用可以有助于解決此類問題。抗體可以產(chǎn)生或衍生自用特定肽、類似物或其衍生物免疫的宿主，或用試劑的免疫原性片段或用試劑的免疫決定簇相應(yīng)的合成免疫原免疫的宿主。優(yōu)選的抗體應(yīng)對天然的、經(jīng)修飾和偶聯(lián)形式的肽具有高度的特異性和親和力。此類抗體也可以用酶、熒光染料或放射性標記物進行標記。
用純化的肽可以制備對經(jīng)修飾的肽具有特異性的抗體，從而誘導(dǎo)肽特異性抗體。通過抗體的誘導(dǎo)，不但經(jīng)過給動物注射后可以刺激免疫反應(yīng)，而且在合成抗體或其它特異性結(jié)合分子的制備中也以進行類似步驟，例如篩選重組免疫球蛋白文庫。單克隆和多克隆抗體都可以通過所屬領(lǐng)域熟知的方法制備。
還可以利用抗肽抗體來治療由經(jīng)修飾的肽、其類似物或衍生物給藥引起的中毒，并且可以離體或體內(nèi)使用。離體方法包括利用固定在固相載體上的抗治療劑抗體對中毒進行免疫透析治療。體內(nèi)方法包括以有效引發(fā)抗體-治療劑復(fù)合物的清除的量施用抗治療劑抗體。
通過在滅菌條件下令血液與抗體接觸，用抗體可以除去患者離體血液中的經(jīng)修飾的肽或其類似物或偶聯(lián)物。譬如，抗體可以固定在柱基質(zhì)上，患者血液從患者取出并且經(jīng)過該基質(zhì)。經(jīng)修飾的肽、肽類似物、衍生物或偶聯(lián)物將與該抗體結(jié)合，含有低濃度的肽、類似物、衍生物或偶聯(lián)物的血液可以返回到患者循環(huán)系統(tǒng)中。通過調(diào)節(jié)壓力和流量可以控制肽化合物的除去量。
所述的肽、類似物、衍生物和偶聯(lián)物從患者血液的血漿組分中優(yōu)先除去會受到影響，譬如，利用半透膜；或首先利用所屬領(lǐng)域的已知方法將細胞組分與血漿組分分開，隨后令血漿組分流經(jīng)含有抗治療劑抗體的基質(zhì)。另外，肽偶聯(lián)的血細胞(包括紅細胞)的優(yōu)先除去可以通過收集和濃縮患者血液中的血細胞并使這些細胞與固定的抗ITP抗體接觸以排除患者血液的血清組分而受到影響。
抗治療劑抗體可以經(jīng)非腸道體內(nèi)施用給接受所述肽、類似物、衍生物或偶聯(lián)物治療的患者?？贵w將與肽化合物和偶聯(lián)物結(jié)合。一旦結(jié)合，即使不是完全阻斷，肽的活性也將受到阻礙，由此降低肽化合物在患者血流中的生物有效濃度并減輕有害的副作用。此外，結(jié)合的抗體-肽復(fù)合物將有助于患者血流中肽化合物和偶聯(lián)物的清除。
全面描述的本發(fā)明現(xiàn)將通過下列非限定實施例舉例說明。實施例1經(jīng)修飾的DP178的制備--YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFK(MPA)-NH2的合成在本實施例中，按照下面的合成路線合成和修飾DP178(SEQ IDNO1)為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，DP178是HIV-1的有效抑制劑，并且能夠抑制HIV-1感染和未感染細胞之間的細胞誘導(dǎo)的合胞體形成以及未感染細胞被無細胞HIV-1病毒的感染。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀(Symphony Peptide Synthesizer)和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。合成結(jié)束時，通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。
DP-178C 實施例2經(jīng)修飾的DP107的制備--NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQK(MPA)NH2的合成在本實施例中，按照下面的合成路線合成和修飾DP107(SEQ IDNO2)為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，DP107表現(xiàn)出對HIV-1有效的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-His(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。
DP-107C 實施例3經(jīng)修飾的抗RSV肽的制備(C末端1)在本實施例中，按照下面的合成路線將肽VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV(SEQ ID NO16)修飾為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，天然序列(SEQ ID NO)抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的病毒性感染，包括抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Val-OH.。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例4經(jīng)修飾的抗RSV肽的制備(T-N末端)在本實施例中，按照下面的合成路線合成肽VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV(SEQ ID NO17)，其相應(yīng)于SEQ ID NO16的肽但半胱氨酸(C)被蛋氨酸(M)殘基替換，并且修飾為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，天然序列(SEQ ID NO16)抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的病毒性感染，包括抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
100tmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Val-OH.。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例5經(jīng)修飾的抗RSV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO14為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO14抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的病毒性感染，包括抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例6(T-143)經(jīng)修飾的抗RSV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO15為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO15抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的病毒性感染，包括抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽類似物的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH.。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例7經(jīng)修飾的抗RSV肽的制備(C末端)在本實施例中，按照下面的合成路線合成肽SEQ ID NO17)，其相應(yīng)于其相應(yīng)于SEQ ID NO16的肽但半胱氨酸(C)被蛋氨酸(M)殘基替換，并且修飾為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，天然序列SEQ ID