專利名稱：減低蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子免疫毒性使之成為鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子的藥物替代品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自眼鏡蛇的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(cNGF)特異結(jié)合脂類小分子，這些脂類小分子是其免疫毒性的主要來(lái)源之一。因此，本發(fā)明提供一種眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子(cNGF)的純化方法和脫脂方法，利用有機(jī)溶劑采取特殊工藝對(duì)純化的cNGF進(jìn)行脫脂處理，成功地去除了脂類小分子，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)脫脂后的cNGF減少了對(duì)小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞的免疫毒性，可作為鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子的替代藥物作為低副作用具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的藥物。
背景技術(shù)：
:神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在人體中廣泛分布，是一個(gè)有著復(fù)雜功能的生物活性蛋白。成熟的有生物活性的NGF以同源 二聚體的形式存在于生物體中，其單體是含有120個(gè)氨基酸的多肽，分子量約為13kD。兩個(gè)單體的折疊片以廣泛的疏水作用形成穩(wěn)定非共價(jià)的活性雙體形式。NGF在人體中廣泛分布，除了神經(jīng)系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)性細(xì)胞中可以找到NGF的蹤跡，在免疫系統(tǒng)的炎癥細(xì)胞中也能表達(dá)NGF，它們是:肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞等。NGF可以在特定的部位和組織高豐度表達(dá)，而這些部位和組織就是天然提取NGF的最佳來(lái)源。已知的有(I)雄性成年小鼠頜下腺；(2)牛精漿；蛇毒；(4)豚鼠前列腺。其中小鼠頜下腺和蛇毒中的含量最為豐富，都以毫克級(jí)存在，是兩個(gè)最主要的來(lái)源。雖然蛇源和鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用相似，但它們的免疫學(xué)行為卻有很大差異。NGF具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能，對(duì)種屬和周圍神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、正常狀態(tài)的維持、凋亡、損傷后的保護(hù)和軸突的有效再生都有著重要作用。隨著大量深入研究，在神經(jīng)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞中都可以表達(dá)NGF和NGF受體，說(shuō)明這些細(xì)胞不僅可以分泌NGF也是NGF的靶細(xì)胞，受到NGF的調(diào)控，并且暗示著NGF可能是這些細(xì)胞之間的樞紐。研究表明，NGF在神經(jīng)系統(tǒng)以外表現(xiàn)出非?；钴S的生物學(xué)功能，例如許多免疫細(xì)胞上都存在NGF受體，NGF能增強(qiáng)特異性和非特異性免疫反應(yīng)，通過(guò)影響免疫細(xì)胞的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，在免疫系統(tǒng)炎癥疾病中扮演了非常重要的角色，如哮喘、肺炎、關(guān)節(jié)炎。在臨床上，NGF已經(jīng)應(yīng)用于治療多種疾病，如外傷引起的神經(jīng)損傷、視神經(jīng)病變、角膜潰瘍、耳聾耳鳴，骨病中促進(jìn)軸突定向再生、髓鞘生成，帕金森病、阿爾茲海默癥、多發(fā)性神經(jīng)炎、帶狀皰疹和面部神經(jīng)麻痹等等。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性分子之一。NGF不僅對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有作用，而且對(duì)于免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)也有一定的影響。目前我國(guó)已有鼠源和人源NGF新藥用于臨床，是有效的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和退行性神經(jīng)病變的新型生物制劑，適用于神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科和創(chuàng)傷等病癥。由于小鼠NGF與人的NGF有很高的同源性(89% )，并且材料的來(lái)源豐富，因此，目前藥效較好的天然NGF多是以小鼠頜下腺為原料提取的。
