專利名稱：遞送治療或診斷試劑的導(dǎo)向蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、癌生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及包含偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑的組合物，和這種組合物在治療學(xué)和癌癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
不斷增長(zhǎng)的證據(jù)揭示許多疾病，從年齡相關(guān)的黃斑變性、動(dòng)脈硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎到癌癥都與血管生成，即新血管形成相關(guān)(Folkman.2001)。在這些血管生成依賴性疾病中，癌癥是最主要的目標(biāo)疾病(Brem，1999；Ferrara和Alitalo，1999；Keshet和Ben-Sasson，1999；Carmeliet和Jain，2000)。根據(jù)抗血管生成理論，正在開發(fā)的有幾十種新的治療劑。在Folkman的重要出版物中，原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位腫瘤的生長(zhǎng)依賴于向腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)和氧的新血管生成(Folkman，1971)。以后的三十多年，變得更加令人信服的是，新血管生成在轉(zhuǎn)移表型中起著關(guān)鍵作用。已證明新血管生成是許多腫瘤的關(guān)鍵性預(yù)后因素及治療目標(biāo)。
了解到腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管生成程度密切相關(guān)，促進(jìn)了研究實(shí)驗(yàn)室和藥廠開發(fā)抑制血管生成而切斷對(duì)腫瘤的血供之策略(Brem，1999；Ferrara和Alitalo，1999；Keshet和Ben-Sasson，1999；Kerbel，2001；Risau，1998Klohs和Hamby，1999；Rosen，2000；Butke和DeNardo，2001；Taraboletti和Margosio，2001；Glaspy，2002)。盡管此科學(xué)理論和正在臨床考核研究的實(shí)驗(yàn)藥物評(píng)價(jià)前途光明，鑒于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所顯示的令人興奮的抗癌作用，學(xué)者們?nèi)孕枰匆娺@些研究的顯著陽(yáng)性結(jié)果。
最近的二項(xiàng)臨床研究涉及二種內(nèi)源性血管生成抑制劑，內(nèi)皮抑制素和血管抑制素。這些蛋白質(zhì)已顯示對(duì)癌癥新血管生成是特異的，而對(duì)正常的血管生長(zhǎng)沒有作用。在動(dòng)物研究中已顯示它們能能抑制癌生長(zhǎng)而無(wú)明顯副作用，也不誘導(dǎo)藥物抗性(Boehm等，1997)。然而人癌癥臨床試驗(yàn)的結(jié)果與臨床前試驗(yàn)的極好結(jié)果不相符(Thomas等，2003；Herbst等，2002；Eder等，2002)。這些試驗(yàn)中的腫瘤反應(yīng)極其少見。如果腫瘤有反應(yīng)，則腫瘤退化的速度非常緩慢。某些病例中，一年以上才見到腫瘤退化的患者超過(guò)25％。迄今，采用這些血管生成抑制劑的臨床試驗(yàn)沒見到快速腫瘤縮小。雖然在這些臨床試驗(yàn)中腫瘤反應(yīng)不常見，但這些內(nèi)源性血管生成抑制劑的確顯示了非常好的安全性。
與動(dòng)物模型中所見的腫瘤特異性血管生成相反，對(duì)腫瘤特異性血管已研究了相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間。因此，人體腫瘤中的血管比小鼠腫瘤中的更成熟。某些實(shí)施例中，這些內(nèi)源性抑制劑抑制血管生成需要較長(zhǎng)時(shí)間，才能阻斷供給腫瘤的血流引起腫瘤細(xì)胞凋亡。這些血管生成抑制劑通過(guò)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)而不是殺傷癌細(xì)胞而發(fā)揮其功能。它們的作用機(jī)制稱為“細(xì)胞靜止”而非“細(xì)胞毒性”。與細(xì)胞毒制劑如化療藥物相反，這些細(xì)胞靜止性血管生成抑制劑不能有效攻擊常見于晚期腫瘤的已良好建立的腫瘤血管。因此這些制劑迄今在大多數(shù)注冊(cè)患者為晚期、并且采用的大部分治療無(wú)效的臨床試驗(yàn)中，沒能顯示顯著的抗癌作用。
與本文所述相對(duì)無(wú)毒性但效能較差的抗血管生成蛋白質(zhì)相反，已試圖采用各種強(qiáng)的治療性蛋白質(zhì)或多肽及編碼它們的核酸來(lái)治療癌癥(不一定只是殺傷癌細(xì)胞)，或已提出這類應(yīng)用。這些物質(zhì)例如，包括自殺蛋白、凋亡誘導(dǎo)蛋白、細(xì)胞因子、白介素、TNF家族蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸。具體例子包括GM-CSF、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素-1β、白介素-2、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-8、白介素-10白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-16、白介素-18、白介素-23、白介素-24、腫瘤壞死因子超家族成員14、腫瘤壞死因子超家族成員13B、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子超家族成員12、細(xì)胞間粘附分子-1、淋巴細(xì)胞功能性抗原-3、協(xié)同剌激分子B7-1、協(xié)同剌激分子B7-2、FMS-相關(guān)酪氨酸激酶3配體、CD40配體、表面抗原CD70、T-細(xì)胞活化細(xì)胞表面糖蛋白配體、協(xié)同剌激分子OX-40、TNF-相關(guān)活化誘導(dǎo)細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子超家族成員11、胞嘧啶脫氨酶、HSV胸腺嘧啶激酶、FAS配體、胱冬酶3、TGF-α1、TGF-α2、TRAIL、Bax、BaK、Bik、Bok、Noxa、Bcl-2家族蛋白質(zhì)、顆粒溶素(NKG5)、顆粒酶A、顆粒酶B和穿孔素。
例如，IL-12和干擾素-α(Glaspy，2002)已用于治療腎細(xì)胞癌和黑色素瘤。然而在癌癥患者中常見顯著的全身毒性，從而限制了提高劑量及它們的臨床效果。IL-12顯示了強(qiáng)大而廣譜的抗癌作用(Trinchieri，2003)。然而在一些臨床試驗(yàn)中顯示了不能接受的副作用(Leonard等，1997)，阻礙了其作為抗癌制劑的應(yīng)用前景。
為了最大程度減少細(xì)胞因子如白介素及表1所列那些治療性蛋白質(zhì)的全身副作用，已采用許多蛋白質(zhì)將這些認(rèn)為有毒性的治療性蛋白質(zhì)靶向腫瘤特異性的血管。此外，也可利用將小分子與能特異性靶向腫瘤新生血管的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，給腫瘤顯影。這些方法中的一些小結(jié)于表1中。
表1
其它靶向策略包括將腫瘤標(biāo)志(B細(xì)胞淋巴瘤的CD20、乳腺癌的Her-2/neu、結(jié)腸、頭頸癌等的EGFR)，或腫瘤特異性血管標(biāo)志(纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域、整合素αvβ3、VEGF受體等)的特異性抗體與治療制劑，如白介素、細(xì)胞因子、白樹毒蛋白、白喉毒素、放射性同位素等交聯(lián)，制備免疫毒素(Kreitman，1999)。然而大多數(shù)免疫毒素策略雖然獲得了臨床療效，但只有極少數(shù)被批準(zhǔn)，如ZevalinTM(ibritumomabtiuxetan)(IDEC Phamaceuticals；San Diego，CA)和Baxxar(Corixa；Seatlle，Washington)。
WO 99/16889描述了含有血管抑制素的連接有不同或互補(bǔ)活性第二分子的氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)。在具體實(shí)施例中，該第二分子選自內(nèi)皮抑制素、人I型干擾素、血小板反應(yīng)蛋白、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)和血小板因子4。其它實(shí)施例中，該融合蛋白用于抗腫瘤治療。
從上述可見，需要能克服該領(lǐng)域以上問(wèn)題并能治療血管生成依賴性疾病的組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明克服了上述問(wèn)題，導(dǎo)致得以診斷和治療血管生成依賴性疾病的化合物和療法。
在本申請(qǐng)書中，將血管生成抑制劑與治療或診斷制劑交聯(lián)。在許多實(shí)施例中，血管生成抑制劑是抗血管生成蛋白或多肽。鑒于它們對(duì)癌的新生血管而非正常血管的親和力，這些蛋白質(zhì)和多肽可用作靶向蛋白，將治療性或診斷性制劑輸送給患病細(xì)胞和/或組織附近。
偶聯(lián)有血管生成抑制劑的治療性蛋白制劑，與單用血管生成抑制劑或治療性蛋白制劑相比，顯著提高了治療效果。采用血管生成抑制劑作為輸送(歸巢，home-in)蛋白或制劑，可將治療劑遞送到癌細(xì)胞和/或組織附近，是因?yàn)檠苌梢种苿┠芘c血管生成特異性疾病的特定血管相締合和/或結(jié)合。這些治療劑治療作用的增強(qiáng)是由于其局部濃度提高的結(jié)果。
此外，也可將血管生成抑制劑與診斷試劑偶聯(lián)。例如，可將它們與綠熒光蛋白、熒光素酶、放射性同位素或它們的組合相偶聯(lián)。這些血管生成抑制劑-診斷試劑偶聯(lián)物將促進(jìn)患者的診斷。
在廣泛的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及含有與治療或診斷制劑相偶聯(lián)的血管生成抑制劑的組合物。本發(fā)明某些優(yōu)選方面涉及一種融合蛋白，其含有的抗血管生成多肽區(qū)域與治療性蛋白或多肽區(qū)域，或診斷性蛋白或多肽區(qū)域相連接，或涉及編碼這類融合蛋白的核酸。然而，在其它實(shí)施例中，可將血管生成抑制劑與治療或診斷性制劑化學(xué)交聯(lián)。
普通技術(shù)人員將會(huì)懂得，通過(guò)閱讀本申請(qǐng)書中任何目前已知的抗血管生成蛋白，或進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)要達(dá)到本發(fā)明的目的，需采用本發(fā)明中所述內(nèi)容。本文中所用的具體抗血管生成蛋白質(zhì)或多肽將在本申請(qǐng)書中其它部分中作更詳細(xì)敘述。提供的某些特別優(yōu)選的例子包括內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素(tumstatin)、血管抑制素和VEGF受體2的可溶性部分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀本申請(qǐng)書將會(huì)很好了解本文中所用的治療制劑。某些情況下，該治療制劑是一種治療性蛋白質(zhì)或多肽。然而小分子、化學(xué)治療藥物、毒素、放射活性化合物和可用于本發(fā)明獲得治療效果的任何其它形式的治療劑也屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
如本申請(qǐng)書其它部分中更詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明示范性的治療蛋白質(zhì)和多肽包括，但不以任何方式限于自殺性蛋白質(zhì)、凋亡誘導(dǎo)性蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、白介素和TNF家族蛋白質(zhì)。示范性的診斷蛋白質(zhì)和多肽包括例如綠熒光蛋白和熒光素酶。以上所述只是可與抗血管生成序列相融合的治療性蛋白質(zhì)的例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得也可采用其它治療性和診斷性蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施例中，血管生成抑制劑是如本文中所述的抗血管生成多肽。某些優(yōu)選實(shí)施例包括內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、血管抑制素和可溶性VEGF受體2作為抗血管生成多肽。本發(fā)明某些優(yōu)選治療性實(shí)施例包括的治療性蛋白質(zhì)或多肽有白介素蛋白質(zhì)或多肽，例如，白介素-12；自殺性蛋白如胞嘧啶脫氨酶，或凋亡誘導(dǎo)蛋白如天然或突變性bik蛋白質(zhì)。本發(fā)明某些優(yōu)選診斷性實(shí)施例包括的診斷性蛋白質(zhì)或多肽有綠熒光蛋白或熒光素酶。某些特別優(yōu)選治療性實(shí)施例包括內(nèi)皮抑制素/白介素-12、血管抑制素/白介素-12、腫瘤抑制素/白介素-12、可溶性VEGF受體2/白介素-12、內(nèi)皮抑制素/胞嘧啶脫氨酶、血管抑制素/胞嘧啶脫氨酶、、腫瘤抑制素/胞嘧啶脫氨酶、可溶性VEGF受體2/胞嘧啶脫氨酶、內(nèi)皮抑制素/突變體bik、腫瘤抑制素/突變體bik和可溶性VEGF受體2/突變體bik。而某些特別優(yōu)選的診斷性實(shí)施例包括內(nèi)皮抑制素/綠熒光蛋白、血管抑制素/綠熒光蛋白、腫瘤抑制素/綠熒光蛋白、可溶性VEGF受體2/綠熒光蛋白、內(nèi)皮抑制素/熒光素酶、血管抑制素/熒光素酶、腫瘤抑制素/熒光素酶和可溶性VEGF受體2/熒光素酶。
雖然本發(fā)明最簡(jiǎn)單的實(shí)施例涉及一種血管生成抑制劑與一種治療性或診斷性制劑的偶聯(lián)，但沒有理由不去構(gòu)成本發(fā)明更為復(fù)雜的組合物。例如，可以將二種或多種血管生成抑制劑與一種治療性或診斷性制劑相偶聯(lián)，一種血管生成抑制劑與二種或多種治療性或診斷性制劑相偶聯(lián)，或甚至二種或多種血管生成抑制劑與二種或多種治療性或診斷性制劑偶聯(lián)。某些情況下，本文中偶聯(lián)的多個(gè)血管生成抑制劑、治療劑和/或診斷試劑是相同的，例如二個(gè)內(nèi)皮抑制素多肽與一個(gè)白介素-12多肽偶聯(lián)?；蛘?，本文中偶聯(lián)的多個(gè)血管生成抑制劑、治療劑和/或診斷試劑是不同的，例如一個(gè)內(nèi)皮抑制素多肽與一個(gè)白介素-12多肽和一個(gè)胞嘧啶脫氨酶多肽偶聯(lián)。技術(shù)人員能夠按照本申請(qǐng)書所述實(shí)施本發(fā)明這類實(shí)施例。
在本發(fā)明關(guān)于融合蛋白的實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，該融合蛋白通常是由編碼連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的核酸序列所表達(dá)的。此類核酸中，編碼抗血管生成多肽區(qū)域的核酸序列，可位于編碼治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的核酸序列的5’或3’端。另外，本發(fā)明不限于編碼這些融合蛋白的核酸應(yīng)怎樣構(gòu)成表達(dá)載體的方法?？稍诜謩e構(gòu)建步驟中將抗血管生成核酸和治療性或診斷性核酸構(gòu)建到一個(gè)載體中?；蛘撸上葘⑺鼈?nèi)诤?，然后?gòu)建到一表達(dá)載體中。本發(fā)明還涉及包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域融合蛋白的編碼核酸?？蓪⑦@種核酸包含在一載體中，與脂質(zhì)復(fù)合，和/或包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。
本發(fā)明的某些具體實(shí)施例涉及制備融合蛋白和編碼此種融合蛋白的核酸的方法，該方法包括獲得編碼含有抗血管生成多肽區(qū)域或其互補(bǔ)物的融合蛋白的第一核酸；獲得編碼治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域或其互補(bǔ)物的第二核酸；和利用該第一核酸和第二核酸，產(chǎn)生包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域融合蛋白的編碼核酸。這些方法還包括測(cè)定編碼該融合蛋白核酸在合適條件下表達(dá)該融合蛋白的能力，和/或診斷或治療活性。這類方法還包括給予對(duì)象編碼該融合蛋白的核酸。
除了采用融合蛋白方法外，可采用化學(xué)交聯(lián)劑，將治療性或診斷性蛋白或小分子制劑與抗血管生成蛋白、多肽或肽交聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道對(duì)某些氨基酸側(cè)鏈特異性的交聯(lián)劑可從商業(yè)來(lái)源購(gòu)得。具體交聯(lián)劑的選擇取決于所涉及的蛋白質(zhì)(或小分子治療性或診斷性制劑)。
采用化學(xué)交聯(lián)方法，可實(shí)施的方法包括獲得血管生成抑制劑；獲得治療性或診斷性制劑；將血管生成抑制劑與治療性或診斷性制劑交聯(lián)，產(chǎn)生偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑。這種方法還可包括測(cè)定偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑的診斷或治療作用，和/或給予受試者偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑。在一具體實(shí)施例中，將表達(dá)抗血管生成基因的產(chǎn)品與所需分子(治療或診斷)交聯(lián)，純化交聯(lián)產(chǎn)物，和給予患者(如為了治療目的或診斷目的，或二者)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物(為研究目的)。
本發(fā)明一些方面涉及包括用包含偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑的組合物處理細(xì)胞的方法。該細(xì)胞是受試者的細(xì)胞，或者是細(xì)胞培養(yǎng)物。某些實(shí)施例中，該細(xì)胞是測(cè)試對(duì)象如小鼠的細(xì)胞。其它實(shí)施例中，所述受試者是人。
本發(fā)明優(yōu)選方面涉及治療或診斷血管生成依賴性疾病的方法，包括但不限于癌癥、老年相關(guān)性黃斑退化、動(dòng)脈硬化、血管纖維瘤、新生血管性青光眼、動(dòng)靜脈畸變、骨不連合骨折、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、結(jié)締組織疾病、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張綜合征、牛皮癬、角膜移植物新血管生成、化膿性肉芽腫、延遲性傷口愈合、晶狀體后纖維組織形成、糖尿病視網(wǎng)膜病變、硬皮病、肉芽形成、血管瘤、沙眼、血友病性關(guān)節(jié)、血管粘連、肥大性疤痕、多發(fā)性硬化、再狹窄和肥胖癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本文了解“血管生成依賴性疾病”的定義。某些具體實(shí)施例所治療的癌癥，例如但不限于頭頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、腦癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃腸道癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。這些方法的一些實(shí)施例包括給予受試者偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑，例如但不限于，包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑中的融合蛋白。其它實(shí)施例包括給予受試者編碼包含偶聯(lián)有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的融合蛋白的核酸。這些情況下，所述核酸可包含在質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體中，或與脂質(zhì)結(jié)合。另外，可將所述核酸分散在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。
本發(fā)明的具體方面涉及治療或診斷癌癥的方法，該方法包括獲得包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的融合蛋白，或包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域融合蛋白的編碼核酸；和給予患者該融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸。
本發(fā)明的其它具體方面涉及診斷和/或治療制劑藥盒，其在適當(dāng)?shù)娜萜髦泻斜景l(fā)明的融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸。
本發(fā)明上述相當(dāng)廣泛的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，閱讀后可更好了解本發(fā)明。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)在以下描述，將形成本發(fā)明權(quán)利要求的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可不難利用本文所披露的概念和具體實(shí)施例作基礎(chǔ)，修改或設(shè)計(jì)其它結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)施與本發(fā)明相同的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)認(rèn)識(shí)到這類等同的結(jié)構(gòu)不會(huì)脫離本發(fā)明權(quán)利要求所設(shè)定的思路和范圍。通過(guò)以下描述并結(jié)合附圖考慮，將會(huì)更好了解本發(fā)明的特征性新特點(diǎn)，其組織和操作方法，及其它目的和優(yōu)點(diǎn)。然而，應(yīng)明確理解，每張附圖目的只是闡明和描述而不是限制本發(fā)明。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明為了更完整了解本發(fā)明，現(xiàn)參見以下描述并結(jié)合附圖。
圖1A和1B顯示可檢測(cè)到抗血管生成-治療/診斷性融合蛋白。圖1A顯示收集的293T細(xì)胞上清液的抗內(nèi)皮抑制素抗體的免疫印跡結(jié)果(18KD內(nèi)皮抑制素(□)，58KD內(nèi)皮抑制素-CD()和93KD endo-IL-12(←))。圖1B，采用ELISA試劑盒(內(nèi)皮抑制素特異性)。
圖2A到2H顯示與內(nèi)皮抑制素相比較，endo-CD融合蛋白在內(nèi)皮導(dǎo)管(2A-2D)和遷移(2E-2H)試驗(yàn)中顯示了相似的抗血管生成作用。圖2A到2C中，研究了HUVEC細(xì)胞管的形成，圖2E到2G研究了細(xì)胞遷移。圖2D和2H中，觀察了5個(gè)視野，計(jì)數(shù)了各個(gè)細(xì)胞管和遷移的細(xì)胞并取平均值。
圖3A到3D顯示可測(cè)定融合基因的治療或診斷功能。圖3A和3A顯示MTT試驗(yàn)結(jié)果。圖3C顯示用Endo-GFP融合基因轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中綠熒光蛋白的表達(dá)。圖3D中研究了用轉(zhuǎn)染了內(nèi)皮抑制素-GM-CSF質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)液剌激時(shí)，NSF60細(xì)胞的增殖。
圖4A到4F顯示內(nèi)皮抑制素-GFP可特異性靶向內(nèi)皮細(xì)胞。
圖5A到5C顯示在B-16親代腫瘤的血管壁中測(cè)到GFP信號(hào)。圖5A表明在利用B-16內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定細(xì)胞系的腫瘤實(shí)驗(yàn)組中測(cè)到GFP。圖5B顯示在A對(duì)側(cè)腫瘤血管壁()中測(cè)到GFP。圖5C顯示在對(duì)照組雙側(cè)B-16親代細(xì)胞系中測(cè)到GFP。