NO16抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的病毒性感染，包括抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Val-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例8經(jīng)修飾的抗RSV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO29為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO29抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的病毒性感染，包括抑制RSV感染和未感染Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例9(T-173)經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO52為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO52抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例10經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO58為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO58抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例11經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO35為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO35抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例12經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO38為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO38抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lgu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH BOC-Lys(Aloc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例13經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO39為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO39抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例14經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO40為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO40抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例15經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO41為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO41抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH Boc-Lys(Aloc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例16經(jīng)修飾的抗HPIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO42為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO42抑制人副流感病毒3(HPIV3)的病毒性感染，包括抑制HPIV3感染Hep-2細胞和未感染CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-His(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例17經(jīng)修飾的抗MeV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO77為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO77抑制麻疹病毒(MeV)的病毒性感染，包括抑制MeV感染和未感染Vero細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-His(Boc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(VarianDynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例18經(jīng)修飾的抗MeV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO79為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO79抑制麻疹病毒(MeV)的病毒性感染，包括抑制MeV感染和未感染Vero細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例19經(jīng)修飾的抗MeV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO81為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO79抑制麻疹病毒(MeV)的病毒性感染，包括抑制MeV感染和未感染Vero細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(VarianDynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例20經(jīng)修飾的抗MeV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾肽SEQ ID NO84為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO84抑制麻疹病毒(MeV)的病毒性感染，包括抑制MeV感染和未感染Vero細胞之間的融合和合胞體形成。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用于冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約1 80分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(VarianDynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例21經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO64為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO64作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mL CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(VarianDynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例22經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO65為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO65作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例23經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO66為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO66作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH Boc-Lys(Aloc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例24經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO67為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO67作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例25經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO68為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO68作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH Boc-Lys(Aloc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例26經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO69為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO69作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例27經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO70為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO70作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，Boc-Lys(Aloc)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例28經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO71為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO71作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例29經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO72為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO72作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。實施例30經(jīng)修飾的抗SIV肽的制備在本實施例中，按照下面的合成路線合成并修飾SEQ ID NO73為含有連接體和馬來酰亞胺基團。如美國專利6,013,236和6,020,459所述，SEQ ID NO73作為粗品肽表現(xiàn)出對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。
100μmole規(guī)模上的經(jīng)修飾的肽的固相肽合成是采用手動固相合成、協(xié)同肽合成儀和Fmoc保護Rink酰胺MBHA樹脂進行。將下列保護的氨基酸順序加入樹脂F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH。把它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)并且按照序列用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用存在于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％(V/V)哌啶溶液在20分鐘內(nèi)進行Fmoc保護基的脫除(步驟1)。通過用3當量溶于5mLCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時手動完成Lys(Aloc)基的選擇性脫保護(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％存在于DCM中的HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。此后再次自動合成以便添加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。每次偶聯(lián)之間，樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次并用異丙醇洗滌3次。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚從樹脂脫下肽，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過制備反相HPLC、使用Varian(Rainin)的制備二元HPLC系統(tǒng)純化在約180分鐘內(nèi)30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))以9.5mL/分鐘進行的梯度洗脫；使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基21mm×25cm柱和λ214和254nm的UV檢測儀(Varian Dynamax UVD II)，得到預(yù)期的經(jīng)修飾的肽(即DAC)，通過RP-HPLC測出肽的純度＞95％。雖然已經(jīng)描述和例舉了本發(fā)明的某些實施方式，但所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明不受這些實施方式具體內(nèi)容的限定，而由所附的權(quán)利要求書限定。
表2DP178羧基端平截YTSYTSLYTSLIYTSLIHYTSLIHSYTSLIHSLYTSLIHSLIYTSLIHSLIEYTSLIHSLIEEYTSLIHSLIEESYTSLIHSLIEESQYTSLIHSLIEESQNYTSLIHSLIEESQNQYTSLJHSLJEESQNQQYTSLIHSLIEESQNQQEYTSLIHSLIEESQNQQEKYTSLIHSLIEESQNQQEKNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF采用表1的單字母氨基酸編碼表3DP178氨基端平截NWFWNWFLWNWFSLWNWFASLWNWFWASLWNWFKWASLWNWFDKWASLWNWFLDKWASLWNWFELDKWASLWNWFLELDKWASLWNWFLLELDKWASLWNWFELLELDKWASLWNWFQELLELDKWASLWNWFEQELLELDKWASLWNWFNEQELLELDKWASLWNWFKNEQELLELDKWASLWNWFEKNEQELLELDKWASLWNWFQEKNEQELLELDKWASLWNWFQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF采用表1的單字母氨基酸編碼表4DP107羧基端平截NNLNNLLNNLLRNNLLRANNLLRAINNLLRAIENNLLRAIEANNLLRAIEAQNNLLRAIEAQQNNLLRAIEAQQHNNLLRAIEAQQHLNNLLRAIEAQQHLLNNLLRAIEAQQHLLQNNLLRAIEAQQHLLQLNNLLRAIEAQQHLLQLTNNLLRAIEAQQHLLQLTVNNLLRAIEAQQHLLQLTVWNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQINNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQANNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARINNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILANNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVENNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ采用表1的單字母氨基酸編碼表5DP107氨基端平截KDQLKDQYLKDQRYLKDQERYLKDQVERYLKDQAVERYLKDQLAVERYLKDQILAVERYLKDQRILAVERYLKDQARILAVERYLKDQQARILAVERYLKDQLQARILAVERYLKDQQLQARILAVERYLKDQKQLQARILAVERYLKDQIKQLQARILAVERYLKDQQIKQLQARILAVERYLKDQWQIKQLQARILAVERYLKDQVWQIKQLQARILAVERYLKDQTVWQIKQLQARILAVERYLKDQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ采用表1的單字母氨基酸編碼表6HIV-2NIHZDP178類似物羧基端平截LEALEANLEANILEANISLEANISQLEANISQSLEANISQSLLEANISQSLELEANISQSLEQLEANISQSLEQALEANISQSLEQAQLEANISQSLEQAQILEANISQSLEQAQIQLEANISQSLEQAQIQQLEANISQSLEQAQIQQELEANISQSLEQAQIQQEKLEANISQSLEQAQIQQEKNLEANISQSLEQAQIQQEKNMLEANISQSLEQAQIQQEKNMYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELEANISQSLEQAQIQQEKNMYELLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL采用表1的單字母氨基酸編碼表7HIV-2NIHZDP178類似物氨基端平截NWLTNWLFTNWLVFTNWLDVFTNWLWDVFTNWLSWDVFTNWLNSWDVFTNWLLNSWDVFTNWLKLNSWDVFTNWLQKLNSWDVFTNWLLQKLNSWDVFTNWLELQKLNSWDVFTNWLYELQKLNSWDVFTNWLMYELQKLNSWDVFTNWLNMYELQKLNSWDVFTNWLKNMYELQKLNSWDVFTNWLEKNMYELQKLNSWDVFTNWLQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLSQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLNISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL采用表1的單字母氨基酸編碼表8呼吸道合胞病毒(RSV)DP107F2區(qū)類似物羧基端平截YTSYTSVYTSVIYTSVITYTSVITIYTSVITIEYTSVITIELYTSVITIELSYTSVITIELSNYTSVITIELSNIYTSVITIELSNIKYTSVITIELSNIKEYTSVITIELSNIKENYTSVITIELSNIKENKYTSVITIELSNIKENKCYTSVITIELSNIKENKCNYTSVITIELSNIKENKCNGYTSVITIELSNIKENKCNGTYTSVITIELSNIKENKCNGTDYTSVITIELSNIKENKCNGTDAYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQEYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTEYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQST采用表1的單字母氨基酸編碼表9呼吸道合胞病毒(RSV)DP107F2區(qū)類似物氨基端平截QSTMQSTLMQSTLLMQSTQLLMQSTLQLLMQSTELQLLMQSTTELQLLMQSTVTELQLLMQSTAVTELQLLMQSTNAVTELQLLMQSTKNAVTELQLLMQSTYKNAVTELQLLMQSTKYKNAVTELQLLMQSTDKYKNAVTELQLLMQSTLDKYKNAVTELQLLMQSTELDKYKNAVTELQLLMQSTQELDKYKNAVTELQLLMQSTKQELDKYKNAVTELQLLMQSTIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTLSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTTIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQST采用表1的單字母氨基酸編碼表10呼吸道合胞病毒(RSV)F1 DP178區(qū)類似物羧基端平截FYDFYDPFYDPLFYDPLVFYDPLVFFYDPLVFPFYDPLVFPSFYDPLVFPSDFYDPLVFPSDEFYDPLVFPSDEFFYDPLVFPSDEFDFYDPLVFPSDEFDAFYDPLVFPSDEFDASFYDPLVFPSDEFDASIFYDPLVFPSDEFDASISFYDPLVFPSDEFDASISQFYDPLVFPSDEFDASISQVFYDPLVFPSDEFDASISQVNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKIFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL采用表1的單字母氨基酸編碼表11呼吸道合胞病毒(RSV)F1 DP178區(qū)類似物氨基端平截DELLSDELLKSDELLRKSDELLIRKSDELLFIRKSDELLAFIRKSDELLLAFIRKSDELLSLAFIRKSDELLQSLAFIRKSDELLNQSLAFIRKSDELLINQSLAFIRKSDELLKINQSLAFIRKSDELLEKINQSLAFIRKSDELLNEKINQSLAFIRKSDELLVNEKINQSLAFIRKSDELLQVNEKINQSLAFIRKSDELLSQVNEKINQSLAFIRKSDELLISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSISQVNEKINQSLAFIRKSDELLASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL采用表1的單字母氨基酸編碼表12人副流感病毒3(HPV3)F1區(qū)DP178類似物羧基端平截ITLITLNITLNNITLNNSITLNNSVITLNNSVAITLNNSVALITLNNSVALDITLNNSVALDPITLNNSVALDPIITLNNSVALDPIDITLNNSVALDPIDIITLNNSVALDPIDISITLNNSVALDPIDISIITLNNSVALDPIDISIEITLNNSVALDPIDISIELITLNNSVALDPIDISIELNITLNNSVALDPIDISIELNKITLNNSVALDPIDISIELNKAITLNNSVALDPIDISIELNKAKITLNNSVALDPIDISIELNKAKSITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLITLNNSVALDPJDISIELNKAKSDLEITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEEITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRS采用表1的單字母氨基酸編碼表13人副流感病毒3(HPV3)F1區(qū)DP178類似物氨基端平截RRSIRRSWIRRSEWIRRSKEWIRRSSKEWIRRSESKEWIRRSEESKEWIRRSLEESKEWIRRSDLEESKEWIRRSSDLEESKEWIRRSKSDLEESKEWIRRSAKSDLEESKEWIRRSKAKSDLEESKEWIRRSNKAKSDLEESKEWIRRSLNKAKSDLEESKEWIRRSELNKAKSDLEESKEWIRRSIELNKAKSDLEESKEWIRRSSIELNKAKSDLEESKEWIRRSISIELNKAKSDLEESKEWIRRSDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSLDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSTLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRS采用表1的單字母氨基酸編碼表14人副流感病毒3(HPV3)F1區(qū)DP107類似物羧基端平截ALGALGVALGVAALGVATALGVATSALGVATSAALGVATSAQALGVATSAQIALGVATSAQITALGVATSAQITAALGVATSAQITAAALGVATSAQITAAVALGVATSAQITAAVAALGVATSAQITAAVALALGVATSAQITAAVALVALGVATSAQITAAVALVEALGVATSAQITAAVALVEAALGVATSAQITAAVALVEAKALGVATSAQITAAVALVEAKQALGVATSAQITAAVALVEAKQAALGVATSAQITAAVALVEAKQARALGVATSAQITAAVALVEAKQARSALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIR采用表1的單字母氨基酸編碼表15人副流感病毒3(HPV3)F1區(qū)DP107類似物氨基端平截IRDAIRDEAIRDKEAIRDLKEAIRDKLKEAIRDEKLKEAIRDIEKLKEAIRDDIEKLKEAIRDSDIEKLKEAIRDRSDIEKLKEAIRDARSDIEKLKEAIRDQARSDIEKLKEAIRDKQARSDIEKLKEAIRDAKQARSDIEKLKEAIRDEAKQARSDIEKLKEAIRDVEAKQARSDIEKLKEAIRDLVEAKQARSDIEKLKEAIRDALVEAKQARSDIEKLKEAIRDVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDLGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRD采用表1的單字母氨基酸編碼表16抗呼吸道合胞病毒(RSV)肽TSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVVAVSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSAVSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVVSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQVAVSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSAVSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVVSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLSKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTKVLHLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSLEGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDGEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKEVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNVNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYNKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIKIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDIALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ采用表1的單字母氨基酸編碼表17抗人副流感病毒3(HPV3)肽TLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSILDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSSIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSSIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSSTELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSSTTTAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSILVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNL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Asn Lys Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn20 25 30Leu Ile Val35<210>54<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>54Ala Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg1 5 10 15Asp Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu20 25 30Ile Val Ala35<210>55<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>55Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg Asp1 5 10 15Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu Ile20 25 30Val Ala Ile35<210>56<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>56Gln Ala Arg Ser Asp Ile Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg Asp Thr1 5 10 15Asn Lys Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu Ile Val20 25 30Ala Ile Lys35<210>57<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>57Ala Arg Ser Asp Ile Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg Asp Thr Asn1 5 10 15Lys Ala Val Gln Ser Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu Ile Val Ala20 25 30Ile Lys Ser35<210>58<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>58Arg Ser Asp Ile Glu 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Val35<210>63<211>47<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>63Thr Trp Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile1 5 10 15Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr20 25 30Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp Val Phe Gly Asn Trp Phe35 40 45<210>64<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>64Trp Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr1 5 10 15Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu20 25 30Leu Gln Lys35<210>65<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>65Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala1 5 10 15Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu20 25 30Gln Lys Leu35<210>66<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>66Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu1 5 10 15Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln20 25 30Lys Leu Asn35<210>67<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>67Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu1 5 10 15Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys20 25 30Leu Asn Ser35<210>68<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>68Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu1 5 10 15Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu20 25 30Asn Ser Trp35<210>69<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>69Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu1 5 10 15Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn20 25 30Ser Trp Asp35<210>70<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>70Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala1 5 10 15Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser20 25 30Trp Asp Val35<210>71<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>71Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp20 25 30Asp Val 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Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser Asp Gln Ile Leu Arg Ser20 25 30Met Lys