目前為止，NGF的晶體結(jié)構(gòu)有6個(gè)，但是卻沒(méi)有一個(gè)是蛇源的NGF蛋白，有4個(gè)是鼠源的，另外2個(gè)則是人源的NGF在大腸桿菌中重組表達(dá)的。蛇源cNGF與鼠源mNGF的氨基酸序列比對(duì)表明，兩者的同源度約為63%。小鼠頜下腺和蛇毒兩種來(lái)源的NGF生物活性相似，但蛇毒NGF具有耐酸、耐堿、耐蛋白酶水解和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，且來(lái)源豐富，說(shuō)明蛇毒NGF具有更廣闊的應(yīng)用前景。目前為止，也已經(jīng)有以舟山眼鏡蛇毒NGF為原料的藥品上市，但是因?yàn)槎靖弊饔帽容^大，并且其副作用機(jī)理不清楚，限制了其應(yīng)用。人們研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，已經(jīng)找到了它的兩個(gè)膜上受體，并且對(duì)于分別與這兩個(gè)受體相關(guān)的信號(hào)通路的研究也比較透徹。在這些研究中經(jīng)常可以注意到一些脂類分子的存在，這些脂類分子或是與其受體偶聯(lián)的信號(hào)通路相關(guān)，或是與調(diào)節(jié)NGF的受體表達(dá)水平相關(guān)，或是被NGF調(diào)節(jié)等等。長(zhǎng)久以來(lái)，科學(xué)家們都是在NGF周邊間接地研究這些脂分子與NGF相關(guān)的生物功能，也很少有學(xué)者直接的將NGF與脂分子聯(lián)系起來(lái)。例如，從蛇毒和大鼠頜下腺中提取的NGF與IysoPS共同作用可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)，釋放出多種炎癥介質(zhì):如5-羥色胺(5-HT)、組胺(hiatamine)和白介素等，但是其機(jī)理至今仍然不清楚。脂類是一類低溶于水卻易溶于非極性溶劑的生物有機(jī)分子。脂類是富含能量的營(yíng)養(yǎng)素，是生物體中能量的一種儲(chǔ)存形式，脂類也是組成生物膜的重要組分，為保持膜的完整性和流動(dòng)性提供支持。脂類還做為一些物質(zhì)的前體形式存在。近年來(lái)研究表明脂類也參與了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，有一些非常重要的脂類被定義為第二信使，發(fā)揮傳遞信號(hào)的中介功能，調(diào)控生命活動(dòng)
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法解析了眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF(SEQ ID NO:1)的晶體結(jié)構(gòu)，第一次在NGF雙體的疏水通道中發(fā)現(xiàn)了脂類分子的存在。通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合提取cNGF中的脂類分 子進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析，我們大概確定這個(gè)脂分子的結(jié)構(gòu)類似二?；视头肿?，分子量為620Da，由兩條脂肪酸酯尾巴組成，包含40-44個(gè)碳原子。利用cNGF及脫脂cNGF開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞組胺釋放效應(yīng)明顯發(fā)生了變化。相比cNGF，脫脂cNGF組胺釋放量明顯降低，將脫脂cNGF與IysoPS共同刺激肥大細(xì)胞時(shí)，組胺釋放量增多，具有類似mNGF的效應(yīng)。這說(shuō)明小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞組胺釋放效應(yīng)是由NGF與IysoPS脂分子共同調(diào)節(jié)的。在本發(fā)明中提供下列:1.眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF的純化方法，所述方法包括下述步驟:(1)將蛇毒粗品溶解于醋酸鈉溶液，(2)將步驟(I)的溶液進(jìn)行第一步離子交換層析，所用緩沖液A液B液均為磷酸鈉緩沖液，B液中洗脫鹽為氯化鈉，各洗脫組分經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，將目的蛋白溶液濃縮；(3)將步驟(2)的濃縮蛋白溶液換至第二步離子交換層析緩沖液，進(jìn)行第二步離子交換層析，所用緩沖液A液B液均為磷酸鈉緩沖液，B液中洗脫鹽為氯化鈉，各洗脫組分經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，將目的蛋白溶液濃縮；和(4)將步驟(3)的濃縮蛋白溶液進(jìn)行分子篩層析。2.根據(jù)第I項(xiàng)的方法，其中步驟(2)和(3)的離子交換層析為陽(yáng)離子交換層析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(2)和(3)的離子交換層析使用Resource S陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行，步驟(4)的分子篩層析使用Superdex 75進(jìn)行凝膠排阻層析。4.根據(jù)第I項(xiàng)的方法，其中步驟(2)所用緩沖液A為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 5.9，緩沖液B為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 7.0, IM NaCl。5.根據(jù)第I項(xiàng)的方法，其中步驟(3)所用緩沖液A為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 6.5，緩沖液B為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 6.8，IM NaCl。6.根據(jù)第I項(xiàng)的方法，其中步驟(4)所用緩沖液為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 6.5。7.眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF的脫脂方法，所述方法包括:將提取純化的眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF與有機(jī)溶劑混合變性，離心取兩相分界面的蛋白沉淀，重復(fù)4-6次，以達(dá)到充分脫脂。8.根據(jù)第7項(xiàng)的脫脂方法，其中所用的有機(jī)溶劑為氯仿。9.脫脂眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF用于制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物的應(yīng)用，其中所述脫脂眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF通過(guò)用第7項(xiàng)的脫脂方法對(duì)眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子脫脂獲得。10.一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物，其包含治療有效量的用第7項(xiàng)的脫脂方法獲得的脫脂眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF。附圖簡(jiǎn)述:


圖1是cNGF及脫脂cNGF (cNGF-dl)的小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)。相比cNGF，脫脂cNGF所引起的組胺釋放效應(yīng)明顯降低；圖2是cNGF的晶體結(jié)構(gòu)。在雙體結(jié)合面的疏水通道中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)脂類小分子，這個(gè)脂類小分子由兩條脂肪鏈尾巴組成，大概包含40-44個(gè)碳原子。圖3是眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，實(shí)施例中所用的試劑除特別說(shuō)明外均為市售分析純級(jí)別的試劑。實(shí)施例1本發(fā)明提供蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF (SEQ ID NO:1)的純化方法及脫脂方法。cNGF及脫脂cNGF的小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)。1、中華眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF蛋白的天然提取純化。提純方案為:第一步離子柱+第二步離子柱+分子篩我們是從廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所購(gòu)買的蛇毒粗品，來(lái)源于中華眼鏡蛇Chinesecobra (N.naja atra)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解,除中華眼鏡蛇蛇毒粗品外，也可以使用其他市售來(lái)源的蛇毒粗品。本發(fā)明對(duì)蛇毒粗品的物種來(lái)源沒(méi)有特別的限制。將粗品蛇毒溶解于0.1M pH4.6的醋酸鈉溶液中，濃度為100mg/ml。將充分溶解的蛇毒粗品高速離心后，去除沉淀，上清留用。第一步陽(yáng)離子交換層析
純化條件:緩沖液:母液0.2M Na2HP04 和 0.2M NaH2P04A Na2HP04: NaH2P04 I: 9 終濃度 20mMB Na2HP04: NaH2P04 6: 4 終濃度 20mM+l M NaCl純化柱:陽(yáng)離子交換柱,例如,包括但不限于,Resource S 6ml (GE)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)然還可以根據(jù)實(shí)際需要而使用其它柱體積的Resource S陽(yáng)離子交換柱，甚至可以使用任何合適的其他陽(yáng)離子交換柱，但是本實(shí)施例使用的是6ml的Resource S柱。第二步陽(yáng)離子交換層析純化條件:緩沖液母液0.2M Na2HP04和(λ 2M NaH2P04A Na2HP04: NaH2P04 3: 7 終濃度 20mMB Na2HP04: NaH2P04 5: 5 終濃度 20mM+0.5MNaCl純化柱:陽(yáng)離子交換柱,例如,包括但不限于,Resource S 6ml (GE)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，當(dāng)然還可以根據(jù)實(shí)際需要而使用其它柱體積的Resource S陽(yáng)離子交換柱，甚至可以使用任何合適的其他陽(yáng)離子交換柱，但是本實(shí)施例使用的是6ml的Resource S柱。將第一步離子交換層析得到的蛋白超濾濃縮，換至第二步離子交換層析緩沖液，過(guò)Resource S 6ml柱,收集目標(biāo)峰,濃縮至一定體積。

第三步精細(xì)純化凝膠排阻層析純化條件:磷酸鈉緩沖液溶液母液0.2M Na2HP04 和 0.2M NaH2P04溶液:20mMNa2HP04: NaH2P04 3:7 pH 6.5純化柱:Superdex 75 (GE)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解,這一步主要是去除少量雜質(zhì)，收集狀態(tài)比較均一的目的蛋白，普通的分子篩都行，沒(méi)有特別要求。將第二步得到的蛋白溶液過(guò)Superdex 75柱,收集主峰,濃縮至10mg/ml以內(nèi)，液氮速凍，存_80°C冰箱。2、cNGF脫脂方法將天然提取純化的cNGF與10倍體積以上的氯仿溶液劇烈震蕩混勻，4°C，5000r.p.m離心30分鐘，形成兩相分層，此時(shí)cNGF蛋白沉淀在兩相界面處，脂類小分子溶于下層的氯仿有機(jī)相中。小心吸出下層有機(jī)相，保留上層溶液及沉淀，然后用10倍以上體積的氯仿重懸，重復(fù)前面的步驟4-6次，以達(dá)到充分脫脂。最后將上層溶液相及沉淀回收，高速離心，保留沉淀，用PH 5.5,50mM的醋酸鈉緩沖液重懸，液氮速凍，_80°C保存。3、cNGF及脫脂cNGF的小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:cNGF,脫脂cNGF工作濃度均為200ng/ml，cNGF與脂類小分子IysoPS共同孵育約十分鐘，刺激時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液為5% FBS(胎牛血清)DMEM。實(shí)驗(yàn)中cNGF、脂類分子均用添加了 0.5mM CaCl2的50mMNa2Ac稀釋。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果:相比cNGF，用脫脂cNGF刺激時(shí)，肥大細(xì)胞釋放組胺的量明顯減少，用脫脂cNGF與IysoPS共同孵育刺激肥大細(xì)胞時(shí)，組胺釋放量又明顯增加，類似于小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mNGF)的作用模式。這說(shuō)明小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞組胺釋放效應(yīng)是由NGF與IysoPS脂分子共同調(diào)節(jié)的。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意