圖6顯示穩(wěn)定的克隆所表達(dá)的內(nèi)皮抑制素抑制了對(duì)側(cè)和局部區(qū)域腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)照組中測(cè)定了所有的腫瘤并一起平均。測(cè)定了實(shí)驗(yàn)組的腫瘤并按它們的細(xì)胞系(B-16親代黑色素瘤細(xì)胞系或內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定的克隆系)平均。
圖7A到7C顯示，在不同的獨(dú)立動(dòng)物研究中，與單用IL-12或內(nèi)皮抑制素相比，endo-IL-12具有高度抗癌作用。圖7A顯示抗B16F10腫瘤的腫瘤內(nèi)基因治療。圖7B顯示與圖7A相似的抗B16F10腫瘤的腫瘤內(nèi)基因治療，例外的是遠(yuǎn)處原發(fā)腫瘤用2×105細(xì)胞攻擊。圖7C提供endo-IL-12與單用IL-12和內(nèi)皮抑制素相比較的說(shuō)明。
圖8A到8D顯示穩(wěn)定的克隆或活體外轉(zhuǎn)染所表達(dá)的融合蛋白對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤的高度抗癌作用。圖8A顯示活體外用抗血管生成化療處理內(nèi)皮抑制素-CD融合基因(Endo內(nèi)皮抑制素；CD胞嘧啶脫氨酶；Endo-CD融合基因)。圖8B顯示活體外用抗血管生成免疫療法治療時(shí)，Tum5-IL12顯示對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤有更佳的腫瘤抑制作用(Tum5腫瘤抑制素抗血管生成缺失性突變體；IL-12白介素12；Tum5-IL12融合基因)。圖8C說(shuō)明在存在該融合蛋白時(shí)遠(yuǎn)處CT26結(jié)腸癌的生長(zhǎng)。將不同基因注射到遠(yuǎn)離所測(cè)定腫瘤(不直接注射基因行處理)的CT26腫瘤部位。圖8D對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤用穩(wěn)定的細(xì)胞系內(nèi)皮抑制素-IL12治療。
發(fā)明詳述定義如本文所用，“一個(gè)”或“一種”可指一個(gè)或多個(gè)。如權(quán)利要求中所用，當(dāng)與詞“包含”合用時(shí)，“一個(gè)”或“一種”可指一個(gè)或一個(gè)以上。如本文所用“另一個(gè)”可指至少有第二個(gè)或多個(gè)。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”本文用于指能改善某些疾病相關(guān)癥狀所需化合物的量。例如，治療癌癥時(shí)，能改善癌到任何程度，或能中止癌癥任何癥狀的化合物應(yīng)是治療有效的化合物。例如，癌癥的改善可能是抑制了癌細(xì)胞和/或組織的血管生成，抑制或阻止了細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞死亡或它們的聯(lián)合作用。某化合物的治療有效量不要求治愈某病而是提供對(duì)某病的治療。
此申請(qǐng)書將整個(gè)PCT國(guó)際申請(qǐng)WO 99/16889的內(nèi)容納入作為參考。
為了提供癌癥治療領(lǐng)域中用的組合物和方法，本發(fā)明人研究了腫瘤血管特異性的內(nèi)源性血管生成抑制劑。具體實(shí)施例中，本發(fā)明人構(gòu)建了偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑。一些具體實(shí)施例中，偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑是兩種成分抗血管生成組分和治療性(或診斷性)組分的融合物。一具體實(shí)施例中，偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑是編碼含有兩種蛋白組分的融合蛋白質(zhì)的融合基因。因此，可將抗血管生成蛋白和治療性(或診斷性)蛋白二者的編碼序列相連接，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞靜止性抗血管生成蛋白與細(xì)胞毒性蛋白的融合蛋白。此外，也可將抗血管生成蛋白與診斷性蛋白，如綠熒光蛋白和熒光素酶融合，通過(guò)抗血管生成蛋白將其(熒光蛋白)引入腫瘤特異性血管中。另一實(shí)施例中，采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，化學(xué)連接抗血管生成蛋白組分和治療或診斷蛋白組分。在示范性實(shí)施例中，通過(guò)將編碼至少一種抗血管生成蛋白的核酸，與至少一種治療性或診斷性核酸相融合來(lái)產(chǎn)生融合基因構(gòu)建物。
由于血管生成抑制劑對(duì)新形成的癌瘤血管，而非正常血管具有親和力，這些蛋白可用作靶向性蛋白將治療劑輸送到癌細(xì)胞附近而不會(huì)擴(kuò)散毒性。連接有這些血管生成抑制劑的治療性蛋白/制劑與單用血管生成抑制劑或治療性蛋白/制劑相比，將能顯著增強(qiáng)對(duì)癌瘤的殺傷和抗癌作用。
抗血管生成蛋白質(zhì)任何抗血管生成蛋白、多肽或肽可用于(制備)偶聯(lián)了治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑，例如本發(fā)明的示范性靶向融合基因產(chǎn)物。血管生成抑制劑(也稱為抗血管生成化合物)是那些能抑制、減少、停止、延緩、阻礙、預(yù)防、阻止、減慢、逆轉(zhuǎn)或妨礙血管生成的制劑。在一具體實(shí)施例中，組織中的血管生成對(duì)產(chǎn)生該血管的組織，如腫瘤或視網(wǎng)膜起著有利作用。
示范性實(shí)施例包括血管生成素-2、血管抑制素、抗凝血酶III(AT3)、尿激酶的氨基未端片段、鈣網(wǎng)蛋白、內(nèi)皮抑制素、VEGF受體2(可溶性片段，經(jīng)去除跨膜區(qū)而制備)、VEGF受體1(可溶性片段，經(jīng)去除跨膜區(qū)而制備)、干擾素α誘導(dǎo)蛋白10、血纖蛋白溶酶原的5Kringle結(jié)構(gòu)域、血纖蛋白溶酶原的Kringle-5結(jié)構(gòu)域、哺乳動(dòng)物絲氨酸蛋白酶抑制劑、干擾素-γ誘導(dǎo)的單核因子、血管抑制性趨化因子融合基因、色素上皮衍生因子、MMP-2的C未端血色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、血小板因子4(CXCL4)、增殖素相關(guān)蛋白、內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶、金屬蛋白酶-1的組織抑制劑、金屬蛋白酶-2的組織抑制劑、金屬蛋白酶-3的組織抑制劑、金屬蛋白酶-4的組織抑制劑、肌鈣蛋白I-2(快速抽動(dòng)骨骼肌)、色氨酰-tRNA合成酶的Ser94-Gln471片段、血小板反應(yīng)蛋白、腫瘤抑制素，或它們的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如何采用本領(lǐng)域熟知的方法，通過(guò)進(jìn)入國(guó)家生物技術(shù)信息中心提供的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公眾可得的序列，獲得這些蛋白質(zhì)、多肽或肽的序列，及編碼它們的核酸序列?？寡苌尚蛄械氖痉缎詫?shí)施例包括(括號(hào)中為它們的GenBank序列號(hào))內(nèi)皮抑制素(AF333247；SEQID NO37)；血管抑制素(SEQ ID NO38)；腫瘤抑制素(AF258351；SEQ ID NO39)和血小板反應(yīng)蛋白(M81339；SEQ ID NO40)。
這些抗血管生成核酸的任何一種，以及該領(lǐng)域已知的其它抗血管生成物質(zhì)或近期已鑒定而此地未列出的抗血管生成物質(zhì)，都可作為抗癌癥或血管生成依賴性疾病基因治療劑的成分，可與本文所列或該領(lǐng)域熟知的或近期可能已鑒定的治療性和/或診斷性蛋白融合后輸送?；蛘?，可表達(dá)和純化這些融合核酸和那些本文未列出的核酸編碼的融合蛋白，用于蛋白療法靶向癌癥和其它血管生成依賴性疾病。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在某些實(shí)施方式中，抗血管生成序列可提供對(duì)疾病的治療，和/或可提供對(duì)疾病的診斷能力。
治療性/診斷性蛋白質(zhì)本發(fā)明的許多組合物含有治療性或診斷性蛋白或多肽，或編碼它們的核酸。任何這類治療性或診斷性蛋白或多肽，或編碼核酸都可用于本發(fā)明，無(wú)論是技術(shù)人員目前已知的或此申請(qǐng)書發(fā)表后發(fā)現(xiàn)的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有各種治療性蛋白或多肽及編碼它們的核酸，對(duì)治療血管生成依賴性疾病包括癌癥有益。在具體實(shí)施例中，這類治療性蛋白或多肽可包括但不限于自殺性蛋白質(zhì)、毒素蛋白質(zhì)、促凋亡蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子蛋白質(zhì)和/或抗血管生成蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的具體方法和組合物中，該治療性多肽或蛋白質(zhì)是本身存在其它化合物時(shí)，能引起細(xì)胞死亡的“自殺性蛋白質(zhì)”。這種自殺性蛋白質(zhì)的一個(gè)代表性例子是單純皰疹病毒的胸苷激酶。其它例子包括帶狀皰疹病毒的胸苷激酶(VZV-TK)、細(xì)菌基因胞嘧啶脫氨酶(其可將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化還原酶、羧肽酶G2、β-葡糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-內(nèi)酰胺酶、硝基還原酶、羧肽酶A、linamarase(也稱為β-葡糖苷酶)、大腸桿菌gpt基因和大腸桿菌Deo基因，及本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì)。某些實(shí)施例中，自殺性蛋白質(zhì)可將前藥轉(zhuǎn)變成毒性化合物。“前藥”本文指用于本發(fā)明方法中可被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘援a(chǎn)物，如對(duì)腫瘤細(xì)胞有毒性的產(chǎn)物的任何化合物。自殺性蛋白質(zhì)可將此種前藥轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物。此種前藥的代表性例子包括更昔洛韋、無(wú)環(huán)鳥苷和FIAU(1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯糖呋喃糖?；?-5-碘尿嘧啶)；對(duì)氧化還原酶為異環(huán)磷酰胺；對(duì)VZV-TK為6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷；對(duì)胞嘧啶脫氨酶為5-氟胞嘧啶；對(duì)β-葡糖醛酸酶為阿霉素；對(duì)硝基還原酶為CB1954和硝基呋噻咪唑；對(duì)羧肽酶A為N-(氰基乙酰)-L-苯丙氨酸或N-(3-氯丙酰)-L-苯丙氨酸。該領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難給予這種前藥。普通技術(shù)人員不難確定前藥的最適劑量和給藥途徑。在具體實(shí)施例中，給予前藥的劑量從約1-20mg/天/公斤體重到約1-50mg/天/公斤體重，或約1-100mg/天/公斤體重。
一些實(shí)施例中，所述治療性蛋白或多肽是癌抑制劑，如p53或Rb，或編碼此類蛋白或多肽的核酸。當(dāng)然，技術(shù)人員知道有各種各樣這類癌抑制劑，和如何獲得它們和/或編碼它們的核酸。
治療性蛋白或多肽的其它例子包括促凋亡治療性蛋白或多肽，例如p15、p16或p21WAF-1。一個(gè)具體實(shí)施例涉及的促凋亡蛋白或多肽是野生型Bik，或含有與野生型Bik相似或比其更高活性的突變體Bik。在某些具體實(shí)施例中，該Bik突變體含有Thr33，Ser35替代或Thr33和Ser35雙替代。在其它具體實(shí)施例中是用Asp替代。其內(nèi)容納入本文作參考的2003年4月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/459,901描述了Bik、Bik突變體和編碼它們的核酸序列。
細(xì)胞因子和編碼它們的核酸也可用作治療性蛋白和多肽。例子包括GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子)；TNFα(腫瘤壞死因子α)；干擾素包括但不限于IFN-α和IFN-γ；和白介素包括但不限于白介素-1(IL1)、白介素-β(IL-β)、白介素-2(IL2)、白介素-4(IL4)、白介素-5(IL5)、白介素-6(IL6)、白介素-8(IL8)、白介素-10(IL10)、白介素-12(IL12)、白介素-13(IL13)、白介素-14(IL14)、白介素-15(IL15)、白介素-16(IL16)、白介素-18(IL18)、白介素-23(IL23)、白介素-24(IL24)，雖然本領(lǐng)域知道還有其它物質(zhì)。
治療性蛋白或多肽的示范性、但非限制性或綜合性名單包括(括號(hào)中為編碼它們的核酸GenBank登錄號(hào))單純皰疹病毒1型(突變體KG111)的胸苷激酶(SEQ ID NO1；J04327)、單純皰疹病毒2型(株9637)的胸苷激酶(tk)(SEQ ID NO2；M29941)、帶狀皰疹病毒的胸苷激酶(SEQ ID NO3；M36160)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(SEQ ID NO4；S56903)、p450氧化還原酶(SEQ ID NO5；D17571)、羧肽酶G2(SEQ ID NO5；M12599)、β-葡糖醛酸酶(SEQ ID NO7；M15182)、青霉素-V-酰胺酶(SEQ ID NO8；M15660)、青霉素-G-酰胺酶(SEQ ID NO9；AF161313)、β-內(nèi)酰胺酶(SEQ ID NO10；AY029068)、硝基還原酶(SEQ ID NO11；A23284)、羧肽酶A(SEQ ID NO12；M27717)、linamarase(SEQ ID NO13；S35175)、大腸桿菌gpt(SEQ ID NO14；X00221)、大腸桿菌Deo(SEQ ID NO15；X03224)、p53(SEQ ID NO16；AF307851)；Rb(SEQ ID NO17；XM_053409)；p15(SEQ ID NO18；U19796)；p16[(SEQ ID NO19；U12818)(SEQ ID NO20；U12819)和(SEQ ID NO21；U12820)]、p21WAF-1(SEQ ID NO22；AF497972)、GM-CSF(SEQID NO23；M10663)、TNFα(SEQ ID NO24；AY066019)、IFN-α(SEQ ID NO25；M34913)、IFN-α(SEQ ID NO26；J00219)；干擾素γ、干擾素β(SEQ ID NO27；M28983)、IL-β、IL2(SEQ ID NO28；K02056)、IL3(SEQ ID NO；29；M14743)、IL4(SEQ ID NO30；M23442)、IL5、IL6(SEQ ID NO31；M29150)、IL7(SEQ ID NO32；J04156)、IL8、IL10(SEQ ID NO33；U16720)、IL12A(SEQ ID NO34；NM_000882)、IL12B(SEQ ID NO35；NM_002187)、IL13、IL14、IL15(SEQ ID NO36；U14407)、IL16、IL18、IL23、IL24、腫瘤壞死因子超家族成員14、腫瘤壞死因子超家族成員13B(也稱為BlyS，BAFF，THANK)、可溶形式、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子超家族成員12(也稱為Apo3L)、細(xì)胞間粘附分子-1、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)相關(guān)抗原-3、協(xié)同剌激分子B7-1、協(xié)同剌激分子B7-2、FMS-相關(guān)酪氨酸激酶3配體、CD40配體、表面抗原CD70、T-細(xì)胞活化細(xì)胞表面糖蛋白配體、協(xié)同剌激分子OX-40配體(原先稱gp34)、TNF相關(guān)活化誘導(dǎo)細(xì)胞因子、全長(zhǎng)(同種型1，ODF；RANKL)、腫瘤壞死因子超家族成員11、TNF相關(guān)活化誘導(dǎo)細(xì)胞因子、可溶形式(同種型2，sODF，sRANKL)、腫瘤壞死因子超家族成員11、顆粒溶素(Granulysin，NKG5)、顆粒酶A、顆粒酶B和穿孔素。
診斷性蛋白的例子包括綠熒光蛋白(M62653；SEQ ID NO41)、熒光素酶(SEQ IDNO42)或它們的組合。
在本發(fā)明的具本實(shí)施例中，編碼治療性或診斷性蛋白或多肽的核酸區(qū)段包含在載體中，如非病毒載體、病毒載體或其組合中。病毒載體可以是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺相關(guān)病毒載體。非病毒載體可以是質(zhì)?；蛑|(zhì)體。核酸區(qū)段也可包含在藥物組合物中。
治療性或診斷性融合核酸的任何組合可作為基因療法制劑輸送，用于抗癌癥或血管生成依賴性疾病，作為與本文所列出的或該領(lǐng)域所知的抗血管生成基因產(chǎn)物一起的一種成分?；蛘?，可表達(dá)和純化這些融合基因編碼的融合蛋白，用于蛋白質(zhì)治療靶向癌癥和其它血管生成依賴性疾病。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，治療序列也可作為診斷序列，反之亦然。在其它實(shí)施例中，在偶聯(lián)有治療制劑的血管生成抑制劑之前，使用偶聯(lián)有診斷試劑的血管生成抑制劑。
通用實(shí)施方案本發(fā)明涉及靶向性抗血管生成融合多肽和/或編碼它們的核酸，以及關(guān)于使用它們的方法。因此在示范性實(shí)施例中，本發(fā)明證明內(nèi)源性血管生成抑制劑，如內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、血管抑制素等能特異性靶向新血管的形成，這是血管生成依賴性疾病，包括癌癥的特征。雖然任何癌癥均可用本發(fā)明治療或預(yù)防，一些癌癥的例子包括頭頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、腦癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃腸道癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
具體說(shuō)，可將這些抗血管生成蛋白質(zhì)與治療性或診斷性蛋白質(zhì)融合，作為引導(dǎo)工具將該融合蛋白輸送到病理性血管生成部位附近。融合基因構(gòu)建物所編碼的這些融合蛋白質(zhì)通過(guò)聯(lián)合抗血管生成和治療性蛋白質(zhì)二者的功能，可提高治療效果。此外，抗血管生成蛋白通過(guò)抗血管生成蛋白所提供的將該融合蛋白靶向患病部位的靶向功能，可最大程度減少治療性蛋白的全身毒性作用。
在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用抗血管生成靶向融合蛋白治療哺乳動(dòng)物癌癥。例如，人卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和其它癌癥可用本文所述組合物，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可按本文所述同樣方法治療。某些實(shí)施例中，例如通過(guò)病毒或非病毒輸送系統(tǒng)將其輸送給合適的受體動(dòng)物，以抑制血管生成，抑制腫脹生長(zhǎng)和發(fā)展，或聯(lián)合作用。
制備示范性的抗血管生成靶向融合蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，這些融合物能選擇性抑制血管生成，抑制細(xì)胞增殖、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，或聯(lián)合作用。該領(lǐng)域技術(shù)人員按照本說(shuō)明書所述，可產(chǎn)生其它示范性抗血管生成靶向融合蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，提供了預(yù)防個(gè)體中細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括給予該個(gè)體抗血管生成靶向融合蛋白。在一具體實(shí)施例中，給予脂質(zhì)體包裹的多肽，和/或該多肽還包含一蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Schwarze等，1999)。某些實(shí)施例中，以聚核苷酸方式給予抗血管生成靶向融合蛋白，其中，所述聚核苷酸含有可影響氨基酸水平修飾的變化，如可用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生這種變化。給予的此種修飾的抗血管生成靶向融合聚核苷酸可包含在載體中，如質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、脂質(zhì)體或它們的組合中。
本發(fā)明的其它實(shí)施例中，提供了處理細(xì)胞的方法，該方法包括使細(xì)胞接觸抗血管生成靶向融合多肽。具體實(shí)施例中，所述細(xì)胞是人的細(xì)胞，該細(xì)胞位于動(dòng)物體內(nèi)，和/或所述動(dòng)物是人。
靶向融合物的產(chǎn)生雖然可用化學(xué)合成方法，或通過(guò)二分子間的化學(xué)鍵產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)，但優(yōu)選通過(guò)融合方法產(chǎn)生它們，即將抗血管生成分子的編碼序列和治療或診斷分子的編碼序列相融合，并置于能指導(dǎo)該融合聚核苷酸在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列控制下。優(yōu)選實(shí)施例中，該嵌合蛋白的各成分具有它們各自作為抗血管生成分子和治療或診斷分子部分的功能活性。
可用分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的方法實(shí)現(xiàn)兩個(gè)全長(zhǎng)編碼序列的融合。優(yōu)選的融合性聚核苷酸只含有第一編碼序列5’端的AUG翻譯起始密碼子，但沒有第二編碼序列的起始密碼子，以避免產(chǎn)生兩個(gè)分離的編碼產(chǎn)物。此外，可將一前導(dǎo)序列置于該聚核苷酸的5’端，以將表達(dá)的產(chǎn)物靶向宿主細(xì)胞中的特定部位或腔室，有利于基因表達(dá)后的分泌或后續(xù)純化。兩個(gè)編碼序列可直接融合不用接頭，或用一接頭。在一具體實(shí)施例中，連接抗血管生成和治療/診斷蛋白質(zhì)的接頭包含VPGVG(彈性蛋白Val-Pro-Gly-Val-Gly)或Gly-Gly-Gly-Ser-Gly。其它接頭是該領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，見WO 99/16889所述，其內(nèi)容納入本文作參考。
根據(jù)本發(fā)明的目的，可采用編碼融合蛋白的聚核苷酸來(lái)產(chǎn)生重組DNA分子，以指導(dǎo)該融合蛋白、融合肽的片段或其功能等價(jià)物在合適的細(xì)胞中表達(dá)。由于遺傳密碼子的固有簡(jiǎn)并性，可采用編碼基本上相同的或功能等價(jià)的氨基酸序列的其它DNA序列，來(lái)實(shí)施本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的克隆和表達(dá)。這類DNA序列包括那些在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與融合序列或其互補(bǔ)序列雜交的序列，這是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
可用于本發(fā)明的改變的序列，包括可導(dǎo)致能產(chǎn)生編碼相同的或功能等價(jià)的融合基因產(chǎn)物的，有不同核苷酸殘基缺失、添加或替代的序列。該基因產(chǎn)物本身在融合序列中可含有導(dǎo)致沉默變化的氨基酸殘基的缺失、添加或替代，從而產(chǎn)生的融合蛋白是功能相等的?？筛鶕?jù)所涉及殘基的極性、帶電性、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性上的相似性，進(jìn)行這類氨基酸替代，這是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
