專利名稱：鈣受體活性化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠調(diào)控一種或多種無(wú)機(jī)離子受體活性的化合物的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)、組成及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
體內(nèi)某些細(xì)胞不僅對(duì)化學(xué)信號(hào)，而且對(duì)離子(如細(xì)胞外鈣離子(Ca2+))產(chǎn)生應(yīng)答。細(xì)胞外Ca2+的濃度(本文記作[Ca2+])的變化改變這些細(xì)胞的功能性應(yīng)答。一種這樣的特化細(xì)胞是分泌甲狀旁腺激素(PTH)的甲狀旁腺細(xì)胞。PTH是調(diào)節(jié)血液和細(xì)胞外液中Ca2+體內(nèi)平衡的主要內(nèi)分泌因子。
PTH通過(guò)作用于骨和腎細(xì)胞，提高血液中Ca2+水平。這種[Ca2+]的提高作用作為負(fù)反饋信號(hào)，抑制PTH分泌。[Ca2+]和PTH分泌之間的相互關(guān)系形成維持體內(nèi)Ca2+平衡的主要機(jī)制。
細(xì)胞外Ca2+直接作用于甲狀旁腺細(xì)胞，調(diào)節(jié)PTH分泌。已證實(shí)存在一種甲狀旁腺細(xì)胞表面蛋白，該蛋白可以檢測(cè)[Ca2+]變化。Brown等，自然，366，574，1993。在甲狀旁腺細(xì)胞中，該蛋白作為細(xì)胞外Ca2+的受體(“鈣受體”)檢測(cè)[Ca2+]變化并引發(fā)功能性細(xì)胞應(yīng)答，即PTH分泌。
細(xì)胞外Ca2+能作用于不同細(xì)胞功能，綜述見(jiàn)Nemeth等，細(xì)胞鈣，11，319，1990。關(guān)于副濾泡細(xì)胞(C細(xì)胞)和甲狀旁腺細(xì)胞中的胞外Ca2+作用的討論見(jiàn)Nemeth，細(xì)胞鈣，11，323，1990。這些細(xì)胞表達(dá)相似的Ca2+受體。Brown等自然，366，574，1993；Mithal等，骨骼和礦物質(zhì)研究雜志，9增刊1，282頁(yè)，1994；Rogers等，骨骼和礦物質(zhì)研究雜志，9增刊1，409頁(yè)，1994；Garrett等，骨骼和礦物質(zhì)研究雜志，9增刊1，409頁(yè)，1994。關(guān)于細(xì)胞外Ca2+對(duì)骨骼破骨細(xì)胞的作用的討論見(jiàn)Zaidi，生物科學(xué)報(bào)道，10，493，1990。另外，角化細(xì)胞、近腎小球細(xì)胞、滋養(yǎng)層、胰β細(xì)胞和脂肪細(xì)胞均對(duì)細(xì)胞外鈣的變化有響應(yīng)，這可能反映這些細(xì)胞的鈣受體的活化。
關(guān)于不同化合物體外模擬細(xì)胞外Ca2+的能力的討論見(jiàn)Nemeth等(精胺和亞精胺)《健康與疾病中的鈣結(jié)合蛋白》1987，學(xué)術(shù)出版公司，33-35頁(yè)；Brown等(例如新霉素)內(nèi)分泌學(xué)128，3047，1991；Chen等(diltiazem及其類似物TA-3090)骨骼和礦物質(zhì)研究雜志，5，581，1990；和Zaidi等(Verapamil)，生化和生物物理研究公報(bào)167，807，1990。Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959，和Nemeth等，PCT/US92/07152，國(guó)際出版號(hào)WO 93/04373描述了能夠調(diào)控?zé)o機(jī)離子對(duì)含有無(wú)機(jī)離子受體的細(xì)胞的作用的各種化合物。
背景技術(shù)：
中提供的參考文獻(xiàn)不認(rèn)為是優(yōu)先技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明描述能調(diào)控一種無(wú)機(jī)離子受體的一種或多種活性的化合物以及通過(guò)調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性來(lái)治療疾病或失調(diào)的方法。優(yōu)選的化合物能模擬或阻遏細(xì)胞外鈣對(duì)細(xì)胞表面鈣受體的作用。
可通過(guò)調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性來(lái)治療的疾病或失調(diào)包括下列一種或多種類型(1)其特征在于無(wú)機(jī)離子體內(nèi)平衡異常，優(yōu)選的是鈣體內(nèi)平衡異常的疾病或失調(diào)；(2)其特征在于細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信使數(shù)量異常的疾病或失調(diào)，所述信使的產(chǎn)生受無(wú)機(jī)離子受體活性，優(yōu)選的是鈣離子受體活性的影響；(3)其特征在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信使的異常作用(例如一種在種類或數(shù)量上不同的作用)，但可被無(wú)機(jī)離子受體活性，優(yōu)選的是鈣受體活性改善的疾患；(4)調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性，優(yōu)選的是鈣受體活性，可以起到有益作用的其它疾病或失調(diào)，例如這樣一種疾病或失調(diào)，其中受體活性激發(fā)一種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信使的產(chǎn)生從而補(bǔ)償另一信使數(shù)量異常。其分泌和/或作用受調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性影響的細(xì)胞外信使包括無(wú)機(jī)離子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子和趨化因子等。細(xì)胞內(nèi)信使的例子包括cAMP，cGMP，IP3和甘油二酯。
因此，本發(fā)明的化合物優(yōu)選地調(diào)節(jié)鈣受體活性并用于治療可受調(diào)控鈣受體一種或多種活性影響的疾病或失調(diào)。鈣受體蛋白使某些特化細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外Ca2+濃度產(chǎn)生應(yīng)答。例如，細(xì)胞外Ca2+抑制甲狀旁腺細(xì)胞分泌甲狀旁腺激素，抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨的吸收，以及激發(fā)C細(xì)胞分泌降鈣素。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該化合物被用于治療其特征在于骨骼和礦物質(zhì)體內(nèi)平衡異常，更優(yōu)選的是鈣的體內(nèi)平衡異常的疾病或失調(diào)。細(xì)胞外Ca2+受到嚴(yán)格的體內(nèi)平衡控制并控制多種過(guò)程，如血凝、神經(jīng)和肌肉的可興奮性和正常的骨骼形成。鈣體內(nèi)平衡異常的特征在于一種或多種下列活性(1)血清鈣的異常增減；(2)鈣隨尿排出量的異常增減；(3)骨骼鈣水平的異常增減，用例如骨骼礦物質(zhì)密度測(cè)量得知；(4)食物中鈣的異常吸收；(5)影響血清鈣水平的信使如甲狀旁腺激素和降鈣素的產(chǎn)生和/或釋放的異常增減；以及(6)由影響血清鈣水平的信使引發(fā)的應(yīng)答的異常變化。鈣的體內(nèi)平衡的這些不同方面的異常增減與一般人群中存在的鈣的體內(nèi)平衡的異常增減相關(guān)并且通常與疾病或失調(diào)相聯(lián)系。
其特征為鈣的體內(nèi)平衡異常的疾病或失調(diào)可能是由不同的細(xì)胞缺陷造成的，如鈣受體活性缺陷，鈣受體的數(shù)量缺陷或是鈣受體所影響的細(xì)胞內(nèi)蛋白有缺陷。例如在甲狀旁腺細(xì)胞中，鈣受體與Gi蛋白偶聯(lián)，后者反過(guò)來(lái)抑制環(huán)腺苷酸的產(chǎn)生。Gi蛋白缺陷可以影響某抑制環(huán)腺苷酸產(chǎn)生的能力。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物及其藥用鹽和復(fù)合物，其具有下式結(jié)構(gòu)I 其中Ar1是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙?；?、亞乙二氧基；Ar2是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基；q是0、1、2或3；R是H或低級(jí)烷基。
本發(fā)明的化合物具有優(yōu)選的立體化學(xué)性質(zhì)。結(jié)構(gòu)I中的CH3位于手性中心，并提供α-(R)-甲基結(jié)構(gòu)。若R是CH3，結(jié)構(gòu)I中的R也位于手性中心，并提供(R)-甲基結(jié)構(gòu)。因此若R是CH3，結(jié)構(gòu)I的化合物有(R，R)立體化學(xué)性質(zhì)。
無(wú)機(jī)離子受體活性是無(wú)機(jī)離子受體活化引發(fā)的過(guò)程。這些過(guò)程包括可以作為細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信使的分子的生產(chǎn)。
調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物包括離子模擬物(ionomimetics)、離子裂解物(ionolyics)、鈣模擬物和鈣裂解物。離子模擬物是結(jié)合無(wú)機(jī)離子受體并模擬(即激發(fā)或加強(qiáng))無(wú)機(jī)離子在無(wú)機(jī)離子受體上的作用。優(yōu)選地，該化合物影響一種或多種鈣受體活性。鈣模擬物是影響一種或多種鈣受體活性并結(jié)合鈣受體的離子模擬物。
離子裂解物是結(jié)合無(wú)機(jī)離子受體并阻遏(即抑制或減弱)無(wú)機(jī)離子在無(wú)機(jī)離子受體上一種或多種活性的化合物。優(yōu)選地，該化合物影響一種或多種鈣受體活性。鈣裂解物是阻遏一種或多種細(xì)胞外鈣引發(fā)的鈣受體活性并結(jié)合鈣受體的離子裂解物。
離子模擬物和離子裂解物可以結(jié)合與天然無(wú)機(jī)離子配體結(jié)合的相同受體位點(diǎn)或結(jié)合另一位點(diǎn)(例如變構(gòu)位點(diǎn))。例如NPS R-467結(jié)合鈣受體，導(dǎo)致鈣受體活性，因此NPS R-467屬于鈣模擬物。但NPS R-467結(jié)合鈣受體上的位點(diǎn)與細(xì)胞外鈣結(jié)合位點(diǎn)不同(即變構(gòu)位點(diǎn))。
計(jì)算該化合物的EC50或IC50可量測(cè)該化合物的有效性。EC50是產(chǎn)生最大模擬效應(yīng)的一半的化合物濃度。IC50是產(chǎn)生最大阻遏效應(yīng)的一半的化合物濃度。鈣受體上化合物的EC50和IC50可通過(guò)檢測(cè)鈣受體上細(xì)胞外鈣的一種或多種活性來(lái)確定。用于測(cè)量EC50和IC50的檢測(cè)的例子描述見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959，和Nemeth等，PCT/US92/07175，國(guó)際出版號(hào)WO 93/04373，(兩種出版物均在此引入作為參考)以及下文。這種檢測(cè)包括卵細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)和測(cè)量鈣受體活性引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)增加。優(yōu)選地，這種試驗(yàn)測(cè)量與鈣受體活性相關(guān)的一種特定激素的釋放或抑制。
調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物優(yōu)選地選擇性靶向于特定細(xì)胞的無(wú)機(jī)離子受體活性。例如，某一給定濃度的一種化合物對(duì)一種細(xì)胞類型的鈣受體活性的影響遠(yuǎn)大于對(duì)另一細(xì)胞類型的鈣受體活性的影響，則實(shí)現(xiàn)對(duì)鈣受體活性的選擇性靶向。優(yōu)選地，體內(nèi)或體外測(cè)得差別效應(yīng)為10倍或更大。更優(yōu)選地，差別效應(yīng)在體內(nèi)測(cè)量，化合物濃度以血漿濃度或細(xì)胞外液濃度測(cè)量，測(cè)量的效應(yīng)是細(xì)胞外信使如血漿降鈣素、甲狀旁腺激素或血漿鈣的產(chǎn)生。例如在優(yōu)選實(shí)施方案中，該化合物選擇性地靶向于PTH分泌而非降鈣素分泌。
優(yōu)選地，該化合物是鈣模擬物或鈣裂解物，用下述試驗(yàn)測(cè)得，在鈣受體上的EC50或IC50小于等于5μM，更優(yōu)選地小于等于1μM、100nM、10nM或1nM。更優(yōu)選地，該試驗(yàn)測(cè)量用表達(dá)人類甲狀旁腺鈣受體的核酸轉(zhuǎn)化且加載(load)fura-2的HEK293細(xì)胞中胞內(nèi)Ca2+。EC50或IC50更有利，因?yàn)檫@可以在體內(nèi)或體外用更低濃度的該化合物。EC50和IC50低的化合物的發(fā)現(xiàn)使得設(shè)計(jì)和合成具有類似或改善的效能、有效性和/或選擇性的其它化合物成為可能。
本發(fā)明另一方面涉及一種調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物及其藥用鹽和復(fù)合物，它具有下式結(jié)構(gòu)II 其中Ar3是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、N(CH3)2、乙基、亞乙二氧基；Ar4是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基；R8是氫或苯基；R9是氫或甲基；以及R10是氫、甲基或苯基。
本發(fā)明另一方面涉及一種調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物，其具有下式
結(jié)構(gòu)III 其中Ar5是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、芐基、芐氧基，α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙?；喴叶趸?CH＝CH-苯基；Ar6是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自乙?；?、低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、甲酯基、OCH2C(O)C2H5和乙酰氧基；R11是氫或甲基；以及R12是氫或甲基。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥物組合物，它由本文描述的調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物和生理可接受載體組成?！八幬锝M合物”指一種以適于對(duì)哺乳動(dòng)物(優(yōu)選的是人)給藥的形式存在的組合物。優(yōu)選地，藥物組合物含有足夠量的適當(dāng)藥物形式的調(diào)控鈣受體的化合物，能夠?qū)θ似鹬委熥饔谩?br> 對(duì)適當(dāng)給藥形式的考慮因素在本領(lǐng)域是已知的，包括毒性、可溶性、給藥途徑和維持活性。例如，注射入血液中的藥物組合物應(yīng)當(dāng)可溶。
藥物組合物也可配制成藥用鹽類(例如酸加成鹽)及其復(fù)合物。這類鹽的制備物通過(guò)改變化合物的物理特性而不妨礙它發(fā)揮生理作用而促進(jìn)其醫(yī)藥應(yīng)用。
本發(fā)明另一方面涉及用本文描述的調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性來(lái)治療患者的方法。該方法涉及用含有治療有效量的調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物的藥物組合物對(duì)患者給藥。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用治療有效量的調(diào)控鈣受體的化合物對(duì)患者給藥來(lái)調(diào)控鈣受體活性，從而治療疾病或失調(diào)。
調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物及含有該化合物的組合物可用于治療患者?！盎颊摺敝高@樣一種哺乳動(dòng)物，其中調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體有有益的效應(yīng)。需要通過(guò)調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體來(lái)治療的患者可用醫(yī)學(xué)界已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定。
優(yōu)選地，患者是患有以下一種或多種特征的疾病或失調(diào)的人(1)無(wú)機(jī)離子的體內(nèi)平衡異常，更優(yōu)選的是鈣的體內(nèi)平衡異常；(2)其生產(chǎn)或分泌受無(wú)機(jī)離子受體活性，更優(yōu)選的是鈣受體活性影響的信使水平異常；(3)其功能受無(wú)機(jī)離子受體活性，更優(yōu)選的是鈣受體活性影響的信使的水平或活性異常。
特征為鈣的體內(nèi)平衡異常的疾病包括甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松和其它骨骼和礦物質(zhì)相關(guān)功能失調(diào)等(描述見(jiàn)例如標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)課本如《Harrison氏內(nèi)服藥原理》)。用模擬或阻遏細(xì)胞外Ca2+在鈣受體上一種或多種效應(yīng)的調(diào)控鈣受體的化合物，直接或間接影響患者體內(nèi)蛋白質(zhì)或其它化合物的水平可治療這些疾病。
“治療有效量”指在一定程度上緩解患者疾病或失調(diào)的一種或多種癥狀；或?qū)⑴c疾病或失調(diào)相關(guān)或有因果關(guān)系的一種或多種生理或生化參數(shù)部分或全部恢復(fù)至正常的化合物量。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，患者患有特征為一種或多種鈣受體調(diào)節(jié)的組分水平異常的疾病或失調(diào)，并且該化合物在選自下列細(xì)胞的細(xì)胞鈣受體上有活性；甲狀旁腺細(xì)胞、破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近端腎小管腎細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管腎細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、Henle氏環(huán)和/或收集管粗上升支的細(xì)胞、表皮的角化細(xì)胞、甲狀腺中副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、血小板、血管平滑肌細(xì)胞、心房細(xì)胞、胃泌素分泌細(xì)胞、胰高血糖素分泌細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、垂體細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞和后穹窿(subfornical)器官的細(xì)胞。
更優(yōu)選地，細(xì)胞選自甲狀旁腺細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、腎Henle氏環(huán)和/或收集管的粗上升支的細(xì)胞、甲狀腺的副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、垂體細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞和后穹窿器官的細(xì)胞。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物是作用于甲狀旁腺細(xì)胞鈣受體并且降低患者血清中甲狀旁腺激素水平的鈣模擬物。更優(yōu)選地，該水平降至足以使血漿Ca2+減少的程度。最優(yōu)選地，甲狀旁腺激素水平降至正常個(gè)體水平。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物是作用于甲狀旁腺細(xì)胞鈣受體并且提高患者血清中甲狀旁腺激素水平的鈣裂解物。更優(yōu)選地，該水平升至足以導(dǎo)致患者骨礦物質(zhì)密度升高的程度。