組合 。
權(quán)利要求
1.眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子CNGF的純化方法，所述方法包括下述步驟: (1)將蛇毒粗品溶解于醋酸鈉溶液， (2)將步驟(I)的溶液進(jìn)行第一步離子交換層析，所用緩沖液A液B液均為磷酸鈉緩沖液，B液中洗脫鹽為氯化鈉，各洗脫組分經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，將目的蛋白溶液濃縮； (3)將步驟(2)的濃縮蛋白溶液換至第二步離子交換層析緩沖液，進(jìn)行第二步離子交換層析，所用緩沖液A液B液均為磷酸鈉緩沖液，B液中洗脫鹽為氯化鈉，各洗脫組分經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，將目的蛋白溶液濃縮；和 (4)將步驟(3)的濃縮蛋白溶液進(jìn)行分子篩層析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)和(3)的離子交換層析為陽(yáng)離子交換層析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟(2)和(3)的離子交換層析使用ResourceS陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行，步驟(4)的分子篩層析使用SuperdeX75進(jìn)行凝膠排阻層析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)所用緩沖液A為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 5.9，緩沖液B為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 7.0, IM NaCl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)所用緩沖液A為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 6.5，緩沖液B為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 6.8，IM NaCl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(4)所用緩沖液為終濃度為20mM的磷酸鈉緩沖液，pH 6.5。
7.眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF的脫脂方法，所述方法包括:將提取純化的眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF與有機(jī)溶劑混合變性，離心取兩相分界面的蛋白沉淀，重復(fù)4-6次，以達(dá)到充分脫脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的脫脂方法，其中所用的有機(jī)溶劑為氯仿。
9.脫脂眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF用于制備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物的應(yīng)用，其中所述脫脂眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF通過(guò)用權(quán)利要求7的脫脂方法對(duì)眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子脫脂獲得。
10.一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物，其包含治療有效量的用權(quán)利要求7的脫脂方法獲得的脫脂眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子cNGF。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自眼鏡蛇的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(cNGF)特異結(jié)合脂類小分子，是其免疫毒性的主要來(lái)源之一。因此，本發(fā)明涉及眼鏡蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子(cNGF)的純化方法和脫脂方法，利用有機(jī)溶劑采取特殊工藝對(duì)純化的cNGF進(jìn)行處理，成功地去除了脂類小分子，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)脫脂后的cNGF減少了對(duì)小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞的免疫毒性，可作為鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子的替代藥物作為低副作用具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的藥物。
文檔編號(hào)A61K38/18GK103159844SQ20111042803
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者江濤, 唐捷, 童瓊, 周洪哲, 孫含麗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所