可工程改造本發(fā)明的DNA序列以改變?nèi)诤暇幋a序列的不同端，包括但不限于本文中將更加詳細(xì)敘述的能修飾基因產(chǎn)物加工和表達(dá)的變化。例如，可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，即定點(diǎn)誘變，插入新的限制性位點(diǎn)，改變糖基化模式，磷酸化等，來(lái)導(dǎo)入突變。
在本發(fā)明一實(shí)施例中，可用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法全部或部分合成該融合蛋白的編碼序列(見例如，Caruther等，Crea和Horn，1980；Chow和Kempe，1981)。例如，可用固相技術(shù)合成這些分子的活性結(jié)構(gòu)域，從樹脂上切下，用制備性高效液相層析純化，然后化學(xué)連接形成嵌合蛋白(如見Creighton，1983，Proteins Structures和Molecular Principles，W.H.Freeman和Co.，N.Y.50-60頁(yè))。合成肽的組成可用氨基酸分析或測(cè)序證實(shí)(如，Edman degradation procedure；見Creighton，1983，Proteins Structures和Molecular Principles，W.H.Freeman和Co.，N.Y.34-49頁(yè))?；蛘?，將合成或重組方法產(chǎn)生的融合蛋白的兩部分，用該領(lǐng)域熟知的方法以化學(xué)接頭相偶聯(lián)(Brinkmann和Pastan，1994)。
為了表達(dá)具有生物活性的融合蛋白，可將編碼嵌合蛋白或功能等價(jià)物的核苷酸序列插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，即該載體含有能轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入編碼序列的必須元件，本文中另有更詳細(xì)描述。該融合基因產(chǎn)物，及經(jīng)重組融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系可用于各種目的，包括但不限于產(chǎn)生能結(jié)合該蛋白質(zhì)表位的抗體(如單克隆或多克隆)以促進(jìn)其純化。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，構(gòu)建含有融合蛋白編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體，，本文中另有更詳細(xì)描述。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)重組/基因重組。
可采用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)融合蛋白編碼序列，這些是本領(lǐng)域熟知的。
可能需要特異性起始信號(hào)來(lái)有效翻譯插入的融合蛋白編碼序列。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和毗鄰序列。當(dāng)整個(gè)融合基因，包括其自身起始密碼子和毗連序列被插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體時(shí)，可不需要其它翻譯控制信號(hào)。然而，當(dāng)融合蛋白編碼序列不包含自身起始密碼子時(shí)，必須提供含有ATG起始密碼子的外源性翻譯控制信號(hào)。另外，該起始密碼子必須位于該融合蛋白編碼序列的讀框中，以確保整個(gè)插入物的翻譯。此外源性翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以有各種來(lái)源，即天然的和合成的。通過(guò)加入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等可提高表達(dá)效率(見Bittner等，1987)。
定義和影響靶向融合基因產(chǎn)物的技術(shù)及基因靶向融合基因產(chǎn)物和基因術(shù)語(yǔ)“靶向融合基因產(chǎn)物”和“靶向融合物”本文用于指具有在所述融合物中，含至少一種抗血管生成組分和至少一種治療和/或診斷組分的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，其生物活性在于它們能執(zhí)行類似于其天然組分的至少一種活性，在某些實(shí)施例中，這二種組分能執(zhí)行類似于不同的天然二組分的活性。例如，它們能優(yōu)先執(zhí)行抗血管生成活性、促凋亡活性、抗細(xì)胞增殖活性、抗腫瘤活性和/或與產(chǎn)生的抗靶向融合基因產(chǎn)物至少一種組分的抗靶向融合抗體起交叉反應(yīng)的抗體活性。術(shù)語(yǔ)“靶向融合基因產(chǎn)物”包括靶向分子的同類物，其能顯示至少某些與天然靶向融合物共同的生物活性。此外，誘變領(lǐng)域技術(shù)人員知道尚未公開的或未發(fā)現(xiàn)的其它同類物，可用于構(gòu)建靶向融合同類物。
術(shù)語(yǔ)“靶向融合物的突變形式”指與編碼上述靶向融合基因產(chǎn)物至少一部分的DNA序列基本相同的任何DNA序列。該術(shù)語(yǔ)也指與這種DNA序列相容的RNA或反義序列?！鞍邢蛉诤匣颉币部珊杏嘘P(guān)控制序列的任何組合。
術(shù)語(yǔ)“基本上相同”當(dāng)用于明確靶向融合氨基酸序列或靶向融合核酸序列時(shí)，指具體對(duì)象序列，例如突變序列，雖與其各個(gè)組分的序列有一個(gè)或多個(gè)替代、缺失、添加或其組合的不同，但其基本作用仍保留了各個(gè)組分至少一部分的至少某些生物活性?；蛘撸绻?a)該DNA同類序列衍生自靶向融合基因編碼區(qū)的至少一部分；或(b)該DNA同類序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)所述的和編碼生物活性靶向融合物的DNA序列的至少一部分雜交；或(c)與(a)或(b)中所述DNA同類序列至少一部分遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性的DNA序列時(shí)，就說(shuō)該DNA同類序列是與上述特定DNA序列“基本相同”。基本上相同的同類蛋白質(zhì)，與天然蛋白質(zhì)組分相應(yīng)序列的相似性高于約80％。具有較低程度相似性但有相當(dāng)生物活性的序列認(rèn)為是等價(jià)物。在確定核酸序列時(shí)，能編碼基本上相似的氨基酸序列的所有對(duì)象核酸序列，均認(rèn)為與參比核酸序列相似，而不論密碼子序列中的差異。
相似性性百分率可通過(guò)例如采用購(gòu)自Wisconsin大學(xué)，Geneticist Computer Group的GAP計(jì)算機(jī)程序，比較序列信息來(lái)測(cè)定相似性百分率。GAP程序采用經(jīng)Smith et al.，1981修定的Needleman等，1970的排列對(duì)比方法。簡(jiǎn)而言之，GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為排列對(duì)比在兩個(gè)序列的短符號(hào)中，相似符號(hào)(即核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以符號(hào)的總數(shù)。GAP程序的優(yōu)選默認(rèn)參數(shù)包括(1)核苷酸的統(tǒng)一比較矩陣(包括相同值為1，不相同值為0)，和Gribskov等，1986的加權(quán)比較矩陣，見Schwartz等，1979；(2)一個(gè)空格罰分3.0，一個(gè)符號(hào)和一個(gè)空格增加0.01罰分；和(3)未端空格不罰分。
核酸序列在某些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及采用靶向性融合核酸、基因和基因產(chǎn)物，或相應(yīng)的蛋白、多肽或肽。術(shù)語(yǔ)“基本上相同于靶向融合物的序列”指該序列基本上對(duì)應(yīng)于靶向融合基因的至少一部分，但有相對(duì)較少的堿基或氨基酸(不論是DNA或蛋白質(zhì))與靶向融合物(或其生物功能等價(jià)物，當(dāng)指蛋白質(zhì)時(shí))不同。術(shù)語(yǔ)“生物功能等價(jià)物”是本領(lǐng)域熟知的，本文進(jìn)一步有詳細(xì)定義。因此，氨基酸序列具有約70％--80％；或更優(yōu)選81％--90％；或甚至更優(yōu)選約91％--99％之間是相同的，或與靶向融合物的氨基酸至少一部分功能上相等的序列，是“基本上相同的”序列。
本發(fā)明包括其序列至少一部分含有功能上相等的密碼子的靶向融合核酸。術(shù)語(yǔ)“功能上相等的密碼子”本文用于指編碼相同氨基酸的密碼子，如精氨酸或絲氨酸的6個(gè)密碼子，也指編碼生物學(xué)上相等氨基酸的密碼子(表1)。
氨基酸密碼子丙氨酸AlaAGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 CysCUGC UGU天冬氨酸 AspDGAC GAU谷氨酸GluEGAA GAG苯丙氨酸 PheFUUC UUU甘氨酸GlyGGGA GGC GGG GGU組氨酸HisHCAC CAU異亮氨酸 IleIAUA AUC AUU賴氨酸LysKAAA AAG亮氨酸LeuLUUA UUG CUA CUCCUGCUU甲硫氨酸 MetMAUG天冬酰胺 AsnNAAC AAU
氨基酸密碼子脯氨酸Pro P CCAAAAAAU谷氨酰胺 Gln Q CAACAG精氨酸Arg R AGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸Ser S AGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸Thr T ACAACCACGACU纈氨酸Val V GUAGUCGUGGUU色氨酸Trp W UGG酪氨酸Tyr Y UACUAU也已知道氨基酸和核酸序列可包含額外的殘基，如額外的N-或C-端氨基酸或5’或3’序列，仍然具有本文上述一種序列的基本性能，只要該序列符合上述的標(biāo)準(zhǔn)，包括在所述蛋白表達(dá)時(shí)保留了該蛋白質(zhì)的生物活性。具體可加在核酸序列上的未端序列，例如包含側(cè)接于該編碼區(qū)5’或3’部分的各種非編碼序列，或包含已知存在于基因中的各種內(nèi)部序列，即內(nèi)含子。
本發(fā)明還包括與本申請(qǐng)書所述序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的DNA區(qū)段的用途?！盎パa(bǔ)的”核酸序列是按照標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick互補(bǔ)法則堿基配對(duì)的那些序列。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”本文指，當(dāng)與上述相同的核苷酸作比較進(jìn)行評(píng)估時(shí)是基本上互補(bǔ)的，或能在上述相對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述核酸區(qū)段雜交的核酸序列。
生物功能等價(jià)物如上所述，可對(duì)偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑，如抗血管生成靶向融合物結(jié)構(gòu)中的至少一部分進(jìn)行修飾或變化，仍可獲得具有同樣或所需特性的分子。一具體實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，偶聯(lián)有治療或診斷制劑的血管生成抑制劑的范圍，包括連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域，或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域；或包括含有連接于治療性蛋白或多肽區(qū)域，或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的融合蛋白的編碼核酸。
例如，某些氨基酸可替代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸而不會(huì)顯著喪失活性。因?yàn)樵谠S多實(shí)施例中，正是蛋白質(zhì)的這種相互反應(yīng)能力和性質(zhì)確定了該蛋白質(zhì)的生物功能活性，可在蛋白質(zhì)序列(或，當(dāng)然可在其DNA編碼序列)中進(jìn)行某些氨基酸序列的替代，仍能獲得同樣性能的或甚至具有對(duì)抗性能的蛋白質(zhì)(如拮抗劑和激動(dòng)劑)。本發(fā)明人認(rèn)為，可在靶向融合蛋白或多肽(或其DNA上)序列的至少一部分中進(jìn)行各種變化，而不會(huì)顯著喪失它們的所需生物活性或用途。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還熟知生物功能等價(jià)蛋白質(zhì)或肽定義的本質(zhì)是如下的概念即可在該分子定義部分進(jìn)行變化的數(shù)目是有限制的，使之仍能產(chǎn)生具有可接受水平的相等生物活性的分子。因此生物功能相等的肽，本文定義為那些其中某些氨基酸，并非大多數(shù)或所有氨基酸被替代的肽。當(dāng)然，可不難制備多種含有不同替代的不同蛋白質(zhì)/肽，并用于本發(fā)明。
也熟知，某些殘基，如活性位點(diǎn)中的殘基，對(duì)蛋白質(zhì)或肽的生物或結(jié)構(gòu)性能顯得特別重要。這類殘基一般是不能互換的。
氨基酸替代，例如可用于修飾靶向融合物的替代，通常是根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性進(jìn)行的，例如它們的疏水性、親水性、所帶電荷、大小等。氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型分析揭示，精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶陽(yáng)電殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有通常相似的形狀。因此，根據(jù)這些考慮，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，定義為生物功能等價(jià)物。
在制造這類變化時(shí)，應(yīng)考慮氨基酸的親水性指數(shù)。各氨基酸根據(jù)它們的疏水性和帶電特征設(shè)定親水指數(shù)，即異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
氨基酸親水指數(shù)賦予蛋白質(zhì)相互反應(yīng)生物功能的重要性通常是本領(lǐng)域知道的(Kyte和Doolittle，1982，納入本文作參考)已知某些氨基酸可取代具有相似親水指數(shù)或評(píng)分的其它氨基酸，仍能保留相似的生物活性。根據(jù)親水性指數(shù)進(jìn)行變化，優(yōu)選親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸取代，在±1內(nèi)的那些取代特別優(yōu)選，在±0.5內(nèi)的那些取代甚至更特別優(yōu)選。
本領(lǐng)域也知道，可根據(jù)親水性有效進(jìn)行相似氨基酸的取代。美國(guó)專利No.4,554,101(納入本文作參考)說(shuō)明了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性受其毗鄰氨基酸親水性的影響，關(guān)系到其免疫原性和抗原性，即蛋白質(zhì)的生物性能。已知，一個(gè)氨基酸可取代另一個(gè)具有相似親水值的氨基酸，仍能獲得生物學(xué)上等同的蛋白質(zhì)。
如美國(guó)專利No.4,554,101中所詳述，為以下氨基酸殘基設(shè)定如下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±0.1)；谷氨酸(+3.0±0.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±0.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
根據(jù)相似的親水性值進(jìn)行變化時(shí)，優(yōu)選親水性值在±2內(nèi)的氨基酸取代，在±1內(nèi)的那些取代特別優(yōu)選，在±0.5內(nèi)的那些取代甚至更特別優(yōu)選。
雖然討論集中在因氨基酸變化產(chǎn)生的功能上相等的多肽上，將會(huì)理解這些變化可能受到編碼核酸變化的影響；還要考慮到遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，即二個(gè)或多個(gè)密碼子可編碼同一個(gè)氨基酸。
聯(lián)合治療為了提高偶聯(lián)有治療或診斷制劑的血管生成抑制劑，如抗血管生成靶向融合蛋白或編碼它們的表達(dá)構(gòu)建物的效率，可能需要將這些組合物與能有效治療血管生成相關(guān)疾病的其它制劑，如抗癌癥制劑聯(lián)用。例如，“抗癌癥制劑”能通過(guò)抑制癌細(xì)胞和/或組織的血管生成、殺傷癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度、減少轉(zhuǎn)移發(fā)生或數(shù)量、減少腫瘤體積、抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤或癌細(xì)胞的血供、促進(jìn)針對(duì)癌細(xì)胞的腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)、防止或抑制癌癥進(jìn)展或提高癌癥受試者壽命而負(fù)面影響受試者的癌瘤。更一般說(shuō)，這些其它組合物以有效殺傷或抑制細(xì)胞增殖的聯(lián)合劑量提供。此方法可能包括使細(xì)胞同時(shí)與表達(dá)構(gòu)建物和制劑或多種因素相接觸。這可通過(guò)使細(xì)胞與第一種組合物或包含二種制劑的藥物相接觸，或使細(xì)胞同時(shí)與不同的組合物或藥物接觸而實(shí)現(xiàn)，其中，第一種組合物含有表達(dá)構(gòu)建物，另一種含有第二種制劑。
腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療制劑的耐受性提出了臨床腫瘤學(xué)的主要問(wèn)題。當(dāng)前癌癥研究的一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)聯(lián)合化療和放療與基因治療，找到提高化療和放療療效的方法。例如，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)將單純皰疹病毒胸苷激酶(HS-tK)基因輸送到腦腫瘤中時(shí)，成功地誘導(dǎo)了對(duì)抗病毒劑更昔洛韋的易感性(Culver等，1992)。在本發(fā)明上下文中，考慮除其它促凋亡或細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑外，可將靶向融合基因治療，相似地與化療、放療或免疫治療干預(yù)結(jié)合起來(lái)應(yīng)用。
或者，此種組合療法可先于或后于其它藥物治療幾分鐘至幾星期。在其它藥物和表達(dá)構(gòu)建物分別施加于細(xì)胞的實(shí)施方式中，通?？杀ＷC在各次輸藥時(shí)間之間不會(huì)有顯著的失效期，這樣所述制劑和表達(dá)構(gòu)建物仍能發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的有益聯(lián)合作用。在此類例子中，考慮可使細(xì)胞在約12-24小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在約6-12小時(shí)內(nèi)，與二種藥物相互接觸。某些情況下，可能需要明顯延長(zhǎng)治療時(shí)間，然而各次給藥之間的失效時(shí)間是幾分鐘(2，3，4，5，6或7)至幾小時(shí)(1，2，3，4，5，6，7，或8)。在具體實(shí)施例中，可采用各種組合，基因療法是“A”，而另一種制劑，如化療、放療、手術(shù)或免疫治療是“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/B B/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A給予患者本發(fā)明的治療性表達(dá)構(gòu)建物，將按照給予化療藥物的通用方案，并考慮到載體的毒性，(如果有的話)。預(yù)計(jì)可按需要重復(fù)治療周期。也考慮各種標(biāo)準(zhǔn)療法及手術(shù)干預(yù)可與上述細(xì)胞過(guò)度增殖療法聯(lián)合應(yīng)用。
基于核酸的表達(dá)系統(tǒng)載體在一實(shí)施例中，靶向融合核酸包含在載體中。術(shù)語(yǔ)“載體”用于指運(yùn)載核酸的分子，可將核酸序列插入其中而導(dǎo)入細(xì)胞并能在細(xì)胞中復(fù)制。核酸序列可以是“外源性的”，意味著它對(duì)載體所導(dǎo)入的細(xì)胞是異物，或者此核酸序列與細(xì)胞中某序列同源但其在宿主細(xì)胞核酸中的位置是通常未見的。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒和植物病毒)和人造染色體(如YACs)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)(見Maniatis等，1988 Ausubel等，1994，二者內(nèi)容納入本文作參考)熟練地構(gòu)建載體。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指含有編碼能被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物至少一部分的核酸序列的載體。某些情況下這些序列不被翻譯，例如在產(chǎn)生反義分子或核酶情況下。表達(dá)載體可含有各種“控制序列”，指在特定宿主生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的、與編碼序列操作性相連接的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列外，載體和表達(dá)載體可包含具有其它功能和上述功能的核酸序列。
啟動(dòng)子和增強(qiáng)子“啟動(dòng)子”是一種位于核酸序列中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和控制轉(zhuǎn)錄速度區(qū)域的調(diào)控序列。它含有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和分子，如RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合的遺傳元件。短語(yǔ)“操作性位于”，“操作性連接于”，“在控制下”和“在轉(zhuǎn)錄控制下”指啟動(dòng)子在與核酸序列的關(guān)系中，處在正確的功能位置和/或取向，控制著轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和/或該核酸序列的表達(dá)。啟動(dòng)子可與或可不與“增強(qiáng)子”連接，增強(qiáng)子指參與核酸序列轉(zhuǎn)錄活化的順式作用調(diào)控序列。
啟動(dòng)子可以是天然與某基因或某序列相連的啟動(dòng)子，如可以通過(guò)分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而得到。這種啟動(dòng)子稱為“內(nèi)源性啟動(dòng)子”。相似地，增強(qiáng)子可以天然與某核酸序列相連或位于該序列下游或上游。另外，可通過(guò)將編碼核酸區(qū)段置于重組或異源性啟動(dòng)子的控制下而獲得某些好處，異源啟動(dòng)子指在天然情況下通常不與該核酸序列相連的啟動(dòng)子。重組或異源增強(qiáng)子也指在其天然情況下不與該核酸序列相連的增強(qiáng)子。這類啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可包括其它基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，從其它原核細(xì)胞、病毒或真核細(xì)胞分離得到的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，和“天然不產(chǎn)生的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的不同元件，和/或能改變表達(dá)的突變性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。除了用合成方法產(chǎn)生啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列外，可采用重組克隆技術(shù)和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)，包括PCRTM，與本文所述組合物連接，來(lái)產(chǎn)生這些序列(見美國(guó)專利4,683,202；5,928,906，分別納入本文作參考)。另外，考慮也可采用能指導(dǎo)核酸序列在核外細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體等中轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控序列。