用標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)技術(shù)，如血檢或尿檢可鑒定需要接受這種治療的患者。例如通過(guò)檢測(cè)其產(chǎn)生或分泌受無(wú)機(jī)離子濃度變化影響的蛋白質(zhì)的缺陷。或通過(guò)檢測(cè)影響無(wú)機(jī)離子體內(nèi)平衡的無(wú)機(jī)離子或激素的水平異常。
本申請(qǐng)通篇用到多個(gè)實(shí)施例。這些實(shí)施例決非用于限制本發(fā)明。
從下面的附圖、發(fā)明詳述、實(shí)施例和權(quán)利要求可明顯看出本發(fā)明的其它特征與優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1a-1r給出不同化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2-131給出本文描述的優(yōu)表性化合物的物理數(shù)據(jù)。
優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明涉及能夠調(diào)控一種或多種無(wú)機(jī)離子受體活性的化合物，優(yōu)選地，該化合物能模擬或阻遏細(xì)胞外離子對(duì)具有無(wú)機(jī)離子受體的細(xì)胞的作用，更優(yōu)選地，該細(xì)胞外離子是Ca2+，該效應(yīng)作用于含鈣受體的細(xì)胞上。涉及鈣活性、鈣受體和/或調(diào)控鈣受體的化合物的出版物包括Brown等，自然366574，1993；Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO94/18959；Nemeth等，PCT/US92/07175，國(guó)際出版號(hào)WO 93/04373；Shoback和Chen，骨骼和礦物質(zhì)研究雜志，9293(1994)；以及Racke等，F(xiàn)EBS快報(bào)(FEBS Lett.)333132，(1993)。這些出版物不被認(rèn)為是本發(fā)明的先有技術(shù)。
I.鈣受體鈣受體存在于不同細(xì)胞類型中，可以在不同細(xì)胞類型中有不同功能。下列細(xì)胞響應(yīng)鈣后的醫(yī)藥效應(yīng)與鈣受體的存在相一致甲狀旁腺細(xì)胞、破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近端腎小管腎細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管腎細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、Henle氏環(huán)和/或收集管粗上升支的細(xì)胞、表皮的角化細(xì)胞、甲狀腺的副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、血小板、血管平滑肌細(xì)胞、心房細(xì)胞、胃泌素分泌細(xì)胞、胰高血糖素分泌細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、垂體細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞和后穹窿器官的細(xì)胞。另外，物理數(shù)據(jù)證實(shí)鈣受體也存在于甲狀旁腺細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、腎Henle環(huán)和/或收集管粗上升支的細(xì)胞、甲狀腺的副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、垂體細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞和后穹窿器官的細(xì)胞。
這些不同細(xì)胞類型的鈣受體可能不同。也可能一種細(xì)胞含有不只一種鈣受體。比較不同細(xì)胞來(lái)源的鈣受體活性與氨基酸序列顯示存在不同的鈣受體類型。例如鈣受體可應(yīng)答許多二價(jià)和三價(jià)陽(yáng)離子。甲狀旁腺鈣受體應(yīng)答鈣和Gd3+，而破骨細(xì)胞應(yīng)答二價(jià)陽(yáng)離子如鈣，但不應(yīng)答Gd3+。因此甲狀旁腺鈣受體與破骨細(xì)胞的鈣受體在藥理上是不同的。
另一方面，編碼甲狀旁腺細(xì)胞和C細(xì)胞的鈣受體的核酸序列顯示這些受體的氨基酸結(jié)構(gòu)相似。然而鈣模擬物在甲狀旁腺細(xì)胞和C細(xì)胞上表現(xiàn)不同的藥理性質(zhì)，調(diào)節(jié)不同活性。因此，盡管鈣受體可能有相似或甚至相同的結(jié)構(gòu)。但其藥理特性可能依表達(dá)它的細(xì)胞或器官類型不同而差別顯著。
通常鈣受體對(duì)細(xì)胞外Ca2+的親和性低(表觀Kd通常大于0.5mM)。鈣受體可能包括一種自由的或結(jié)合的效應(yīng)子機(jī)理，其定義見(jiàn)Cooper、Bloom和Roth，《神經(jīng)藥理學(xué)的生化基礎(chǔ)》，第四章，因此與細(xì)胞內(nèi)鈣受體如鈣調(diào)蛋白和肌鈣蛋白不同。
鈣受體響應(yīng)細(xì)胞外鈣水平的變化。確切的變化依賴特定受體和含有受體的細(xì)胞系。例如鈣對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞上鈣受體的體外效應(yīng)包括1.胞內(nèi)鈣增加。這種增加是由于胞外鈣的內(nèi)流和/或胞內(nèi)鈣的募集。胞內(nèi)鈣增加的特征包括(a)快速(到達(dá)峰值的時(shí)間＜5秒)而暫時(shí)性的[Ca2+]i增加，對(duì)1μM La3+或1μM Gd3+抑制有抗性，用離子霉素預(yù)處理(細(xì)胞外Ca2+不存在時(shí))后消除；(b)增加不受二氫吡啶抑制；(c)暫時(shí)性增加被10mM氟化鈉預(yù)處理10分鐘消除；(d)暫時(shí)性增加被蛋白激酶C(PKC)的激活物如佛波醇十四烷酸乙酯(PMA)，歐亞瑞香脂或(-)-吲哚內(nèi)酰胺V預(yù)處理所減小。蛋白激酶C的整體效應(yīng)是使鈣的濃度響應(yīng)曲線向右移，而不影響最大響應(yīng)；以及(e)用百日咳毒素預(yù)處理(100ng/ml大于4小時(shí))不影響該增加。
2.肌醇-1，4，5-三磷酸或甘油二酯形成的快速(＜30秒)增加。用百日咳毒素預(yù)處理(100ng/ml＞4小時(shí))不影響該增加；3.抑制多巴胺和異丙基腎上腺素激發(fā)的環(huán)AMP形成。該效應(yīng)被百日咳毒素預(yù)處理(100ng/ml＞4小時(shí))阻遏；以及4.抑制PTH分泌。用百日咳毒素預(yù)處理(100ng/ml＞4小時(shí))不影響對(duì)PTH分泌的抑制。
用本領(lǐng)域已知技術(shù)可方便地確定鈣對(duì)不同細(xì)胞中其它鈣受體的效應(yīng)。這些效應(yīng)在觀察到甲狀旁腺細(xì)胞中胞內(nèi)鈣增加這一點(diǎn)上相似。但這種效應(yīng)預(yù)計(jì)在其它方面，例如引起或抑制不是甲狀旁腺激素的一種激素的釋放上會(huì)有不同。
II.調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物調(diào)控一種或多種無(wú)機(jī)離子受體活性。優(yōu)選的調(diào)控鈣受體的化合物是鈣模擬物和鈣裂解物。通過(guò)篩選依據(jù)具有特定活性的化合物(即引導(dǎo)化合物)為模型而構(gòu)建的一些化合物來(lái)鑒定調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物。
測(cè)量鈣受體活性的優(yōu)選方法是測(cè)量[Ca2+]i的變化?？捎貌煌募夹g(shù)如利用被表達(dá)人甲狀旁腺鈣受體的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)且載有fura-2的HEK293細(xì)胞；以及通過(guò)測(cè)量用編碼鈣受體的核酸注射的爪蟾卵細(xì)胞中Cl-流來(lái)測(cè)量[Ca2+]i的變化。(見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO94/18959。)例如，poly(A)+mRNA可得自表達(dá)鈣受體的細(xì)胞，如甲狀旁腺細(xì)胞、破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近端腎小管腎細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管腎細(xì)胞、Henle環(huán)和/或收集管的粗上升支的細(xì)胞、表皮的角化細(xì)胞、甲狀腺的副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、中樞神經(jīng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、血小板、血管平滑肌細(xì)胞、心房細(xì)胞、胃泌素分泌細(xì)胞、胰高血糖素分泌細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞和胃腸道細(xì)胞。優(yōu)選地，核酸來(lái)自甲狀旁腺細(xì)胞，C細(xì)胞或破骨細(xì)胞。更優(yōu)選地，核酸編碼鈣受體并且位于質(zhì)粒或載體上。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)控鈣受體的化合物是鈣模擬物，抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞對(duì)骨的重吸收作用；抑制體外破骨細(xì)胞對(duì)骨的重吸收作用；激活C細(xì)胞體外或體內(nèi)的降鈣素分泌；抑制甲狀旁腺細(xì)胞體外分泌甲狀旁腺激素和降低體內(nèi)PTH分泌；提高體內(nèi)降鈣素水平；或阻遏破骨細(xì)胞體外對(duì)骨的重吸收作用以及抑制體內(nèi)對(duì)骨的重吸收作用。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中調(diào)控鈣受體的化合物是鈣裂解物，激發(fā)甲狀旁腺細(xì)胞體外分泌甲狀旁腺激素以及提高體內(nèi)甲狀旁腺激素水平。
優(yōu)選地，該化合物選擇性地靶向于特定細(xì)胞中無(wú)機(jī)離子受體活性，更優(yōu)選的是鈣受體活性?！斑x擇性地”指給定濃度的該化合物對(duì)一種細(xì)胞類型上無(wú)機(jī)離子受體活性的作用比對(duì)另一種細(xì)胞類型上無(wú)機(jī)離子受體活性的作用大。優(yōu)選地，差別效應(yīng)為10倍或更大。優(yōu)選地，濃度指血漿濃度，測(cè)量的效應(yīng)是細(xì)胞外信使如血漿降鈣素，甲狀旁腺激素或血漿鈣的生產(chǎn)。例如在優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物選擇性地靶向于PTH分泌而非降鈣素分泌。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該化合物在一種或多種，但非全部下列細(xì)胞中的EC50和IC50小于等于5μM甲狀旁腺細(xì)胞、破骨細(xì)胞、近腎小球腎細(xì)胞、近端腎小管腎細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管腎細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、Henle環(huán)和/或收集管粗上升支的細(xì)胞、表皮的角化細(xì)胞、甲狀腺的副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、血小板、血管平滑肌細(xì)胞、心房細(xì)胞、胃泌素分泌細(xì)胞、胰高血糖素分泌細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、垂體細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞和后穹窿器官的細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞選自甲狀旁腺細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、腎中Henle環(huán)和/或收集管粗上升支的細(xì)胞、甲狀腺的副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)、腸道細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞、垂體細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞和后穹窿器官的細(xì)胞。物理數(shù)據(jù)如原位雜交和抗體染色已證實(shí)該組細(xì)胞中存在鈣受體。
優(yōu)選地，調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物模擬或阻遏具有無(wú)機(jī)離子受體的細(xì)胞，細(xì)胞外離子的作用，從而具有醫(yī)療作用。調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物對(duì)具有不同類型無(wú)機(jī)離子受體形態(tài)的細(xì)胞可以具有相同或不同的作用(例如，具有正常無(wú)機(jī)離子受體，正常數(shù)量的無(wú)機(jī)離子受體，異常無(wú)機(jī)離子受體，異常數(shù)量的無(wú)機(jī)離子受體的細(xì)胞)。
調(diào)控鈣受體的化合物優(yōu)選地模擬或阻遏細(xì)胞外離子在具有鈣受體的細(xì)胞上的所有作用。但是鈣模擬物不具有細(xì)胞外Ca2+的所有生物活性。相似地，鈣裂解物不能阻遏細(xì)胞外鈣造成的所有活性。另外不同的鈣模擬物和不同的鈣裂解物不一定與細(xì)胞外Ca2+結(jié)合在鈣受體上相同的位點(diǎn)來(lái)起作用。
無(wú)機(jī)調(diào)控化合物不需要與天然配體以相同程度或完全相同的形式影響無(wú)機(jī)受體活性。例如同作用于鈣受體的鈣相比，鈣模擬物可以以不同程度，不同持續(xù)時(shí)間，結(jié)合不同的結(jié)合位點(diǎn)或具有不同的親和性來(lái)影響鈣受體活性。
A.鈣模擬物(Calcimimetic)1.結(jié)構(gòu)I化合物能夠調(diào)控鈣受體活性的結(jié)構(gòu)I化合物(及其藥用鹽及復(fù)合物)具有下式 其中Ar1是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亞乙二氧基、優(yōu)選地每個(gè)取代基獨(dú)立選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選地，Ar1是具有1-5個(gè)取代基的萘基或苯基。各取代物獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3、CH3、更優(yōu)選的是CF3O、I、Cl、F、CF3；Ar2是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基，優(yōu)選地每個(gè)取代物獨(dú)立地選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選地，Ar2是具有1-5個(gè)取代基的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3和CH3、更優(yōu)選的是CF3O、I、Cl、F、CH3O和CF3。q是0、1、2或3；且R是H或CH3。
“低級(jí)烷基”指含有1-4個(gè)碳，優(yōu)選的1-3個(gè)碳原子的飽和碳?xì)浠衔?，可以是直鏈或支鏈?br> “低級(jí)烷氧基”指“O-低級(jí)烷基”。其中“O”是連接到低級(jí)烷基上的氧。
“低級(jí)硫代氧基”指“S-低級(jí)烷基”。其中“S”是連接到低級(jí)烷基上的硫。
“低級(jí)鹵代烷基”指被至少一個(gè)鹵素取代的低級(jí)烷基。優(yōu)選地僅是低級(jí)烷基的末端碳被鹵素取代并且有1-3個(gè)鹵素。更優(yōu)選地，低級(jí)鹵代烷基含1個(gè)碳。優(yōu)選地，鹵素取代物為Cl或F。
“低級(jí)鹵代烷氧基”指“O-低級(jí)鹵代烷基”。其中“O”是連接到低級(jí)鹵代烷基上的氧。
a.Ar1和Ar2均為任意取代的苯基在優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar1和Ar2均為任意取代的苯基且化合物具有下式 其中R是氫或甲基，m和n各自獨(dú)立地是0、1、2、3、4或5；每個(gè)X獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亞乙二氧基。優(yōu)選地每個(gè)X獨(dú)立地選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選地，每個(gè)X獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3和CH3，更優(yōu)選的是CF3O、I、Cl、F和CF3；每個(gè)Z獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基。優(yōu)選地每個(gè)Z獨(dú)立地選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選地，每個(gè)Z獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、CF3、I、Cl、F和CH3。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)Z取代基在間位。更優(yōu)選地，該化合物具有下式 其中R是氫或甲基；m是0、1、2、3、4或5，優(yōu)選的是1或2；每個(gè)X獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亞乙二氧基，優(yōu)選地每個(gè)取代基獨(dú)立地選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選的是異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、CF3、I、Cl、F和CH3。
更優(yōu)選地，該化合物具有下式 其中R是氫或甲基；R1是鹵素或氫，優(yōu)選地，R1是F或氫；R2是氫、鹵素、低級(jí)烷基、低級(jí)鹵代烷基、或低級(jí)鹵代烷氧基、優(yōu)選地，R2是氫、CF3、CH3、OCF3、或F，而且R3的氫、鹵素或烷氧基，優(yōu)選地，R3是Cl、F、氫或甲氧基，更優(yōu)選的是甲氧基。
在可選的更優(yōu)選的組合中；R1、R2和R3中至少兩個(gè)是鹵素，優(yōu)選的是F，且R是氫或CH3；R是氫或CH3，R2是低級(jí)鹵代烷基或低級(jí)鹵代烷氧基，優(yōu)選的是OCF3或CF3，且R1和R3是氫；R是CH3，R3是鹵素，優(yōu)選的是Cl，R1是鹵素或氫，優(yōu)選的是F或氫，R2是氫，低級(jí)烷基，低級(jí)鹵代烷基或低級(jí)鹵代烷氧基，優(yōu)選的是氫、CF3、CH3、OCF3或F。
b.Ar2是萘基且q是0另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar2是萘基，q是0，化合物具有下式
其中Ar1是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，每個(gè)取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亞乙二氧基，優(yōu)選地每個(gè)取代基獨(dú)立地選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選地，Ar1是具有1-5個(gè)取代基的萘基或苯基，每個(gè)取代基獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CH3S、CF3、CF3O、I、Cl、F和CH3。
更優(yōu)選地，Ar1是任意取代的苯基，化合物具有下式 其中Xn表示上述任意取代的苯基的任意取代基(優(yōu)選的取代基和取代基數(shù)目的描述見(jiàn)上)。