權(quán)利要求
1.經(jīng)修飾的抗病毒肽，含有具有抗病毒活性的肽，和與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價鍵的反應(yīng)性基團。
2.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述反應(yīng)性基團是琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺基。
3.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述反應(yīng)性基團是與血液蛋白上的巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基。
4.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽是DP178或DP107或其類似物。
5.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽對人免疫缺陷病毒(HIV)顯示出抗病毒活性。
6.權(quán)利要求5的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ ID NO1至SEQ ID NO9組成的組。
7.權(quán)利要求5的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽是DP178或DP107。
8.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽對人呼吸道合胞病毒(RSV)顯示出抗病毒活性。
9.權(quán)利要求8的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ ID NO10至SEQ ID NO30組成的組。
10.權(quán)利要求8的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ ID NO14至SEQ ID NO17和SEQ ID NO29組成的組。
11.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽對人副流感病毒(HPIV)顯示出抗病毒活性。
12.權(quán)利要求11的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ ID NO31至SEQ ID NO62組成的組。
13.權(quán)利要求11的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ IDNO35、SEQ ID NO38至SEQ ID NO42、SEQ ID NO52和SEQ IDNO58組成的組。
14.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽對麻疹病毒(MeV)顯示出抗病毒活性。
15.權(quán)利要求14的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ ID NO74至SEQ ID NO86組成的組。
16.權(quán)利要求14的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ IDNO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81和SEQ ID NO84組成的組。
17.權(quán)利要求1的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽對猿猴免疫缺陷病毒(SIV)顯示出抗病毒活性。
18.權(quán)利要求17的經(jīng)修飾的肽，其中所述肽選自由SEQ ID NO63至SEQ ID NO73組成的組。
19.一種用于預(yù)防和/或治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的組合物，所述組合物含有對人免疫缺陷病毒(HIV)具有抗病毒活性的肽，所述肽被反應(yīng)性基團修飾，所述反應(yīng)性基團與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述反應(yīng)性基團是與血液蛋白上的巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述肽是DP178或DP107或其類似物。
22.一種用于預(yù)防和/或治療人呼吸道合胞病毒(RSV)感染的組合物，所述組合物含有對RSV具有抗病毒活性的肽，所述肽被反應(yīng)性基團修飾，所述反應(yīng)性基團與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價鍵。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述反應(yīng)性基團是與血液蛋白上的巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述肽選自由SEQ ID NO14至SEQ ID NO17和SEQ ID NO29組成的組。
25.一種用于預(yù)防和/或治療人副流感病毒(HPIV)感染的組合物，所述組合物含有對人副流感病毒(HPIV)表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，所述肽被反應(yīng)性基團修飾，所述的反應(yīng)性基團與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述反應(yīng)性基團是與血液蛋白上的巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述肽選自由SEQ ID NO35、SEQ ID NO38至SEQ ID NO42、SEQ ID NO52和SEQ ID NO58組成的組。
28.一種用于預(yù)防和/或治療麻疹病毒(MeV)感染的組合物，所述組合物含有對麻疹病毒(MeV)表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，所述肽被反應(yīng)性基團修飾，所述的反應(yīng)性基團與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述反應(yīng)性基團是與血液蛋白上的巰基反應(yīng)的馬來酰亞胺基。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述肽選自由SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81和SEQ ID NO84組成的組。
全文摘要
具有抗病毒和抗融合活性的肽經(jīng)修飾提供更高的穩(wěn)定性和改進的體內(nèi)半衰期。所選肽包括融合抑制劑DP178和DP107和有關(guān)的肽及其類似物。經(jīng)修飾的肽能夠與一種或多種血液組分,優(yōu)選流動的血液組分形成共價鍵。
文檔編號C07K14/16GK1351611SQ00807671
公開日2002年5月29日申請日期2000年5月17日優(yōu)先權(quán)日1999年5月17日
發(fā)明者多米尼克·P·布里頓, 羅伯特·S·迪弗雷納, 尼塞·布迪耶萊布, 馬丁·羅比塔利, 彼得·G·米爾納申請人:康久化學(xué)公司

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技術(shù)研發(fā)人員：多米尼克.P.布里頓;羅伯特.S.迪弗雷納;尼塞.布迪耶萊布;馬丁.羅比塔利;彼得.G.米爾納
技術(shù)所有人：康久化學(xué)公司
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