當(dāng)然，重要的是采用能有效指導(dǎo)DNA區(qū)段在選擇用于表達(dá)的細(xì)胞、細(xì)胞器和生物體中表達(dá)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知道蛋白質(zhì)表達(dá)所用的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和細(xì)胞的類型，例如見Sambrook等(1989)，納入本文參考文獻(xiàn)。所用的啟動(dòng)子可以是組成型、組織特異性、可誘導(dǎo)性，和/或能在適當(dāng)條件下指導(dǎo)高水平表達(dá)導(dǎo)入的DNA區(qū)段，因而在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和/或肽時(shí)具有優(yōu)越性。啟動(dòng)子可以是異源的或內(nèi)源的。
在一具體實(shí)施例中，所用的啟動(dòng)子是組織特異性的和/或是患病組織(如癌)周圍微環(huán)境特異性的，細(xì)胞特異性的，或細(xì)胞類型特異性的。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明采用了2002.5.5提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No＿＿＿，題名為“BIPARTITE T-CELLFACTOR(TCF)-RESPONSIVE PROMOTER”和2003.5.5提交的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)Express Mail號(hào)EU 110397859US中所述的啟動(dòng)子，此二專利內(nèi)容納入本文作參考。
組織特異性啟動(dòng)子或元件的鑒定及其活性的特征分析試驗(yàn)是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。此類區(qū)域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等1999)、促生長(zhǎng)素抑制素受體2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠2(XI)膠原(Tsumaki等，1998)、DIA多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長(zhǎng)因子II(Wu等，1997)、人血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(Almendro等，1996)。
啟動(dòng)信號(hào)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)編碼序列的有效翻譯還可能需要特異性啟動(dòng)信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子或毗連序列?？赡苄枰峁┩庠葱苑g調(diào)控信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難確定這一點(diǎn)并提供必須的信號(hào)。已很好知道啟動(dòng)密碼子必須是“框內(nèi)”，即與所需編碼序列同處讀框內(nèi)以保證整個(gè)插入物的翻譯。外源性翻譯控制信號(hào)和啟動(dòng)密碼子可以是天然的或合成的。加入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件可提高表達(dá)率。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，采用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件來(lái)產(chǎn)生多個(gè)基因或多順?lè)醋有攀埂RES元件能繞過(guò)5’甲基化加帽(Cap)依賴性翻譯的核糖體掃描模式，在內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已報(bào)道了小RNA病毒家族二成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦脊髓炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，及哺乳動(dòng)物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可將IRES元件連接到異源性開放讀框內(nèi)。可一起轉(zhuǎn)錄各自被IRES分開的多個(gè)開放讀框，產(chǎn)生多順?lè)醋有攀?。借助IRES元件各開放讀框能進(jìn)入核糖體得到有效翻譯。采用一個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄一個(gè)信使，能有效表達(dá)多個(gè)基因(見美國(guó)專利5,925,565和5,935,819，納入本生長(zhǎng)作參考)。
多克隆位點(diǎn)載體可含有多個(gè)克隆位點(diǎn)(MCS)，該位點(diǎn)是含有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的核酸區(qū)域，可采用任一區(qū)域與標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)結(jié)合來(lái)消化該載體(見Carbonelli等，1999；Levenson等，1998；Cocea，1997，納入本文作參考)。“限制性酶消化”指采用只在核酸分子特定位置起作用的酶催化切割核酸分子。可從市場(chǎng)上購(gòu)買到許多這些限制性酶。這類酶的用途廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道。通常，采用能在MCS內(nèi)切割的限制性酶使載體線性化或片段化，以保證外源序列連接入該載體。“連接”指在兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵，二片段彼此可毗連或不毗連。涉及限制性酶和連接反應(yīng)的技術(shù)是重組技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
剪接位點(diǎn)大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子將經(jīng)歷RNA剪接去除原代轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子。含基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點(diǎn)，以確保轉(zhuǎn)錄物的正確加工而表達(dá)蛋白質(zhì)(見Chandler等，1997納入本文作參考)。
聚腺苷酸信號(hào)表達(dá)時(shí)，通常要有一聚腺苷酸信號(hào)來(lái)行使轉(zhuǎn)錄物的正確聚腺苷酸化。不認(rèn)為聚腺苷酸信號(hào)的性質(zhì)對(duì)成功實(shí)施本發(fā)明是關(guān)鍵性的，和/或可采用任何這類序列。優(yōu)選例包括SV40聚腺苷酸信號(hào)和/或牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸信號(hào)，能方便地和/或已知能在各種靶細(xì)胞中很好發(fā)揮功能的聚腺苷酸信號(hào)。還考慮可用采轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)作為表達(dá)盒中的元件。這些元件的作用是提高信使水平和/或盡量減少讀取盒中的其它序列。
復(fù)制起始位點(diǎn)為了在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增載體，其可含有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)(常稱為“ori”)此位點(diǎn)是一種能啟動(dòng)復(fù)制的特定核酸序列。此外，如果宿主細(xì)胞是酵母菌，可采用自主復(fù)制序列(ARS)。
可選擇性和可篩選性標(biāo)志本發(fā)明某些實(shí)施例中，可通過(guò)在表達(dá)載體中含有一標(biāo)志，而在體外或體內(nèi)鑒定含有本發(fā)明核酸結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。這種標(biāo)志可賦予細(xì)胞一種可鑒定的變化，有易于鑒定含有該表達(dá)載體的細(xì)胞。通常，可選擇標(biāo)志賦予的性能是可讓其被選擇出來(lái)的標(biāo)志。陽(yáng)性選擇標(biāo)志是存在此標(biāo)志時(shí)而得以選出的標(biāo)志，而陰性可選擇標(biāo)志是該標(biāo)志存在時(shí)阻止其選擇的標(biāo)志。陽(yáng)性可選擇標(biāo)志的一個(gè)例子是抗藥性標(biāo)志。
通常包含藥物選擇性標(biāo)志有助于轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如，能賦予對(duì)新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和組氨醇抗性的基因可用作可選擇標(biāo)志。除了能賦予表型而得以區(qū)分實(shí)施本發(fā)明而建立的轉(zhuǎn)化子的標(biāo)志外，也考慮其它類型的標(biāo)志，包括諸如基于比色分析的GFP等可篩選標(biāo)志。或者，可采用可篩選酶，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道可能在FACS分析時(shí)如何利用免疫標(biāo)志。不認(rèn)為所用標(biāo)志很重要，只要其能與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)被表達(dá)。可選擇和可篩選標(biāo)志的其它例子是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
宿主細(xì)胞術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”本文中可互換使用。所有這些術(shù)語(yǔ)也包括其子代，即任何和所有的后代。可理解所有子代由于故意或非故意的突變而不可能相同。在表達(dá)異源性核酸序列的段落中，“宿主細(xì)胞”指原核或真核細(xì)胞，包括能復(fù)制載體，和/或表達(dá)載體編碼的異源基因的任何可轉(zhuǎn)化生物體。宿主細(xì)胞可被用作載體的受體。宿主細(xì)胞可被“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”，指外源性核酸轉(zhuǎn)移到或?qū)氲剿拗骷?xì)胞中的過(guò)程。轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代目標(biāo)細(xì)胞及其子代。
宿主細(xì)胞可衍生自原核或真核細(xì)胞，取決于所需結(jié)果是該載體的復(fù)制，還是部分或全部表達(dá)載體編碼的核酸序列?？少?gòu)得許多細(xì)胞系和培養(yǎng)物用作宿主細(xì)胞，可從美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)獲得它們，ATCC是活培養(yǎng)物和基因材料擋案保管服務(wù)機(jī)構(gòu)(www.atcc.org)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)載體的骨架和需要的結(jié)果確定合適的宿主。例如，可將質(zhì)粒或粘粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞復(fù)制出許多載體?？捎米魉拗骷?xì)胞進(jìn)行載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)菌細(xì)胞包括DH5α，JM109和KC8，以及許多可從市場(chǎng)購(gòu)買到的細(xì)菌宿主，如SURE感受態(tài)細(xì)胞和SOLOPACKTMGOLD細(xì)胞(STRATAGENE，LaJolla)。另外，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌LE392可用作噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。
用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的真核宿主細(xì)胞包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本領(lǐng)域技術(shù)人員可購(gòu)得和知道各種細(xì)胞類型的許多宿主細(xì)胞。相似地，病毒載體可用于真核或原核宿主細(xì)胞，特別是允許載體復(fù)制或表達(dá)的那些細(xì)胞。
某些載體可采用使其能在原核和真核二種細(xì)胞中均能復(fù)制和/或表達(dá)的調(diào)控序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞維持它們并使載體復(fù)制的條件。也了解和知道大規(guī)模生產(chǎn)載體及生產(chǎn)載體編碼的核酸和它們的同源多肽、蛋白質(zhì)或肽的技術(shù)和條件。
表達(dá)系統(tǒng)已存在含有上述部分或所有組成的許多表達(dá)系統(tǒng)。原核和/或真核系統(tǒng)可用于本發(fā)明來(lái)產(chǎn)生核酸序列，或它們的同源多肽、蛋白質(zhì)和肽。許多這類系統(tǒng)可從市場(chǎng)購(gòu)得。
昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生高水平異源核酸區(qū)段的蛋白質(zhì)表達(dá)，見美國(guó)專利No.5,871,986；4,879,236所述，二者納入本文參考，可從INVITROGEN和BACPACKTMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM FROM CLONTECH，以MAXBAC2.0名稱買到。
表達(dá)系統(tǒng)的其它例子包括STATAGENE’s COMPLETE CONTROLTM的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其包括合成的蛻皮激素-可誘導(dǎo)受體，或其pET表達(dá)系統(tǒng)，一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)?？烧T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)例子可從INVITROGEN購(gòu)買到，它攜帶有T-REXTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)，一種采用全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。INVITROGEN也提供酵母菌表達(dá)系統(tǒng)，稱為畢赤嗜甲醇表達(dá)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)用于在嗜甲醇畢赤酵母菌中高水平生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣表達(dá)載體，如表達(dá)構(gòu)建物來(lái)生產(chǎn)核酸序列或其同源的多肽、蛋白質(zhì)或肽。
核酸遞送本發(fā)明諸方面的總體方法涉及上述組合物和/或治療劑，其提供含有編碼特定的和/或所需蛋白質(zhì)、多肽和肽的基因構(gòu)建物，從而允許這些蛋白質(zhì)發(fā)揮所需要的活性。本發(fā)明中，所需的蛋白質(zhì)、多肽或肽是含有血管生成抑制劑和治療或診斷序列的靶向融合物。雖然認(rèn)為該基因構(gòu)建物和/或蛋白質(zhì)可被直接輸送，但優(yōu)選實(shí)施方式包括向細(xì)胞提供特定和所需蛋白質(zhì)、多肽和肽的編碼核酸。這樣提供后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制能合成蛋白性組合物，及該表達(dá)構(gòu)建物可提供的任何組分。提供反義物、核酶和其它抑制劑時(shí)，優(yōu)選的方式也是向細(xì)胞提供編碼該構(gòu)建物的核酸。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，可將編碼該基因的核酸穩(wěn)定整合入細(xì)胞的基因組中。其它實(shí)施例中，此核酸可作為DNA的分離的游離體區(qū)段穩(wěn)定維持在細(xì)胞中。這類核酸區(qū)段和“游離體”編碼的序列在宿主細(xì)胞周期同步過(guò)程中，能充分保留和獨(dú)立復(fù)制。表達(dá)構(gòu)建物如何被輸送給細(xì)胞，和/或在細(xì)胞中核酸如何保留取決于所用的表達(dá)構(gòu)建物的類型。
利用病毒載體輸送DNA某些病毒能感染細(xì)胞并通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞整合到宿主細(xì)胞基因組中，和/或穩(wěn)定表達(dá)病毒基因，從而使它們成為外源基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物的有吸引力的候選者。本發(fā)明優(yōu)選的基因治療載體通常是病毒載體。
雖然某些病毒能接受異種遺傳物質(zhì)，但受到它們可容納的核苷酸數(shù)量的限制，和/或它們可感染的細(xì)胞范圍限制，已證明這些病毒成功地進(jìn)行了基因表達(dá)。然而，腺病毒不能將其遺傳物質(zhì)整合入宿主基因組中，和/或因而基因表達(dá)不需要宿主復(fù)制機(jī)制，使其非常適合快速有效的異源基因表達(dá)。制備復(fù)制缺陷性感染病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
當(dāng)然，采用病毒輸送系統(tǒng)，需要充分純化病毒粒子，使其基本上沒有不良污染物，如缺陷性干擾性病毒顆粒、內(nèi)毒素和其它熱原質(zhì)，從而不會(huì)在接受該載體構(gòu)建物的細(xì)胞、動(dòng)物和個(gè)體中引起任何不良反應(yīng)。純化載體的優(yōu)選方法包括采用浮力密度梯度離心，如氯化銫梯度離心。
腺病毒載體輸送表達(dá)構(gòu)建物的具體方法包括利用腺病毒表達(dá)載體。雖然已知腺病毒載體整合入基因組DNA的能力低，但這些載體賦予的高效基因轉(zhuǎn)移抵消了此缺點(diǎn)?！跋俨《颈磉_(dá)載體”意味著包括含有腺病毒序列的那些構(gòu)建物，能(a)支持該構(gòu)建物的包裝和/或(b)能最終克隆到其中的組織和/或細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)中表達(dá)。
該表達(dá)載體含有經(jīng)基因工程改造形式的腺病毒。已知腺病毒的基因組成是36kb的線性雙鏈DNA病毒，允許用長(zhǎng)達(dá)7kb的外源序列置換腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒感染宿主細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA能以游離體方式復(fù)制而無(wú)潛在的基因毒性。還有，腺病毒結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定。和/或大量擴(kuò)增后未測(cè)到基因組重排。
腺病毒特別適合用作基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，因?yàn)槠浠蚪M大小適中，易操作，滴度高，靶細(xì)胞范圍廣泛和/或感染力高。該病毒基因組二端含有100-200個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列(ITR)，它們是病毒DNA復(fù)制和/或包裝所必須的順式元件。其基因組的早期(E)和/或晚期(L)區(qū)域含有受病毒DNA復(fù)制驅(qū)動(dòng)的不同轉(zhuǎn)錄單位。其E1區(qū)(E1A和/或E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組和/或幾種細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。E2區(qū)(E2A和E2B)表達(dá)導(dǎo)致合成病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制、后期基因表達(dá)/或宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。后期基因的產(chǎn)物包括大多數(shù)病毒衣殼蛋白，只是在主要后期啟動(dòng)子(MLP)產(chǎn)生的一個(gè)原代轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)有效加工后才表達(dá)。在感染后期此MLP(位于16.8m.u.)特別有效，和/或此啟動(dòng)子產(chǎn)生的所有mRNA含有5’-三聯(lián)前導(dǎo)序列(TPL)，使它們能優(yōu)先翻譯mRNA。
在此系統(tǒng)中，通過(guò)穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生重組腺病毒。由于二個(gè)前病毒之間有可能重組，因此可產(chǎn)生野生型腺病毒。故從單一空斑分離單克隆病毒和/或檢測(cè)其基因組結(jié)構(gòu)很是重要。
產(chǎn)生和/或增殖復(fù)制缺陷性的此種腺病毒依賴于獨(dú)特的輔助細(xì)胞系，稱為293細(xì)胞，產(chǎn)生自身Ad5 DNA片段轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞，能組成性表達(dá)E1蛋白質(zhì)(E1A和/或E1B；Graham等，1977)，此腺病毒載體在293細(xì)胞幫助下能在E1區(qū)、D3區(qū)和二區(qū)中攜帶外源DNA(Graham和Prevec，1991)。最近已報(bào)道了在E4區(qū)中含有缺失的腺病毒載體(美國(guó)專利5,670,488，納入本文作參考)。
實(shí)際上腺病毒可包裝大約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)提供額外的大約2kbDNA容量。加上E1和/或E3區(qū)中可替代的大約5.5kbDNA，此腺病毒載體的最大容量在7.5kb，和/或該載體總長(zhǎng)的大約15％。該載體骨架中保留了80％以上的腺病毒基因組。
輔助細(xì)胞系可衍生自人細(xì)胞，如人胚腎細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞和其它人胚胎間充質(zhì)和上皮細(xì)胞。或者，輔助細(xì)胞可衍生自其它種類哺乳動(dòng)物的允許人腺病毒(生長(zhǎng))的細(xì)胞。這類細(xì)胞包括，如Vero細(xì)胞和其它猴胚胎間充質(zhì)和/或上皮細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。
最近，Racher等，(1995)公開了培養(yǎng)293細(xì)胞和/或增殖腺病毒3的改進(jìn)方法。一種方式中，通過(guò)在含100-200ml培養(yǎng)液的1升硅化旋轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge，UK)中接種單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成天然細(xì)胞集落。以40rpm攪拌后用臺(tái)酚蘭估計(jì)細(xì)胞活力。另一方式中，如下采用Fibra-Cel微載體(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。細(xì)胞接種重懸于5ml培養(yǎng)液中，加入到250ml Erlenmeyer瓶的載體(50ml)中，和/或靜置1-4小時(shí)，偶而攪動(dòng)。用50ml新鮮培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液和/或搖動(dòng)。為產(chǎn)生病毒，讓細(xì)胞生長(zhǎng)至80％鋪滿，然后更換培養(yǎng)液(至25％最終體積)和/或加入0.05MOI的腺病毒。培養(yǎng)物靜置過(guò)夜，然后體積增加到100％和/或再搖動(dòng)72小時(shí)。