更優(yōu)選地，化合物具有下式 其中R是CH3或氫；R4是低級(jí)烷基、鹵素或烷氧基、優(yōu)選地是異丙基，氯或甲氧基；且R5是氫，低級(jí)烷基或鹵素優(yōu)選的是甲基、CH3、Br或Cl。
c.Ar2是萘基且q是2在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Ar1是取代苯基，Ar2是萘基，q是2，化合物具有下式
其中R是氫或CH3；n是0、1、2、3、4或5，優(yōu)選的是1或2；每個(gè)X獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亞乙二氧基、優(yōu)選地每個(gè)取代基獨(dú)立選自CH3、CH3O、CH3CH2O、亞甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基和乙酰氧基。更優(yōu)選的是異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、CF3、I、Cl、F和CH3。
更優(yōu)選地，化合物具有下式 其中R6是氫，低級(jí)鹵代烷基或低級(jí)鹵代烷氧基、優(yōu)選的是氫，OCF3或CF3，且R7是鹵素或氫，優(yōu)選的是氯或氫。
在另一實(shí)施方案中R，R6和R7如上述(帶有上述優(yōu)選取代基)，條件是R和R6均為氫，R7不是Cl；以及R是CH3，R6和R7如上述(帶有上述優(yōu)選取代基)。
2.結(jié)構(gòu)II化合物結(jié)構(gòu)II化合物具有下式 其中Ar3是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，每個(gè)取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、N(CH3)2、乙基、亞乙二氧基、優(yōu)選的是N(CH3)2、低級(jí)烷氧基或低級(jí)烷基；Ar4是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，每個(gè)取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基，優(yōu)選的是低級(jí)烷氧基，更優(yōu)選的是甲氧基；R8是氫或苯基，優(yōu)選的是氫；R9是氫或甲基；R10是氫、甲基或苯基，更優(yōu)選地，當(dāng)R10是甲基時(shí)，其連接的手性碳是(R)立體異構(gòu)體。
優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)II中的α-甲基是(R)-α-甲基。
3.結(jié)構(gòu)III化合物結(jié)構(gòu)III化合物具有下式 其中Ar5是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，每個(gè)取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、芐基、芐氧基，α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亞乙二氧基、-CH＝CH-苯基，優(yōu)選的是低級(jí)烷基、苯氧基、-CH＝CH-苯基、二甲基芐基、甲氧基、亞甲基或亞乙基；Ar6是被0至5個(gè)取代基任意取代的萘基或苯基，每個(gè)取代基獨(dú)立地選自乙基、低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、甲酯基、OCH2C(O)C2H5和乙酰氧基，優(yōu)選的是甲氧基、低級(jí)烷基、苯基、鹵素、CF3、CN、甲酯基或OCH2C(O)C2H5；R11是氫或甲基；優(yōu)選地，當(dāng)R11是甲基時(shí)，其連接的碳是(R)立體異構(gòu)體；且R12是氫或甲基，優(yōu)選地當(dāng)R12是甲基時(shí)，其連接的碳是(R)立體異構(gòu)體。
4.鈣模擬物活性用本領(lǐng)域已知的方法可確定化合物模擬Ca2+在鈣受體上的活性的能力，描述見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959。例如在體外甲狀旁腺上檢測(cè)時(shí)，鈣模擬物具有一種或多種，優(yōu)選的是全部下述活性1.該化合物導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度快速(到達(dá)峰值的時(shí)間＜5秒)瞬時(shí)增加，對(duì)1μM La3+或1μM Gd3+的抑制有抗性。[Ca2+]i的增加在細(xì)胞外Ca2+不存在時(shí)仍存在，但被離子霉素預(yù)處理(細(xì)胞外Ca2+不存在)消除；2.該化合物加強(qiáng)了受低于最大濃度的細(xì)胞外Ca2+誘發(fā)的[Ca2+]i增加；3.細(xì)胞外Ca2+誘發(fā)的[Ca2+]i增加不受二氫吡啶抑制；4.該化合物造成的[Ca2+]i暫時(shí)性增加不能被10mM氟化鈉預(yù)處理10分鐘所消除；5.該化合物造成的[Ca2+]i暫時(shí)性增加不能被蛋白激酶C(PKC)的激活劑如佛波醇十四乙酯(PMA)，歐亞瑞香脂或(-)-吲哚內(nèi)酰胺V的預(yù)處理所減少。蛋白激酶C激活物的整體效應(yīng)是使鈣的濃度響應(yīng)曲線向右移，但不影響最大響應(yīng)；6.該化合物導(dǎo)致肌醇-1，4，5-三磷酸和/或甘油二酯形成的快速(＜30秒)增加；
7.該化合物抑制多巴胺或異丙基腎上腺素激發(fā)的環(huán)AMP形成；8.該化合物抑制PTH分泌；9.用百日咳毒素預(yù)處理(100ng/ml，＞4小時(shí))阻遏該化合物對(duì)環(huán)AMP形成的抑制效應(yīng)，但不影響[Ca2+]i，肌醇-1，4，5-三磷酸，或甘油二酯的增加和PTH分泌的減少；10.該化合物在注射了牛或人甲狀旁腺細(xì)胞的poly(A)+富集mRNA的爪蟾卵細(xì)胞中引發(fā)Cl-流增加，但對(duì)注射了水或肝mRNA的爪蟾卵細(xì)胞無(wú)作用；且11.相似地，使用來(lái)自甲狀旁腺細(xì)胞的克隆的鈣受體，該化合物將在注射了編碼受體的特定cDNA或mRNA的爪蟾卵細(xì)胞中引發(fā)應(yīng)答。
用已知技術(shù)可以測(cè)量不同的鈣活性。(見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959)。模擬Ca2+在鈣響應(yīng)性細(xì)胞(優(yōu)選的是鈣受體)上活性的化合物的平行定義由這里提供的實(shí)施例以及Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959中顯而易見(jiàn)。
優(yōu)選地，用這里描述的生物試驗(yàn)或根據(jù)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959測(cè)量，該化合物具有一種或多種，更優(yōu)選的是所有下述活性引發(fā)內(nèi)源鈣的暫時(shí)性增加，持續(xù)時(shí)間小于30秒(優(yōu)選地通過(guò)募集內(nèi)源鈣)；引發(fā)[Ca2+]i快速增加，在30秒內(nèi)發(fā)生；引發(fā)[Ca2+]i的持續(xù)增加(大于30秒)(優(yōu)選地通過(guò)外源鈣內(nèi)流)；引發(fā)肌醇-1，4，5-三磷酸或甘油二酯水平增加，優(yōu)選地小于60秒中發(fā)生；以及抑制多巴胺或異丙基腎上腺素激發(fā)的環(huán)AMP形成。i的暫時(shí)性增加優(yōu)選地被10mM氟化鈉預(yù)處理細(xì)胞10分鐘消除，或者用蛋白激酶C的激活物，優(yōu)選的是佛波醇十四烷酸乙酯(PMA)，歐亞瑞香脂或(-)-吲哚內(nèi)酰胺V短暫預(yù)處理細(xì)胞(不超過(guò)10分鐘)所減小。
C.鈣裂解物用根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可確定該化合物阻遏細(xì)胞外鈣在鈣受體上的活性的能力。(也見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959。)例如對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞應(yīng)用時(shí)，阻遏細(xì)胞外鈣效應(yīng)的化合物在體外甲狀旁腺細(xì)胞上受檢驗(yàn)時(shí)，具有一種或多種，更優(yōu)選的是全部下述特征1.該化合物部分地或完全地阻遏濃度增大的細(xì)胞外Ca2+的如下能力(a)增大[Ca2+]i，(b)募集細(xì)胞內(nèi)Ca2+，(c)增加肌醇-1，4，5-三磷酸形成，(d)減少多巴胺或異丙基腎上腺素激發(fā)的環(huán)AMP形成，和(e)抑制PTH分泌；2.該化合物阻遏注射了?；蛉思谞钆韵偌?xì)胞的poly(A)+-mRNA的爪蟾卵細(xì)胞中受細(xì)胞外Ca2+或鈣模擬物化合物引發(fā)的Cl-流增加，但注射了水或肝mRNA的爪蟾卵細(xì)胞中無(wú)這種Cl-流增加；3.相似地，使用來(lái)自甲狀旁腺細(xì)胞的克隆的鈣受體，該化合物將阻遏注射了編碼受體的cDNA，mRNA或cRNA的爪蟾卵細(xì)胞中受細(xì)胞外Ca2+或鈣模擬物化合物引發(fā)的應(yīng)答。
阻遏鈣在鈣響應(yīng)性細(xì)胞(優(yōu)選的是鈣受體)上的作用的化合物的平行定義在本文提供的實(shí)施例以及Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959中顯而易見(jiàn)。
III.疾病或失調(diào)的治療可通過(guò)調(diào)控鈣受體活性來(lái)治療的疾病或失調(diào)在本領(lǐng)域已知。例如根據(jù)受鈣受體活性調(diào)節(jié)的細(xì)胞的功能性應(yīng)答可以鑒定能通過(guò)調(diào)控鈣受體活性來(lái)治療的疾病或失調(diào)。受鈣受體調(diào)節(jié)的細(xì)胞的功能性應(yīng)答在本領(lǐng)域已知，包括甲狀旁腺細(xì)胞分泌PTH，C細(xì)胞分泌降鈣素，破骨細(xì)胞的重吸收作用。
這樣的功能性應(yīng)答與不同疾病或失調(diào)相聯(lián)系。例如甲狀旁腺功能亢進(jìn)造成的血漿PTH水平升高。降低血漿PTH水平能有效地治療甲狀旁腺功能亢進(jìn)。類似地，血漿降鈣素水平升高與重吸收作用的抑制相聯(lián)系。抑制骨重吸收作用能有效治療骨質(zhì)疏松。因此，鈣受體活性的調(diào)控可用來(lái)治療如下疾病如甲狀旁腺功能亢進(jìn)和骨質(zhì)疏松。
調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性，優(yōu)選的是鈣受體活性的化合物可用來(lái)為患一系列疾病或失調(diào)的患者帶來(lái)良好療效。例如，骨質(zhì)疏松是與年齡相關(guān)的疾病，其特征在于骨質(zhì)量減少，骨折危險(xiǎn)增大?；衔锟杀挥脕?lái)直接(例如一種破骨細(xì)胞離子模擬化合物)或通過(guò)增加內(nèi)源降鈣素水平(例如C細(xì)胞鈣模擬物)間接地阻遏破骨細(xì)胞重吸收作用?？蛇x地，對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞鈣受體有活性的鈣裂解物可以升高甲狀旁腺激素的循環(huán)水平，刺激骨形成。所有這三種方法均會(huì)給骨質(zhì)疏松患者帶來(lái)良好療效。
另外已知間斷的低劑量PTH可以造成骨質(zhì)的同化效應(yīng)及相應(yīng)的骨重建。因此引發(fā)甲狀旁腺激素暫時(shí)性增加的化合物及劑量方案(例如用甲狀旁腺細(xì)胞離子裂解物間斷給藥)能增加骨質(zhì)疏松患者的骨質(zhì)。
其它疾病或失調(diào)的鑒定可通過(guò)鑒定與某種疾病或失調(diào)相聯(lián)系并受鈣受體活性調(diào)節(jié)的其它細(xì)胞功能性應(yīng)答來(lái)進(jìn)行。用類似方法可鑒定能通過(guò)調(diào)控其它無(wú)機(jī)離子受體來(lái)治療的疾病或失調(diào)。
本發(fā)明的調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物可對(duì)一種無(wú)機(jī)離子受體起作用，產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞效應(yīng)，最終產(chǎn)生治療效果。本發(fā)明的調(diào)控鈣受體的化合物能對(duì)鈣受體起作用，產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞效應(yīng)，最終產(chǎn)生治療效果。本發(fā)明通過(guò)靶向于含鈣受體的細(xì)胞可治療不同的疾病。
例如原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)(HPT的特征是高血鈣和循環(huán)PTH水平異常升高。與HPT主要類型相聯(lián)系的缺陷是甲狀旁腺細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外Ca2+的負(fù)反饋調(diào)節(jié)敏感性降低。因此在原發(fā)性HPT患者的組織中，細(xì)胞外Ca2+的“調(diào)定點(diǎn)”向右移，需要用高于正常濃度的細(xì)胞外Ca2+來(lái)抑制PTH分泌。而且在原發(fā)性HPT中即使高濃度的細(xì)胞外Ca2+經(jīng)常只能部分地抑制PTH分泌。在繼發(fā)性(尿毒)HPT中盡管Ca2+抑制PTH分泌的程度正常但觀察到細(xì)胞外Ca2+的調(diào)定點(diǎn)類似地變大。PTH分泌的變化與[Ca2+]i的變化相平行受細(xì)胞外Ca2+誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加的調(diào)定點(diǎn)向右移且這種增加的數(shù)量級(jí)減小。
繼發(fā)性HPT患者也可能患腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良。鈣模擬物看來(lái)可用于治療這些患者的異常PTH分泌與骨營(yíng)養(yǎng)不良。
模擬細(xì)胞外Ca2+活性的化合物可用于長(zhǎng)時(shí)程控制原發(fā)性和繼發(fā)性HPT。這些化合物提供了抑制PTH分泌需要的但高血鈣不能獨(dú)立實(shí)現(xiàn)的附加刺激因而有助于緩解高血鈣。效率比細(xì)胞外Ca2+高的化合物可能克服甲狀旁腺瘤造成的在原發(fā)性HPT主要形式中特別麻煩的PTH分泌中看中看來(lái)不可抑制的成分。可選地或附加的，這些化合物能抑制PTH的合成，而長(zhǎng)期高血鈣已顯示能抑制牛和人腺瘤的甲狀旁腺組織中早前期PTH mRNA的水平。長(zhǎng)期高血鈣還抑制甲狀旁腺細(xì)胞的體外增殖，故而鈣模擬物也能有效限制繼發(fā)性HPT中甲狀旁腺細(xì)胞增生性狀。
除甲狀旁腺細(xì)胞的其它細(xì)胞能直接對(duì)細(xì)胞外Ca2+濃度的生理變化應(yīng)答。例如甲狀腺副囊泡細(xì)胞(C細(xì)胞)的降鈣素分泌受細(xì)胞外Ca2+濃度變化調(diào)節(jié)。
分離的破骨細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞外Ca2+濃度的增加，相應(yīng)的[Ca2+]i增加部分地來(lái)自細(xì)胞內(nèi)Ca2+的募集。破骨細(xì)胞中[Ca2+]i增加與骨吸收作用的抑制相聯(lián)系。成骨細(xì)胞釋放堿性磷酸鹽直接受鈣激發(fā)。
腎中近腎小球細(xì)胞分泌腎素同PTH分泌一樣被細(xì)胞外Ca2+濃度增加所抑制。細(xì)胞外Ca2+導(dǎo)致這些細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+的募集。其它腎細(xì)胞對(duì)鈣的應(yīng)答如下Ca2+增多抑制近端腎小管細(xì)胞的1，25(OH)2-維生素D的形成，激發(fā)遠(yuǎn)端腎小管細(xì)胞中鈣結(jié)合蛋白的生產(chǎn)，抑制Ca2+和Mg2+的腎小管重吸收和血管緊張素對(duì)Henle環(huán)粗上升支(MTAL)的作用，減弱血管緊張素對(duì)皮質(zhì)收集管細(xì)胞的作用并且影響腎小球血管中血管平滑肌細(xì)胞。
鈣還促進(jìn)腸道杯狀細(xì)胞、乳腺細(xì)胞和皮膚細(xì)胞的分化；抑制心房分泌心房鈉尿肽；減少血小板中cAMP聚集；改變胃泌素和胰高血糖素的分泌；作用于血管平滑肌細(xì)胞來(lái)修飾血管活性因子的細(xì)胞分泌；并且影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。
因此有足夠證據(jù)顯示Ca2+除了有廣泛的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)作用，還可作為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)某些特化細(xì)胞的應(yīng)答。本發(fā)明的化合物可用于治療與這些細(xì)胞中受破壞的Ca2+應(yīng)答相聯(lián)系的疾病或失調(diào)。
可以治療或預(yù)防的特定的疾病或失調(diào)，根據(jù)受影響的細(xì)胞，還包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)如癲癇發(fā)作，中風(fēng)，頭部外傷，脊髓損傷，低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷如心搏停止或初生苦痛(neonatal distress)，癲癇，退行性神經(jīng)疾病如老年癡呆癥，杭廷頓氏癥和帕金森氏癥，癡呆，神經(jīng)緊張，抑郁，焦慮，恐慌，強(qiáng)迫觀念與行為失調(diào)，外傷后緊張癥，精神分裂癥，惡性精神抑制綜合癥，和圖雷特氏綜合癥；涉及腎過(guò)度重吸收水的疾病如異常ADH分泌綜合癥(SIADH)，肝硬變，充血式心力衰竭和腎炎；高血壓，預(yù)防和/或降低陽(yáng)離子抗生素(例如氨糖苷抗生素)的腎毒性；消化道運(yùn)動(dòng)疾病如腹瀉和大腸痙攣；胃腸道潰瘍；過(guò)度鈣吸收引起的胃腸道疾病如肉樣瘤??；和自體免疫疾病及器官移植排斥。
雖然本發(fā)明的調(diào)控鈣受體的化合物典型地用于治療人，但也可用來(lái)治療其它溫血?jiǎng)游锏南嗨苹蛳嗤膊。缙渌`長(zhǎng)類動(dòng)物，家畜如豬，牛，禽類；及競(jìng)技動(dòng)物和寵物如馬，狗和貓。
IV.給藥本發(fā)明描述的不同化合物可用于通過(guò)調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性，尤其是鈣受體活性來(lái)治療不同病癥。本發(fā)明的化合物可被配制為用于多種方式給藥，如全身和局部或定位給藥。技術(shù)與制劑一般可參閱《雷明頓氏醫(yī)藥科學(xué)》Mack出版公司，Easton，賓州。離子模擬物和離子裂解物的給藥的討論見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959。
適當(dāng)?shù)膭┝啃问讲糠忠蕾嚻鋺?yīng)用和給藥途徑，例如口服、透皮或注射。無(wú)論靶細(xì)胞在多細(xì)胞宿主還是在培養(yǎng)物中，這種劑量形式均應(yīng)使化合物到達(dá)靶細(xì)胞。例如注射入血流的藥物化合物或組合物應(yīng)當(dāng)可溶。其它因素在本領(lǐng)域是已知的，包括毒性及阻止化合物或組合物發(fā)揮效力的劑量形式等考慮因素。
化合物也可配制成藥用鹽類(例如酸加成鹽)及其復(fù)合物。藥用鹽是在其給藥濃度下無(wú)毒的鹽。這種鹽的制備物可改變化合物的物理特性而不妨礙它行使其生理功能，從而方便其藥物應(yīng)用。物理性質(zhì)的有用變化包括降低熔點(diǎn)以協(xié)助跨粘膜給藥，增大可溶性來(lái)促進(jìn)藥物的高濃度給藥。
藥用鹽包括酸加成鹽如含有硫酸鹽、鹽酸鹽、馬來(lái)酸鹽、磷酸鹽、磺胺鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、環(huán)己基磺胺鹽和奎尼酸鹽的酸加成鹽。(見(jiàn)例如PCT/US92/03736，在此引入作為參考)。藥用鹽可得自如下酸如鹽酸、馬來(lái)酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、環(huán)己基氨基磺酸和奎尼酸。
藥用鹽可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。例如，化合物的游離堿形式溶于含適當(dāng)酸的合適溶劑，如水或水-酒精溶液，再通過(guò)蒸發(fā)溶液分離。在另一實(shí)施例中通過(guò)將游離堿與有機(jī)溶劑中的酸反應(yīng)來(lái)制備鹽。
載體或賦形劑也可用于協(xié)助化合物給藥。載體和賦形劑的例子包括碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖如乳糖、葡萄糖、或蔗糖或各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和生理相容性溶劑。組合物或藥物組合物可用不同途徑給藥，包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)，口服，局部或跨粘膜給藥。
全身給藥的方式優(yōu)選為口服?？蛇x地可以注射，例如肌肉內(nèi)、靜脈、腹膜內(nèi)和皮下注射。為進(jìn)行注射，將本發(fā)明化合物配成溶液，優(yōu)選地用生理相容性緩沖液如Hank’s液或任氏液。另外，化合物可配成固體形式，使用前重新溶解或懸浮。也可制成冰凍干燥形式。
全身給藥也可用跨粘膜或透皮方式，或者將化合物口服。對(duì)于跨粘膜或透皮給藥，在制劑中用與待滲透的屏障相適應(yīng)的滲透劑。這種滲透劑一般在本領(lǐng)域已知，包括例如用于跨粘膜給藥的膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。另外去污劑可用來(lái)協(xié)助滲透。跨粘膜給藥可用例如鼻腔噴劑或栓劑。對(duì)口服給藥，化合物可配成常規(guī)的口服劑量形式如膠囊，片劑和液體制劑。
對(duì)于局部給藥，本發(fā)明的化合物可配制成油膏、藥膏、凝膠或霜?jiǎng)?，這在本領(lǐng)域是已知的。
本發(fā)明的各種化合物的給藥量用標(biāo)準(zhǔn)操作方法確定。一般來(lái)說(shuō)，治療有效量是約1納摩爾至1微摩爾化合物，優(yōu)選的是0.1納摩爾和1微摩爾，這依賴其EC50和IC50及患者的年齡與體形及與患者有關(guān)的疾病或失調(diào)。通常對(duì)接受治療的動(dòng)物，該劑量在0.1至50mg/kg之間，優(yōu)選的是0.01至20mg/kg受治療的動(dòng)物。
V.實(shí)施例下面提供實(shí)施例以闡明本發(fā)明的不同方面與實(shí)施方案。這些實(shí)施例不是用來(lái)限制本發(fā)明的。
實(shí)施例1從人甲狀旁腺瘤克隆人甲狀旁腺鈣受體本實(shí)施例描述用pBoPCaR1作雜交探針從人甲狀旁腺瘤克隆人甲狀旁腺鈣受體(見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO94/18959)。在弱嚴(yán)謹(jǐn)條件下用探針交叉雜交鑒定編碼人甲狀旁腺鈣受體的核酸。
從診斷患有原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)的39歲白種男子取出的人甲狀旁腺腺瘤制備信使RNA。用pBoPCaR1作雜交探針Northern印跡分析該mRNA鑒定到約5Kb和約4Kb的鈣受體轉(zhuǎn)錄物。從該mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。在瓊脂糖凝膠上根據(jù)大小選擇大于3Kbp的雙鏈cDNA，連到克隆載體λZapII中。用pBoPCaR1的5.2Kbp cDNA插入序列作雜交探針篩選50萬(wàn)個(gè)初級(jí)重組噬菌體。用[32P]-dCTP隨機(jī)啟動(dòng)合成來(lái)標(biāo)記pBoPCaR1插入序列至比活為1×109cpm/μg。
篩選文庫(kù)時(shí)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性為38℃400mM Na+，50％甲醛。將噬菌斑提升濾膜(plaque lift filter)用濃度為500,000cmp/ml的探針雜交20小時(shí)。然后用1×SSC 40℃洗1小時(shí)。
通過(guò)與pBoPCaR1雜交初次篩選得大約250個(gè)陽(yáng)性克隆。其中7個(gè)經(jīng)過(guò)二次篩選和三次篩選分離到與pBoPCaR1探針雜交的單克隆。這7個(gè)克隆作限制酶圖譜和Southern印跡分析。3個(gè)克隆含約5Kbp的cDNA插入序列，看來(lái)對(duì)應(yīng)于5Kb mDNA的全長(zhǎng)克隆。2個(gè)克隆含約4Kbp的cDNA插入序列，看來(lái)對(duì)應(yīng)4Kb mRNA的全長(zhǎng)克隆。
兩個(gè)不同大小插入序列的限制酶圖譜顯示它們?cè)?′端有相似序列區(qū)，但其3′端序列不同。DNA序列分析顯示小的插入序列可能是由于在大插入序列所用的多聚腺苷化位點(diǎn)上游的可選多聚腺苷化。
兩種大小的代表性cDNA插入序列被亞克隆至質(zhì)粒載體pBluescript8K。線性化后用T7 RNA聚合酶生產(chǎn)的cRNA轉(zhuǎn)錄物作體外轉(zhuǎn)錄。將cRNA轉(zhuǎn)錄物注射入爪蟾卵細(xì)胞(150ng/μl RNA；50nl/卵細(xì)胞)作功能分析。溫育2-4天后檢測(cè)卵細(xì)胞中是否存在有功能的鈣受體。加入適當(dāng)鈣受體激動(dòng)劑激發(fā)鈣激活的Cl-流，檢測(cè)到兩種克隆類型均有有功能的鈣受體。已知的鈣受體激動(dòng)劑，包括NPS R-467和NPS R-568(見(jiàn)Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959)，激活卵細(xì)胞表達(dá)的受體的濃度與激活天然甲狀旁腺受體的有效濃度幾乎相同。因此兩種克隆均編碼有功能的人甲狀旁腺鈣受體。
將每種大小的插入序列亞克隆至pBluescript中制備得質(zhì)粒pHuPCaR5.2和pHuPCaR4.0。插入序列的核酸序列和氨基酸序列由SEQID NO1和2給出。
在兩種cDNA插入序列的核酸序列中觀察到幾處不同。兩種cDNA插入序列的序列分析顯示在3′非翻譯區(qū)存在至少兩段序列差異，這可能由于可選的多聚腺苷化。另外插入序列5′端有序列差異。這些不同序列對(duì)應(yīng)非翻譯區(qū)，可能是由于有不同的轉(zhuǎn)錄起始和/或拼接。
在cDNA克隆pHuPCaR5.2和pHuPCaR4.0(見(jiàn)SEQ.ID.NO.1和2)的編碼區(qū)中觀察到三處附加的序列差異位點(diǎn)，顯示這些cDNA克隆編碼不同蛋白。人CaR基因序列分析顯示cDNA克隆pHuPCaR5.2比pHuPCaR4.0 cDNA克隆多出的30個(gè)堿基對(duì)來(lái)自不同的mRNA拼接。不同mRNA拼接預(yù)示在pHuPCaR5.2 cDNA編碼的CaR多肽對(duì)應(yīng)于pHuPCaR4.0 cDNA編碼的多肽氨基酸#536和#537位點(diǎn)插入10個(gè)附加的氨基酸。另外pHuPCaR4.0在氨基酸#925處編碼谷酰胺(Gln)，在990位編碼甘氨酸(Gly)，而pHuPCaR5.2在兩個(gè)等價(jià)的位點(diǎn)均編碼精氨酸(Arg)。人CaR基因在這些位置分別編碼Gln和Arg。pHuPCaR4.0cDNA與人DNA的差異看來(lái)代表人類群體中真實(shí)的序列多態(tài)性，而pHuPCaR5.2中單堿基變化可能反映其克隆時(shí)的突變。兩種cDNA均編碼有功能的鈣受體，這通過(guò)在測(cè)量Cl-電導(dǎo)時(shí)注射了由這些cDNA克隆制備的cRNA的爪蟾卵細(xì)胞均響應(yīng)細(xì)胞外鈣可知。不過(guò)也可能這兩種受體的功能和/或藥理上不同。
實(shí)施例2.選擇表達(dá)鈣受體的穩(wěn)定的重組細(xì)胞分離到穩(wěn)定表達(dá)兩種人鈣受體和牛鈣受體的克隆細(xì)胞系。鈣受體cDNA被亞克隆到兩種不同的可購(gòu)得的表達(dá)載體；pMSG(得自Pharmacia)和Cep 4B(得自Invitrogen)中。第一個(gè)載體含有黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)的可選擇標(biāo)記基因，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可越過(guò)添加2μg/ml氨基喋呤和25μg/ml霉酚酸造成的嘌呤生物合成途徑屏障。第二個(gè)載體編碼潮霉素(200μg/ml)抗性基因。用Not I和Hind III限制酶從母體pBluescript質(zhì)粒中移出HuPCaR5.2和HuPCaR4.0 cDNA(分別為SEQ ID NO1和2)，然后直接連接到用Not I+Hind III消化的Cep4B中或用DNA聚合酶的Klenow片段處理后平末端連接至Sma I消化的pMSG中。
如上述含HuPCaR5.2插入序列的pMSG亞克隆被轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中。篩選出20個(gè)抗性克隆，然后表征。如上述，含HuPCaR5.2插入序列的Cep4B亞克隆被轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。用潮霉素篩選得到穩(wěn)定的克隆庫(kù)。類似地制備表達(dá)HuPCaR4.2受體同功型的克隆。
從潮霉素篩選的HEK 293細(xì)胞庫(kù)中得到的細(xì)胞用含HuPCaR5.2插入序列的Cep4B轉(zhuǎn)染，再鋪到放在12孔組織培養(yǎng)平板各小孔中的膠原包被的AKlar小塊上。2-6天后除去培養(yǎng)基，用平衡的鹽溶液和1ml含1μMfura2-AM，1mM CaCL2和0.1％BSA，1mM CaCl2的緩沖液洗細(xì)胞。37℃下用熒光光度計(jì)測(cè)量對(duì)鈣受體激動(dòng)物應(yīng)答的熒光，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340nm和510nm。信號(hào)標(biāo)定時(shí)加入離子霉素(40μM)確定Fmax，加入0.3M EGTA，2.5M Tris HCl，pH10確定表觀Fmin。作為加入下述鈣受體激動(dòng)物Ca2+(10mM)，Mg2+(20mM)和NPS R-467后的響應(yīng)，觀察到[Ca2+]i活躍增加。表達(dá)有功能的物質(zhì)K受體的對(duì)照細(xì)胞不對(duì)這些鈣模擬物化合物進(jìn)行應(yīng)答。
得到用pHuPCaR4.0序列轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞的另外的克隆分離物。如上述分離凈化其對(duì)鈣模擬物的應(yīng)答，只是這些細(xì)胞在懸液中受試。
實(shí)施例3用加載fura-2的甲狀旁腺細(xì)胞測(cè)量鈣受體活性本小節(jié)描述從牛和人得到甲狀旁腺細(xì)胞以及用甲狀旁腺細(xì)胞測(cè)量鈣受體活性的方法。
從附近屠宰場(chǎng)新宰殺的牛(12-15周大)中得到甲狀旁腺，裝在含(mM)NaCl，126；KCl，4；MgCl2，1；Na-HEPES，20；pH7.4；葡萄糖，5.6；和可變量的CaCl2(例如1.25mM)的冰冷甲狀旁腺細(xì)胞緩沖液(PCB)中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。從由于原發(fā)性或尿素性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(尿素HPT)接受甲狀旁腺組織手術(shù)摘除的患者得到人甲狀旁腺，與牛組織一樣處理。
將腺體除去多余脂肪和結(jié)締組織，再用小剪刀剪成邊長(zhǎng)約2-3mm的小方塊。用膠原酶消化制備解離的甲狀旁腺細(xì)胞，然后在Percoll緩沖液中離心純化。得到的甲狀旁腺細(xì)胞制備物基本不含血紅細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，和毛細(xì)組織；檢驗(yàn)方法是相差顯微法和蘇丹黑B染色。解離并純化的甲狀旁腺細(xì)胞是含5到20個(gè)細(xì)胞的小簇(cluster)。用錐蟲蘭或溴乙錠的排除作標(biāo)示的細(xì)胞存活率通常為95％。
雖然此時(shí)細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)，但還是應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后確定其生理應(yīng)答(例如PTH分泌的抑制能力和[Ca2+]i的靜息水平)。原代培養(yǎng)物還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即細(xì)胞用放射性同位素可標(biāo)記至同位素平衡，這對(duì)涉及測(cè)量肌醇磷酸鹽代謝的研究十分必要。
在Percoll梯度純化后，用1∶1的補(bǔ)充了50μg/ml鏈霉素，100U/ml青霉素，5μg/ml慶大霉素的Ham’s F12 Dulbecco’s改性Eagle’s培養(yǎng)基(GIBCO)和ITS+混合物洗幾次細(xì)胞。ITS+是含有胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，硒，和牛血清清蛋白(BSA)-亞麻酸的預(yù)混的溶液(CollaborativeResearch，Bedford，麻省)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至塑料燒瓶(75或150cm2；Falcon)中，37℃在含5％CO2的潮濕空氣中溫育過(guò)夜。在過(guò)夜培養(yǎng)物中不添加血清，因?yàn)檠鍟?huì)使細(xì)胞附在塑料上增殖并脫分化。上述條件下培養(yǎng)的細(xì)胞脫水后可以方便地從燒瓶中取出并且與新鮮制備的細(xì)胞有相同的存活力。
將純化的甲狀旁腺細(xì)胞重懸于含1μM fura-2-乙酰氧基甲酯的1.25mM CaCl2-2％BSA-PSB中，37℃溫育20分鐘。然后使細(xì)胞沉淀，重懸于缺少酯的相同緩沖液中，37℃再溫育15分鐘。用含0.5BSA和0.5mM CaCl2的PCB洗兩次，保存于室溫(約20℃)中。使用前將細(xì)胞用預(yù)熱的0.5mM CaCl2-PCB稀釋5倍，得到的BSA的終濃度為0.1％。用于熒光記錄的小杯中的細(xì)胞濃度為1-2×106/ml。
在37℃下用裝備了耐熱杯架和磁力攪拌器的熒光光度計(jì)(Biomedical Instrumentation Group，賓州大學(xué)，費(fèi)城，賓州)測(cè)量加載了指示劑的細(xì)胞的熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340nm和510nm。該熒光顯示細(xì)胞液中Ca2+水平。用毛地黃皂苷(50μg/ml，終濃度)標(biāo)定熒光信號(hào)以得到最大熒光(Fmax)，用EGTA(10mM，pH8.3，終濃度)得到最小熒光(Fmin)，以及224nm的離解常數(shù)。染料泄漏依賴于溫度，大多發(fā)生在加熱小杯中的細(xì)胞后前兩分鐘。此后染料泄漏增加很慢。為了較正對(duì)染料泄漏的標(biāo)定，將細(xì)胞置于小杯后攪拌2-3分鐘。然后除去細(xì)胞懸液，沉淀細(xì)胞，將上清放回清潔的小杯中。用毛地黃皂苷和EGTA處理上清，估計(jì)染料泄漏的為全部Ca2+依賴性熒光信號(hào)的10-15％。從表觀Fimn中減去該估計(jì)值。
實(shí)施例4用加載Fura-2的HEK 293/pHuPCaR 4.0細(xì)胞測(cè)量鈣受體活性本小節(jié)描述用加載Fura-2的HEK 293/pHuPCaR 4.0細(xì)胞測(cè)量鈣受體活性的方法。將pHuPCaR 4.0轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞在用含5μM fluo-3/AM的20mM HEPES緩沖的Dulbecco’s改性Eagle’s培養(yǎng)基中室溫溫育1小時(shí)，加載上fura-2。然后用含1mM CaCl2和1mM MgCl2的20mM HEPES緩沖的Hank’s平衡的鹽溶液洗滌。再將待檢驗(yàn)化合物加到細(xì)胞中，測(cè)量熒光(激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為340和510nm)。
實(shí)施例5測(cè)量化合物調(diào)控鈣受體活性的能力用加載fura-2的被編碼pHuPCaR 4.0的核酸轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞或用加載了fura-2的甲狀旁腺細(xì)胞檢測(cè)其中[Ca2+]i增加來(lái)檢測(cè)不同化合物調(diào)控鈣受體活性的能力。不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果由表1.a，1.b.1，1.b.2，1.c和2總結(jié)。表1.a，1.b.1，1.b.2，1.c總結(jié)了根據(jù)實(shí)施例4的描述(即用加載了fura-2的被編碼pHuPCaR 4.0的核酸轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞)檢測(cè)的不同濃度的各化合物對(duì)鈣受體活性的作用。
表2總結(jié)了不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中EC50對(duì)加載了fura-2的甲狀旁腺細(xì)胞或HEK 293/pHuPCaR 4.0計(jì)算。細(xì)胞如實(shí)施例2(對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞)或?qū)嵤├?(對(duì)HEK 293/pHuPCaR 4.0細(xì)胞)的描述加載fura-2并試驗(yàn)。
表1.a.在表達(dá)人鈣受體的HEK 293細(xì)胞中在3.3ng/ml時(shí)產(chǎn)生超過(guò)40％的應(yīng)答的鈣模擬物化合物化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300 330 33 3.3參照化合物R-568 95 69 2417P 101 86 5417X 105 93 5124X 126 109 12410924Y 119 120 12710217J 116 118 12210225A 122 120 1149217E 116 110 1109224Z 138 138 1359014S 116 106 1058825E 132 129 1228517G 125 128 1197714T 126 125 1177717H 126 124 1117414O 119 119 1027425I 119 113 1147412J 131 130 11368
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300 330 33 3.312I115 111 93 6825G130 115 99 669R 108 101 6412F118 110 101 6312O110 117 94 6223Z129 126 100 6117M 115 99 5916V 114 102 5825O126 115 96 5725J119 123 105 5616L146 138 98 5612N115 106 102 5516T 97 88 5525U107 107 95 5517P 101 86 5416Q 110 88 5323E137 113 102 5317C113 120 99 5225L97 97 85 528Z 101 97 5217X 105 93 5113R 132 98 5117O 112 96 5123Q122 114 98 5116X 111 96 5124V127 98 71 5013O 115 94 5017N 108 86 4921V122 116 99 4824M132 134 99 4813U 108 79 47
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330 33 3.324P 140 138 1104617Y 109 94 79 4611X 100 76 4525H 115 107 89 4522J 99 71 459C 104 82 4513S 102 87 4510Q 103 100 84 4413P 110 83 448K 98 81 4413N 114 88 4310N 106 97 77 4312H 114 115 94 4325P 90 81 75 4118A 111 88 4014L 109 78 40表1.b.1在表達(dá)人鈣受體的HEK 293細(xì)胞中在33ng/ml時(shí)產(chǎn)生超過(guò)40％應(yīng)答的鈣模擬物化合物化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.3參照化合物R-56895 692417P 101865417X 105935112C 134 125983916I 121 1179636