除了要求腺病毒載體是復(fù)制缺陷型和至少是條件缺陷型的之外，不認(rèn)為腺病毒載體的性質(zhì)對(duì)成功實(shí)施本發(fā)明是關(guān)鍵性的。腺病毒可以是已知的42種不同血清型和A-F亞組中的任何一種。優(yōu)選亞組C的5型腺病毒作為起始材料，以獲得用于本發(fā)明的條件性復(fù)制缺陷型腺病毒載。這是因?yàn)?型腺病毒是人腺病毒，已知道其大量的生化和遺傳信息，并且歷史上其已被用于采用腺病毒作載體的大多數(shù)構(gòu)建物中。
如上所述，本發(fā)明典型的載體是復(fù)制缺陷型的、不含有腺病毒的E1區(qū)。因此最方便的是在E1編碼序列已被去除的部位導(dǎo)入轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)。然而，該結(jié)構(gòu)插入腺病毒序列中的部位對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵的?？扇鏚arlsson等，(1986)所述，將編碼感興趣基因的聚核苷酸插入E3取代載體中E3缺失區(qū)位置，輔助細(xì)胞系和輔助病毒則互補(bǔ)了E4缺失的E4區(qū)。
腺病毒的培養(yǎng)和/或操縱是該領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，其顯示體外和體內(nèi)有著廣泛的宿主范圍。使病毒可獲得高滴度，如每毫升109-1011空斑形成單位，它們具有高感染力。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒輸送的外源基因是游離體，因此對(duì)宿主細(xì)胞基因毒性低。接種野生型腺病毒的研究未見副作用報(bào)道(Couch等，1963；Top等，1971)，證明作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體它們是安全的和/或有治療潛力。
腺病毒載體已用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，動(dòng)物研究提示，重組腺病毒可用于基因治療(Straford-Perricaudet和Perricaudet，1991a；(Straford-Perricaudet等，1991b；Rich等，1993)。給予不同組織，包括氣管灌注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)和/或腦內(nèi)定位接種(Le Gal La Salle等，1993)。重組腺病毒和腺相關(guān)病毒(見下)能感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂性人原代細(xì)胞。
AAV載體腺相關(guān)病毒是用于本發(fā)明細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種有吸引力的載體系統(tǒng)，因?yàn)樗项l率高，可感染非分裂細(xì)胞，使其可將基因輸送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，例如組織培養(yǎng)物中(Muzyczka，1992)和體內(nèi)。AAV感染性具有廣泛宿主范圍(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。關(guān)于rAAV載體產(chǎn)生和用途的詳述見美國(guó)專利No.5,139,941和/或4,797,368，各自納入本文作參考。
證明AAV可用于基因輸送的研究包括LaFace等，(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；Walsh等(1994)。重組AAV載體已成功用于體外和/或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志基因(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1985；McLaughlin等，1988)和涉及人類疾病的基因(Flotte等，1992；Luo等，1994；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近AAV已批準(zhǔn)用于治療膀胱纖維變性的I期人試驗(yàn)。
AAV是一種依賴性細(xì)小病毒，需要另一種病毒(或是腺病毒或皰疹病毒家族某成員)共感染才能在培養(yǎng)細(xì)胞中經(jīng)歷產(chǎn)毒性感染(Muzyczka，1992)。缺少輔助病毒共感染時(shí)，野生型AAV基因組通過(guò)其兩未端整合入人染色體19中，在那兒以潛伏狀態(tài)作為前病毒居留(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。然而，rAAV整合不限于染色體19，除非AAV的Rep蛋白也表達(dá)(Shelling和Smith，1994)。當(dāng)攜帶AAV前病毒的細(xì)胞加上輔助病毒感染時(shí)，可從該染色體和從重組質(zhì)粒中“拯救”了AAV基因組，和/或建立正常的產(chǎn)毒性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。
通常，通過(guò)共轉(zhuǎn)染含有側(cè)接二個(gè)AAV末端重復(fù)序列的感興趣基因的質(zhì)粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；各自納入本文作參考)和/或含有野生型AAV編碼序列而無(wú)末端重復(fù)序列的質(zhì)粒，如Pim45(mCcARTY等，1991；納入本文作參考)。也用腺病毒和和攜帶AAV輔助功能所需腺病毒基因的質(zhì)粒感染和轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以此種方式制備的rAAV病毒貯藏液污染有腺病毒，必須用物理方法與rAAV顆粒分離(例如氯化銫密度離心)?；蛘撸刹捎煤珹AV編碼區(qū)的腺病毒載體和含AAV編碼區(qū)及某些和所有腺病毒輔助基因的細(xì)胞系(Yang等，1994；Clark等，1995)。也可采用攜帶rAAV DNA作為整合前病毒的細(xì)胞系(Flotte等，1995)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因輸送載體具有應(yīng)用前景，因?yàn)樗鼈兡軐⑵浠蛘先胨拗骰蚪M中，而轉(zhuǎn)運(yùn)大量的外源性遺傳物質(zhì)，能感染廣譜的物種和細(xì)胞類型，并被包裝在特定的細(xì)胞系中(Miller，1992)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，特征是能通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程在感染細(xì)胞中將其RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA(Coffin，1990)。產(chǎn)生的DNA然后穩(wěn)定整合入細(xì)胞染色體中成為前病毒，和/或指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。整合導(dǎo)致在受體細(xì)胞和/或其后代中保留該病毒的基因序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有分別編碼衣殼蛋白質(zhì)、聚合酶和包膜組分的三個(gè)基因gag，pol和/或env。Gag基因上游的序列含有基因組包裝到病毒粒子中的信號(hào)。這些病毒含有的強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子也是整合入宿主細(xì)胞基因組所需要的(Coffin，1990)。
為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼感興趣基因的核酸插入病毒基因組某些病毒序列處產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。為了產(chǎn)生病毒粒子，需構(gòu)建含gag，pol和env基因但無(wú)LTR的包裝細(xì)胞系和包裝組分(Mann等，1983)。當(dāng)將含cDNA的重組質(zhì)粒，與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起導(dǎo)入(例如通過(guò)磷酸鈣沉淀)此細(xì)胞系中時(shí)，包裝序列能使重組質(zhì)粒進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄并被包裝成為病毒顆粒，然后分泌到培養(yǎng)液中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)液，任選地濃縮，用于基因轉(zhuǎn)運(yùn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染廣泛的各種細(xì)胞類型。然而，其整合和/或穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞分裂(Paskind等，1975)。
與采用缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有關(guān)的是可能在包裝細(xì)胞中出現(xiàn)野生型復(fù)制活性病毒。這可能是由于gag，pol env序列上游重組病毒插入物的完整序列整合入宿主細(xì)胞基因組中所致。然而，現(xiàn)已有新的包裝細(xì)胞系可大大減少重組的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
已報(bào)道了采用第二代逆轉(zhuǎn)錄病毒載體輸送基因。Kasahara等(1994)制備了莫洛尼小鼠白血病病毒的工程改造變體，只能正常感染小鼠細(xì)胞，其包膜蛋白經(jīng)過(guò)修飾，故該病毒能特異性結(jié)合和感染攜帶有紅細(xì)胞生成素(EPO)受體的人細(xì)胞。這一點(diǎn)是通過(guò)將EPO序列的一部分插入包膜蛋白中產(chǎn)生具有新結(jié)合特性的嵌合蛋白而實(shí)現(xiàn)的。
用于本發(fā)明的具體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括慢病毒和Indiana水皰性口炎病毒。
其它病毒載體可采用其它病毒地載體作為本發(fā)明中的表達(dá)構(gòu)建物?？刹捎醚苌圆《荆缍幻绮《?Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、仙臺(tái)病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒的載體。對(duì)于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞它們可賦予幾種有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
隨著最近發(fā)現(xiàn)的缺陷型乙肝病毒，對(duì)于不同病毒序列的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系有了新的觀點(diǎn)。體外研究顯示，該病毒盡管其基因組缺失了80％以上，仍可保留輔助-依賴性包裝和逆轉(zhuǎn)錄能力(Horwich等，1990)。這提示，其基因組的大部分可用外源遺傳物質(zhì)替代。Chang等最近將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喴腋尾《净蚪M的聚合酶、表面和/或pre-表面抗原編碼序列位置。將其與野生型病毒共轉(zhuǎn)染入禽肝癌細(xì)胞系中。用含有高滴度重組病毒的培養(yǎng)液感染了原代鴨肝細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后至少24天中測(cè)到CAT基因的穩(wěn)定表達(dá)。
某些其它實(shí)施例中，基因療法的載體是HSV。使HSV成為有吸引力的載體的因素是其基因組的大小和組成。因?yàn)镠SV大，與其它較小病毒系統(tǒng)相比，加入多個(gè)基因和表達(dá)盒不成問(wèn)題。此外，可得到具有不同性能(溫度、強(qiáng)度等)的不同病毒控制序列，使其比其它系統(tǒng)能在更大程度上控制表達(dá)。還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該病毒具有較少剪接的信使，易于基因操作。HSV也較易操縱和/或可高滴度生長(zhǎng)。因此就獲得足夠MOI所需體積和重復(fù)劑量需要較少而言，輸送問(wèn)題不大。
修飾的病毒本發(fā)明其它實(shí)施例中，待輸送的核酸包含在經(jīng)基因工程改造能表達(dá)特異性結(jié)合配體的感染性病毒中。因而該病毒顆粒能特異性結(jié)合靶細(xì)胞的同源受體，將其組分輸送給細(xì)胞。依靠在病毒包膜上化學(xué)加入乳糖殘基化學(xué)修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒，最近設(shè)計(jì)開發(fā)了特異性靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的新方法。此種修飾可使該病毒通過(guò)唾液酸糖蛋白受體感染肝細(xì)胞。
設(shè)計(jì)了使重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向的另一種方法，是采用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和/或抗特異性細(xì)胞受體的生物素化抗體。該抗體用鏈霉親和素經(jīng)生物素組分偶聯(lián)(Roux等，1989)。采用抗主要組織相容性復(fù)合體I類和II類的抗體，他們證明可體外用親嗜性病毒感染各種帶有這些表面抗原的人細(xì)胞(Roux等，1989)。
DNA輸送的其它方法本發(fā)明的不同實(shí)施例中，將DNA作為表達(dá)構(gòu)建物輸送給細(xì)胞。為了有效表達(dá)基因構(gòu)建物，必須將該表達(dá)構(gòu)建物輸送給細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輸送方法是通過(guò)病毒感染，其中表達(dá)構(gòu)建物包含在感染性病毒顆粒中。然而，本發(fā)明也考慮用幾種非病毒方法轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)構(gòu)建物到細(xì)胞中。本發(fā)明一實(shí)施例中，表達(dá)構(gòu)建物只由裸露重組DNA和/或質(zhì)粒組成。該構(gòu)建物的轉(zhuǎn)運(yùn)可采用物理和/或化學(xué)方法透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行。如下所述這些方法的一些可成功采納用于體內(nèi)和/或活體內(nèi)。
脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染本發(fā)明另一實(shí)施例中，可將表達(dá)構(gòu)建物包裹在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是以磷脂雙層膜和/或內(nèi)部水性介質(zhì)為特征的囊泡性結(jié)構(gòu)。多室脂質(zhì)體具有被水性介質(zhì)分隔的多層脂質(zhì)層。當(dāng)將磷脂懸浮在過(guò)量水溶液中時(shí)可自發(fā)性形成脂質(zhì)體。在形成封閉結(jié)構(gòu)和/或包裹水份和/或?qū)⑷苜|(zhì)溶解在脂質(zhì)雙層間之前，脂成分經(jīng)歷了自身重排(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考慮表達(dá)構(gòu)建物與脂轉(zhuǎn)染胺(Lipofectamine，Gibco BRL)的復(fù)合物。脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸輸送和外源DNA的體外表達(dá)已非常成功(Nicolan和SENS，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)證明了在培養(yǎng)的雞胚、Hela和肝癌細(xì)胞中脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源DNA輸送和/或表達(dá)的可行性。
本發(fā)明某些實(shí)施例中，可將脂質(zhì)體與血凝性病毒(HVJ)組成復(fù)合物，顯示促進(jìn)了與細(xì)胞膜的融合和/或促進(jìn)了脂質(zhì)體包裹DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。本發(fā)明其它實(shí)施例中，將脂質(zhì)體與核內(nèi)非組蛋白性染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用(Kato等，1991)。其它實(shí)施例中，將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-1二者復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用。其它實(shí)施例中，輸送載體可包含配體和脂質(zhì)體。當(dāng)在DNA構(gòu)建物中采用細(xì)菌啟動(dòng)子時(shí)，也需要將合適的細(xì)菌聚合酶包含在脂質(zhì)體中。
本發(fā)明人考慮可將neu-抑制性基因產(chǎn)物用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入細(xì)胞。Nabel等(1990)提出，可將這類構(gòu)建物與脂質(zhì)體偶聯(lián)，通過(guò)導(dǎo)管直接導(dǎo)入。采用這些方法，neu-抑制性基因產(chǎn)物可在體內(nèi)特定部位有效表達(dá)，不只是在靜脈注射可抵達(dá)的肝、脾細(xì)胞中表達(dá)。因此，本發(fā)明還包含neu-抑制基因產(chǎn)物編碼DNA構(gòu)建物的組合物(配制成DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物)，和使用這種構(gòu)建物的方法。
如美國(guó)專利No.5,641,484所述，脂質(zhì)體特別適合治療HER2/neu介導(dǎo)的癌癥。
脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體的制備可用Gao等(1991)的方法制備動(dòng)物細(xì)胞靶向融合物的有效轉(zhuǎn)染試劑陽(yáng)離子脂質(zhì)體。Gao等描述了一步合成的新的陽(yáng)離子膽固醇衍生物。據(jù)報(bào)道此種脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體用于轉(zhuǎn)染更有效，對(duì)處理細(xì)胞的毒性比用Lipofectin試劑制備的低。這些脂質(zhì)是DC-Chol(“3’(N-(N’N’-二甲基胺乙烷)-氨甲酰膽固醇”)和DOPE(“二油酰磷酯酰乙醇胺”)。生產(chǎn)這些脂質(zhì)體的步驟如下。
通過(guò)簡(jiǎn)單的膽甾烯基氯甲酸酯和N，N-二甲基乙烯二胺反應(yīng)合成DC-Chol。將膽甾烯基氯甲酸酯溶液(2.25g，5mmol，用無(wú)水氯仿配)0℃逐滴加入到過(guò)量N，N-二甲基乙烯二胺的溶液(2ml，18.2mmol，溶于3ml無(wú)水氯仿)中。蒸發(fā)除去溶劑后，4℃在無(wú)水乙醇中重結(jié)晶純化殘留物，真空干燥。產(chǎn)品是白色DC-Chol粉末。
在氯仿中混合1.2μmol DC-Chol和8.0μmol DOPE制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體。干燥該混合物，真空干燥，在一試管中重懸于1ml stero 20mM Hepes緩沖液(pH7.8)中。4℃水合24小時(shí)后，超聲波儀超聲分散5-10分鐘，形成平均直徑150-200nm的脂質(zhì)體。
制備脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，發(fā)明人采用如下步驟。將待轉(zhuǎn)染的DNA放在DMEM/F12培養(yǎng)液中，比例為15μg DNA比50μl DMEM/F12。用DMEM/F12稀釋DC-Chol/DOPE脂質(zhì)體混合物至50μl DMEM/F12比100μl脂質(zhì)體。然后輕輕混合DNA稀釋液和脂質(zhì)體稀釋液，37℃培育10分鐘。培育后DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物易于注射。
可通過(guò)含有，例如磷酯酰膽堿(PC)、磷酯酰絲氨酸(PS)、膽固醇(Chol)、氯化N-[1-2，3-二油酰基丙基]-N，N-三甲胺(DOTMA)、二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)和/或者說(shuō)β-[N-(N’N’-二甲基胺乙烷]氨甲?；懝檀?DC-Chol)，及該技術(shù)人員所知的其它脂類組成的脂質(zhì)體進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。該領(lǐng)域技術(shù)員知道有各種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)可用于本發(fā)明。這些技術(shù)中有Nicolau等，1987；Nabel等，1990和Gao等，1991所述的那些。在一具體實(shí)施例中，脂質(zhì)體含有DC-Chol。更具體說(shuō)，在優(yōu)選實(shí)施例章節(jié)中發(fā)明人的脂質(zhì)體含有按照Gao等(1991)所說(shuō)制備的DC-Chol和DOPE。發(fā)明人還預(yù)備使用含DOTMA的脂質(zhì)體，其可從San Diego，Calif.的Vical，Inc.，以商標(biāo)名LipofectinTM購(gòu)買到。
可用各種方法將脂質(zhì)體導(dǎo)入與細(xì)胞接觸。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可簡(jiǎn)單地將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物分散加入在細(xì)胞培養(yǎng)液中。體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，通常注射脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。靜脈注射可使脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到例如肝和脾。為了讓DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入通過(guò)靜脈注射不能進(jìn)入的細(xì)胞，可將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物直接注射到動(dòng)物機(jī)體中的特定部位。例如，通過(guò)導(dǎo)管注射入主動(dòng)脈壁。其它例子中，發(fā)明人采用腹膜內(nèi)注射使基因轉(zhuǎn)運(yùn)到小鼠中。
制備脂質(zhì)體復(fù)合物所用的脂質(zhì)可以是上述脂質(zhì)。具體說(shuō)，DOTMA、DOPE和/或DC-Chol可構(gòu)成脂質(zhì)體復(fù)合物的全部或一部分。發(fā)明人特別成功的是用含有DC-Chol的復(fù)合物。在優(yōu)選實(shí)施例中，脂質(zhì)將含有DC-Chol和DOPE。雖然預(yù)計(jì)任何比例的DC-Chol與DOPE都可用，但預(yù)計(jì)所含DC-Chol與DOPE的比例在1∶20和2∶1的脂質(zhì)特別優(yōu)異。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)約1∶10-1∶5比例的DC-Chol∶DOPE制備的脂質(zhì)體有用。
在一具體實(shí)施例中，采用能提高靶向融合物在細(xì)胞核中保留所需的最小區(qū)域，這樣不會(huì)在接受靶向融合基因構(gòu)建物的細(xì)胞中導(dǎo)入不需要的DNA。該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，如限制性酶切，將能產(chǎn)生靶向融合物的小區(qū)域。這些區(qū)域抑制neu的能力不難通過(guò)實(shí)施例中所述試驗(yàn)測(cè)定。