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.317D 108913817F 111902824C 116 113873225K 124 107863513F 125 122853821F 109853621S 132 131853410F 96 842714R 106 107843713G 111 128822914Z 118 103822016N 122 1598288U 123 129821123W 117 97 812512G 139 139813515G 113803225M 118 100792513V 110793314P 112 10378306T 123 129781514Q 101783517L 111 104783124K 106783024U 106 106782525Q 116 95 77208J 104773923H 121 114772821C＝4U 134 114761725F 97 85 762816R 100762517I 118 97 7618
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.324J 103753121O 109753724G 109 94 752215I 111 93 752421D 104751720Y 117 95 742410P 10274823M 113 97 742614Y 109731717K 98 97 733712E 117 121732317Z 99 733716W 10273423K 106 107722425X 96 94 722213W 109711223P 125 99 702218B 111 96 692621Y 100683617W 92 671323A 103672423G 127 93 671313M 92 661521U 104 104661821R 100661510S/10T 86 651317R 98 651313X 10265134N 100651321E 94 64415J 80 75 6413
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.322Y 114642821G 88 631824L 105621010V 99 62810W/10X 98 61917B 92 611923Y 106 87 611611Y 1036120表1.b.2在表達(dá)人鈣受體的HEK 293細(xì)胞中在330ng/ml時(shí)產(chǎn)生超過(guò)40％的應(yīng)答的鈣模擬物化合物化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.3參照化合物R568 95 692417P 101865417X 105935118C 99 87 601823T 102 74 60314V 93 598G 84 59623I 10258321M 102581724O 137 1145883U 89 579A 82 56612M 98 86 561112B 130 110564
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.321P 92 56138T 85 551310L/10M 99 55424I 109 84 551114N 89 551523R 104 86 541323S 97 53321T 133 11253310W/10X 81 53413T 90 5366R 94 52720I 87 521224A 122 85 52912D 128 1095256X 84 521018T 99 74 521421X 119 10151223J 102 61 512910Z 96 51516Z 88 51923N 96 50216U 85 50411D 96 50423X 94 49117A 88 49720J 80 48822X 86 481023U 87 4839Z 74 48416J 92 76 473125N 94 73 4684P 81 468
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.323O 111 79 461313Q 95 4654G 83 4612Y 80 461012L 88 451023F 82 45511W 81 4428H 88 44725V 89 59 432625W 95 69 42810R 82 42721N 124 98 4248S 73 4278X 75 401913E 123 94 402表1.c.在表達(dá)人鈣受體的HEK293細(xì)胞中在3.3ng/ml時(shí)產(chǎn)生超過(guò)40％應(yīng)答的鈣模擬物化合物化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.3參照化合物R568 95 692417P 101865417X 10593517X 853H 843L 81 2816O 129 81 2128O/8Q124 80 140
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.314A 98 78 10723L 107 77 3791T 767W 764H 77 378D 755M 73 214U 7224E 94 71 35616M 130 68 1144M 68 342S 67 2917V 91 66 27-12X 66 1523D 91 66 35134P 65 325B/5C65 203M 64 1916K 78 62 3685D 62 184D 61 1324B 76 61 341124H 81 60 32135L 60 162Y 59 105G 58 163V 56 142Q 56 414B 75 55 11413Z 93 54 2258A 5424D 87 53 3439
化合物代號(hào) 4種濃度下的活性百分比(ng/mL)3300330333.31D 5313I 85 52 3 13B 52 158C 5114H 112 49 5 57U 495E 48 713H 88 48 361213Y 106 47 2 44J 47 814I 80 45 1174B 45 83D 45 43R 45 23A 41 714J 55 41 6 54I 40 9表2圖1的芳基烷基胺鈣模擬物在體外對(duì)甲狀旁腺細(xì)胞鈣受體的活性(EC50≤5μM)
實(shí)施例6-17化合物的合成本文描述的化合物可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成，描述見(jiàn)如Nemeth等，PCT/US93/01642，國(guó)際出版號(hào)WO 94/18959。下面提供的實(shí)施例描述了文中涉及的化合物的代表性合成。
化合物9R，14U和17P的合成是通過(guò)將購(gòu)置的醛或酮用伯胺在氰硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉存在下進(jìn)行還原性胺化制備的?；衔?1Y、12H、12K、12M、14S、14T、16L-0、17E、17G、17J、24X、24Y、25A、25E-25K和25O用類似方法制備。
發(fā)現(xiàn)在合成這三種化合物(9R，14U和16P)時(shí)用三乙酰氧基硼氫化鈉得到需要的非對(duì)映異構(gòu)體，其非對(duì)映異構(gòu)選擇性大于氰硼氫化鈉。富集的混合物進(jìn)一步用正相HPLC或從有機(jī)溶劑中重結(jié)晶而被純化成單個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體。
化合物8J、8U、11X、17M和25Y是通過(guò)將伯胺與醛或酮在異丁氫基鈦(IV)存在下縮合制備的。得到的中間體亞胺被氰硼氫化鈉，硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作用而被原位(insitu)還原。化合物8U合成用的中間體enamine用二氫氧化鈀在碳上催化還原。
化合物12U，12V和12Z用胺與腈的二異丁基鋁氫化物(DIBAL-H)介導(dǎo)的縮合反應(yīng)制備。得到的中間體亞胺被氰硼氫化鈉或硼氫化鈉原位還原。中間體鏈烯(化合物12U和12V)在EtOH中用碳上的鈀催化氫化。用游離堿與揮發(fā)HCl作用得到白色固體，將化合物轉(zhuǎn)化成其鹽酸鹽。
這些合成中的胺購(gòu)自Aldrich化學(xué)品公司，Milwaukee，WI或Celgene公司，Warren，N.J.或用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。所有其它試劑均購(gòu)自Aldrich化學(xué)品公司。
實(shí)施例6化合物25Y的合成N-(3-(2-苯基)丙基)-1-(1-萘基)乙胺室溫?cái)嚢?-苯基-1-丙胺(135mg，1mmol)，1′-乙酰萘酮(170mg，1mmol)和異丙氧基鈦(IV)(355mg，1.3mmol)的混合物1小時(shí)。用1M乙醇化氰硼酸鈉(1mL)處理產(chǎn)生反應(yīng)，室溫?cái)嚢?6小時(shí)。用醚稀釋反應(yīng)物再用水處理(0.1mL)。將反應(yīng)物離心，除去醚層，濃縮成乳狀油。一小部分該物質(zhì)用含0.1％。異丙胺的二氯甲烷至二氯甲烷中含10％甲醇的梯度HPLC(Phenomenex，1.0×25cm，5μM硅石)純化。用GC/El-MS測(cè)得產(chǎn)物(游離堿)是單一組分(Rt＝10.48分)m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)289(M+，11)，274(63)，184(5)，162(5)，155(100)，141(8)，115(8)，91(45)，77(5)。
實(shí)施例7化合物8J的合成N-(3-苯基丙基)-1-(3-硫甲基苯基)乙胺鹽酸鹽將3′-氨基乙酰苯(2.7g，20mmol)溶于4mL濃縮HCl，4g冰和8mL水中。溶液冷卻至0℃，亞硝酸鈉(1.45g，21mmol)溶于3-5ml水，加入溶液中超過(guò)5分鐘，維持溫度低于6℃。將硫代甲醇鈉(1.75g，25mmol)溶于5mL水，冷卻至0℃。將重氮鹽加入該溶液超過(guò)10分鐘，維持溫度低于10℃。將反應(yīng)物攪拌1小時(shí)，溫度升至與環(huán)境相同。反應(yīng)混合物合成醚和水層。將醚層分離出來(lái)，用碳酸鈉和氯化鈉洗滌，用硫酸鈉干燥。醚揮發(fā)后得到74％產(chǎn)率的3′-硫甲基乙酰苯。減壓蒸餾純化粗提物質(zhì)。
3-苯基丙胺(0.13g，1mmol)，3′-硫甲基乙酰苯(0.17g，1mmol)和異丙醇鈦(IV)(0.36g，1.25mol)混合放置4小時(shí)。加入乙醇(1mL)和氰硼氫化鈉，將反應(yīng)物攪拌過(guò)夜。加入4ml和200μL水引發(fā)反應(yīng)。將混合物旋渦振蕩，然后離心分離出固體。醚層從沉淀物中分開(kāi)，真空除去溶劑。油重新溶于二氯甲烷，用制備型TLC在硅膠上純化化合物，用3％甲醇/二氯甲烷洗脫得到純油質(zhì)的標(biāo)題化合物GC/EI-MS(Rt＝7.64分鐘)m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)285(M+，18)，270(90)，180(17)，151(100)，136(32)，104(17)，91(54)，77(13)。
實(shí)施例8化合物8U的合成N-3-(2-甲氧苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基芐胺鹽酸鹽室溫下攪拌(R)-(+)-3-甲氧基-α-甲基芐胺(3.02g，20mmol)，2-甲氧基肉桂醛(3.24g，20mmol)和異丙醇鈦(IV)(8.53g，30mmol，1.5Eq.)的混合物2小時(shí)，用1M(20mL)乙醇化氰硼氫化鈉處理。將反應(yīng)物攪拌過(guò)夜(16小時(shí))，用二乙醚稀釋，再用水(1.44mL，80mmol，4Eq.)處理。混合1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物離心，去除醚層，濃縮成油。將該物質(zhì)重溶于冰醋酸，加氫氧化鈀搖動(dòng)，再在室溫下60磅氫中氫化。過(guò)濾除去催化劑，將得到的溶液濃縮成稠油。該物質(zhì)重溶于二氯甲烷，用1NNaOH中和。從水相中分離出二氯甲烷溶液，通過(guò)無(wú)水碳酸鉀干燥，濃縮成油。將該物質(zhì)重溶于醚，用二乙醚中的1M HCl處理。收集得到的沉淀物，用二乙醚清洗，在空氣中干燥。該物質(zhì)(游離堿的GC/EI-MS(Rt＝9.69分鐘)顯示出單一組分m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)299(M+，21)，284(100)，164(17)，150(8)，135(81)，121(40)，102(17)，91(43)，77(18)。
實(shí)施例9化合物9R的合成(R)-N-(1-(2-萘基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺鹽酸鹽(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(10.0g，58mmol)，2′-乙酰萘(9.4g，56mmol)，異丙醇鈦(IV)(20.7g，730mmol)和EtOH(無(wú)水)(100mL)加熱至60℃3小時(shí)。然后加入氰硼氫化鈉(NaCNBH3)(3.67g，58.4mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將醚(1L)和H2O(10mL)加入反應(yīng)混合物，離心除去得到的沉淀。上清在真空下蒸發(fā)，用熱己烷將粗產(chǎn)品重結(jié)晶4次，得到1.5g純(98+％)非對(duì)映異構(gòu)體。將游離堿溶于己烷，過(guò)濾，加入發(fā)煙HCl，沉淀產(chǎn)物為白色固體(1.1g，6％產(chǎn)率)，熔點(diǎn)200-240℃軟化(dec.)。
實(shí)施例10化合物11X的合成N-(4-異丙基苯基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺鹽酸鹽(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(1.06g，6.2mmol)，4-異丙基苯甲醛(0.92g，6.2mmol)和異丙醇鈦(IV)(2.2g，7.7mmol)的混合物加熱至100℃5分鐘，然后在室溫下攪拌4小時(shí)。加入氰硼氫化鈉(NaCNBH3)(0.39g，6.2mmol)，再加EtOH(1mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將醚(100mL)和H2O(1mL)加入反應(yīng)混合物中，離心除去得到的沉淀。上清在真空下蒸發(fā)，粗提產(chǎn)品在硅膠上層析(50mm×30cm柱)(用1％MeOH(CHCl3)洗脫)，層析后的物質(zhì)重溶于己烷，加入發(fā)煙HCl，沉淀產(chǎn)物為白色固體(0.67g，35％產(chǎn)率)，熔點(diǎn)257-259℃。
實(shí)施例11化合物12U的合成N-3-(2-甲基苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基芐胺鹽酸鹽將2-甲基肉桂腈(1.43g，10mmol)在二氯甲烷中(10mL)的溶液冷卻至0℃，滴加(15分鐘)1M二異丁基鋁氫化物(10mL，二氯甲烷)處理。將反應(yīng)物在0℃下攪拌15分鐘，滴加(15分鐘)二氯甲烷(10mL)中1M(R)-(+)-3-甲氧基-α-甲基芐胺(1.51g，10mmol)處理。將反應(yīng)物在0℃下攪拌1小時(shí)，倒入含氰硼氫化鈉(1g，16mmol)的乙醇(100mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)。反應(yīng)物用醚稀釋，用1N NaOH中和。移去醚層，用無(wú)水碳酸鉀干燥，濃縮成油。該物質(zhì)在硅石上用二氯甲烷至二氯甲烷中含5％甲醇的梯度層析。得到不飽和中間體，GC/El-MS(Rt＝10.06分鐘)為單一組分。m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)281(M+，17)，266(59)，176(19)，146(65)，135(73)，131(100)，91(21)，77(13)。
將乙醇化的不飽和中間體在碳披鈀存在時(shí)在室溫下氫化16小時(shí)。將該反應(yīng)的產(chǎn)物用二乙醚中的1M HCl處理，轉(zhuǎn)化成鹽酸鹽。該物質(zhì)的GC/El-MS(Rt＝9.31分鐘)顯示出單一組分m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，21)，268(100)，164(12)，148(8)，135(85)，121(12)，105(49)，91(23)，77(21)。
實(shí)施例12化合物12V的合成N-3-(3-甲基苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基芐胺鹽酸鹽該化合物的制備按照實(shí)施例11的方法進(jìn)行，但用的是2-甲基肉桂腈。不飽和中間體用GC/EI-MS(Rt＝10.21分鐘)為單一組分m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)281(M+，57)，266(86)，146(98)，135(88)，131(100)，115(43)，102(26)，91(43)，77(18)。用實(shí)施例11的方法還原該物質(zhì)并形成鹽酸鹽，得到產(chǎn)物。該物質(zhì)(游離堿)的GC/EI-MS(Rt＝9.18分鐘)顯示為單一組分m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，19)，268(100)，164(11)，148(8)，135(76)，121(16)，105(45)，91(23)，77(21)。
實(shí)施例13化合物12Z的合成N-3-(2-氯苯基)-1-丙基-(R)-1-(1-萘基)乙胺鹽酸鹽該化合物的制備按照實(shí)施例11的方法進(jìn)行，但用的是10mmol量級(jí)的2-氯氫化肉桂腈和(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺。用二氯甲烷至二氯甲烷中含5％甲醇的梯度通過(guò)硅石進(jìn)行層析，得到產(chǎn)物，TLC分析(二氯甲烷中含5％甲醇)為單一組分。用二乙醚中1M HCl處理制備得鹽酸鹽。
實(shí)施例14化合物14U的合成(R)-N-(1-(4-甲氧基苯基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺鹽酸鹽(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(1.1g，6.2mmol)，4′-甲氧基乙酰苯(0.93g，6.2mmol)，異丙醇鈦(IV)(2.2g，7.7mmol)和EtOH(無(wú)水的)(1mL)的混合物加熱至60℃3小時(shí)。然后加入氰硼氫化鈉(NaCNBH3)(0.39g，6.2mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將醚(200mL)和H2O(2mL)加入反應(yīng)混合物中，離心除去得到的沉淀。將上清在真空下蒸發(fā)，粗提產(chǎn)品在硅膠上層析(25mm×25cm柱)(用1％MeOH/CHCl3洗脫)。將該物質(zhì)的一部分用HPLC層析[Selectosil，5μM硅膠；25cm×10.0mm(Torrence，加州)，4mL每分鐘；UV檢測(cè)275nM；12％乙酸乙酯-88％己烷(洗脫時(shí)間12.0分鐘)]。HPLC純化的非對(duì)映異構(gòu)體再溶入己烷中，加入發(fā)煙HCl，沉淀產(chǎn)物為白色固體(20mg)，熔點(diǎn)209-210℃(dec.)。
實(shí)施例15化合物17M的制備N-(3-氯-4-甲氧基芐基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺鹽酸鹽(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(6.6g，39mmol)，3′-氯-4′-甲氧基苯甲醛(16.6g，39mmol)，和異丙醇鈦(IV)(13.8g，48.8mmol)和EtOH(無(wú)水)(30mL)的混合物加熱至80℃30分鐘，然后在室溫下攪拌3小時(shí)。再加入氰硼氫化鈉(NaCNBH3)(2.45g，39mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將醚(100mL)和H2O(2mL)加入反應(yīng)混合物，離心除去得到的沉淀。上清在真空下蒸發(fā)，粗提產(chǎn)品在硅膠上層析(50mm×30cm柱)(用CH2Cl2洗脫)。層析的物質(zhì)再溶于己烷(500mL)，用Norit@過(guò)濾(0.2μM)脫色，然后加發(fā)煙HCl，沉淀產(chǎn)物為白色固體(10.2g，56％產(chǎn)率)，熔點(diǎn)241-242℃(dec.)。
實(shí)施例16化合物17P的合成4-甲氧基-3-甲基乙酰苯[17P前體]
4′-羥基-3′-甲基乙酰苯(5.0g，33.3mmol)，碘甲烷(5.7g，40.0mmol)，K2CO3(顆粒狀，無(wú)水)(23.0g，167mmol)和丙酮(250mL)的混合物回流3小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽，真空下蒸發(fā)，粗提產(chǎn)品溶于醚(100mL)，用H2O(2×20mL)洗。將有機(jī)相干燥(Na2SO4)后蒸發(fā)得4.5g，82.4％產(chǎn)率。該酮用于下述反應(yīng)，不需進(jìn)一步純化。
(R)-N-(1-(4-甲氧基-3-甲基苯基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺鹽酸鹽[化合物17P](R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(4.24g，24.8mmol)，4′-甲氧基-3′-甲基乙酰苯(4.06g，24.8mmol)，異丙醇鈦(IV)(8.8g，30.9mmol)和EtOH(無(wú)水)(1mL)的混合物加熱至100℃2小時(shí)。加入異丙醇(45mL)，將反應(yīng)物冰浴冷卻至10℃。然后分若干部分加入三乙酰氧硼氫化鈉(NaHB(O2CCH3)3)(10.5g，49.5mmol)共15分鐘。再將反應(yīng)混合物加熱至70℃18小時(shí)。將混合物冷卻至室溫，加入醚(400mL)。離心懸浮液，收集上清，用醚(400mL)洗滌沉淀物?；旌系挠袡C(jī)洗滌液在真空下蒸發(fā)。殘余物重溶入醚(400mL)中，用1N NaOH(4×50mL)和H2O(2×50mL)洗滌。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，過(guò)濾，真空蒸發(fā)。將EtOH(無(wú)水)加入濕的殘余物中，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器徹底干燥得到油狀物。將混合物在硅膠上層析(50mm×30cm)[用(1％MeOH1％IPACHCl3洗脫)。得48g油]。
所需的非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)一步用HPLC層析純化[SUPELCOSILTMPLC-S，18μM硅膠；25cm×21.2mm(Supelco，Inc.Bellefonte，賓州)，7mL每分鐘；UV檢測(cè)275nM；20％EtOAc-80％己烷(洗脫時(shí)間9.5-11.0分鐘；UV檢測(cè)275nM；20％EtOAc-80％己烷(洗脫時(shí)間9.5-11.0分鐘)]。該混合物(洗脫劑中100mg/mL溶液)的注射(800μL等分試樣)給出65mg所需異構(gòu)體。多次HPLC注射得到1.0g純化物質(zhì)。HPLC層析的物質(zhì)溶于己烷(50mL)，用發(fā)煙HCl沉淀得到鹽酸鹽。用燒結(jié)玻璃收集該鹽，用己烷洗滌，得到1.0g白色固體，熔點(diǎn)204-205℃。
實(shí)施例17化合物17X的合成3-氯-4-甲氧基苯甲醛3-氯-4-羥基苯甲醛(25g，160mmol)，碘甲烷(27.25g，192mmol)，K2CO3(顆粒狀，無(wú)水)(110.6g，800mmol)和丙酮(300mL)的混合物回流3小時(shí)。反應(yīng)混合物然后被冷卻至室溫。加入二乙醚(500mL)，用紙將混合物過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽。濾過(guò)物減壓蒸發(fā)，溶于二乙醚(800mL)，用0.1N NaOH(3×100mL)洗。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)后真空蒸發(fā)得到24g，92％產(chǎn)率的粗提產(chǎn)物。將該物質(zhì)進(jìn)一步用硅膠(50mm×30cm)層析純化(用己烷-EtOAc，5∶1洗脫)得到15.02g，56％產(chǎn)率的白色固體TLC(己烷-EtOAc，5∶1)Rf＝0.24；GC Rt＝4.75分鐘；MS(EI)m/Z 170(M+)，172(M+2)。
1-甲基-(3′-氯-4′-甲氧基芐基)乙醇將3-氯-4-甲氧基苯甲醛(13g，76.5mmol)，甲基氯化鎂(52g，153mmol)和THF(300mL)的混合物回流3小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫。滴加NH4Cl(飽和溶液，6mL)再加入二乙醚(500mL)，用紙將混合物過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽。將濾過(guò)物減壓蒸發(fā)，得到的固體溶于二乙醚(300mL)，水洗(4×25mL)。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)，真空下蒸發(fā)，得到11.3g，80％產(chǎn)率的粗提產(chǎn)物。該物質(zhì)進(jìn)一步用硅膠(50mm×30cm)層析(用CH2CH2洗脫)純化得11.3g，63％產(chǎn)率的油；TLC(CH2Cl2)Rf＝0.25；GC Rt＝5.30分鐘；MS(EI)m/Z 186(M+)，188(M+2)。
3′-氯-4′-甲氧基乙酰苯1-甲基-(3′-氯-4′-甲氧基芐基)乙醇(7.6g，41mmol)，氯鉻酸吡啶(PCC)(13.16g，61.5mmol)和CH2Cl2(300mL)的混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。加入二乙醚(1000mL)，得到的混合物置于硅膠層析柱(50mm×30cm)(用二乙醚洗脫)得到7.3g，97％產(chǎn)率的粗固體產(chǎn)物。該物質(zhì)的GC分析顯示其純度為99％，用于下列反應(yīng)時(shí)無(wú)需進(jìn)一步純化。TLC(二乙醚)Rf＝1.0；GC Rt＝5.3分鐘；MS(EI)m/Z 184(M+)，184(M+2)。
(R，R)-N-(1-乙基-4′-甲氧基-3′-氯苯基)-1-(1-萘基乙基)胺將3′-氯-4′-甲氧基乙酰苯(5.3g，29mmol)，(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(4.98g，29mmol)，異丙醇鈦(IV)(10.2g，36mmol)和異戊醇的混合物加熱至100℃3小時(shí)。三乙酰氧基硼氫化鈉(NaB(O2CCH3)3；12.29g，58mmol)分若干部分加入10分鐘。反應(yīng)混合物加熱回流30分鐘然后在室溫下攪拌18小時(shí)。將混合物倒入二乙醚(500mL)；加入H2O(2mL)，離心懸浮液除去鈦鹽的微小沉淀物。收集上清，用醚洗沉淀(500mL)?；旌嫌袡C(jī)層干燥(Na2SO4)后真空蒸發(fā)得到6.81g，70％產(chǎn)率的粗提產(chǎn)品。
將該物質(zhì)用硅膠(50mm×30cm)層析(用3％MeOH-97％CH2Cl2洗脫)進(jìn)一步純化得到2.01g油。通過(guò)重結(jié)晶進(jìn)一步純化該非對(duì)映異構(gòu)體。用發(fā)煙HCl將游離堿(1.98g)轉(zhuǎn)化成其HCl鹽。該鹽溶于熱的異丙醇(65mL)，用紙將溶液過(guò)濾。將濾過(guò)物真空干燥，得到的固體溶于異丙醇(30mL)。室溫放置18小時(shí)后，收集結(jié)晶固體，用冷異丙醇(20mL)洗，干燥得到0.87g，40％(來(lái)自游離堿)的非對(duì)映異構(gòu)體的純鹽酸鹽熔點(diǎn)236-2371/2℃(dec)；TLC(MeOH-CH2Cl2[99:1])Rf＝0.25；GC Rt＝11.06分鐘；FTIR(KBr沉淀，cm-1)3433，2950，2931，2853，2803，2659，2608，2497，1604，1595，1504，1461，1444，1268，1260，1067，1021，802，781，733；MS(EI)m/Z 339(M+)，341(M+2)。
實(shí)施例18另外的合成方案22Z和23A的制備向二甲基甲酰胺(100mL)中氫化鈉(2.173g，在油中60％，54.325mmol)的攪拌溶液中滴加磷酸三乙酯(12.47g，55.65mmol)，室溫下攪拌30分鐘。然后滴加二甲基甲酰胺(50ml)中m-三氟甲氧基苯甲醛(10.0g，52.6mmol)溶液，然后將溶液在室溫下攪拌30分鐘，100℃攪拌30分鐘。加入水淬滅反應(yīng)，用二乙醚(500mL)轉(zhuǎn)移到另一漏斗中。醚溶液用飽和氯化銨(4×500ml)洗滌，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濃縮得油狀乙基m-三氟甲氧基肉桂酸酯；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)260(M+，19)，232(16)，215(100)，187(21)，101(28)。
將乙醇(100ml)中的乙酯用催化量(10％重量)的氫氧化鈀在60磅氫中還原。還原(2小時(shí)室溫下)后，將反應(yīng)物過(guò)濾，濃縮得到油狀乙基m-三氟甲氧基氫化肉桂酸m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)262(M+，16)，217(7)，188(100)，175(28)，103(31)，91(18)，77(23)。
將飽和乙酯在室溫下在乙醇-10M氫氧化鈉(1∶1)溶液中水解16小時(shí)。然后酸化溶液，將產(chǎn)物抽提進(jìn)二乙醚。醚溶液在無(wú)水磷酸鎂上干燥，濃縮得到固體m-三氟甲氧基氫化肉桂酸m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)234(M+，46)，188(100)，174(65)，103(27)，91(12)，77(17)。
在過(guò)量巰基氯(thionyl chloride)中在室溫下攪拌酸4小時(shí)。減壓(100℃)蒸發(fā)過(guò)量的巰基氯，得到油狀m-三氟甲氧基氫化肉桂基氯。產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。
將四氫呋喃中m-三氟甲氧基氫化肉桂基氯(9.8g，39mmol)的溶液冷卻至-78℃，滴加溴化甲基鎂(39mmol)溶液(3M 13mL，在四氫呋喃中)。將反應(yīng)物在-78℃下攪拌4小時(shí)，在室溫下攪拌8小時(shí)，然后用稀HCl淬滅。反應(yīng)混合物用二乙醚抽提。將醚用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濃縮成油。用己烷至丙酮的梯度對(duì)該物質(zhì)用硅石層析得到油狀4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁酮；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)232(M+，68)，217(7)，189(59)，175(31)，103(28)，43(100)。
將4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁酮(2.32g，10mmol)，(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺(1.51g，10mmol)和異丙醇鈦(IV)(3.55g，12.5mmol)的溶液在室溫下攪拌4小時(shí)。反應(yīng)混合物用乙醇化的氰硼氫化鈉(10mmol)溶液(10ml，1M)處理后在室溫下攪拌16小時(shí)。將該反應(yīng)物用二乙醚稀釋(50ml)并用水(0.72ml，40mmol)處理。徹底混合后，將溶液離心，醚層脫水濃縮得到油狀固體。固體懸浮于二乙醚，用0.45μM CR PTFE Acrodisc過(guò)濾，濃縮得到澄清的油。用氯仿中的5％甲醇重復(fù)性制備型薄層層析得到兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體(S，R)-N-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，22Z[m-/Z(相對(duì)強(qiáng)度)367(M+，3)，352(20)，232(4)，178(47)，135(100)，105(14)，91(10)；77(11)]和(R，R)-N-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，23A；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)367(M+，3)，352(19)，232(7)，178(43)，135(100)，105(19)，91(10)，77(11)。
22X和22Y的制備以相似的方式將等摩爾量的4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁酮，(R)-1-(1-萘基)乙胺和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原中間體亞胺。用氯仿中5％甲醇分離凈化(work-up)和重復(fù)性制備型薄層層析得到(S，R)-N-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，22X；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)387(M+，3)，372(15)，198(15)，176(12)，155(100)，128(8)，115(6)，109(4)，103(5)，77(8)和(R，R)-N-[4-(3-1三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，22Y；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)387(M+，2)，372(12)，198(16)，176(11)，155(100)，128(8)，115(6)，109(4)，103(5)，77(8)。
4T的制備以相似的方式將等摩爾量的4-(2-氯苯基)-2-丁酮，制備自O(shè)-氯苯甲醛，(R)-1(3-甲氧基苯基)乙胺和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原中間體亞胺。用氯仿中的5％甲醇分離凈化和重復(fù)性制備型薄層層析得到(R，R)-N-[4-(2-氯苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，4T；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)317(M+，3)，302(16)，178(62)，135(100)，125(15)，105(10)，91(6)，77(8)。
21Y的制備以相似的方式將等摩爾量的4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁酮，制備自m-三氟甲基苯甲醛，(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原中間體亞胺。用氯仿中的5％甲醇的分離凈化和用重復(fù)性制備型薄層層析得到(R，R)-N-[4-(3-三氯甲基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21Y[M/Z(相對(duì)強(qiáng)度)351(M+，2)，336(18)，216(4)，202(3)，178(45)，135(100)，105(13)，91(9)，77(8)]和(S，R)-N-[4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21X。
25C和25D的制備以相似的方式將等摩爾量的4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁酮，(R)-1-(1-萘基)乙胺和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原中間體亞胺。用氯仿中的5％甲醇的分離凈化和重復(fù)性制備型薄層層析得到(S，R)-N-[4-(3-三氯甲基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，25C[m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)37(M+，3)，356(16)，198(15)，155(100)，129(8)，115(5)，109(3)，77(2)]和(R，R)-N-[4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，25D；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)371(M+，3)，356(16)，198(15)，155(100)，129(8)，115(5)，109(3)，77(2)。
21D的制備以相似的方式將等摩爾量的4-苯基-2-丁酮(Aldrich化學(xué)品公司)，(R)-1-(3-甲氯基苯基)乙胺和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原中間體亞胺。用氯仿中的5％甲醇的分離凈化和重復(fù)性制備型薄層層析得到(R，R)-N-(4-苯基-2-丁基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21D[m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，4)，268(13)，178(45)，135(100)，105(15)，91(43)，77(11)]和(S，R)-N-(4-苯基-2-丁基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21E。
21F的制備以相似的方式將等摩爾量的4-苯基-2-丁酮(Aldrich化學(xué)品公司)，(R)-1-(1-萘基)乙胺和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原中間體亞胺。用氯仿中的5％甲醇的分離凈化和重復(fù)性制備型薄層層析得到(R，R)-N-(4-苯基-2-丁基)-1-(1-萘基)乙胺，21F；[m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)303(M+，6)，288(14)，198(22)，155(100)，129(8)，115(5)，91(19)，77(4)。
12Z的制備將二氯甲烷中的2-氯氫化肉桂腈(Aldrich化學(xué)品公司，1.66g，10mmol)的攪拌溶液冷卻至-78℃，滴加二異丁基鋁氫化物(1.42g，10mmol)處理。將反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時(shí)，冷卻至-78℃，用二氯甲烷(25ml)中的1-(1-萘基)乙胺(1.71g，10mmol)的溶液處理。將反應(yīng)物移至冰浴，攪拌2小時(shí)。然后將反應(yīng)物直接倒入乙醇中硼氫化鈉(50ml，0.2M，10mmol)的攪拌溶液中。將混合物室溫?cái)嚢?0分鐘，加10％HCl淬滅過(guò)量的硼氫化鈉。加10N NaOH將溶液調(diào)至堿性，移至分離漏斗，用二乙醚(300ml)洗滌。除去水相，用1N NaOH(3×100mL)洗剩下的有機(jī)層。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮成油。用氯仿至10％甲醇-氯仿梯度將該物質(zhì)硅膠層析得到2.34g(72％產(chǎn)率)澄清油狀(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基)-1-(1-萘基)乙胺，12Z；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)323(M+，2)，308(63)，288(7)，196(5)，184(5)，155(100)，125(24)，115(8)，103(4)，91(3)，77(7)。
12B的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理2-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-[3-(2-甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12B；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)281(M+，6)，266(5)，176(27)，146(75)，135(63)，131(100)，115(25)，105(21)，91(21)，77(21)。