本發(fā)明某些實(shí)施例中，將脂質(zhì)體與血凝性病毒(HVJ)組成復(fù)合物，顯示能促進(jìn)與細(xì)胞膜的融合和促進(jìn)脂質(zhì)體包裹的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。其它實(shí)施例中，將脂質(zhì)體與核內(nèi)非組蛋白性染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用(Kato等，1991)。還有其它實(shí)施例中，將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-1二者復(fù)合和/或結(jié)合運(yùn)用。這類表達(dá)構(gòu)建物已成功用于在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)核酸，它們也適合于本發(fā)明。當(dāng)在DNA構(gòu)建物中采用細(xì)菌啟動(dòng)子時(shí)，還需要將合適的細(xì)菌聚合酶包含在脂質(zhì)體中。
通過(guò)含靶向融合物的脂質(zhì)體體內(nèi)治療癌癥根據(jù)以上提供的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可用至少一種靶向融合物處理任何細(xì)胞，在具體實(shí)施例中，任何癌細(xì)胞都可這樣處理。例如，在某些實(shí)施例中，被處理的細(xì)胞分別是HER2/neu-陽(yáng)性或HER2/neu-陰性。
其內(nèi)容納入本文作參考的美國(guó)專利No.5,641,484說(shuō)，可采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的直接基因轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)來(lái)獲得對(duì)活的宿主中HER2/neu-過(guò)度表達(dá)的人癌細(xì)胞的抑制。其所述實(shí)施方案如下。給雌性裸小鼠(5-6周齡)腹腔內(nèi)SK-OV-3細(xì)胞(2×106/100μl)。SK-OV-3細(xì)胞是人卵巢癌細(xì)胞能在裸鼠腹腔中生長(zhǎng)。5天后，給小鼠腹腔注射各種化合物。某些小鼠只注射治療性DNA，某些注射按上述方法制備的脂質(zhì)體/治療性DNA復(fù)合物，所述小鼠注射200μl所述化合物。首次注射后，在小鼠活著期間每7天重復(fù)注射。
上述結(jié)果表明脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)可抑制HER2/neu-過(guò)度表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，預(yù)計(jì)脂質(zhì)體介導(dǎo)的靶向融合物基因療法通過(guò)將靶向融合物直接靶向HER2/neu-癌基因，可作為HER2/neu-過(guò)度表達(dá)的人卵巢癌的強(qiáng)力治療制劑。
用靶向融合物脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染治療人的疾病根據(jù)美國(guó)專利No.5,641,484所述的動(dòng)物體內(nèi)研究結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解和預(yù)計(jì)有極大的可能采用抗血管生成靶向融合物與脂質(zhì)體的復(fù)合物，來(lái)治療HER2/neu-介導(dǎo)的癌癥。認(rèn)為臨床研究可證明這些效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道直接確定采用靶向融合物抑制癌癥的最好治療方案。這在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中不是常規(guī)實(shí)施的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題而是優(yōu)化問(wèn)題。裸鼠的體內(nèi)研究提供了開始優(yōu)化劑量和輸送方案的起始點(diǎn)。注射次數(shù)開始是一周一次，如美國(guó)專利No.5,641,484所述小鼠研究那樣做。然而，注射次數(shù)可調(diào)整優(yōu)化，從一天到每隔二周，每月一次，取決于初步臨床試驗(yàn)的結(jié)果和特殊患者的需要。人的劑量最初可從小鼠所用靶向融合物的量推測(cè)確定，約每50克體重15μg質(zhì)粒DNA。據(jù)此，50kg的婦女每劑需要用15mgDNA治療。當(dāng)然，此劑量可上調(diào)或下調(diào)，如這類方案常規(guī)那樣，取決于初步臨床試驗(yàn)的結(jié)果和特殊患者的需要。預(yù)計(jì)這些臨床試驗(yàn)將證明靶向融合物治療人HER2/neu-過(guò)度表達(dá)癌癥的用途。劑量和頻率方案最初可根據(jù)動(dòng)物體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)，如該領(lǐng)域經(jīng)常做的那樣。
電穿孔本發(fā)明某些實(shí)施例中，通過(guò)電穿孔將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞中。電穿孔包括將細(xì)胞和/或DNA懸液暴露于高壓放電。
采用電穿孔轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞已相當(dāng)成功。以此方式已采用人免疫球蛋白κ基因轉(zhuǎn)染了小鼠前B淋巴細(xì)胞(Potter等，1984)和用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染了大鼠肝細(xì)胞(Tur-Kaspa等，1986)。
磷酸鈣和DEAE-葡聚糖本發(fā)明其它實(shí)施例中，采用磷酸鈣沉淀將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。已用此技術(shù)以腺病毒5型DNA轉(zhuǎn)染了人KB細(xì)胞(Graham和Van Der Eb，1973)。還以此方式用新霉素標(biāo)志基因轉(zhuǎn)染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NTH3T3和/或Hela細(xì)胞(Chen和Okayama，1987)，用各種標(biāo)志基因轉(zhuǎn)染了大鼠肝細(xì)胞(Rippe等，1990)。
另一實(shí)施例中，采用DEAE-葡聚糖然后用聚乙二醇將表達(dá)構(gòu)建物輸送給細(xì)胞。以此方式將報(bào)告質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠骨髓瘤和/或紅白血病細(xì)胞(Gopal，1985)。
粒子轟擊技術(shù)本發(fā)明另一實(shí)施例將裸DNA表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞涉及顆子轟擊技術(shù)。此方法依靠加速包被DNA的微粒到高速使微粒穿過(guò)細(xì)胞膜和/或進(jìn)入細(xì)胞而不殺傷它們(Klein等，1987)。已開發(fā)了加速小粒子的幾種裝置。一種裝置依靠高壓電產(chǎn)生的電流進(jìn)而提供運(yùn)動(dòng)力(Yang等，1990)。所用微粒由生物學(xué)橢性物質(zhì)如鎢和金珠組成。
本發(fā)明其它實(shí)施例包括用直接微粒加載和/或超聲加載導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建物。已采用直接微粒將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入蟾蜍卵母細(xì)胞(Harland和Weintraub，1985)，和/或通過(guò)超聲加載用胸苷激酶基因園子染了LTK-成纖維細(xì)胞(Fechheimer等，1987)。
腺病毒輔助轉(zhuǎn)染本發(fā)明某些實(shí)施例中，采用腺病毒輔助的轉(zhuǎn)染將表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。據(jù)報(bào)道采用腺病毒偶聯(lián)系統(tǒng)提高了轉(zhuǎn)染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotton等，1994)。
藥物制備本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的一種或多種形式的血管生成抑制劑，如溶于或分散于藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑中的抗血管生成靶向融合物和/或其它制劑。短語(yǔ)“藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的”指當(dāng)給予動(dòng)物，例如人(適當(dāng)時(shí))，不會(huì)產(chǎn)生副作用、過(guò)敏或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文所公開的內(nèi)容，知道含有至少一種靶向融合物形式或其它活性成分的藥學(xué)組合物的制備方法，例如見Remington的Pharmaceutical Scinces，第18版，Mack Printing Company，1990，納入本文參考文獻(xiàn)。另外，對(duì)于動(dòng)物(如人)給藥，應(yīng)知道制品應(yīng)符合FDA公署生物標(biāo)準(zhǔn)要求的無(wú)菌、無(wú)熱原，總體安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”本文用于包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑，抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩劑、鹽類、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、增甜劑、調(diào)味劑、染料等物質(zhì)和它們的組合，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的(見例如，Remington的Pharmaceutical Scinces，第18版，Mack Printing Company，1990，1289-1329頁(yè)，納入本文參考文獻(xiàn))。除了與活性成分不相容的常規(guī)運(yùn)載體外，認(rèn)為均可用于治療或藥學(xué)組合物中。
所述靶向融合物形式可含不同類型的運(yùn)載體，取決于給藥途徑如注射是否要以固體、液體或氣溶膠形式給藥，是否需要除菌。本發(fā)明組合物可通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、膀胱內(nèi)、粘膜、心包內(nèi)、口服、局部、采用氣溶膠、注射、輸液、持續(xù)輸液、局部灌注直接浸浴靶細(xì)胞、通過(guò)導(dǎo)管、通過(guò)灌洗、配制在霜膏中、在脂質(zhì)組合物(如脂質(zhì)體)中或通過(guò)該領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的其它方法或上述方法的任何組合給予(見例如，Remington的Pharmaceutical Scinces，第18版，Mack Printing Company，1990，納入本文參考文獻(xiàn))。
給予患病動(dòng)物本發(fā)明組合物的確切劑量由物理和生理因素，如體重、疾病嚴(yán)重性、待治療疾病的類型、原有和共同的治療措施、受試者的特發(fā)病和給藥途徑所決定。負(fù)責(zé)給藥的醫(yī)生將決定組合物中活性成分的濃度和受試者個(gè)體的適合劑量。
某些實(shí)施例中，藥物組合物可含有，例如至少約0.1％的活性成分。其它實(shí)施例中，該活性成分含有重量單位的約2％-75％，或約25％-60％，及例如可從其中推斷出的任何范圍。其它非限制性例子中，每次給藥的一個(gè)劑量也可含約1μg/kg/體重，約5μg/kg/體重，約10μg/kg/體重，約50μg/kg/體重，約100μg/kg/體重，約200μg/kg/體重，約350μg/kg/體重，約500μg/kg/體重，約1mg/kg/體重，約5mg/kg/體重，約10mg/kg/體重，約50mg/kg/體重，約100mg/kg/體重，約200mg/kg/體重，約350mg/kg/體重，約500mg/kg/體重，約1000mg/kg/體重，或更多，和可從其中推斷出的任何范圍?？蓮纳狭袛?shù)字推斷出的范圍的非限制性例子中，可根據(jù)上述數(shù)字給予約5mg/kg/體重-100mg/kg/體重，約5μg/kg/體重-約500mg/kg/體重等。
無(wú)論如何，該組合物可含有各種抗氧化劑以防止一種或多種萬(wàn)分的氧化。此外可用防腐劑，如各種抗菌和抗真菌劑包括對(duì)羥基苯丙酸酯(如甲基對(duì)羥基苯丙酸酯、丙基對(duì)羥基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。
該靶向融合物形式可配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，如與蛋白質(zhì)組分的游離氨基形成的鹽，或與無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、磷酸，或有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無(wú)機(jī)堿，如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵；或有機(jī)堿如異丙胺、三甲基胺、組胺或普魯卡因。
在該組合物是液體形式的實(shí)施例中，運(yùn)載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有但不限于水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、脂質(zhì)(如甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)和它們的組合。例如，可通過(guò)采用包衣如卵磷酯；通過(guò)用運(yùn)載體如液體多元醇或脂分散維持所需顆粒大??；用表面活性劑如羥丙基纖維素；或這些方法的組合來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑如糖、氯化鈉或其組合。
其它實(shí)施例中，本發(fā)明可采用滴眼劑、滴鼻液或噴霧、氣溶膠或吸入劑。通常將這類組合物設(shè)計(jì)成與靶組織類型相容。一非限制性例子中，滴鼻液常設(shè)計(jì)成以液滴或噴霧形式給予鼻通道的水溶液。制備的滴鼻液在許多工作方面類似于鼻分泌液，從而可維持正常的纖毛運(yùn)動(dòng)。優(yōu)選實(shí)例中，滴鼻水溶液通常等滲或輕度緩沖維持pH約5.5-6.5。此外，類似于眼科制品的抗微生物防腐劑、藥物或適合的藥物穩(wěn)定劑，如需要可包含有配方中。例如，各種已知的商品化滴鼻制品，包括抗菌素或抗組胺藥。
某些實(shí)施例中，制備通過(guò)口服消化途徑給予的靶向融合物形式。這些實(shí)施例中，固體組合物可含有，例如溶液、懸浮液、乳液、片劑、藥丸、膠囊(如硬或軟衣殼明膠膠囊)、緩釋制劑、口頰吸收組合物、栓劑、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑或它們的組合?？诜M合物可直接加到飲食中?？诜o藥的優(yōu)選運(yùn)載體包括橢性稀釋劑、可同化食用運(yùn)載體或它們的組合。本發(fā)明其它方面?？蓪⒖诜M合物制成糖漿或酏劑。糖漿或酏劑可含有，例如至少一種活性制劑、增甜劑、防腐劑、芳香劑、染色劑、防腐劑功它們的組合。
在某些優(yōu)選實(shí)施例中，口服組合物可含有一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑和它們的組合。某些實(shí)施例中，此組合物可含有以下一種或多種種物質(zhì)粘合劑如西黃嗜膠、阿拉伯膠、谷物淀粉、明膠或其組合；賦形劑如磷酸二鈣、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組合；崩解劑如谷物淀粉、土豆淀粉、海藻酸或其組合；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；增甜劑如蔗糖、乳糖、糖精或其組合；芳香劑如薄荷、冬青油、櫻桃香精、橙子香精等；或上述物質(zhì)的組合。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上述類型物質(zhì)外可含有運(yùn)載體如液體運(yùn)載體。可存在各種其它物質(zhì)如包衣劑或可修飾劑量單位的物理形式。例如藥片、藥丸，或可用蟲膠、糖或二者包裹膠囊。
適合于其它給藥方式的其它制劑包括栓劑。栓劑是重量和形狀不同的固體劑量形式，醫(yī)學(xué)上常用于插入直腸、陰道或尿道。插入后，糖錠變軟，融化或溶于體腔液體中。通常對(duì)于栓劑，傳統(tǒng)的運(yùn)載體包括例如聚亞烷基二醇、甘油三脂或其組合。某些實(shí)施例中，栓劑可由含有約0.5％--10％，優(yōu)選約1％--2％范圍活性成分的混合物組成。
滅菌可注射溶液通過(guò)在適當(dāng)溶劑中加入所需量的活性組分與上述各種其它成分，然后按需要過(guò)濾除菌而配制。通常在含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和/或其它萬(wàn)分的無(wú)菌運(yùn)載體中，加入不同的除菌活性成分配成分散設(shè)計(jì)師。配制滅菌注射液、懸浮液或乳液用的滅菌粉劑時(shí)，優(yōu)選的配制方法是真空干燥或凍干技術(shù)，可從事先過(guò)濾除菌的液體介質(zhì)產(chǎn)生活性成分加上其它所需成分的粉末。如需要液體介質(zhì)應(yīng)適當(dāng)緩沖，注射前該液體稀釋液先用足夠的鹽或葡萄糖做成等滲。也考慮制備供直接注射的高濃度組合物制品，考慮用DMSO作為溶劑可導(dǎo)致極快的滲透，輸送高濃度的活性制劑到小區(qū)域中。
該組合物在制備和貯存條件下必須穩(wěn)定，防止微生物如細(xì)菌和真菌污染。須知應(yīng)將內(nèi)毒素的污染保持最低，在安全水平例如在0.5ng/mg蛋白質(zhì)之下。
在具本實(shí)施例中，可在該組合物采用延遲吸收劑如單硬脂酸鎂、明膠或其組合來(lái)延緩可注射組合物的吸收。
在本發(fā)明的一具本實(shí)施例中，所用的組合物是抗血管生成靶向融合物，其表達(dá)至少部分受2002.5.5提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No＿＿，題為“BIPARTITE T-CELLFACTOR(TCF)-RESPONSIVE PROMOTER”和2003.5.5提交的美國(guó)非臨時(shí)專利申請(qǐng)Express Mail號(hào)EU110397859US(二文內(nèi)容納入本文作參考)中所述啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，其中，所述融合物含有脂質(zhì)體，如DC-Chol、DOTMA等。
實(shí)施例此文包括以下實(shí)施例以顯示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得，實(shí)施例中按照本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)所公開的技術(shù)，在實(shí)施本發(fā)明中工作良好，可認(rèn)為構(gòu)成了實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了此公開內(nèi)容后，知道可在所分開的具體實(shí)施方式
中作出許多修改仍能獲得類似結(jié)果，但這為脫離本發(fā)明的思路和范圍。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料和方法免疫印跡采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，用含有內(nèi)皮抑制素、內(nèi)皮抑制素-胞嘧啶脫氨酶(endo-CD)和內(nèi)皮抑制素-白介素12(endo-IL12)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后用無(wú)血清培養(yǎng)液置換原培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清液用抗內(nèi)皮抑制素抗體作免疫印跡。
ELISA用編碼內(nèi)皮抑制素-IL12或內(nèi)皮抑制素-GM-CSF的質(zhì)粒，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后用無(wú)血清培養(yǎng)液置換原培養(yǎng)液。收集上清液作ELISA檢測(cè)內(nèi)皮抑制素蛋白。
實(shí)施例2抗血管生成-治療/診斷性融合基因的表達(dá)圖1顯示，產(chǎn)生融合蛋白后，可測(cè)到抗血管生成-治療/診斷性融合蛋白。圖1A，293細(xì)胞上清液的抗內(nèi)皮抑制素抗體免疫印跡?？蓽y(cè)到18KD內(nèi)皮抑制素(□)、58KD內(nèi)皮抑制素-CD()和93KD endo-IL12(←)。圖1B說(shuō)明采用ELISA試劑盒(內(nèi)皮抑制素特異性)也可測(cè)到和和定量?jī)?nèi)皮抑制素-IL12和內(nèi)皮抑制素-GM-CSF融合蛋白。
實(shí)施例3特征分析融合蛋白的抗血管生成和治療/診斷功能的實(shí)驗(yàn)材料和方法內(nèi)皮管試驗(yàn)在96孔板各孔中加入50μl Matrigel(Collaborative BiomoleculesBedford，MA)并使其聚合。使含5,000個(gè)人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的無(wú)抗菌素EGM-2懸浮培養(yǎng)液通過(guò)包被有Matrigel的各孔。收集用不同質(zhì)粒(內(nèi)皮抑制素、內(nèi)皮抑制素-CD和CD)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液處理的細(xì)胞。所有試驗(yàn)一式三份進(jìn)行。37℃培養(yǎng)細(xì)胞12-24小時(shí)，顯微鏡觀察。給細(xì)胞攝影。觀察5個(gè)視野計(jì)數(shù)內(nèi)皮管數(shù)取平均值。
遷移試驗(yàn)用Boyden小室試驗(yàn)在HUVEC上測(cè)試內(nèi)皮抑制素對(duì)VEGF-誘導(dǎo)的趨化作用的抑制效果。胰酶處理后，洗滌，用含0.5％FBS的M199培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，將10,000個(gè)細(xì)胞接種在上室小孔中，加入從轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒(內(nèi)皮抑制素、內(nèi)皮抑制素-CD和CD)的293T收集的上清液。將含2％FBS加10ng/ml VEGF的M199培養(yǎng)液放在下室中作為趨化吸引劑。用8μm孔徑的聚碳酸酯濾膜將含細(xì)胞小室與趨化吸引劑分開。37℃培養(yǎng)小室6-8小時(shí)。棄去非遷移細(xì)胞后用PBS洗滌上室孔，用塑料葉片刮濾膜固定在4％福爾馬林PBS中，用DAPI熒光染料染色，置于載玻片上。采用高強(qiáng)熒光視野記錄販個(gè)獨(dú)立的均勻著色圖象。觀察5個(gè)視野計(jì)數(shù)內(nèi)皮管數(shù)取平均值。所有試驗(yàn)一式三份進(jìn)行。
MTT試驗(yàn)用MTT試驗(yàn)測(cè)定了5FC與胞嘧啶脫氨酶(CD)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?FU對(duì)293細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。發(fā)肯人采用不同的質(zhì)粒(內(nèi)皮抑制素、內(nèi)皮抑制素-CD和CD)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培育12-14小時(shí)。胰酶處理后，洗滌，用含2％FBS加不同濃度5FU或5FC的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，在96孔板各孔中接種5,000個(gè)細(xì)胞。37℃培養(yǎng)平板3-4天。發(fā)明人加入20μl MTT液并培育2小時(shí)，然后各孔加入100μl裂解液培育過(guò)夜。次日測(cè)定570nm時(shí)的吸光度。
綠熒光表達(dá)以同樣方法用含內(nèi)皮抑制素-GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。培養(yǎng)36小時(shí)后熒光顯微鏡觀察GFP熒光。