12C的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理2-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-[3-(2-甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12C；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)281(M+，4)，266(15)，176(18)，146(62)，135(58)，131(100)，115(23)，105(19)，91(38)，77(17)。
12D的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理2，4，6-三甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和電泳得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-[3-(2，4，6-三甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12D；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)309(M+，8)，294(25)，174(82)，159(100)，135(52)，129(29)，105(21)，91(17)，77(14)。
12E的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理4-異丙基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-[3-(4-異丙基苯基)丙-2-烯基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12E；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)309(M+，9)，294(7)，174(98)，159(22)，135(80)，177(100)，105(35)，91(37)，77(19)。
12F的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理2，4-二甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-[3-2，4-二甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12F；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)295(M+，8)，294(15)，174(29)，160(75)，145(100)，135(68)，117(21)，105(30)，91(26)，77(19)。
12G的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理3-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-[3-(3-甲氧基苯基)丙-2-烯基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12G；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)281(M+，5)，266(9)，176(24)，146(71)，135(62)，131(100)，115(23)，105(19)，91(41)，77(18)。
25E的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的(R)-N-(3-苯基丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25E；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)267(M+，3)，252(14)，176(17)，135(62)，117(100)，105(28)，91(56)，77(33)。
25G的制備以相似的方式用二異丁基鋁氫化物處理α-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺處理中間體鋁-亞胺復(fù)合物。用乙醇化的硼氫化鈉處理中間體亞胺。分離凈化和層析制得澄清無(wú)色油狀的(R)-N-(2-甲基-3-苯基丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25G；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)281(M+，5)，266(18)，190(12)，146(78)，135(82)，131(100)，115(21)，105(21)，91(62)，77(19)。
6X的制備用二甲基甲酰胺(50ml)中的磷酸二乙基氰甲酯(13.3g，75mmol)溶液處理二甲基甲酰胺(150ml)中氫化鈉(1.8g，75mmol)的攪拌的溶液。將反應(yīng)物在室溫下攪拌30分鐘。然后將反應(yīng)物用3-氯苯甲(10.54g，75mmol)處理，室溫?cái)嚢?小時(shí)。60℃攪拌30分鐘。然后加入水(200ml)淬滅反應(yīng)。將反應(yīng)混合物用二乙醚轉(zhuǎn)移到分離漏斗，用水(5×300ml)和鹽溶液洗滌得到的有機(jī)相。有機(jī)層用無(wú)水碳酸鉀干燥，濃縮得到固體3-氯肉桂腈(11.06g)。將固體溶于四氫呋喃(50ml)用過(guò)量二硼烷處理，室溫下攪拌30分鐘。將反應(yīng)物倒入冰/10％HCl中。用二乙醚(2×200ml)洗酸性水相。加10N NaOH調(diào)水相成堿性，用二乙醚(200ml)抽提。醚抽提物用無(wú)水碳酸鉀干燥，濃縮得到油狀3-(3-氯苯基)丙胺(0.6g，354mmol)。將3-(3-氯苯基)丙胺(0.6g，354mmol)，3′-甲氧基乙酰苯(0.53g，354mmol)和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)(1.26g，443mmol)室溫?cái)嚢?小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。將反應(yīng)物在室溫下攪拌16小時(shí)，用二乙醚(50ml)稀釋，用水(0.32ml，17.7mmol)處理。充分混合后將溶液離心，使醚層濃縮成牛奶狀固體。該物質(zhì)懸浮于二乙醚中，用0.45μM CR PTFE Acrodisc過(guò)濾。醚洗液濃縮成油。用3％甲醇-二氯甲烷(含0.1％異丙胺層析該物質(zhì)(硅石，制備型薄層層析)得到N-[3-(3-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6X；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)303(M+，3)，288(40)，196(3)，164(8)，135(100)，126(46)，103(26)，91(29)，77(29)。
6V的制備在室溫下將等摩爾量的3-(4-氯苯基)丙胺(如上以相似方式制備自4-氯苯甲醛，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀N-[3-(4-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6V；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)303(M+，8)，288(91)，196(4)，164(10)，135(100)，125(61)，103(21)，91(21)，77(18)。
20A的制備以相似的方式，將等摩爾量的1-(1-甲氧基苯基)丙胺，4-叔丁基乙酰苯和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)在室溫下混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀(R)-N-[1-(4-叔丁基苯基)乙基]-1-(1-萘基)乙胺，20A，m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)331(M+，12)，316(29)，161(70)，155(100)，131(14)，127(31)，115(10)，105(6)，91(10)，77(10)。
25H和25I的制備以相似的方式在室溫下將等摩爾量的(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，反-4-苯基-3-丁烯-2-酮和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀(R，R)-N-(2-甲基-4-苯基J-3-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25H；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，4)，268(13)，178(40)，135(100)，105(15)，91(47)，77(13)和油狀(S，R)-N-(2-甲基-4-苯基J-3-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25I；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，4)，268(13)，178(40)，135(100)，105(15)，91(47)，77(13)。
16L和16M的制備以相似的方式在室溫下將等摩爾量的(R)-1-(3-甲氧基苯基)-乙胺，3-甲氧基乙酰苯和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀(R，R)-N-[1-(4-甲氧基苯基)乙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，16L；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)284(M-1，1)，270(85)，150(83)，135(100)，120(12)，105(28)，91(25)，77(23)。和油狀(S，R)-N-[1-(4-甲氧基苯基)乙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，16M；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)284(M-1，1)，270(53)，150(98)，135(100)，120(11)，105(33)，91(25)，77(23)。
5R/5C的制備以相似的方式用4-氯乙酰苯制備3-甲基-3-(4-氯苯基)肉桂腈。該腈被催化還原(氫氧化鈀，乙酸，60磅氫氣2小時(shí))生成3-甲基-3-(4-氯苯基)丙胺。在室溫下將等摩爾量該胺，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀N-(3-甲基-3-(4-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，5B/5C；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)317(M+，12)，302(74)，210(2)，182(4)，164(12)，135(100)，121(25)，103(40)，91(19)，77(28)。
4Z/5A的制備以相似的方式用3-氯乙酰苯制備3-甲基-3-(3-氯苯基)肉桂腈。該腈被催化還原(氫氧化鈀，乙酸，60磅氫氣2小時(shí))生成3-甲基-3-(3-氯苯基)丙胺。在室溫下將等摩爾量的該胺，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5ml，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀N-[3-甲基-3-(3-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，4Z/5A；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，17)，268(71)，164(13)，135(100)，121(21)，105(27)，91(26)，77(14)。
4Y的制備以相似的方式用2-氯乙酰苯制備3-甲基-3-(2-氯苯基)肉桂腈。該腈被催化還原(氫氧化鈀，乙酸，60磅氫氣2小時(shí))生成3-甲基-3-(2-氯苯基)丙胺。在室溫下將等摩爾量的該胺，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩爾當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合4小時(shí)，用乙醇化的氰硼氫化鈉(5m1，1M，5mmol)處理中間體亞胺。分離凈化和層析得到油狀N-[3-甲基-3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，4Y；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，17)，268(71)，164(13)，135(100)，121(21)，105(27)，91(26)，77(4)。
6T的制備將二氯甲烷中的NPS R-568(30.3g，100mmol)溶液在-78℃用三溴化硼(50g，200ml)逐滴處理。在室溫下攪拌反應(yīng)物1小時(shí)，將其倒在冰上。用氯仿從水相中抽提氫溴酸。溶于氯仿的物質(zhì)用50％HCl洗(4×100ml)。氯仿洗液用無(wú)水硫酸鎂干燥，濃縮得到(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-羥基苯基)乙胺鹽酸鹽固體。二甲基甲酰胺中的氫化鈉(0.48g，20mmol)溶液用(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-羥基苯基)乙胺鹽酸鹽(3.25g，10mmol)處理，將反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)用碘乙烷(1.17g，11mmol)處理，室溫?cái)嚢?6小時(shí)。分離凈化和用氯仿中3％甲醇硅石層析得到油狀(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-乙氧基苯基)乙胺，6T；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)316(M+，1)，302(100)，282(11)，196(5)，178(7)，149(74)，121(34)，103(25)，91(28)，77(29)。
6R的制備以相似的方式用NPS R-467制備油狀(R)-N-(3-苯基丙基)-1-(3-乙氧基苯基)乙胺，6R；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)283(M+，10)，268(74)，178(11)，162(8)，149(100)，121(30)，103(16)，91(86)，77(29)。
3U的制備在室溫下將等摩爾量的3，3-二苯基丙胺(2.11g，10mmol)，1′-乙酰萘酮(1.70g，10mmol)和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)(3.55g，12.5mmol)攪拌4小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物用乙醇化的氰硼氫化鈉(12.5ml，12.5mmol)的1M溶液處理，在室溫下攪拌16小時(shí)。反應(yīng)用二乙醚(50ml)稀釋，用水(0.72ml，40mmol)處理。充分混合后將混合物離心，使醚層脫水，濃縮成牛奶狀油。將該油懸浮于二乙基醚，用0.45μM CR PTFE Acrodisc過(guò)濾。將二乙醚濾過(guò)物濃縮，得到澄清無(wú)色油狀N-(3，3-二苯基丙基)-1-(1-苯基)乙胺，3U；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)365(M+，17)，350(19)，181(23)，155(100)，141(25)，115(11)，91(13)，77(6)。
6F的制備以相似的方式如上處理等摩爾量的1-(3-甲氧基苯基)乙胺(1.51g，10mmol)，2′-乙酰萘酮(1.70g，10mmol)和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)(3.55g，12.5mmol)。分離凈化得到澄清無(wú)色油狀的N-[1-(2-萘基)乙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6F；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)305(M+，1)，290(35)，170(49)，155(100)，135(55)，115(28)，105(10)，91(9)，77(10)。
4G的制備以相似的方式將等摩爾量的(R)-1-苯基乙胺，1′-乙酰萘酮和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原所得到的中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的N-[1-(1-萘基)乙基]-1-苯基乙胺，4G；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)275(M+，16)，260(79)，155(100)，127(27)，105(70)，77(32)。
4H的制備以相似的方式將等摩爾量的(R)-1-苯基乙胺，2′-乙酰萘酮和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原所得到的中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的N-[1-(2-萘基)乙基]-1-苯基乙胺，4H；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)275(M+，1)，260(61)，155(100)，120(36)，105(55)，77(15)。
6E的制備以相似的方式將等摩爾量的(1-(3-甲氧基苯基)乙胺，1′-乙酰萘酮和1.25當(dāng)量的異丙醇鈦(IV)混合，用乙醇化的氰硼氫化鈉還原所得到的中間體亞胺。分離凈化和層析得到澄清無(wú)色油狀的N-1-(1-萘基)乙基-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6E；m/Z(相對(duì)強(qiáng)度)305(M+，10)，290(30)，170(43)，155(100)，135(69)，115(9)，105(15)，91(14)，77(18)。
實(shí)施例19藥物制劑適于對(duì)病人給藥的藥物制劑由表3給出。
表3
其它NPS(R)-568鹽酸鹽制劑和劑量形式的例子包括適于用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)持續(xù)或延續(xù)釋藥的那些。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)也可以確定適當(dāng)?shù)膭┝俊＠缭谝唤M實(shí)驗(yàn)中，NPS(R)-568鹽酸鹽的10-400mg口服劑量在受試人中顯示出藥理活性?？诜﨨PS(R)-568鹽酸鹽后在人血漿中觀察到顯著水平的17Q(NPS(R)-568的一種主要代謝物)的O-葡糖苷結(jié)合物。因此17Q的O葡糖苷結(jié)合物可能產(chǎn)生有益效果。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可確定NPS(R)-568的其它適當(dāng)劑量范圍。
根據(jù)本申請(qǐng)所提供的技術(shù)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員也可確定本文描述的其它化合物的適當(dāng)劑量范圍、制劑和劑量形式。
其它實(shí)施方案在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)，因此雖然只給出并描述了幾個(gè)實(shí)施方案，在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)與范圍的條件下，對(duì)本發(fā)明可有不同的改進(jìn)。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人NPS Pharmaceuticals，Inc.