NSF60(GM-CSF依賴性)細(xì)胞增殖試驗(yàn)為了定量測(cè)定內(nèi)皮抑制素-GM-CSF的生物活性，采用了該因子依賴性細(xì)胞系NSF60。用轉(zhuǎn)染了對(duì)照質(zhì)粒、編碼內(nèi)皮抑制素-GM-CSF質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞條件培養(yǎng)液，或二種濃度的重組GM-CSF，培養(yǎng)NSF60細(xì)胞。培養(yǎng)48小時(shí)后，用2mg/ml Cell Titer 96TM MTS試劑粉末(3-(4’5-二甲基噻唑基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯)-2-(4-磺基苯)-2H-四唑內(nèi)鹽)(Promega，USA)和0.92mg/ml吩嗪硫酸二甲酯(Sigma，USA)，測(cè)定作為生物活性標(biāo)志的脫氫酶活性，確定NSF60細(xì)胞質(zhì)增殖。
實(shí)施例4融合蛋白擁有抗血管生成和治療/診斷性二種功能圖2顯示，與內(nèi)皮抑制素比較endo-CD融合蛋白在內(nèi)皮管(圖2A-2D)和遷移(圖2E-2H)試驗(yàn)中顯示了類似的抗血管生成作用。從內(nèi)皮抑制素基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集的上清液，從內(nèi)皮抑制素-CD融合基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集的上清液顯示了對(duì)HUVEC細(xì)胞管形成(圖2A、2B、2C)和細(xì)胞遷移(圖2E、2F、2G)的抑制作用。圖2D和2H中，觀察了5個(gè)視野，計(jì)數(shù)了內(nèi)皮管和遷移細(xì)胞數(shù)并取平均值。
圖3說(shuō)明可測(cè)到融合基因的治療或診斷性功能。圖3A和3B中提供MTT試驗(yàn)結(jié)果。如所提供的不同濃度5FU或5FC與CD基因轉(zhuǎn)染，可用熒光顯微鏡檢測(cè)到轉(zhuǎn)染endo-GFP融合基因的293T細(xì)胞中的綠熒光蛋白表達(dá)。圖3D中，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑制素-GM-CSF質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可剌激NSF60細(xì)胞增殖。用轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑制素-GM-CSF質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)的NSF60細(xì)胞上清液的OD405值略高于用15.6nM重組GM-CSF蛋白培養(yǎng)細(xì)胞的值。因此，內(nèi)皮抑制素-GM-CSF質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)顯示了GM-CSF的功能，如GM-CSF依賴性NSF60細(xì)胞增殖所證明的那樣。
實(shí)施例5抗血管生成-治療/診斷性融合蛋白的腫瘤特異性靶向作用的實(shí)驗(yàn)材料和方法體外內(nèi)皮細(xì)胞的靶向?yàn)榱俗C明抗血管生成-治療或診斷性融合基因的特異性靶向作用，發(fā)明人將原先建立的293T內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定克隆細(xì)胞接種在10cm平板中。同時(shí)在4小室板中接種不同的細(xì)胞系(MDA-231乳腺癌細(xì)胞、小鼠內(nèi)皮細(xì)胞SVEC和人內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC)。細(xì)胞粘附后，發(fā)明人將4孔板放入10cm板中，加入足夠的培養(yǎng)液覆蓋所有的孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，用PBS洗滌4孔板，在熒光顯微鏡下觀察綠熒光。
體內(nèi)腫瘤靶向發(fā)明人將2×105個(gè)親代細(xì)胞系或內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定克隆的B16細(xì)胞皮下注射到7-9周齡的B57小鼠。各鼠注射二個(gè)部位。實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)明人將B16親代細(xì)胞注射在一部位，B16內(nèi)皮抑制素-GFP細(xì)胞注射另一部位。對(duì)照組中，二部位均接受B16親代腫瘤細(xì)胞。14天后，收集腫瘤并固定。發(fā)明人用抗GFP抗體作免疫組化染色。
實(shí)施例6抗血管生成-治療/診斷性融合蛋白的腫特異性靶向作用圖4顯示內(nèi)皮抑制素-GFP可特異性靶向內(nèi)皮細(xì)胞。與293T內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定克隆細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，可在SVEC小鼠內(nèi)皮細(xì)胞(E)但不是MDA-231乳腺癌細(xì)胞(B)中檢測(cè)到大量綠色熒光信號(hào)。
圖5。在B-16親代腫瘤的血管壁中測(cè)到GFP信號(hào)。圖5A顯示實(shí)驗(yàn)組。B-16內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定細(xì)胞系中可見彌散的GFP信號(hào)。圖5B顯示5A對(duì)側(cè)的腫瘤(來(lái)自B-16親代細(xì)胞系)中，血管壁中()發(fā)現(xiàn)GFP信號(hào)。圖5C中，對(duì)照組來(lái)自雙側(cè)B-16親代細(xì)胞系的腫瘤中未能測(cè)到GFP信號(hào)。
實(shí)施例7動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)材料與方法內(nèi)皮抑制素--GFP抑制局部和遠(yuǎn)處腫瘤生長(zhǎng)用內(nèi)皮抑制素--GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16黑色素瘤細(xì)胞。建立穩(wěn)定克隆后，發(fā)明人給7-9周齡的B57小鼠皮下注射來(lái)自親代細(xì)胞系或內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定克隆的2×105個(gè)B16細(xì)胞。動(dòng)物分成二組，每組10只小鼠，每鼠注射二部位。實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)明人將B16親代細(xì)胞注射在一部位，B16內(nèi)皮抑制素-GFP細(xì)胞注射另一部位。對(duì)照組中，二部位均接受B16親代腫瘤細(xì)胞。14天時(shí)收集腫瘤并計(jì)算。腫瘤體積±S.D繪圖。
融合蛋白對(duì)局部腫瘤的高度抗癌作用B16F10黑色素瘤模型—在6-7周齡的C57/BL6有免疫力雌鼠的右腹側(cè)皮下注射1×106個(gè)或2.5×105個(gè)B16-F10細(xì)胞。接種4天后，將編碼熒光素酶、內(nèi)皮抑制素、IL12或內(nèi)皮抑制素-IL12和陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物(100μl鹽水中)的不同質(zhì)粒DNA直接注射入腫瘤(約5mm直徑)中。重復(fù)治療每天三次，間隔四天。接種腫瘤17天后測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤大小。
CT-26結(jié)腸癌模型--將CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞(2×105個(gè))皮下注射到7-9周齡B57CL6小鼠右腹側(cè)。同時(shí)將另一組CT-26黑色素瘤細(xì)胞(2×105個(gè))皮下注射到該小鼠左腹側(cè)。腫瘤攻擊四天后，在左側(cè)CT-26腫瘤中注射含熒光素酶(Luc)、內(nèi)皮抑制素(Endo)、白介素-12(IL-12)或Endo-IL12融合基因的不同質(zhì)粒。重復(fù)此程序每周二次，每隔二天測(cè)定腫瘤大小。計(jì)算右側(cè)遠(yuǎn)處腫瘤的大小并按治療期繪圖。
實(shí)施例8抗血管生成-治療/診斷性融合蛋白的動(dòng)物模型圖6顯示穩(wěn)定克隆細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)皮抑制素-GFP抑制了對(duì)側(cè)和局部的腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)照組中，測(cè)定了所有的腫瘤并取平均值。按細(xì)胞系(B16親代黑色素瘤細(xì)胞系或內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定克隆)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的腫瘤并取平均值。
圖7顯示與單用IL12或內(nèi)皮抑制素相比，在不同的獨(dú)立動(dòng)物研究中，endo-IL12具有高度抗癌作用。圖7A中為針對(duì)B16F10的腫瘤內(nèi)基因治療。與內(nèi)皮抑制素和IL-12基因相比，內(nèi)皮抑制素-IL12顯示了對(duì)皮下異種移植物B16-F10黑色素癌有最顯著的抗癌作用。圖7B為與圖7A相似的抗B16F10腫瘤的腫瘤內(nèi)基因治療，除最初遠(yuǎn)處腫瘤用2×105個(gè)細(xì)胞攻擊外。如圖7C所示，endo-IL12仍顯示比單用IL-12和內(nèi)皮抑制素更好的療效。
實(shí)施例9融合蛋白對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤抗癌作用的實(shí)驗(yàn)材料和方法活體外轉(zhuǎn)染第0天，給7-9周齡的B57CL6小鼠右側(cè)腹皮下注射B16-F10黑色素瘤細(xì)胞(2×105個(gè))。各組10只小鼠。發(fā)明人用含有熒光素酶(Luc)、內(nèi)皮抑制素(Endo)、胞嘧啶脫氨酶(CD)和內(nèi)皮抑制素-CD(end-CD)、腫瘤抑制素的抗血管生成缺失突變體(tum5)、白介素-12(IL-12)或Tum5-IL12融合基因的不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16F10黑色素瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后收獲這些黑色素瘤細(xì)胞在第一天注射到不同組小鼠的左腹側(cè)。在第4、7、10天重復(fù)此程序3次。測(cè)定右腹側(cè)遠(yuǎn)處腫瘤的大小，計(jì)算體積按治療期繪圖。
穩(wěn)定的克隆給7-9周齡B57CL6小鼠右腹側(cè)皮下注射來(lái)2×105個(gè)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞。二天后，在左側(cè)皮下注射B16F10癌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)皮抑制素、IL-12或end0-IL12的克隆細(xì)胞2×105個(gè)。每周二次反復(fù)注射穩(wěn)定的克隆癌細(xì)胞。每二天測(cè)定右腹側(cè)遠(yuǎn)處腫瘤的大小。
實(shí)施例10融合蛋白對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤的高度抗癌作用圖8顯示穩(wěn)定克隆或活體外轉(zhuǎn)染表達(dá)的融合蛋白對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤具有高度抗癌作用。圖8A，內(nèi)皮抑制素-CD融合基因抗血管生成-化療的活體外治療，顯示對(duì)對(duì)側(cè)腫瘤生長(zhǎng)有較好的抑制作用(Endo內(nèi)皮抑制素；CD胞嘧啶脫氨酶；Endo-CD融合基因)。圖8B顯示Tum5-IL12融合基因抗血管生成免疫療法的活體外治療對(duì)遠(yuǎn)處腫瘤有較好的腫瘤抑制作用(Tum5腫瘤抑制素抗血管生成缺失突變體；IL12白介素-12；Tum5-IL12融合基因)。圖8C表明遠(yuǎn)處CT-26結(jié)腸癌的生長(zhǎng)受到Endo-IL12基因治療的最顯著抑制。將各種基因注射到遠(yuǎn)離測(cè)定腫瘤部位的未直接注射基因治療的CT-26腫瘤中。圖8D顯示用內(nèi)皮抑制素-IL12穩(wěn)定細(xì)胞系治療遠(yuǎn)處腫瘤。Endo-IL12顯示了比其它治療蛋白更好的抗癌癥效果。
實(shí)施例11結(jié)果的顯著性分析以上結(jié)果顯示，如本文提供的研究結(jié)果表明所證實(shí)的那樣，搞血管生成融合基因可用于基因治療和診斷試劑。圖1中，該融合基因可導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)，用免疫印跡和ELISA可檢測(cè)到。如圖2和圖3所示該融合蛋白是有功能的，具有抗血管生成能力，以及該功能至少部歸功于該結(jié)合的蛋白質(zhì)。在這些功能試驗(yàn)中，如內(nèi)皮管形成和遷移試驗(yàn)所證明的那樣，融合蛋白內(nèi)皮抑制素-CD能抑制血管生成，程度上類似于野生型內(nèi)皮抑制素。此外，結(jié)合于典型內(nèi)皮抑制素的治療/診斷性蛋白質(zhì)仍具有其野生型式的功能。內(nèi)皮抑制素-GFP能呈現(xiàn)綠色熒光。內(nèi)皮抑制素-GM-CSF能誘導(dǎo)其生長(zhǎng)依賴于GM-CSF的NSF60細(xì)胞增殖。內(nèi)皮抑制素-CD可將無(wú)毒性的5-FC轉(zhuǎn)變成有毒性的5-FU，從而殺傷293T和HUVEC(人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞。
在體外(圖4)和病理學(xué)研究(圖5)中，內(nèi)皮抑制素-GFP顯示是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的。圖4中，當(dāng)與含內(nèi)皮抑制素-GFP的條件培養(yǎng)液一起培養(yǎng)時(shí)只有內(nèi)皮細(xì)胞(SVEC)顯示GFP信號(hào)。圖5中，內(nèi)皮抑制素-GFP能從內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定表達(dá)的克隆腫瘤(圖5A)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處親代B16F10黑色素瘤細(xì)胞中，抗內(nèi)皮抑制素-GFP抗體可檢測(cè)到內(nèi)皮抑制素-GFP(圖5B)。相反，當(dāng)不給攜帶B16-F10腫瘤的小鼠接種內(nèi)皮抑制素-GFP穩(wěn)定克隆腫瘤時(shí)，該親代細(xì)胞則不顯示GFP信號(hào)(圖5C)。換言之，融合蛋白中的內(nèi)皮抑制素組分可導(dǎo)致GFP蛋白在遠(yuǎn)處腫瘤血管部位表達(dá)。因此證明了可用抗血管生成蛋白(此例中是內(nèi)皮抑制素)輸送非腫瘤血管特異性蛋白(此例中是GFP)到腫瘤部位。此外，內(nèi)皮抑制素-GFP在其它實(shí)施例中可作為診斷工具，因?yàn)榭蓹z測(cè)到GFP發(fā)出的熒光信號(hào)，內(nèi)皮抑制素可靶向腫瘤的新生血管。
最后，該融合基因及其編碼的蛋白質(zhì)可用作治療制劑。本發(fā)明人采用融合基因，如內(nèi)皮抑制素-IL12治療黑色素瘤(圖7A和7B)和帶有結(jié)腸癌的小鼠(圖7C)，顯示比單用內(nèi)皮抑制素或IL-12具有高度抗癌癥作用。這些基因編碼的融合蛋白作為蛋白治療制劑，在用該融合基因(圖8C)或穩(wěn)定的克隆(圖8D)作為“蛋白質(zhì)工廠”，活體外治療腫瘤細(xì)胞(圖8A和8B)或注射入已建株的腫瘤的其它動(dòng)物研究中，也顯示有效(圖8)，并且所分泌的蛋白質(zhì)能抑制遠(yuǎn)處腫瘤的生長(zhǎng)。
實(shí)施例12偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的抗血管生成抑制劑的活體內(nèi)試驗(yàn)抗癌癥治療劑的一種有用生物性能是其能減少體內(nèi)致瘤性。為測(cè)試此可能性，在某些實(shí)施例中，本文的研究中沒有利用偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管抑制劑的抗腫瘤活性。例如，可在裸鼠癌癥模型中進(jìn)行活體內(nèi)致癌性試驗(yàn)?？稍谂囵B(yǎng)板中通過(guò)SN脂質(zhì)體輸送融合基因轉(zhuǎn)染示范性的癌細(xì)胞系，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和前列腺癌細(xì)胞系PC-3。24小時(shí)后，小心收集受處理的細(xì)胞接種在裸鼠的乳房脂肪墊中(mfp)(對(duì)MCF-7)或皮下結(jié)締組織(對(duì)PC-3)中。例如接種4百萬(wàn)個(gè)MCF-7細(xì)胞和1百萬(wàn)個(gè)PC-3細(xì)胞。用空載體peDNA3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。每周測(cè)定接種腫瘤的大小。
此種“活體內(nèi)試驗(yàn)”繞過(guò)了體內(nèi)基因輸送問(wèn)題，顯示在最佳輸送條件下，含有抗血管生成性能融合基因的腫瘤細(xì)胞比對(duì)照的腫瘤生長(zhǎng)能力差。
實(shí)施例13偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的抗血管生成抑制劑的體內(nèi)試驗(yàn)在某些實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所述制備偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管生成抑制劑，如本文所述抗血管生成融合基因產(chǎn)物，用于以下體內(nèi)研究。通過(guò)注射用偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管生成抑制劑，治療已長(zhǎng)有腫瘤的小鼠，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，顯示能抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。
乳腺癌的全身基因療法包括，例如非病毒基因輸送系統(tǒng)(SN)和融合基因。可全身給予SN-融合基因，顯示能抑制例如植入裸鼠中的人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，某些實(shí)施例中，延長(zhǎng)了被治療動(dòng)物的生命。
顯然，上述方法證明本發(fā)明的特異性融合基因是有用的。按照本文提供的說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備和測(cè)試任何數(shù)量的融合基因的抗血管生成活性、抗細(xì)胞增殖活性、抗腫瘤活性、促凋亡活性或這些活性的組合。
實(shí)施例14偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的示范性血管生成抑制劑的測(cè)定在動(dòng)物研究中，如細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物和/或模型中，除上述實(shí)施例所述的之外，測(cè)試了偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管生成抑制劑的相關(guān)抗腫瘤活性。在本發(fā)明的一般料施例中，通過(guò)載體，如脂質(zhì)體、腺病毒載體或其組合，將融合基因輸送給裸鼠模型觀察其抗腫瘤活性。一旦證明了抗腫瘤活性，進(jìn)一步用有免疫能力的小鼠檢查潛在的毒性，隨后進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
在一具體實(shí)施例中，至少在一種動(dòng)物中測(cè)定抗血管生成融合基因的優(yōu)先的生長(zhǎng)抑制活性。簡(jiǎn)而言之，例如，將癌細(xì)胞系注射到裸鼠乳房脂肪墊中產(chǎn)生乳腺異種植入物模型。任何癌細(xì)胞都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不論其基因型或表達(dá)水平(如不論是HER-2/neu陽(yáng)性或HER-2/neu陰性)。在一具體實(shí)施例中，采用HER-2/neu過(guò)度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系(如SKBR3和/或MDA-MB361)進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到特寫大小時(shí)將融合基因，某些實(shí)施例中，將對(duì)照，與可接受運(yùn)載體如脂質(zhì)體的混合物給予小鼠。比較這些治療所致的腫瘤大小和存活曲線，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
本發(fā)明某些實(shí)施例中，采用小鼠動(dòng)物模型研究靶向抗血管融合基因產(chǎn)品。在一具體實(shí)施例中，采用雙側(cè)黑色素瘤或結(jié)腸腫瘤模型。在另一實(shí)施例中，采用一側(cè)腫瘤內(nèi)基因治療方案。在另一實(shí)施例中，在該靶向融合多肽中采用自殺性治療基因，腹腔內(nèi)給予動(dòng)物模型前藥(如5FC)然后輸入自殺性治療基因。在某些實(shí)施例中，測(cè)定對(duì)側(cè)腫瘤大小來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤靶向效果。除自殺性基因治療外，也可采用，例如給予內(nèi)皮抑制素-胞嘧啶脫氨酶和5FC作為前藥，來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)皮抑制素-IL12。在某些實(shí)施例中，也可測(cè)定同側(cè)腫瘤的大小來(lái)評(píng)價(jià)化療的效果。
實(shí)施例15偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的其它血管生成抑制劑的制備根據(jù)上述實(shí)施例提供的資料和本說(shuō)明書中的說(shuō)明，加上專業(yè)知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)有興趣和能夠制備偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的其它融合性血管生成抑制劑，從而能確定其在本發(fā)明中采用本文所述方法學(xué)的用途。
實(shí)施例16偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的其它血管生成抑制劑的測(cè)定除本文所述示范性實(shí)施例外，一旦產(chǎn)生了偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管生成抑制劑，可如上所述用相關(guān)細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)定。另外，可用FACS分析進(jìn)行抗血管生成融合基因產(chǎn)品的測(cè)定。此外在具體實(shí)施例中，可采用本文所述的活體內(nèi)系統(tǒng)或體內(nèi)系統(tǒng)測(cè)定其它抗血管生成融合基因產(chǎn)品。
實(shí)施例17臨床試驗(yàn)此實(shí)施例是關(guān)于采用偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管生成抑制劑治療人的方案的開發(fā)。在具體實(shí)施例中，該偶聯(lián)有治療或診斷性制劑的血管生成抑制劑，是包括蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，單獨(dú)或與其它藥物組合的抗血管生成融合基因產(chǎn)品。在一具體實(shí)施例中，也采用其它藥物來(lái)治療血管生成，如抑制腫瘤。在一具體實(shí)施例中，用藥物來(lái)治療癌癥。該抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，和抗癌藥物治療可用于臨床治療各種癌癥。這種治療在對(duì)常規(guī)化療方案具有抗性的腫瘤治療，如治療卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、腦、結(jié)腸和肺癌患者中是特別有用的工具。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀本說(shuō)明書將會(huì)明白實(shí)行臨床試驗(yàn)，包括患者的治療和監(jiān)測(cè)的各種要素。提供以下信息作為通用指導(dǎo)，以指導(dǎo)這些已建立的抗血管生成蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸在臨床試驗(yàn)中的運(yùn)用。