(ii)發(fā)明名稱鈣受體活性化合物(iii)序列數(shù)2(iv)相關(guān)地址(A)收信人Lyon&Lyon(B)街道First Interstate WorldCenter，Suite 4700633 West Fifth Street(C)城市Los Angeles(D)州California(E)國(guó)家USA(F)郵編90017(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5時(shí)盤，1.44Mb存貯量(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件FastSeq(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期(C)分類(vii)在先申請(qǐng)資料全部在先申請(qǐng)包括下述申請(qǐng)2(A)申請(qǐng)?zhí)朥.S.08/353,784(B)提交日期1994年12月8日(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US/94/12117(B)提交日期1994年10月21日(viii)律師/代理人資料
(A)姓名Heber，Sheldon O.
(B)注冊(cè)號(hào)38，179(C)參考/登記號(hào)215/304(ix)遠(yuǎn)程通訊資料(A)電話(213)489-1600(B)電傳(213)955-0440(C)電報(bào)67-3510(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5006個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA to mRNA(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置436...3699(D)其它資料(xi)序列描述SEQ ID NO1GCTGCTGTGG CCGGACCCGA AGGCGGGCGC CGGGAGCGCA 40GCGAGCCAGA CGCGCCTCTC CAAGACCGTG ACCTTGGCAT 80AGGGAGCGGG GCTGCGCGCA GTCCTGAGAT CAGACCAGAG 120CTCATCCTCG TGGAGACCCA CGGCCGAGGG GCCGGAGCTG 160CCTCTGTGCG AGGGAGCCCT GGCCGCGGCG CAGAAGGCAT 200CACAGGAGGC CTCTGCATGA TGTGGCTTCC AAAGACTCAA 240GGACCACCCA CATTACAAGT CTGGATTGAG GAAGGCAGAA 280ATGGAGATTC AAACACCACG TCTTCTATTA TTTTATTAAT 320CAATCTGTAG ACATGTGTCC CCACTGCAGG GAGTGAACTG 360CTCCAAGGGA GAAACTTCTG GGAGCCTCCA AACTCCTAGC 400TGTCTCATCC CTTGCCCTGG AGAGACGGCA GAACC 435ATG GCA TTT TAT AGC TGC TGC TGG GTC CTC TTG GCA 471Met Ala Phe Tyr Ser Cys Cys Trp Val Leu Leu Ala1 5 10
CTC ACC TGG CAC ACC TCT GCC TAC GGG CCA GAC CAG507Leu Thr Trp His Thr Ser Ala Tyr Gly Pro Asp Gln15 20CGA GCC CAA AAG AAG GGG GAC ATT ATC CTT GGG GGG543Arg Ala Gln Lys Lys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Gly25 30 35CTC TTT CCT ATT CAT TTT GGA GTA GCA GCT AAA GAT579Leu Phe Pro Ile His Phe Gly Val Ala Ala Lys Asp40 45CAA GAT CTC AAA TCA AGG CCG GAG TCT GTG GAA TGT615Gln Asp Leu Lys Ser Arg Pro Glu Ser Val Glu Cys50 55 60ATC AGG TAT AAT TTC CGT GGG TTT CGC TGG TTA CAG651Ile Arg Tyr Asn Phe Arg Gly Phe Arg Trp Leu Gln65 70GCT ATG ATA TTT GCC ATA GAG GAG ATA AAC AGC AGC687Ala Met Ile Phe Ala Ile Glu Glu Ile Asn Ser Ser75 80CCA GCC CTT CTT CCC AAC TTG ACG CTG GGA TAC AGG723Pro Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Gly Tyr Arg85 90 95ATA TTT GAC ACT TGC AAC ACC GTT TCT AAG GCC TTG759Ile Phe Asp Thr Cys Asn Thr Val Ser Lys Ala Leu100 105GAA GCC ACC CTG AGT TTT GTT GCT CAA AAC AAA ATT795Glu Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Gln Asn Lys Ile110 115 120GAT TCT TTG AAC CTT GAT GAG TTC TGC AAC TGC TCA831Asp Ser Leu Asn Leu Asp Glu Phe Cys Asn Cys Ser125 130GAG CAC ATT CCC TCT ACG ATT GCT GTG GTG GGA GCA867Glu His Ile Pro Ser Thr Ile Ala Val Val Gly Ala135 140ACT GGC TCA GGC GTC TCC ACG GCA GTG GCA AAT CTG903Thr Gly Ser Gly Val Ser Thr Ala Val Ala Asn Leu145 150 155CTG GGG CTC TTC TAC ATT CCC CAG GTC AGT TAT GCC939Leu Gly Leu Phe Tyr Ile Pro Gln Val Ser Tyr Ala160 165TCC TCC AGC AGA CTC CTC AGC AAC AAG AAT CAA TTC975Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ser Asn Lys Asn Gln Phe170 175 180
AAG TCT TTC CTC CGA ACC ATC CCC AAT GAT GAG CAC 1011Lys Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp Glu His185 190CAG GCC ACT GCC ATG GCA GAC ATC ATC GAG TAT TTC 1047Gln Ala Thr Ala Met Ala Asp Ile Ile Glu Tyr Phe195 200CGC TGG AAC TGG GTG GGC ACA ATT GCA GCT GAT GAC 1083Arg Trp Asn Trp Val Gly Thr Ile Ala Ala Asp Asp205 210 215GAC TAT GGG CGG CCG GGG ATT GAG AAA TTC CGA GAG 1119Asp Tyr Gly Arg Pro Gly Ile Glu Lys Phe Arg Glu220 225GAA GCT GAG GAA AGG GAT ATC TGC ATC GAC TTC AGT 1155Glu Ala Glu Glu Arg Asp Ile Cys Ile Asp Phe Ser230 235 240GAA CTC ATC TCC CAG TAC TCT GAT GAG GAA GAG ATC 1191Glu Leu Ile Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu Glu Ile245 250CAG CAT GTG GTA GAG GTG ATT CAA AAT TCC ACG GCC 1227Gln His Val Val Glu Val Ile Gln Asn Ser Thr Ala255 260AAA GTC ATC GTG GTT TTC TCC AGT GGC CCA GAT CTT 1263Lys Val Ile Val Val Phe Ser Ser Gly Pro Asp Leu265 270 275GAG CCC CTC ATC AAG GAG ATT GTC CGG CGC AAT ATC 1299Glu Pro Leu Ile Lys Glu Ile Val Arg Arg Asn Ile280 285ACG GGC AAG ATC TGG CTG GCC AGC GAG GCC TGG GCC 1335Thr Gly Lys Ile Trp Leu Ala Ser Glu Ala Trp Ala290 295 300AGC TCC TCC CTG ATC GCC ATG CCT CAG TAC TTC CAC 1371Ser Ser Ser Leu Ile Ala Met Pro Gln Tyr Phe His305 310GTG GTT GGC GGC ACC ATT GGA TTC GCT CTG AAG GCT 1407Val Val Gly Gly Thr Ile Gly Phe Ala Leu Lys Ala315 320GGG CAG ATC CCA GGC TTC CGG GAA TTC CTG AAG AAG 1443Gly Gln Ile Pro Gly Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys325 330 335GTC CAT CCC AGG AAG TCT GTC CAC AAT GGT TTT GCC 1479Val His Pro Arg Lys Ser Val His Asn Gly Phe Ala340 345
AAG GAG TTT TGG GAA GAA ACA TTT AAC TGC CAC CTC 1515Lys Glu Phe Trp Glu Glu Thr Phe Asn Cys His Leu350 355 360CAA GAA GGT GCA AAA GGA CCT TTA CCT GTG GAC ACC 1551Gln Glu Gly Ala Lys Gly Pro Leu Pro Val Asp Thr365 370TTT CTG AGA GGT CAC GAA GAA AGT GGC GAC AGG TTT 1587Phe Leu Arg Gly His Glu Glu Ser Gly Asp Arg Phe375 380AGC AAC AGC TCG ACA GCC TTC CGA CCC CTC TGT ACA 1623Ser Asn Ser Ser Thr Ala Phe Arg Pro Leu Cys Thr385 390 395GGG GAT GAG AAC ATC AGC AGT GTC GAG ACC CCT TAC 1659Gly Asp Glu Asn Ile Ser Ser Val Glu Thr Pro Tyr400 405ATA GAT TAC ACG CAT TTA CGG ATA TCC TAC AAT GTG 1695Ile Asp Tyr Thr His Leu Arg Ile ser Tyr Asn Val410 415 420TAC TTA GCA GTC TAC TCC ATT GCC CAC GCC TTG CAA 1731Tyr Leu Ala Val Tyr Ser Ile Ala His Ala Leu Gln425 430GAT ATA TAT ACC TGC TTA CCT GGG AGA GGG CTC TTC 1767Asp Ile Tyr Thr Cys Leu Pro Gly Arg Gly Leu Phe435 440ACC AAT GGC TCC TGT GCA GAC ATC AAG AAA GTT GAG 1803Thr Asn Gly Ser Cys Ala Asp Ile Lys Lys Val Glu445 450 455GCG TGG CAG GTC CTG AAG CAC CTA CGG CAT CTA AAC 1839Ala Trp Gln Val Leu Lys His Leu Arg His Leu Asn460 465TTT ACA AAC AAT ATG GGG GAG CAG GTG ACC TTT GAT 1875Phe Thr Asn Asn Met Gly Glu Gln Val Thr Phe Asp470 475 480GAG TGT GGT GAC CTG GTG GGG AAC TAT TCC ATC ATC 1911Glu Cys Gly Asp Leu Val Gly Asn Tyr Ser Ile Ile485 490AAC TGG CAC CTC TCC CCA GAG GAT GGC TCC ATC GTG 1947Asn Trp His Leu Ser Pro Glu Asp Gly Ser Ile Val495 500TTT AAG GAA GTC GGG TAT TAC AAC GTC TAT GCC AAG 1983Phe Lys Glu Val Gly Tyr Tyr Asn Val Tyr Ala Lys505 510 515
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CAG CAG CAG CCC AGA TGC AAG CAG AAG GTC ATC TTT3276Gln Gln Gln Pro Arg Cys Lys Gln Lys Val Ile Phe960 965GGC AGC GGC ACG GTC ACC TTC TCA CTG AGC TTT GAT3312Gly Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser Leu Ser Phe Asp970 975 980GAG CCT CAG AAG AAC GCC ATG GCC CAC GGG AAT TCT3348Glu Pro Gln Lys Asn Ala Met Ala His Gly Asn Ser985 990ACG CAC CAG AAC TCC CTG GAG GCC CAG AAA AGC AGC3384Thr His Gln Asn Ser Leu Glu Ala Gln Lys Ser Ser995 1000GAT ACG CTG ACC CGA CAC CAG CCA TTA CTC CCG CTG3420Asp Thr Leu Thr Arg His Gln Pro Leu Leu Pro Leu100510101015CAG TGC GGG GAA ACG GAC TTA GAT CTG ACC GTC CAG3456Gln Cys Gly Glu Thr Asp Leu Asp Leu Thr Val Gln10201025GAA ACA GGT CTG CAA GGA CCT GTG GGT GGA GAC CAG3492Glu Thr Gly Leu Gln Gly Pro Val Gly Gly Asp Gln103010351040CGG CCA GAG GTG GAG GAC CCT GAA GAG TTG TCC CCA3528Arg Pro Glu Val Glu Asp Pro Glu Glu Leu Ser Pro10451050GCA CTT GTA GTG TCC AGT TCA CAG AGC TTT GTC ATC3564Ala Leu Val Val Ser Ser Ser Gln Ser Phe Val Ile10551060AGT GGT GGA GGC AGC ACT GTT ACA GAA AAC GTA GTG3600Ser Gly Gly Gly Ser Thr Val Thr Glu Asn Val Val106510701075AAT TCA TAAAATGGAA GGAGAAGACT GGGCTAGGGA 3636Asn SerGAATGCAGAG AGGTTTCTTG GGGTCCCAGG GATGAGGAAT3676CGCCCCAGAC TCCTTTCCTC TGAGGAAGAA GGGATAATAG3716ACACATCAAA TGCCCCGAAT TTAGTCACAC CATCTTAAAT3756GACAGTGAAT TGACCCATGT TCCCTTTAAA AAAAAAAAAA3796AAAAAGCGGC CGC 3809
權(quán)利要求
1.一種調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物及其藥用鹽和復(fù)合物，所述化合物具有下式 其中Ar1是被0至5個(gè)取代基任意選擇地取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙酰基、亞乙二氧基；Ar2是被0至5個(gè)取代基任意選擇地取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基；q是0、1、2或3；且R是氫或低級(jí)烷基；其中所述化合物調(diào)控一種或多種無(wú)機(jī)離子受體活性。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述Ar1苯基，若存在的話，具有1至5個(gè)取代基，各取代基獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CF3、CH3S、CF3O、I、Cl、F和CH3；所述Ar2苯基，若存在的話，具有1至5個(gè)取代基，各取代基獨(dú)立地選自異丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3和CH3；所述化合物是鈣模擬物；且所述無(wú)機(jī)離子受體活性是鈣受體活性。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中q是2，存在所述具有1至5個(gè)取代基的Ar1苯基和所述具有1至5個(gè)取代基的Ar2苯基。
4.權(quán)利要求3的化合物，所述Ar2苯基是間甲氧基苯基。
5.權(quán)利要求2的化合物，其中q是0，存在所述Ar2萘基。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中存在所述具有1至5個(gè)取代基的Ar1苯基。
7.權(quán)利要求2的化合物，其中q是2，存在所述具有1至5個(gè)取代基的Ar1苯基和所述Ar2萘基。
8.權(quán)利要求2的化合物，其中所述Ar1苯基，如果存在的話，具有1至5個(gè)取代基，各取代基獨(dú)立地選自CF3O、I、Cl、F和CF3；且所述Ar2苯基，如果存在的話，具有1至5個(gè)取代基，各取代基獨(dú)立地選自CF3O、I、Cl、F、CH3O和CF3。
9.權(quán)利要求3的化合物，其中所述Ar1苯基具有1至5個(gè)取代基，各取代基獨(dú)立地選自CF3O、I、Cl、F和CF3；且所說(shuō)的Ar2苯基具有1至5個(gè)取代基，各取代基獨(dú)立地選自CF3O、I、Cl、F、CH3O和CF3。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中Ar2苯基是間甲氧基苯基。
11.權(quán)利要求2的化合物，其中R是CH3。
12.權(quán)利要求3的化合物，其中R是CH3。
13.權(quán)利要求4的化合物，其中R是CH3。
14.權(quán)利要求7的化合物，其中R是CH3。
15.權(quán)利要求11的化合物或其藥用鹽和復(fù)合物，其中所述化合物具有下式
16.一種調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物或其藥用鹽和復(fù)合物，所述化合物具有下式 其中Ar3是被0至5個(gè)取代基任意選擇地取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、芐基、芐氧基、二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、N(CH3)2、乙?；?、亞乙二氧基；Ar4是被0至5個(gè)取代基任意選擇地取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基；R8是氫或苯基；R9是氫或甲基；且R10是氫、甲基或苯基。
17.一種調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體的化合物，該化合物具有下式 其中Ar5是被0至5個(gè)取代基任意選擇地取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、芐基、芐氧基，α，α-二甲基芐基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙?；?、亞乙二氧基、-CH＝CH-苯基；Ar6是被0至5個(gè)取代基任意選擇地取代的萘基或苯基，各取代基獨(dú)立地選自乙?；?、低級(jí)烷基、鹵素、低級(jí)烷氧基、低級(jí)硫代烷基、亞甲二氧基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、甲酯基、OCH2C(O)C2H5和乙酰氧基；R11是氫或甲基；且R12是氫或甲基。
18.權(quán)利要求1的化合物，該化合物是N-3-(3-三氟甲基苯基)-1-丙基-(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，或其藥用鹽。
19.一種用于治療患有下列疾病中的一種疾病的病人的藥物組合物，這些疾病選自原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、Paget氏癥、惡性高血鈣、骨質(zhì)疏松癥、高血壓和腎病性骨營(yíng)養(yǎng)不良，該組合物含有有效量的權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)權(quán)利要求的化合物和可在藥物中應(yīng)用的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有通式a)、b)、c)并且能調(diào)控一種無(wú)機(jī)離子受體的一種或多種活性的化合物以及通過(guò)調(diào)控?zé)o機(jī)離子受體活性來(lái)治療疾病或失調(diào)的方法。優(yōu)選地，該化合物能模擬或阻遏細(xì)胞外Ca
文檔編號(hào)C07D215/14GK1534016SQ0213022
公開(kāi)日2004年10月6日 申請(qǐng)日期1995年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月21日
發(fā)明者B·C·范瓦格內(nèi), S·T·莫伊, M·F·巴蘭德林, E·G·德?tīng)柭? E·F·內(nèi)梅特, B C 范瓦格內(nèi), 內(nèi)梅特, 巴蘭德林, 德?tīng)柭? 莫伊 申請(qǐng)人:Nps藥物有限公司