選擇進(jìn)行臨床研究的患者是患轉(zhuǎn)移性乳腺癌、上皮性卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或其它癌癥，和通常處于發(fā)生癌癥高危險(xiǎn)中，原先接受過(guò)癌癥治療現(xiàn)已緩解，或?qū)χ辽僖环N常規(guī)治療無(wú)反應(yīng)的患者。在一示范性臨床試驗(yàn)方案中，患者可在胸腔或腹腔中安置Tenckhoff導(dǎo)管或其它適合的裝置，以便進(jìn)行一系列的胸腹腔滲出液采樣。通常希望知道胸腹腔中是否有已知的小室、肌酐水平在2mg/dl以下，膽紅素水平在2mg/dl以下?；颊邞?yīng)呈現(xiàn)正常的血凝模式。對(duì)于抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，和其它抗癌藥物的給藥，可在胸腔或腹腔中放置Tenckhoff導(dǎo)管或其它裝置，除非這些裝置先前手術(shù)時(shí)已放好?？色@得胸腹腔液的樣品，從而可測(cè)定和記錄此類液體中的基線水平、細(xì)胞組成、細(xì)胞學(xué)參數(shù)、LDH和相應(yīng)的標(biāo)記(CEA、CA15-3、CA125、PSA、p38(磷酸化和非磷酸化形式)細(xì)胞中的Akt(磷酸化和非磷酸化形式)(抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼它們的核酸)。
以同樣方法，可單獨(dú)或與其它抗癌藥物一起給予抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸。給藥可在胸腹腔中，直接注射于腫瘤，或以全身方式。起始劑量可為0.5mg/kg體重。每劑可治療3個(gè)患者，毒性不超過(guò)3級(jí)?？?00％遞增(0.5mg，1mg，2mg，4mg)提高劑量直到測(cè)到藥物毒性相關(guān)等級(jí)2。此后劑量可按25％遞增。如果對(duì)于某患者，大量的抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸，和大量抗癌藥物應(yīng)用，測(cè)到的內(nèi)毒素聯(lián)合水平超過(guò)5EU/kg，可將給予的劑量均分成二次輸注，間隔6小時(shí)。
可在短時(shí)間內(nèi)輸注，或以恒定的輸注速度在7-21天期間，給予抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸和/或其它抗癌藥物有組合。可單獨(dú)給予，或與抗癌藥物和/或大黃素樣酪氨酸激酶抑制劑一起，給予抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼抗血管生成融合蛋白、肽或多肽的核酸輸注。輸注的劑量水平取決于每次所達(dá)到的毒性程度。因此，如果在一次輸液，或以恒定速度輸液一段時(shí)間后毒性達(dá)到II級(jí)時(shí)，應(yīng)撒消下一步劑量或停止恒定速度輸液除非毒性改善。可將增加劑量的抗血管生成融合蛋白質(zhì)、肽或多肽，或編碼突變蛋白、肽或多肽的核酸，與抗癌藥物組合給予患者組，直到大約60％的患者顯示了不可接受范圍的III或IV級(jí)毒性。此值的2/3劑量可認(rèn)為是安全劑量。
當(dāng)然，在治療前和間隔約3-4周后，應(yīng)檢查身體、測(cè)量腫瘤和作實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)應(yīng)包括CBC、分化和血小板計(jì)數(shù)、尿液檢查、SMA-12-100(肝和腎功能試驗(yàn))、血凝情況和任何其它合適的化學(xué)試驗(yàn)，以確定患病程度，或確定當(dāng)前癥狀的原因。也應(yīng)監(jiān)測(cè)血清中的相應(yīng)生物學(xué)標(biāo)記，如CEA、CA15-3、p38(磷酸化和非磷酸化形式)和Akt(磷酸化和非磷酸化形式)、p185等。
為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程和評(píng)價(jià)抗腫瘤反應(yīng)，考慮應(yīng)每隔4周檢查患者的相應(yīng)腫瘤標(biāo)志，如果最初異常，每周檢查CBC、分化和血小板計(jì)數(shù)二次共4周；如果沒觀察到骨髓抑制，每周一次。如果任何患者有長(zhǎng)時(shí)間骨髓抑制，勸告作骨髓檢查以排除腫瘤入侵骨髓引起各類血細(xì)胞減少。應(yīng)每隔4周作血凝情況檢查。應(yīng)每周進(jìn)行SMA-12-100。第一次給藥后72小時(shí)可采取胸/腹腔滲出液樣品，然后前二個(gè)療程中每周一次，然后每4周一次直到研究進(jìn)展或研究結(jié)束?？稍u(píng)估體液中的細(xì)胞組成、細(xì)胞學(xué)參數(shù)、LDH和相應(yīng)的標(biāo)志(CEA、CA15-3、CA125、ki67和Tunel試驗(yàn)以測(cè)定凋亡，Akt)和細(xì)胞中的Akt。當(dāng)疾病可測(cè)定時(shí)應(yīng)每隔4周記錄腫瘤的測(cè)定數(shù)據(jù)。每隔8周應(yīng)重復(fù)適當(dāng)?shù)姆派錂z查評(píng)價(jià)腫瘤反應(yīng)。首次治療后4和8周和研究結(jié)束時(shí)重復(fù)肺呼吸量測(cè)定和DLCO。每隔4周作尿分析。
通過(guò)可接受的測(cè)定數(shù)據(jù)確定臨床反應(yīng)。例如，所有可測(cè)定的疾病參數(shù)消失至少一個(gè)月可認(rèn)為是完全反應(yīng)。而所有可評(píng)定的腫瘤結(jié)節(jié)兩垂直直徑之和減少50％或更多，或在至少一個(gè)月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)腫瘤增大，可認(rèn)為是部分反應(yīng)。類似地，在一個(gè)或多個(gè)部位疾病進(jìn)程中，所有可測(cè)定的病損兩垂直直徑之和減少50％或更多，可認(rèn)為是混合反應(yīng)。
參考文獻(xiàn)本說(shuō)明書所提到的所有專利和出版物表明了本發(fā)明涉及領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有納入本文作參考的專利和出版物以同樣程度納入，就象各出版物特定和單獨(dú)納入作參考那樣。
專利美國(guó)專利No.4,683,202美國(guó)專利No.4,797,368美國(guó)專利No.4,879,236美國(guó)專利No.5,139,941美國(guó)專利No.5,220,007美國(guó)專利No.5,284,760美國(guó)專利No.5,354,670美國(guó)專利No.5,366,878美國(guó)專利No.5,389,514美國(guó)專利No.5,635,377美國(guó)專利No.5,641,484美國(guó)專利No.5,670,488美國(guó)專利No.5,789,166美國(guó)專利No.5,798,208美國(guó)專利No.5,830,650
美國(guó)專利No.5,871,986美國(guó)專利No.5,925,565美國(guó)專利No.5,928,906美國(guó)專利No.5,935,819PCT國(guó)際專利申請(qǐng)WO 99/16889。
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Niethammer等，Cancer Res.，61(16)6178-6184，2001雖然本發(fā)明的內(nèi)容及其優(yōu)點(diǎn)已作了詳細(xì)描述，但應(yīng)知道可作出各種變化、替代和改變而不脫離本文權(quán)利要求所確定的思路和范圍。然而，本發(fā)明的范圍不希望受到此說(shuō)明書所述的過(guò)程、機(jī)制、制造方法、材料的組成、工具、方法和步驟的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解，可利用本發(fā)明公開的內(nèi)容、現(xiàn)有的或后來(lái)發(fā)展的過(guò)程、機(jī)制、制造方法、材料的組成、工具、方法和步驟，進(jìn)行基本上相同的工作或獲得基本上與相應(yīng)實(shí)施例相同的結(jié)果。因此本發(fā)明的權(quán)利要求將這類過(guò)程、機(jī)制、制造方法、材料的組成、工具、方法和步驟包括在其范圍內(nèi)。
序列表<110>M.-C.恒(HUNG，MIEN-CHIE)K.-L.蘭(LAN，KENG-LI)F.歐陽(yáng)(OU-YANG，F(xiàn)U)J.-C.劉(LIU，JAW-CHING)K.-H.蘭(LAN，KENG-HSIN)<120>遞送治療或診斷試劑的導(dǎo)向蛋白質(zhì)<130>UTFC797WO<140>未知<141>2003-05-06<150>60/383,063<151>2002-05-06<160>42<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1606<212>DNA<213>單純皰疹病毒<400>1aggagcttca gggagtggcg cagctgcttc atccccgtgg cccgttgctc gcgtttgctg 60gcggtgtccc cggaagaaat atatttgcat gtctttagtt ctatgatgac acaaaccccg 120cccagcgtct tgtcattggc gaattcgaac acgcagatgc agtcggggcg gcgcggtccc 180aggtccactt cgcatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc 240gacccgctta acagcgtcaa cagcgtgccg cagatcttgg tggcgtgaaa ctcccgcacc 300tctttggcaa gcgccttgta gaagcgcgta tggcttcgta cccctgccat caacacgcgt 360ctgcgttcga ccaggctgcg cgttctcgcg gccatagcaa ccgacgtacg gcgttgcgcc 420ctcgccggca gcaagaagcc acggaagtcc gcctggagta gaaaatgccc acgctactgc 480gggtttatat agacggtcct cacgggatgg ggaaaaccac caccacgcaa ctgctggtgg 540ccctgggttc gcgcgacgat atcgtctacg tacccgagcc gatgacttac tggcaggtgc 600tgggggcttc cgagacaatc gcgaacatct acaccacaca acaccgcctc gaccagggtg 660agatatcggc cggggacgcg gcggtggtaa tgacaagcgc ccagataaca atgggcatgc 720cttatgccgt gaccgacgcc gttctggctc ctcatatcgg gggggaggct gggagctcac 780atgccccgcc cccggccctc accctcatct tcgaccgcca tcccatcgcc gccctcctgt 840gctacccggc cacgcgatac cttatgggca gcatgacccc ccaggccgtg ctggcgttcg 900tggccctcat cccgccgacc ttgcccggca caaacatcgt gttgggggcc cttccggagg 960acagacacat cgaccgcctg gccaaacgcc agcgccccgg cgagcggctt gacctggcta 1020tgttggccgc gattcgccgc gtttacgggc tgcttgccaa tacggtgcgg tatctgcagg 1080
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<210>3<211>1524<212>DNA<213>水痘帶狀皰疹<220>
<221>modified_base<222>(1199)<223>n＝a，c，g，t/u<400>3ctggcgcata ccctcgcaaa actggtgata cttagtaggg gtatgtatat tagcgctaaa 60acggcaagat tttaattcca ctataaaaca aacggtcttt ccggcaccac tggattccgt 120ttgtataata caaacacaat cggggcgtcg gcgtcccaaa tttacttcaa acgacattga 180tatgcgtaca gccctttgaa catccacgtg ggataacggc gacaggagtt ttgccagcct 240cgggttgaac gcgtccgcga aacctcgacg tacgttatca atatcctttt tgagtacatc 300gtaaaaacga gtgtggcaac gttgtcccaa acgaaaacac ttggcccgaa ttcgactagc 360ggacatattt gaagttccgt cccagaagat aacctaagac gcgtttgtct acaataaaca 420tgtcaacgga taaaaccgat gtaaaaatgg gcgttttgcg tatttatttg gacggggcgt 480atggaattgg aaaaacaacc gccgccgaag aatttttaca ccactttgca ataacaccaa 540accggatctt actcattggg gagcccctgt cgtattggcg taaccttgca ggggaggacg 600ctatttgcgg aatttacgga acacaaactc gccgtcttaa tggagacgtt tcgcctgaag 660acgcacaacg cctcacggct cattttcaga gcctgttctg ttctccgcat gcaattatgc 720atgcgaaaat ctcggcattg atggacacaa gtacatcgga tctcgtacaa gtaaataagg 780agccgtataa aattatgtta tccgaccgac acccaatcgc ctcaactata tgttttccct 840tgtccagata cttagtggga gatatgtccc cagcggcgct tcctgggtta ttgtttacgc 900ttcccgctga accccccggg accaacttgg tagtttgtac cgtttcactc cccagtcatt 960tatccagagt aagcaaacgg gccagaccgg gagaaacggt taatctgccg tttgttatgg 1020ttctgagaaa tgtatatata atgcttatta atacaattat atttcttaaa actaacaact 1080ggcacgcggg ctggaacaca ctgtcatttt gtaatgatgt atttaaacag aaattacaaa 1140aatccgagtg tataaaacta cgcgaagtac ctgggattga agacacgtta ttcgccgtnc 1200ttaaacttcc ggagctttgc ggagagtttg gaaatattct gccgttatgg gcatggggaa 1260tggagaccct ttcaaactgc ttacgaagca tgtctccgtt cgtattatcg ttagaacaga 1320caccccagca tgcggcacaa gaactaaaaa ctctgctacc ccagatgacc ccggcaaaca 1380tgtcctccgg tgcatggaat atattgaaag agcttgttaa tgccgttcag gacaacactt 1440cctaaatata cctagtattt acgtatgtac cagtaaaaag atgatacaca ttgtcatact 1500cgcgtgtacg tgtttttctt tttt1524<210>4<211>1634<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>4
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tcttagctat tgtaatatta tatgcaaatt gatgaatggt aattttgtaa ttgtgggtca 2340ctgtactatt ttaacgaata ataaaatcag gtataggtaa ctaaaaa 238權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中，所述抗血管生成多肽區(qū)域是內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、血管抑制素或可溶性VEGF受體2區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，進(jìn)一步明確所述多肽包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域進(jìn)一步明確為白介素區(qū)域。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽。其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域是白介素-12區(qū)域。
6.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域進(jìn)一步明確為自殺性蛋白質(zhì)區(qū)域。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域是胞嘧啶脫氨酶區(qū)域。
8.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域進(jìn)一步明確為促凋亡區(qū)域。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域是突變性Bik區(qū)域。
10.如權(quán)利要求1所述的多肽，進(jìn)一步明確所述多肽包含連接有診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域。
11.如權(quán)利要求10所述的多肽，其中，所述診斷性蛋白或多肽區(qū)域是綠熒光蛋白區(qū)域。
12.一種方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述抗血管生成多肽區(qū)域是內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、血管抑制素或可溶性VEGF受體2區(qū)域。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的多肽進(jìn)一步明確為包含與治療性蛋白或多肽區(qū)域相融合的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域進(jìn)一步明確為白介素區(qū)域。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域是白介素-12區(qū)域。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域進(jìn)一步明確為自殺性蛋白質(zhì)區(qū)域。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述治療性蛋白或多肽區(qū)域是胞嘧啶脫氨酶區(qū)域。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步明確所述多肽包含與診斷性蛋白或多肽區(qū)域相融合的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述診斷性蛋白或多肽區(qū)域是綠熒光蛋白區(qū)域。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述細(xì)胞進(jìn)一步明確為受試者體內(nèi)所含細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述受試者是小鼠。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述受試者是人。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步明確為治療或診斷血管生成依賴性疾病的方法。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述血管生成依賴性疾病進(jìn)一步明確是癌癥。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述癌癥是頭頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、腦癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃腸道癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步明確該方法包括給予受試者包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑中的、包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽的多肽與脂質(zhì)復(fù)合。
29.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步明確該方法包括給予受試者包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽的編碼核酸。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述核酸包含在質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體或脂質(zhì)體中。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述核酸分散在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。
32.一種治療或診斷癌癥的方法，其特征在于，所述方法包括獲得包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽；或包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽的編碼核酸；和給予患者該多肽或該多肽的編碼核酸。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述患者患有癌癥。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述癌癥是頭頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、口腔癌、前列腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、血管瘤、肉瘤、肺癌、腦癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃腸道癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，給予所述患者包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽。
36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，給予所述患者連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域多肽的編碼核酸。
37.一種編碼包含連接有治療性蛋白或多肽區(qū)域或診斷性蛋白或多肽區(qū)域的抗血管生成多肽區(qū)域的多肽的核酸。
38.如權(quán)利要求37所述的核酸，進(jìn)一步明確其包含在一載體中。
39.如權(quán)利要求37所述的核酸，進(jìn)一步明確其與脂質(zhì)復(fù)合。
40.如權(quán)利要求37所述的核酸，進(jìn)一步明確其包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有與治療性或診斷性制劑偶聯(lián)的血管生成抑制劑的組合物。在一具體實(shí)施方式
中，該組合物是編碼偶聯(lián)有治療性或診斷性制劑的血管生成抑制劑的融合基因或該融合基因產(chǎn)物。在一具體實(shí)施例中，該組合物可用于治療血管生成相關(guān)疾病如癌癥的方法中。
文檔編號(hào)C07K14/78GK1681836SQ03816004
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月6日
發(fā)明者M·-C·恒, K·-L·蘭, F·歐陽(yáng), J·-C·劉, K·-H·蘭 申請(qǐng)人:得克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)